niveles de hif-1α, ang-1, ang-2, tie-2 en pulpa dental de

NIVELES DE HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2 EN PULPA DENTAL DE TERCEROS MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E

INCOMPLETO

PRESENTADO POR:

ANGIE SANTINA RODRIGUEZ GUERRERO

GLORIA MELISSA PANTOJA MORA

FRANCISCO JAVIER HERNANDEZ ACOSTA

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

SAN JUAN DE PASTO

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

ESPECIALIZACIÓN EN ENDODONCIA

2020

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NIVELES DE HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2 EN PULPA DENTAL DE TERCEROS MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E

INCOMPLETO

PRESENTADO POR:

ANGIE SANTINA RODRIGUEZ GUERRERO GLORIA MELISSA PANTOJA MORA


Trabajo presentado para optar título de: Especialista en Endodoncia

Asesores:

Javier Caviedes-Bucheli. Odontólogo. Especialista en Endodoncia. MSc en Microbiología. Universidad Cooperativa de Colombia-Campus Pasto.

Alexander López Ordoñez. Odontólogo Especialista en Periodoncia. MSc en

Epidemiologia. Universidad Cooperativa de Colombia-Campus Pasto.

Hernán Darío Muñoz. Odontólogo. Especialista en Endodoncia. Universidad Cooperativa de Colombia-Campus Pasto.

Luis Fernando López. Odontólogo. Especialista en Endodoncia. Universidad

Cooperativa de Colombia-Campus Pasto.

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

SAN JUAN DE PASTO

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA


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2020

NOTA DE ACEPTACIÓN

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FIRMA DEL PRESIDENTE DEL JURADO

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FIRMA DEL JURADO

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FIRMA DEL JURADO

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DEDICATORIA

Francisco: Dedico este trabajo de grado a mi familia, que me acompañó en todo este camino, quienes día a día me motivaron para culminar esta meta. Melissa: Dedico este trabajo de grado a Dios, quien como guía estuvo presente en el caminar de mi vida, bendiciéndome y dándome fuerzas para continuar sin desfallecer. A mi hijo Alejandro quien es mi fortaleza, el pilar y la razón de toda mi vida, A mi madre, por su sacrificio para sacarme adelante y su apoyo sin importar nuestras diferencias. A quien me acompaño en este proceso: Carlos mi compañero de vida, quien me alentó para continuar a través de sus consejos, de su amor y su paciencia y a todos los que aportaron un granito de arena para culminar esta meta. Angie: Dedico este trabajo a aquellas personas que no me dejaron desfallecer. Quienes con su sola presencia me motivaron día a día a seguir luchando. Mi familia, mi gran tesoro.

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AGRADECIMIENTOS

Hoy queremos agradecer, primero a Dios por brindarnos muchos dones cada día; salud, amor y dedicación, para iniciar y terminar este camino. A nuestras familias por ser incondicionales y creer siempre en nosotros. Inspirarnos cada día a seguir luchando por un objetivo. A la Universidad Cooperativa de Colombia, por abrirnos las puertas a continuar con nuestros estudios de posgrado; por creer en nosotros y darnos la oportunidad de pertenecer a esa hermosa familia, seguir creciendo profesionalmente y brindarnos las mejores herramientas para ser los mejores especialistas. A los docentes que nos brindaron sus conocimientos y su apoyo; además de contar con los mejores recursos para ser excelentes. Fue un trabajo difícil, a veces estresante y muy desgastante; pero sin esfuerzo, no hay recompensa. Hoy podemos decir, que después de dos años cumplimos esa meta; ese logro que tanto anhelamos, ese sueño que nos propusimos y hoy por fin se convierte en realidad. Es una meta que todos superamos, porque más que un trabajo en grupo, fue un trabajo en equipo y estamos orgullosos de ser la primera promoción en esta especialización. Agradecemos además al Dr. Javier Caviedes-Bucheli, por todos sus conocimientos, por su apoyo, por impulsarnos a ser los mejores, no quedarnos estancados únicamente en cosas básicas y siempre sobresalir. A nuestro asesor de tesis Dr. Alexander López Ordoñez, por toda su paciencia, conocimiento y dedicación. Al Dr. Luis Fernando López, por su acompañamiento constante, por haber depositado en nosotros toda su confianza. Tal vez, falten muchos por nombrar, pero como ya lo mencionamos anteriormente, este es un logro de todos y para todos. A nuestro grupo de trabajo, pasamos días duros, difíciles y a pesar de todo estuvimos unidos, en las buenas y en las malas. Aprendimos a coordinar todo el trabajo y por fin cumplimos el objetivo. También agradecemos a nuestros compañeros de posgrado, por su compañerismo y apoyo moral. Día a día todos fueron una pieza clave y aportaron en alto grado a nuestras ganas de conseguir este logro.

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Para terminar, a las futuras generaciones les decimos que no se desanimen, luchen todos los días; siempre intenten ser los mejores, llegar a lo más alto; sabemos que lo lograrán.

TABLA DE CONTENIDO

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................... 9

2. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................ 12

3. MARCO TEÓRICO .................................................................................... 14

4. ESTADO DEL ARTE ................................................................................. 22

5. OBJETIVOS ............................................................................................... 28

5.1. OBJETIVO GENERAL: ............................................................................... 28 5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ....................................................................... 28

6. METODOLOGÍA ........................................................................................ 29

6.1. ENFOQUE DE ESTUDIO ............................................................................ 29 6.2. TIPO DE ESTUDIO .................................................................................... 29 6.3. ÁREA DE ESTUDIO .................................................................................. 29 6.4. POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA ........................................................ 29 6.5. CRITERIOS DE SELECCIÓN ....................................................................... 30 6.6. VARIABLES ............................................................................................ 30 6.7. ENMASCARAMIENTO Y ALEATORIZACIÓN ................................................... 31 6.8. RECOLECCION DE DATOS ........................................................................ 31 6.9. CALIBRACIÓN DE OPERADORES ............................................................... 32 6.10. TOMA DE MUESTRA, ALMACENAMIENTO Y PROCESAMIENTO DEL TEJIDO

PULPAR: .......................................................................................................... 32 6.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................ 34 6.12. CONSIDERACIONES ÉTICAS ..................................................................... 35

7. RESULTADOS ........................................................................................... 36

7.1. ANÁLISIS DE DATOS SOCIODEMOGRÁFICOS ............................................... 36 7.2. ANÁLISIS BIVARIADO ............................................................................... 37 7.3. ANÁLISIS DE FACTORES ANGIOGÉNICOS .................................................... 38 7.4. CORRELACIÓN ENTRE DESARROLLO RADICULAR Y LOS FACTORES

ANGIOGÉNICOS ................................................................................................ 41

8. DISCUSIÓN ............................................................................................... 43

9. CONCLUSIONES ...................................................................................... 48

10. RECOMENDACIONES ........................................................................... 49

11. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................... 50

12. ANEXOS ................................................................................................. 63

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla No 1: Funciones de las angiopoyetinas 18 Tabla No 2: Funciones del Receptor TIE-2 18 Tabla No 3: Funciones del Factor inductor de hipoxia (HIF) 19 Tabla No 4: Variable independiente 30 Tabla No 5: Variables dependientes 31 Tabla No 6: Variables sociodemográficas, clínicas y radiográficas 31 Tabla No 7: Datos sociodemográficos de los participantes del estudio 36 Tabla No 8: Resultado pruebas de normalidad variables cuantitativas 37 Tabla No 9: Resultado pruebas de significancia estadística 37 Tabla No 10: Expresión de ANG-1 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo 38 Tabla No 11: Expresión de ANG-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo 39 Tabla No 12: Expresión de HIF-1α en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo 40 Tabla No 13: Expresión de TIE-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo 40 Tabla No 14: Expresión de ANG-1, ANG-2, HIF-1α y TIE-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo 41 Tabla No 15: Resultados de los coeficientes de correlación de Pearson y Spearman ANG-1, ANG-2, HIF-1α y TIE-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo 41

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica No 1: Expresión de ANG-1 en dientes con ápice abierto y cerrado 38 Gráfica No 2: Expresión de ANG-2 en dientes con ápice abierto y cerrado 39 Gráfica No 3: Expresión de HIF-1α en dientes con ápice abierto y cerrado 40 Gráfica No 4: Expresión de TIE-2 en dientes con ápice abierto y cerrado 40

ÍNDICE DE FIGURAS Figura No 1: Vías directa e indirecta de la angiogénesis 21

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RESUMEN

Objetivo: Determinar los niveles de los factores angiogénicos ANG-1, ANG-2, HIF-1α y su receptor TIE-2 en terceros molares con desarrollo radicular completo e incompleto y relacionar los mismos con el grado de desarrollo radicular. Metodología: Se obtuvieron cuarenta muestras de pulpa dental humana de terceros molares recién extraídos divididos en dos grupos: desarrollo radicular incompleto (n= 20) y completo (n= 20). Los tejidos se almacenaron a -80 ° C, se descongelaron en un baño frío y se volvieron a congelar con sus respectivos deshielos para desintegrar el tejido. Se realizaron tres ciclos de sonicación hasta que las muestras se homogeneizaron, luego se centrifugaron y se recogió el sobrenadante para la detección de los marcadores a estudiar. Las muestras se procesaron para la prueba ELISA utilizando el principio ELISA-sandwich. Para cada proteína analizada, se calculó la media, mediana y la desviación estándar para cada grupo. Las pruebas t de Student y U Mann-Whitney se realizaron de acuerdo con su comportamiento paramétrico o no paramétrico. Sumado a lo anterior se ejecutaron coeficientes de correlación de Pearson y Spearman con el grado de desarrollo radicular. Resultado: En dientes con desarrollo radicular completo las expresiones HIF-1α, ANG-1, ANG-2 y TIE-2 fueron más altas y estadísticamente significativas, comparadas con su expresión en el grupo de desarrollo radicular incompleto. Hay un fuerte grado de correlación positiva entre los estadios Nolla y ANG-1, HIF-1α y TIE-2; mientras que la relación con ANG-2 fue moderada. Conclusión: Se encontró un aumento significativo en la expresión de ANG-1, HIF-1α y TIE-2 en dientes con desarrollo radicular completo; sumado a lo anterior hay una correlación fuerte positiva entre estos factores y el desarrollo radicular. Palabras clave: Angiogénesis, pulpa dental humana, HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2.

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La pulpa dental (PD) es un tejido altamente inervado e irrigado y es por esta razón que depende de procesos propios vasculares para su homeostasis o respuesta ante una agresión patológica (1). Hay dos procesos esenciales propios de los vasos sanguíneos, que ocurren durante la formación dental: vasculogénesis y angiogénesis (2). La vasculogénesis es responsable del suministro nutricional al germen dental. Es definida como la creación de un plexo vascular primario en la etapa embrionaria, gracias a la intervención de células precursoras endoteliales, que migraron del mesodermo e invadieron la papila dental en el estadio de campana; bajo condiciones mínimas de oxígeno. El otro mecanismo es la angiogénesis que consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes (3). El proceso de angiogénesis involucra una serie de mecanismos propios de células endoteliales, que van desde la degradación de la membrana basal, la proliferación celular, migración dentro del estroma y formación de brotes tubulares, originando una neovascularización (2). Se puede dar durante el proceso de desarrollo coronal y radicular o posterior a este, como respuesta ante diversos tipos de injuria (4). Durante el proceso de odontogénesis se observa una amplia red vascular en la zona odontogénica que conforma el complejo dentinopulpar (5). Desde un punto de vista fisiológico; en este momento, la angiogénesis puede ser explicada porque el proceso de formación y mineralización de la dentina es muy complejo y para culminar la formación radicular, se requiere que los vasos sanguíneos aumenten, y así suplir la demanda funcional de los odontoblastos y fibroblastos (6). Previo a la formación de la dentina, los capilares presentes se caracterizan por ser una red vascular de aumentado grosor, ubicada bajo la capa odontoblástica. Al iniciar la aposición de dentina, los capilares invaden esta capa ubicándose cerca de la predentina donde forman una red vascular de nuevos capilares fenestrados. La actividad de estos capilares es dependiente de la demanda funcional; por consiguiente parece disminuir al concluir el proceso de formación dental (6). No obstante, los procesos angiogénicos no cesan, puesto que tras concluir la formación radicular y ante injurias de diverso tipo, la PD puede entrar en hipoxia (7) y además como respuesta a una agresión se generan variantes de dentina reparativa (8). El inicio de la angiogénesis puede desencadenarse por dos vías: una vía directa que es producto del balance de factores de crecimiento, citoquinas y metaloproteinasas (MMP), factores de transcripción, moléculas de adhesión, componentes propios de la matriz extracelular y moléculas inhibitorias. De acuerdo a numerosos estudios los factores de crecimiento presentes son:

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factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante Beta (TGF-β), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor de crecimiento placentario (PIGF), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF 1 y 2), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento insulínico (IGF) (9). Los factores de crecimiento pueden provenir del escaso suministro sanguíneo presente o de la matriz de dentina y son liberados cuando metabólicamente se requiera, por medio de estimulación bioquímica (10). La segunda vía corresponde a factores propios angiogénicos que estimulan este proceso y que son denominados angiopoyetinas; dentro de ellas ANG-1, ANG-2 y su receptor TIE-2. Adicionalmente se encuentra el factor inducible de hipoxia (HIF-1); el cual es un activador transcripcional altamente sensible al oxígeno, que actúa en sinergia con otros factores angiogénicos, incluidas las angiopoyetinas y los factores de crecimiento VEGF, TGF-β y PlGF, participando en la formación de la vasculatura (11). El común denominador de las dos vías es la presencia de hipoxia y la acción de VEGF, con el incremento de la permeabilidad vascular (12). La reducción en el flujo de oxígeno induce a células, que incluso no son vasculares, como fibroblastos y odontoblastos, a la liberación de moléculas que intervienen en procesos angiogénicos, intentando conservar la homeostasis. Cuando se logra, las células se retroalimentan de los niveles de oxígeno presentes en el ambiente y su posibilidad de difusión, cesando sustancialmente la liberación de factores angiogénicos (13). Estas células hipóxicas también ejercen acción directa sobre células endoteliales para incrementar los vasos sanguíneos y de esta manera alcanzar la normoxia necesaria para continuar con todas las actividades celulares (14). Los procesos de hipoxia son comunes ante estados patológicos producto de la inflamación, propia de los tejidos pulpares o periapicales (15). No obstante, también es normal en el proceso de desarrollo radicular, debido a que hay un aumento en los requerimientos metabólicos para generar tejido mineralizado y completar la formación dental (13). Hay dos investigaciones que han abordado el estudio diferencial de los factores angiogénicos entre dientes con desarrollo radicular completo e incompleto, utilizando el mismo modelo experimental in-vivo en terceros molares. El primero elaborado por Friedlander y cols (2018), en el cual mediante inmunohistoquímica determinó que hay una mayor microdensidad de vasos sanguíneos y expresión de VEGF/VEGFR2 en la PD de dientes inmaduros (16). El otro estudio realizado por Gómez-Sosa y cols (2019), en el cual se efectuó PCR; encontró que en los dientes con cierre apical, la expresión del VEGFA fue mayor; por otro lado en los dientes sin cierre apical, la expresión del TGF-βR1 lo fue, siendo ambas estadísticamente significativas (17). No hay un parámetro que dicte qué cantidades de angiopoyetinas y HIF son normales dentro de un tejido, justificado en que sus niveles son oscilatorios y

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no dependen únicamente de la demanda funcional; sino también de otros factores como la presencia de algún ente agresor, que desencadene un proceso inflamatorio o que el tejido esté generando un proceso neoplásico (18). El estado del arte muestra que las investigaciones se han centrado en entender su comportamiento. El campo de regeneración e investigación de células pluripotenciales derivadas de la PD ha ido en aumento y la angiogénesis es una opción terapéutica que no solamente permite estrategias de revascularización (19), sino de diferenciación de estas células (20), ya que se puede intervenir en el mantenimiento de las mismas, conservando los niveles de oxígeno y el suministro de nutrientes. En este caso, la angiogénesis en la PD depende de la interacción entre células madre y las células endoteliales, manteniendo unas condiciones ideales para su supervivencia. Pero para las dos alternativas de tratamiento la respuesta puede variar dependiendo si es un diente inmaduro o no (21). La gran mayoria de estudios que se han realizado en relación a la función de los factores angiogénicos, objeto de nuestra investigación, han sido in-vitro mediante cultivos celulares; lo cual tiene una gran limitante y es que no permite conocer el actuar de los mismos en dientes expuestos a las condiciones que se presentan en cavidad oral. El conocimiento acerca de la vía directa de la angiogénesis está en aumento debido a su importancia en terapia regenerativa o de conservación de la vitalidad pulpar; empero la literatura no muestra muchas investigaciones realizadas sobre las moléculas que participan en la vía indirecta. Es por esto que se debe incrementar el conocimiento en cuanto a esta vía y por consiguiente la pregunta de investigación planteada es ¿Cuales son los niveles de ANG-1, ANG-2, HIF-1α TIE-2 en la pulpa dental de terceros molares con completo e incompleto desarrollo radicular?

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2. JUSTIFICACIÓN

Los estados de hipoxia y normoxia son comunes a procesos fisiológicos y patológicos presentes en el organismo (22). Pueden iniciarse como consecuencia de enfermedades sistémicas, entre ellas: cáncer, cardiopatías isquémicas, arteriopatías periféricas y enfermedades oculares; o en el campo odontológico, enfermedades orales como: pulpitis y periodontitis (23). Desde una perspectiva fisiológica, puede desencadenarse como resultado del proceso de formación radicular. En este caso, por funciones metabólicas (24), la oxigenación presente debe incrementarse de forma considerable, puesto que se están originando tejidos mineralizados. Cuando el diente esta completamente formado, la demanda de oxígeno responde simplemente a la preparación ante una posible injuria. Esta demanda por tanto, es proporcional a la vascularización presente (25). La mayoría de las respuestas tisulares en el organismo están relacionadas con el oxígeno y por ende la expresión de factores transcripcionales sensibles a este, inducen expresión de numerosos genes angiogénicos, metabólicos y propios del control del ciclo celular (26). Las vías proangiogénicas sirven como intermediarias en el funcionamiento de estructuras endoteliales, estromales y vasculares importantes. Estas vías se han estudiado ampliamente en relación a factores de crecimiento, específicamente VEGF, IGF y TGF-β; es decir por la vía directa pero escasamente se han abordado en la vía indirecta con relación a ANG-1, ANG-2, TIE-2 y HIF-1α, aún conociendo su relación con el VEGF (27,28). Para comprender que ocurre en esta vía complementaria, se debe conocer cómo es el comportamiento de estos factores en condiciones homeostáticas; por ejemplo, el desarrollo radicular; en donde el desequilibrio no es producto de un estímulo nocivo. La angiogénesis en la PD es un proceso único, dado que este tejido tiene características particulares; como el hecho de estar rodeado de esmalte, dentina y cemento, que son tejidos mineralizados y que limitan la inflamación (29). Adicionalmente debe considerarse que los procesos de vascularización son heterogéneos en dientes con desarrollo radicular completo e incompleto; asumiendo que el suministro sanguíneo, oxigenación resultante y demanda energética, es mayor en dientes con ápice abierto en comparación con los que superaron esta etapa; justificado en que deben culminar la mineralización (13). Dadas estas condiciones el abordaje terapéutico relacionado con ingeniería tisular debería ser distinto y selectivo, de acuerdo al grado de cierre apical. Estudios previos han descubierto que hay un diferencial entre los niveles de oxígeno y los factores de crecimiento presentes en estos dientes (17,30,31); no obstante, no se han cuantificado los niveles de ANG-1, ANG-2, HIF-1α y TIE-2 en salud.

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Descifrar esto puede ser de gran utilidad en el campo de la ingeniería tisular ya que se conocería el comportamiento de la PD desde el punto de vista fisiopatológico estimulado por las dos vías de angiogénesis directa e indirecta. Las injurias a las cuales se enfrenta el tejido pulpar son de diferente naturaleza. En su gran mayoría, producen corte en el suministro sanguíneo que conlleva a hipoxia y finalmente a necrosis pulpar (32). El objetivo primario de un tratamiento endodóntico es conservar la vitalidad del diente; y si esto no es posible, extirpar el tejido pulpar necrótico y llenar la cavidad de un material biocompatible, el cual carece de las funciones inductora, formativa, protectora, nutritiva y reparativa del tejido que lo precedía (33). A nivel celular, la respuesta al escaso oxigeno presente, no conlleva únicamente a la apoptosis. Al contrario, puede estimular un potencial de proliferación y diferenciación celular, intentando recuperar el tejido perdido (34). La capacidad reparativa de la PD varia dependiendo del grado de formación radicular y consecuentemente también lo hará la capacidad de respuesta a través de mecanismos angiogénicos (35). Ampliar la comprensión de los mismos puede contribuir a las terapias de conservación de la vitalidad pulpar, después de un proceso inflamatorio estimulando el aumento de la vasculatura presente y por consiguiente aumentando el suministro de oxígeno; siempre y cuando, la naturaleza del daño sea reversible (36). Otra de las posibles contribuciones del estudio seria mejorar el conocimiento investigativo realizado con células pluripotenciales presentes en la PD; en donde se ha comprobado que la inducción de hipoxia estimula el potencial regenerativo y de diferenciación de las mismas. En conclusión, se puede considerar, el primer eslabón para futuras investigaciones que lleven a tratamientos menos radicales, que pretendan preservar la naturaleza de este tejido (37).

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3. MARCO TEÓRICO

3.1. Desarrollo de la raíz dental

El proceso de odontogénesis involucra diferentes estadios: brote o yema casquete, campana, corona, posterior desarrollo radicular y erupción del diente (38). Este órgano se forma a partir del epitelio dental y el mesénquima derivado de la cresta neural y la interacción entre estos dos tejidos es de vital importancia para la formación dental (39). El inicio de la odontogénesis ocurre cuando el epitelio dental se invagina en el mesénquima que lo rodea para producir el brote dental (40). Cuando la formación de la corona está casi completa, la raíz del diente comienza a desarrollarse. En la formación radicular intervienen tres tipos de células las pertenecientes a la papila dental, el folículo dental y son ayudadas por una doble capa epitelial llamada vaina epitelial radicular de Hertwig (VERH) (41). La vaina epitelial radicular de Herwig (VERH) se ubica en la porción cervical del diente y crece en dirección apical; es decir que se encuentra entre la papila y el folículo dental (42). La capa epitelial interna de la vaina y la membrana basal epitelial son inducidas a convertirse en odontoblastos y posteriormente formar la dentina. Cuando concluye la formación de la dentina radicular, la vaina que envuelve la raíz del diente se perfora, permitiendo que las células del folículo dental entren en contacto con la dentina de la raíz. Estas células posteriormente se diferenciarán en cementoblastos, que son los encargados de la formación de cemento (43). La actividad celular en la zona responde al incremento en la laminina 5, secretada por la VERH, que induce la adhesión celular, migración y diferenciación de células de la papila dental. Esta también secreta TGF-β el cual induce la formación de odontoblastos. Por su parte, en el cemento, la actividad se inicia cuando las células epiteliales de VERH y células mesenquimales del folículo dental están en proximidad. En la región apical la VERH se invagina en el cemento celular y expresa fosfatasa alcalina (44). La dentina radicular está compuesta por odontoblastos, que se han diferenciado de las células de la papila dental; por otra parte el cemento está formado principalmente por cementoblastos, que se han diferenciado de las células del folículo dental. Moléculas como TGF-β, IGF y FGF contribuyen a la diferenciación terminal de odontoblastos y cementoblastos; cuando el proceso eruptivo inicia y por tanto el proceso de desarrollo radicular está a punto de concluir (45). Durante el desarrollo radicular, los tejidos que componen la raíz, están en un estado de normoxia relativa, dependiente de la demanda funcional; caso contrario ocurre cuando el cierre apical inicia y está por finalizar la formación radicular. Por la inducción del proceso de mineralización, hay una alta demanda de oxígeno y como mecanismo compensatorio el organismo tiende a

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producir más vasos sanguíneos derivados de la vasculatura presente del diente en formación (25).

3.2. Vasculogénesis en la pulpa dental

Los vasos sanguíneos pueden originarse a partir de dos procesos distintos: vasculogénesis y angiogénesis (46). En la vasculogénesis, la diferenciación de células endoteliales se produce a partir de células precursoras mesodérmicas (Angioblastos) (47). Mientras que en la angiogénesis se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes (48). La vasculogénesis ocurre durante el desarrollo embrionario y conduce a la formación del plexo vascular primario. Estos canales endoteliales se desarrollan aún más, formando un sistema más complejo y ramificando en vasos cada vez más grandes (46). En el proceso de desarrollo dental, la vascularización del germen dental se produce por vasculogénesis. Diferentes estudios han mostrado que precursores de células endoteliales derivadas del mesodermo, invaden la papila en formación en el estadio de campana temprana y forman estructuras vasculares primarias. En esta etapa los vasos sanguíneos se agrupan y se disponen de acuerdo a la forma de las raíces (49). En este momento la papila dental es de un tamaño mayor a 200 µm, la difusión de oxígeno está limitada a una distancia de a 100 y 200 µm; por tanto requiere más vasos sanguíneos capaces de asegurar que las células reciban oxígeno a esa distancia (13). Modelos in-vitro han comprobado que las células que se encuentran a una mayor distancia están en un estado de hipoxia y como resultado de la misma, secretan factores proangiogénicos, que actúan sobre las células endoteliales vecinas para inducir la angiogénesis o estimulan la llegada de precursores de células endoteliales en la papila dental durante el desarrollo dental (32). Los vasos sanguíneos de la PD, se caracterizan por presentar paredes delgadas, ya que están protegidos por una funda de dentina dura e inflexible. Una o más arteriolas de pequeño calibre entran en la pulpa a través del foramen apical y atraviesan la pulpa del conducto radicular. Una vez, en la cámara pulpar, se ramifican periféricamente para formar una densa red de capilares debajo de la capa odontoblástica. Los capilares presentan múltiples perforaciones, lo que es un indicio de la actividad metabólica de la capa. Las vénulas pequeñas drenan el lecho capilar y finalmente salen como venas a través del foramen apical (50). El flujo sanguíneo es diferente en la PD comparada con otras partes del cuerpo, debido a que el suministro sanguíneo es más rápido y la presión arterial es muy elevada.

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3.3. Histología de un diente con formación radicular incompleta

Como el desarrollo radicular no ha concluido, células pertenecientes a la papila dental, aún rodean el ápice del diente. Estas células tienen un potencial de diferenciación multinaje y sumado a esto una alta tasa de crecimiento (51). Histológicamente los tejidos que componen los dientes permanentes inmaduros son: una zona rica en células, restos de la papila y folículo dental en apical, y finalmente el ligamento periodontal. La zona apical rica en células es una delgada banda que conforma una especie de capuchón, el cual se prolonga a través del ápice en vías de cierre y separa la pulpa radicular madura e inmadura. Se caracteriza porque contiene pequeños vasos sanguíneos, células en proliferación y fibroblastos. Su papel en la angiogénesis aún se encuentra en estudio (52). La papila dental en apical, es un tejido adherido a la raíz en formación; contiene células inmaduras y fibroblastos (53). Estas células presentan una alta actividad proliferativa incluso mayor que las DPSC (Células madre de la pulpa dental) y también una alta supervivencia a trauma (54).

3.4. Histología de un diente con formación radicular completa

La PD ya madura, es un tejido conectivo laxo especializado, que contiene células, fibras, sustancia fundamental, vasos sanguíneos y terminaciones nerviosas. Está encerrado dentro de las paredes rígidas de dentina y junto a esta, forma un conjunto embrionario y funcional conocido como complejo dentinopulpar (55). El tejido pulpar tiene varias funciones que incluyen iniciación, formación, protección, nutrición, reparación y promoción de la vitalidad dental. En condiciones normales se encuentra permanentemente sometido a estrés mecánico durante la masticación (56). A nivel histológico, se pueden distinguir cuatro zonas distintas en la PD: la zona odontoblástica, localizada en la periferia de la pulpa, seguida de una zona libre de células, ubicada debajo de los odontoblastos; una zona rica en células, ya en el área ocupada por el tejido pulpar y por último el núcleo de la pulpa, donde hay una mayor cantidad de vasos sanguíneos y nervios (57). Aunque los fibroblastos son el grupo celular más predominante en la PD, también se pueden observar otros tipos de células, como son odontoblastos, células sanguíneas, células de Schwann, células endoteliales y células mesenquimales indiferenciadas (58). En adición a lo anterior, durante los episodios inflamatorios también se pueden encontrar células y componentes propios de la respuesta inmune como macrófagos, mastocitos, células presentadoras de antígenos y proteínas plasmáticas (59).

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El colágeno y las fibras reticulares forman parte de la matriz extracelular de la PD humana y desempeñan un papel importante en el soporte del tejido. El colágeno tipo I es el componente principal de la fibra, pero los tipos III, V y VI también representan una parte significativa de la matriz extracelular pulpar (60). Los elementos celulares y fibrilares de la PD están rodeados por una sustancia gelatinosa que tiene un gran contenido de agua y numerosos glicosaminoglicanos, glucoproteínas y proteoglicanos. Esta sustancia gelatinosa actúa como una barrera contra la invasión bacteriana; que consiste en un elemento de defensa no específico. Además, las células interactúan constantemente con la matriz extracelular. Esta a su vez, tiene una función muy significativa, ya que forma un sustrato que proporciona las condiciones adecuadas para el crecimiento y la diferenciación de las células de los diversos tejidos (61).

3.5. Angiogénesis

La PD desafortunadamente presenta una limitada capacidad inflamatoria, al estar rodeada por tejidos mineralizados. Ante un estimulo nocivo, se incrementa la presión, provoca edema y puede generar inflamación y dolor. La dentina y pulpa pueden inducir la liberación de factores de crecimiento implicados en la angiogénesis como respuesta reparativa, entre ellos VEGF y TGF-β (62). Los nuevos vasos capilares se forman a través de la angiogénesis por la división de los vasos precursores originales. La angiogénesis es parte de un proceso natural esencial para una gran cantidad de procesos fisiológicos entre ellos el embarazo, embriogenésis, ovulación y reparación de heridas; o patológicos como artritis, retinopatía diabética y desarrollo de tumores. En muchas enfermedades importantes, el cuerpo pierde el control sobre la angiogénesis; lo que resulta en un desarrollo excesivo de vasos sanguíneos, como se observa en la retinopatía del prematuro, cáncer y psoriasis (18). Los primeros pasos de la angiogénesis son la vasodilatación y el aumento de la permeabilidad capilar, lo cual posibilita el transporte de proteínas plasmáticas (Fibrinógeno y plasminógeno) desde el lúmen hasta la periferia vascular. Las células endoteliales proliferan y migran por la influencia de factores angiogénicos. Estas nuevas células endoteliales conforman túbulos y se fijan firmemente a la matriz extracelular que los rodea (22). Múltiples moléculas regulan estos procesos, entre ellos factores angiogénicos y angiostáticos que permiten una homeostasis (18). Se han identificado numerosos inductores angiogénicos. De estos el VEGF es considerado por muchos como una molécula reguladora maestra para los procesos relacionados con la angiogénesis (18). Este, y las angiopoyetinas, las cuales inducen la proliferación, migración y diferenciación de células endoteliales, son los partícipes de la vía indirecta. El VEGF se potencializa

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mediante la síntesis y liberación de monóxido de nitrógeno y prostaciclina, induciendo una mejora en la permeabilidad vascular.

3.6. Factores angiogénicos

• Angiopoyetinas 1, 2 y receptor TIE-2: De la familia de las angiopoyetinas se han descubierto 4 moléculas (ANG-1, 2, 3 y 4). De estas las más importantes son ANG-1 y ANG-2, cuya actividad está relacionada con el receptor TIE-2 (63). Algunas de las funciones inherentes a estas dos angiopoyetinas y su sitio de unión, se resumen en los cuadros No 1 y 2: Tabla No 1: Funciones de las angiopoyetinas 1 y 2.

ANGIOPOYETINA CÉLULAS QUE LA EXPRESAN

FUNCIONES

ANG-1 Expresada en células perivasculares (Células endoteliales, pericitos, células del músculo liso, fibroblastos y células tumorales).

Agonista angiogénico importante para la remodelación y maduración de los vasos inmaduros. Se une a TIE-2 como agonista para continuar con la homeostasis vascular. Tiene un efecto protector y antiinflamatorio en el endotelio; además actúa como regulador de VEGF y la permeabilidad vascular, por consiguiente tiene funciones inhibitorias (64–68).

ANG-2 Se expresa en células endoteliales ubicadas en el borde de los vasos sanguíneos en proliferación, y se almacenan en los cuerpos de Weibel-Palade.

Homólogo a ANG-1. Tiene el potencial de activar o antagonizar TIE-2 en diferentes circunstancias y comportarse como un agonista parcial. Regulador dinámico autocrino del eje ANG-1/TIE-2. Puede estar involucrado en proporcionar la señal inicial para la remodelación angiogénica, permitiendo que el endotelio vuelva a un estado moldeable, característico de las primeras fases. En contraste con ANG-1, ANG-2 es proinflamatorio e induce la permeabilidad endotelial.

La función de ANG-2 puede ser específica para el lecho vascular y el órgano, pero los mecanismos moleculares no se han descubierto. La expresión de ANG-2 está influenciada por factores de crecimiento, como VEGF, bFGF, y por factores ambientales como la hipoxia. En presencia de VEGF, ANG-2 induce la migración de células endoteliales, adicionalmente proliferación y aumento en el diámetro capilar. En ausencia de VEGF, ANG-2 induce apoptosis de células endoteliales y regresión vascular (65,69–76).

Tabla No 2: Funciones del receptor TIE-2.

RECEPTOR CÉLULAS QUE LO EXPRESAN

FUNCIONES

TIE-2 Es un receptor de fosfotirosina quinasa que se expresa en el endotelio vascular, Funciona principalmente como receptor de ANG-1

Se ha demostrado que los vasos sanguíneos más grandes tienen mayor cantidad de TIE-2 en comparación con los pequeños. Es un receptor tanto para ANG-1 como para ANG-2. La unión de ANG-1 regula la autofosforilación del receptor y promueve la migración y la supervivencia de las células endoteliales. También este funciona en la señalización que controla la formación, remodelación, organización y formación de redes reticulares complejas. En el caso de ANG-2, se requiere la presencia de VEGF, para el inicio y la estabilización de la angiogénesis (71,73,77–80).

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• Factor inducible por la hipoxia (HIF-1): Se define como un factor de transcripción o complejo proteico que aumenta la expresión de genes específicos en presencia de bajas concentraciones de oxígeno (81). Está altamente relacionado con la regulación del gen que codifica a la eritropoyetina (EPO) (74). En condiciones hipóxicas se activan genes en el núcleo celular, el HIF aumenta, incrementa el oxígeno y hay activación de iNOS (Óxido nítrico sintasa inducible) para posteriormente suprimir el HIF (82). Cuando esto sucede se activan genes proangiogénicos, entre ellos VEGF, ANG-1, ANG-2, TIE-2, PDGF, bFGF como también MCP-1 (Proteína quimiotáctica de monocitos) (83). La regulación de este factor se da por enzimas prolil-hidrolasa (PHD), las cuales intervienen en las subunidades α sensibles al oxígeno, que activan la degradación proteosomal y previene la activación de la vía HIF. En normoxia, la hidroxilación de dos residuos de prolina y la acetilación de un residuo de lisina en el dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODDD), lleva a procesos que traen como consecuencia la degradación de HIF-1α, a través de la vía de la ubiquitina-proteasoma (84). En hipoxia, el HIF-1α se vuelve estable e interactúa con coactivadores, que regulan la expresión de los genes diana (85). Otras de las funciones del HIF-1α se observan en la tabla No 3: Tabla No 3: Funciones del Factor inductor de hipoxia (HIF)

FACTOR DE TRANSCRIPCION

TIPOS FUNCIONES

HIF HIF-1 Y 2 La regulación de los factores de transcripción se origina por vía hidroxilación enzimática. Hay cambios que impulsan la expresión de genes adaptativos a medios hipóxicos. Genera la expresión de genes glicolíticos que producen energía en niveles bajos de oxígeno, donde no se puede realizar fosforilación oxidativa en las mitocondrias. Induce también piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (PDK1) permitiendo la actividad mitocondrial. El bloqueo de la actividad de oxígeno produce mayor disponibilidad de este, lo cual se refleja en la reducción de la muerte celular (86–91).

3.7. Estados de normoxia e hipoxia:

En homeostasis, la PD cursa por un estado de normoxia, capaz de permitir las demandas funcionales y metabólicas de las células que la componen. Los momentos de hipoxia se desarrollan ante un incremento de la demanda funcional o respuesta ante una injuria (57). A nivel pulpar, estados hipóxicos son característicos cuando se eleva la presión pulpar o se desarrollan procesos inflamatorios de diferente frecuencia y duración, y adicionalmente de diversa etiología como caries, trauma dentoalveolar, trauma oclusal y movimientos ortodónticos (92). A nivel celular, la hipoxia grave y por periodos de tiempo prolongados puede llevar a la detención del ciclo celular y la apoptosis (93). Una célula expuesta a bajas concentraciones de oxígeno adapta su metabolismo (94); medio por el cual

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consigue energía, modulando la adenosina monofosfato activada e induciendo también proliferación de células madre (95). Si las células y tejidos resisten bajas concentraciones de oxígeno, se conduce a la inducción transcripcional de genes que participan en la angiogénesis, el metabolismo del hierro y la glucosa, como también inductores de la proliferación y supervivencia celular. El factor primario que media esta respuesta es el HIF-1 (57).

3.8. Vías de angiogénesis

• Vía directa: La importancia de los factores de crecimiento en la mediación de las respuestas a requerimientos fisiológicos o patológicos del complejo dentinopulpar, da origen a la vía directa, a través de la cual se origina la angiogénesis (96). El VEGF, es esencial en las dos vías angiogénicas. La totalidad de subtipos de este factor se han encontrado en pulpa y ligamento periodontal (97). Este es reconocido por ser un activador de la permeabilidad vascular e iniciar la proliferación celular, actividad mitótica de células endoteliales, migración celular, brote de células endoteliales y supervivencia de las mismas. Es un factor que se une a receptores de tirosina kinasa como VEGFR-1 y VEGFR-2 que controlan el proceso angiogénico, en presencia de HIF (98). De igual manera, varios factores angiogénicos, como el PDGF contribuyen en proliferación de monocitos, que secretan mitógenos endoteliales; y en la formación de brotes; resultado del cambio de fenotipo de las células endoteliales (99). El FGF por su parte, actúa como un agente paracrino, ejecutando una regulación positiva para diferenciación y proliferación de células endoteliales. Mientras que el TGF-β tiene como función modular la angiogénesis, induciendo apoptosis en el mismo tipo de células (100). • Vía indirecta: En el caso de la PD, la angiogénesis ha sido descrita ampliamente en la literatura. La vía directa con la participación de factores de crecimiento ha sido entendida, pero poco se conoce de la función de HIF-1α, las ANG-1, ANG-2 y TIE-2. Las células que sufren hipoxia expresan HIF-1, el cual es una proteína de señalización que regula el equilibrio del oxígeno e induce la angiogénesis en los tejidos del organismo; desempeña un papel fundamental en procesos de reparación y cicatrización (101). Al liberarse el HIF-1, el proceso angiogénico podría iniciarse por vía directa por medio los numerosos factores de crecimiento o por vía indirecta mediante la interacción de VEGF, ANG-1,2/TIE-2, la cual es más larga (102)

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El mecanismo de inicio de la angiogénesis mediado por ANG-1,2/TIE-2 consiste en que en condiciones de normoxia, hay estabilidad vascular en los vasos sanguíneos que es producto de la unión del receptor TIE-2 al ligando ANG-1 (57). Mientras este complejo ANG-1/TIE-2 se mantenga unido, se inducirá la asociación entre pericitos y células endoteliales que inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos; el cual es un proceso angiostático. Pero durante la hipoxia, ANG-2 se une a TIE-2. El complejo ANG-2/TIE2 inhibe la fosforilación de TIE-2, incluso en presencia de ANG-1 (103). Esta acción conduce a la desestabilización de los vasos sanguíneos, y en presencia de VEGF promueve la migración y la proliferación de células endoteliales que inician la angiogénesis (32,69,104). La figura No 1 muestra un esquema de las vías angiogénicas. Figura No 1: Vías directa e indirecta de la angiogénesis. Adaptado de: Goldberg M. The Dental Pulp. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2014 [Cited 2019 Jun 25]. 61-71 p.

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4. ESTADO DEL ARTE

Son pocos los estudios que han intentado dilucidar la relación entre la presencia de factores angiogénicos y el desarrollo radicular. Escasos reportes han cuantificado estos factores en la PD. La complejidad en la realización de las investigaciones radica, en primer lugar, en el modelo utilizado para realizarlas, y en segundo lugar, la dificultad asociada a la variabilidad de estos factores, tanto en condiciones normales, como patológicas. La mayoría de los estudios centran su atención en células pluripotenciales de origen pulpar y su papel en medios angiogénicos a través de estudios in-vitro. Por otra parte, y en menor número hacen énfasis en la vía mediada por los factores de crecimiento. No obstante, los restantes ligan la función de las angiopoyetinas con el VEGF (105). Respecto a vía directa, el factor de crecimiento mas estudiado con el modelo de terceros molares propuesto ha sido IGF-1. Con relación a este, se puede mencionar un estudio realizado en nuestro país, por Caviedes-Bucheli y cols (2007), en donde se utilizó radioinmunoensayo para evaluar si hay diferencias en la expresión de esta sustancia en terceros molares con desarrollo radicular completo e incompleto. Se utilizaron en total 26 muestras; 13 dientes para cada grupo. Los resultados mostraron que el promedio de IGF-1 para dientes sin cierre apical es 11.18 ng/g, en cambio para los dientes con cierre apical, la media fue 1950.73 ng/g. Mostrando una mayor cantidad de IGF-1, en dientes con desarrollo radicular completo; siendo de relevancia estadística, por tanto se puede sugerir un rol de este factor de crecimiento en la maduración y conservación de la homeostasis de tejidos maduros (106). Otro ejemplo a considerar, también fue elaborado por Caviedes-Bucheli y cols (2009). Donde no solo evaluó la expresión de IGF-1, sino también de antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA) utilizando el mismo tipo de dientes e igual tamaño de muestra. En este caso, los promedios por análisis de inmunocontenido para IGF-1 fueron de 3501.97 y 4694.88 µ² y de PCNA fue de 2912.09 y 3808.92 µ² en dientes con incompleto y completo desarrollo radicular respectivamente. Por lo anterior, se puede afirmar que el rol de estas sustancias es de suma importancia para la proliferación y diferenciación de las células pulpares ya maduras, al igual que en la mineralización de los tejidos dentales duros. Por consiguiente, su baja proporción en desarrollo radicular incompleto puede indicar un número considerable de células que continúan en proceso de diferenciación, bajo un adecuado suministro sanguíneo y por ende, este factor no es dependiente del desarrollo radicular en que se encuentre el diente (107). En relación a los factores restantes Tran-Huan y cols (2018) en Francia, mediante un estudio in-vitro cuantificaron VEGF, PDGF y FGF; los cuales eran

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liberados por células de la PD humana lesionadas mecánicamente y también mediante una sustancia nociva como 2-hidroxietil metacrilato (HEMA). Las células pulpares se obtuvieron de terceros molares explantados y fueron cultivadas y sometidas a injuria mecánica y concentraciones diferentes de HEMA. Al final de estudio se mostró que las células secretaron niveles significativos de PDGF-AB, VEGF y FGF-2. Con estos resultados, podemos considerar que hay potencial reparativo latente de las células pulpares maduras ante un estimulo; además de observar que la actividad angiogénica, no solo es propia de células endoteliales, sino que otro tipo de células también lo pueden hacer (108). Respecto al rol de VEGF, es propio citar una investigación realizada en Nueva Zelanda, por Friedlander y cols (2018); que tuvo como objetivo examinar la densidad de la microvasculatura, distribución de células endoteliales y actividad angiogénica empleando el modelo de terceros molares con desarrollo radicular diferencial. Ellos emplearon marcadores de células endoteliales anti-CD34 y anti-CD146, al igual que marcador para VEGF y su receptor, que fueron estudiados a través de microscopía óptica. Se encontró que las pulpas de dientes inmaduros eran más vasculares, pues poseían mayor cantidad de células CD34 y CD146. Del mismo modo, se halló una mayor cantidad de vasos sanguíneos. El mayor número de estos se encontraba en el tercio coronal; mientras que en la porción apical, el número disminuía considerablemente. En relación a la actividad de VEGF fue expresado en mayor cantidad en zonas de la papila y pulpa de dientes con ápice abierto. La anterior afirmación, nos lleva a concluir que hay actividad angiogénica permanente en toda la pulpa, aunque esta puede diferir por el avance de la formación radicular (30). Otro estudio proveniente de la misma universidad, elaborado por Al-Hassiny y cols (2019), consideró evaluar la expresión génica del VEGF con las ANG-1 y 2 en tejidos pulpares sanos o con diagnóstico de pulpitis reversible. Esta investigación empleó pruebas de inmunohistoquímica y PCR; encontrando que el porcentaje medio de expresión fue: 53% para VEGF, 80% para ANG-1 y 67% para ANG-2, en células no endoteliales pertenecientes a pulpas con algún grado de inflamación. En contraste para pulpas sanas arrojó una expresión de 46% para VEGF, 71% para ANG-1 y 61% para ANG-2. La expresión de estos fue superior en células endoteliales. De las evidencias anteriores, se puede afirmar que hay una sinergia entre VEGF y las angiopoyetinas, que modula la angiogénesis. Las cantidades de estas sustancias fueron superiores en pulpa inflamada, comparado con pulpa sana. Igualmente el incremento en la expresión de ARNm y proteínas pertenecientes a los marcadores angiogénicos VEGF y ANG-1 en pulpas con pulpitis reversible fue estadísticamente significativo; para VEGF, lo fue más para células endoteliales; mientras que las angiopoyetinas fueron de relevancia estadística en los dos grupos. Concluyendo que el proceso inflamatorio puede regular la señalización de ANG-1/ANG-2/TIE-2 (109).

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El más reciente estudio que explora el VEGF junto con la expresión de otros factores angiogénicos fue elaborado por Gómez-Sosa y cols (2019). Este consideró el mismo modelo experimental que usa dientes con diferente grado de desarrollo radicular. Empleó 56 dientes, 28 para cada grupo. El propósito de la investigación era medir la expresión de factores de crecimiento angiogénico ANG-2, VEGFA, TGF-β y sus respectivos receptores mediante RT2-PCR. Los resultados difieren entre grupos, puesto que para dientes con desarrollo radicular incompleto se observa una mayor presencia de TGF-βR1. En contraste los dientes con completo desarrollo radicular, la expresión de VEGFA fue mayor. Estos niveles en dientes con desarrollo completo pueden sugerir una mayor actividad celular y la preparación ante posibles injurias; mientras que la actividad de TGF-βR1 en dientes inmaduros puede ser sinónimo de un incremento vascular y en el suministro sanguíneo; dado que requiere una mayor cantidad de sangre (17). Otros estudios han consideraron el uso de células pluripotenciales de la PD y sustentan adicionalmente la implicación de otros factores diferentes a VEGF; entre ellos bFGF, ANG-2. Los anteriores, inducen proliferación y migración de células endoteliales. Por su parte, la angiogenina, la cual es una ribonucleasa, induce formación neovascular en condiciones hipóxicas. Por consiguiente, cabe mencionar una investigación realizada en Brasil, con células madre y fibroblastos de PD humana, expuestos a condiciones hipóxicas experimentales in-vitro. En este se evaluó la expresión de VEGF y bFGF por medio de Western blot, inmunoensayo ligado a enzimas e inmunocitoquímica. Concluyendo que el inducir HIF-1α promueve la expresión de VEGF en los dos tipos de células estudiadas. Aunque, la hipoxia no indujo la expresión de factor de crecimiento bFGF. YC-1, un agente antiangiogénico, inhibió parcialmente el HIF-1α y VEGF en ambos tipos de células. Alrededor de fibroblastos expuestos a hipoxia, se encontró la proliferación y brote de células endoteliales, empero no se presentó en células normóxicas. Por lo anterior, se puede concluir que la hipoxia induce respuestas proangiogénicas complejas y específicas de tipo celular; sumado a esto se destaca su participación activa en procesos de revascularización pulpar (32). Es relevante considerar que los procesos de angiogénesis y vasculogénesis son mediados por neuropéptidos, sumado a los factores de crecimiento. La angiogenina, ANG-2 y la leptina son algunas de las proteínas que intervienen como factores pro y antiangiogénicos, ya que este mecanismo debe mantenerse en equilibrio. Sobre la leptina, es conveniente citar un estudio realizado en Japón, que utilizó modelos animales como mandíbulas de rata. Este descubrió que la leptina; hormona producida por adipocitos, se expresa en ameloblastos, odontoblastos y células de papila dental; algo similar a lo que ocurre con el VEGF. Por tanto, la presencia de leptina sugiere actividad angiogénica. Curiosamente, se observó más células leptina positivas en el tercio coronal de la papila dental, que está más cerca de la capa odontoblástica; en comparación con los tercios medio y apical. Adicionalmente, en la papila dental se encontraron más células endoteliales vasculares positivas alrededor de ameloblastos y odontoblastos que expresan leptina y

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VEGF. Todos estos hallazgos nos muestran que los ameloblastos, odontoblastos y células de la papila dental pueden inducir procesos angiogénicos durante la odontogénesis y dada la evidencia estos se prolongan durante el periodo de supervivencia del diente (110). La angiogénesis puede ser producto de procesos de hipoxia. Estos, pueden considerarse fisiológicos o patológicos y desembocan en la necesidad de incrementar el flujo vascular. Por ende, la actividad angiogénica en el organismo puede ser iniciada por múltiples estímulos, cuya consecuencia inherente sea la disminución en el flujo de oxígeno (111). Hay evidencia que sugiere que la reducción de este gas en el tejido pulpar puede provocarse por acciones tales como trauma oclusal (112) y movimientos ortodónticos (113) . Las fuerzas ortodónticas pueden provocar daño celular, alteraciones circulatorias y cambios vasculares de la PD, que crean un ambiente hipóxico en la misma. Para mantener la homeostasis de la PD, la hipoxia induce inevitablemente una reacción defensiva. Sin embargo, este es un proceso complejo y está regulado por numerosos factores (114). Una publicación realizada por Wei y cols (2015), utilizó un modelo animal experimental de movimiento dental ortodóntico para investigar los efectos de la fuerza mecánica en la expresión de VEGF y HIF-1α en la PD. Para tal fin se realizó un análisis histológico de la PD y las expresiones de las proteínas HIF-1α y VEGF en la PD. Los resultados mostraron que la inflamación y los cambios vasculares ocurrieron en el tejido pulpar en diferentes períodos de tiempo. Además, hubo cambios significativos en la expresión de las proteínas HIF-1α y VEGF bajo fuerza ortodóntica. Después de la aplicación de carga mecánica, la expresión de HIF-1α y VEGF fue marcadamente positiva en los días 1, 3 y 7 y luego de 2 semanas. Finalmente, se debilitó 4 semanas tras la exposición a la fuerza. Por esta razón, se afirma que la expresión de HIF-1α y VEGF se mejoró por la fuerza mecánica. HIF-1α y VEGF pueden desempeñar un rol sustancial en la retención de la homeostasis de la PD durante el movimiento dental ortodóntico (115) . Otros estudios en modelos animales han mostrado que hay una mayor expresión de HIF-1α y VEGF posterior a la aplicación de tracción ortodóntica (116), lo cual también es sinónimo del mantenimiento del equilibrio de los tejidos, posterior a la aplicación de la fuerza. Como lo mostró Derringer y cols (2003) donde mediante un estudio ex-vivo con cultivos de células pulpares, encontró que la angiogénesis se produce como consecuencia de la interacción de múltiples factores de crecimiento liberados después de la aplicación de la fuerza. Todos estos actúan para obtener ese potencial, interactuando entre sí (117). La angiogénesis, vista como resultado del trauma oclusal puede ser explicada debido a la generación de neuropéptidos. El-karim y cols (2009) elaboró una investigación in-vitro con fibroblastos pulpares provenientes de molares sanos, cultivados en una matriz con propiedades angiogénicas estimulados por NPY (Neuropéptido Y), Polipéptido intestinal vasoactivo (VIP), Péptido relacionado

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con el gel de la calcitonina (CGRP) y sustancia P (SP). Lo que evidencia la relación entre la liberación de neuropéptidos y factores angiogénicos. Al respecto un estudio de Caviedes-Bucheli y cols (2011), que utilizó premolares sanos, los cuales iban a ser extraídos por motivos ortodónticos y que experimentalmente fueron sometidos a trauma mediante la colocación de un bloque de resina sobre la superficie oclusal; reportó una expresión de SP 45% mayor en PD y 120% mayor en LP, comparado con los controles sin trauma; encontrándose relevancia estadística. Por lo anterior, se concluye que hay liberación de neuropéptidos como SP, no solo en la PD, sino también en el ligamento periodontal y por ende la liberación de estas sustancias incrementa la actividad angiogénica (118). Su racional biológico se sustenta en que la presencia de cargas oclusales excesivas, supera la capacidad adaptativa de los tejidos periapicales provocando que la PD se inflame de manera localizada. Por las propiedades quimiotácticas de la SP, se activa la zona libre de células en el tejido adyacente a la lesión; el HIF-1α y la expresión de VEGF en células madre y fibroblastos de la PD aumentan, y por lo tanto, la angiogénesis tiene lugar como un medio reparativo, ya que los nuevos vasos controlarán las necesidades metabólicas y de oxigenación de la PD, a través de la mediación del sistema nervioso por la generación de neuropéptidos como SP (119). Para resaltar el papel de los factores de crecimiento sobre el proceso de diferenciación celular, es importante citar un estudio Gharaei y cols (2019) que indaga acerca del perfil angiogénico utilizando células madre de la PD provenientes de terceros molares; exponiendo estas células a biomarcadores angiogénicos específicos de células endoteliales de la vena umbilical humana, mediante un ensayo inmunoenzimático ELISA y PCR. En los resultados, se encontró una gran variedad de factores pro y antiangiogénicos como EGF, inhibidor tisular de proteína 1, inhibidor de activador de plasminógeno, entre otros. La ANG-2 se detectó, pero los niveles fueron escasos (120). Dando soporte a lo anterior, se puede citar una investigación realizada en Turquía por Aksel y cols (2018). Esta tuvo como propósito investigar el potencial de proliferación de células madre de la PD, en un modelo de cultivo tridimensional, usando gel de fibrina como simulación de tejido blando y discos de dentina desmineralizada como matriz de tejido duro. Las células madre fueron insertadas en las matrices junto con VEGF y posteriormente recubiertas con proteína morfogenética ósea (BMP-2). La metodología consistía en la cuantificación de niveles de VEGF y BMP-2 liberados mediante ELISA y la diferenciación angiogénica y odontogénica por PCR-RT. Al final se indicó que las células estudiadas fueron capaces de proliferar y diferenciarse en células con morfología similar a los fibroblastos. Se observó expresión de genes angiogénicos y odontogénicos. Las interacciones presentes mejoraron el potencial angiogénico (121). Otro estudio in-vitro realizado por Ahmed y cols (2016) en Japón con células de cuatro donantes; empleó células pluripotenciales extraídas de terceros molares,

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que fueron cultivadas en ambientes normóxicos e hipóxicos. Las conclusiones observadas afirman que las células hipóxicas eran de tamaño más pequeño y exhibían núcleos más grandes. Las células expuestas a un ambiente con únicamente 5% de oxígeno aumentaron significativamente la tasa de proliferación, la capacidad de migración, la expresión de marcadores de células madre (CXCR4 y G-CSFR) y la expresión de los genes proangiogenicos SOX2, VEGF, NGF y BDNF destacando la respuesta adaptativa de este tipo de células a medios con escasa cantidad de oxigeno (122). En cuanto a la relación entre la hipoxia con el proceso de mineralización de los tejidos es importante destacar un estudio realizado en Corea del Sur por Choi y cols (2014). En este estudio se cultivaron células del folículo dental perteneciente a terceros molares que no habían completado su desarrollo radicular. Por medio de análisis de citometria de flujo e inducción del proceso de mineralización, se demostró que la proteína 1 de cemento (CEMP1) induce un fenotipo cementoblasto en células precursoras de los mismos pertenecientes al ligamento periodontal. El oxígeno es crítico para el desarrollo correcto de muchos tejidos; un ambiente con escasez del mismo, incrementa la expresión de CEMP1 y por consiguiente, la deposición de minerales, actividad de la fosfatasa alcalina en las células madre de la PD, células madre del LP y células del folículo dental. La acción del HIF-1 se interrelacionaba con la expresión y mineralización de CEMP1 y eran directamente proporcionales. En contraste, cuando HIF-1α fue silenciada, la expresión de CEMP1 y la mineralización in-vitro permanecieron estables (123).

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5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general:

Determinar los niveles de los factores angiogénicos ANG-1, ANG-2, HIF-1α y su receptor TIE-2 en terceros molares con desarrollo radicular completo e incompleto.

5.2. Objetivos específicos:

Establecer diferencias en los niveles de ANG-1, ANG-2, HIF-1α y TIE-2 entre dientes con desarrollo radicular completo e incompleto.

Relacionar los niveles de los factores angiogénicos ANG-1, ANG-2, HIF-1α y TIE-2 con el proceso de desarrollo radicular mediante los estadios de Nolla.

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6. METODOLOGÍA

6.1. Enfoque de estudio

Se propuso un enfoque de tipo cuantitativo, puesto que las medidas resultado serán medias o medianas dadas en picomoles por miligramo de tejido pulpar (pmol/mg).

6.2. Tipo de estudio

El tipo de diseño es experimental, ensayo clínico no controlado; justificado en que se intervino a los pacientes realizando la exodoncia respectiva, bajo las condiciones necesarias para mantener el diente viable. Posteriormente extraer la PD y realizar su respectivo análisis. No se realizó aleatorización.

6.3. Área de estudio

Clínica de Pregrado y Posgrado de la Universidad Cooperativa de Colombia- Campus Pasto.

6.4. Población de estudio y muestra

Los pacientes que participaron en el estudio fueron voluntarios, asistentes a la clínica de pregrado y posgrado que requieren la exodoncia del tercer molar por razones ortodónticas. Para estudiar el proceso angiogénico, este diente es el indicado (124). Por estudios previos destacados en el estado del arte y ante la escasez de literatura disponible sobre el tema; el tamaño de la muestra será similar al propuesto por Caviedes-Bucheli y cols (17,125). La muestra esta conformada por 40 dientes, los cuales serán divididos en dos grupos de acuerdo al grado de desarrollo radicular que presentan. Las razones por las cuales se utilizó un tamaño muestral pequeño son: falta de información previa con relación al tema de estudio, desconocimiento de los valores normales de las variables a utilizar (Media y desviación estándar) y limitaciones éticas (126). Cuando se terminó el experimento con la variable que mayor cambio mostró (ANG-1), se calculó el poder estadístico, siendo este de 91.2% y el error estándar de 0.03. En la presente investigación el tipo de muestreo fue: no probabilístico, a conveniencia, que supone un procedimiento de selección informal. La condición que requerían los individuos participantes en el estudio era tener una edad comprendida entre 16 y 24 años y presentar un tercer molar con un grado avanzado de formación radicular, que requiera exodoncia. Lo anterior, se corroboraba mediante la toma de una radiografía periapical y posteriormente se determinaba a qué grupo iba cada paciente. Como la unidad de estudio era el diente, un paciente podía aportar uno o dos especímenes al mismo.

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6.5. Criterios de selección

Criterios de inclusión para pacientes: Individuos sanos entre los 16 y 30 años.

Criterios de exclusión para pacientes:

Pacientes con medicación.

Pacientes fumadores.

Mujeres embarazadas. Criterios de inclusión para dientes: Para dientes con formación radicular incompleta:

Dientes que no estén en oclusión.

Dientes impactados total o parcialmente.

Diámetro apical mayor a 3 e inferior a 7 mm en sentido mesiodistal o bucolingual.

Para dientes con formación radicular completa:

Dientes bajo oclusión.

Diámetro apical no mayor de 0.5 mm. Criterios de exclusión para dientes:

Dientes con caries o restauraciones.

Dientes con antecedentes de inflamación periapical.

Dientes con enfermedad periodontal y pericoronitis.

Dientes que durante el proceso de exodoncia fueron seccionados o sufrieron quemadura durante la osteotomía.

6.6. Operacionalización de variables

Tabla No 4: Variable independiente

VARIABLE VALORES POSIBLES

DEFINICIÓN NIVEL DE MEDICIÓN

MÉTODO DE RECOLECCIÓN

DESARROLLO RADICULAR

1= Incompleto. 2= Completo.

Se define como el grado de cierre apical como consecuencia de la formación radicular.

Categórico dicotómico.

Radiografía periapical.

Tabla No 5: Variables dependientes




ANG-1 Valores a determinar.

Se define como la cantidad de angiopoyetina-1 en picomoles por gramo de tejido pulpar presente en la muestra.

Cuantitativo continuo.

Resultados de laboratorio.

ANG-2 Valores a determinar.

Se define como la cantidad de angiopoyetina-2 en picomoles por gramo de tejido pulpar presente en la muestra.

Cuantitativa continua.


HIF-1α Valores a determinar.

Se define como la cantidad de factor inductor de hipoxia en picomoles por gramo de tejido pulpar presente en la muestra.



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TIE-2 Valores a determinar.

Se define como la cantidad del receptor TIE-2 en picomoles por gramo de tejido pulpar presente en la muestra.



Tabla No 6: Variables sociodemográficas, clínicas y radiográficas




DIENTE 18, 28, 38 y 48. Se define como el código numérico del tercer molar de acuerdo a la nomenclatura internacional.

Categórico Politómico.

Instrumento de recolección de

datos.

EDAD 16 a 30 años. Se define como la edad en años cumplidos cuando se diligencia la historia clínica.

Cuantitativa discreta.


datos.

SEXO 1= Femenino. 2= Masculino.

Se define como el sexo que reporta el paciente.

Categórica dicotómica.


datos.

ESTADIO NOLLA

0-10. Se define como el estado radiográfico de la calcificación y formación de los dientes.

Categórico politómico.

Radiografía periapical

DIÁMETRO APICAL CLÍNICO

Entre 0 y 7 mm Se define como la distancia mesodistal o vestibulolingual del ápice radicular, medida con sonda milimetrada posterior a la exodoncia del tercer molar.



datos.

DIÁMETRO APICAL

MICROSCÓPICO

Entre 0 y 7 mm Se define como la distancia mesodistal o vestibulolingual del ápice radicular, medida con un microscopio con una magnificación de 20X posterior a la exodoncia del tercer molar.



datos.

6.7. Enmascaramiento y aleatorización

No es posible que tenga enmascaramiento y aleatorización, justificado en que es indispensable determinar previamente el estadío de Nolla radiográfico y clasificar el tercer molar para cada grupo; además por los criterios de inclusión y exclusión se requirió un muestreo no probabilístico.

6.8. Recolección de datos

Los pacientes que requerían exodoncia de terceros molares eran citados a una consulta para la elaboración de historia clínica y verificar el cumplimiento de los criterios de inclusión y exclusión. Para seleccionar los dientes que se incluyeron en la investigación, el día previo a la cirugía se procedió a evaluar las radiografías panorámicas de los terceros molares del grupo de pacientes que iban a ser atendidos y que necesitaban la exodoncia. Se descartaban los dientes que no encajaban con parámetros clínicos y radiográficos exigidos.

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Posteriormente se explicaba al paciente las ventajas y desventajas del procedimiento, se firmaba el consentimiento o asentimiento informado, consentimiento de donación de órganos y habeas data. Se diligenció luego el instrumento de recolección de datos (Anexo No 1), se toma la radiografía periapical y con una regla milimetrada se medían los agujeros apicales (Cuando eran claramente visibles). Lo ideal era usar una tomografía para determinar con exactitud el grado de desarrollo radicular, pero por razones éticas y económicas esto no se pudo realizar.

6.9. Calibración de operadores

Los integrantes del grupo de investigación fueron calibrados para realizar cada uno, un procedimiento clínico: la selección de los dientes desde el punto de vista radiográfico, la cirugía y la toma del tejido pulpar. La clasificacion de acuerdo al estadio de Nolla en cada radiografía y la medición del ápice de forma clínica y en el microscopio fue realizada dos veces por el mismo operador, quien disponía de una guía con imágenes para facilitar su identificación. En cuanto al operador que realizó la exodoncia, fue entrenado de tal manera que el procedimiento clínico no demore mas de 10 minutos en su realización y que solo se efectúe luxación supraperiostica. El último operador fue entrenado para realizar la toma del tejido pulpar intacto con el instrumental estéril. Previa aprobación del comité de ética, cada operador fue calibrado con dos dientes. Estos no fueron incluidos en el presente estudio.

6.10. Toma de muestra, almacenamiento y procesamiento del tejido pulpar:

Cumpliendo con todos los protocolos de asepsia y antisepsia, se realiza la exodoncia. Se inicia con la ejecución de la técnica de anestesia, dependiendo de la localización del diente y considerando que la solución a emplear debía ser prilocaína sin vasoconstrictor. Se procedió a realizar la sindesmotomia, luxación supraperiostica y exéresis del diente con forcep. Cada diente extraído era colocado en un recipiente que contenía 20 ml de PBS

(Solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4, 0.1 M) previamente servido. Cuando se extraía la PD, se colocaba en un tubo de eppendorf que también había sido acondicionado con PBS de manera que cada recipiente mantendría el tejido cubierto por completo. Todos los envases eran rotulados con la identificación del paciente y el grupo al que pertenecía. Una vez tomado el diente se colocan los campos estériles en el mesón de trabajo con el juego de instrumental y materiales necesarios para la extracción del tejido pulpar (Cucharilla, cureta periodontal, pinza hemostática o algodonera, explorador endodóntico, gasas y guantes estériles). Luego, el

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operador verificaba clínicamente el diámetro apical con una sonda periodontal milimetrada. Este resultado se corroboraba, primero con un dentímetro y al final en el microscopio con un aumento de 20X. Esta información se consignaba en el instrumento de recolección de datos. La superficie radicular de cada diente se raspa con una cucharilla, para eliminar el ligamento periodontal que podria contaminar la muestra de PD. Se secciona cada diente usando una pieza de mano de alta velocidad con una fresa Zekrya (Dentsply Tulsa Dental, OK, EE.UU) irrigada con solución salina esteril contenida en una jeringa de 5 cc. Los cortes se hicieron de la siguiente manera: los molares superiores se seccionaron en sentido longitudinal a la raíz por vestibular y palatino. Primero se realizaba un trazo a manera de guía y luego se continuaba uniendo los cortes tanto en oclusal, como en el área de la furca (Si sus raíces no estaban fusionadas). Al final se obtendrán dos mitades, una mesial y otra distal. En el caso de los molares inferiores, fueron seccionados en dirección longitudinal a la raíz, por mesial y distal; y se continuaba uniendo los cortes de la misma forma que los molares superiores; solo que se obtienen dos mitades diferentes una vestibular y otra lingual. Era necesario tener cuidado de no tocar el tejido pulpar con la fresa. Una vez logrado lo anterior, se tomaba el diente con una gasa estéril, y con un elevador recto pequeño se fracturaba en dos mitades colocando su punta activa en el corte recién creado y girándolo 180°; de esa manera se exponía el tejido pulpar, tanto cameral como radicular. Este protocolo fue el mismo empleado por Gomez-Sosa y col (2019) (17). Luego la PD se separaba de la dentina empleando una cucharilla y una cureta. Con una pinza se tomaba el tejido, se secaba y se pesaba. Por último, se colocaba en el criovial de 2 ml se identificaba con el número del paciente y de la muestra respectiva, anexando también la identificación del grupo al cual pertenece. Posteriormente se tomaba el criovial y se colocaba en un canister previamente marcado con los datos del investigador y se sumergía en el tanque para nitrógeno líquido (MVE SC 20/20, MVE Inc, USA) donde se congeló y fue almacenado a -80 °C. Estos pasos se repitieron por cada muestra tomando las precauciones de esterilización del instrumental y cadena de asepsia, necesarias para evitar contaminación cruzada de las muestras. En esta investigación se estableció que el tiempo que transcurría desde la extracción del diente hasta la inmersión en el tanque para nitrógeno líquido, no debía superar los 40 minutos para asegurar que no existiera compromiso del ARN del tejido, sino las muestras debían ser excluidas.

Cuando se completaron todas las muestras, se rompen con un mortero, se homogenizan con una jeringa y una aguja, se descongelaron con un baño frío y se volvieron a congelar durante dos ciclos más, con su respectivo

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descongelamiento para que el tejido se desintegre. Para finalizar este proceso se efectúan tres ciclos de sonicación de 15 s a 30 Hz, con un baño frio intermedio de un minuto entre ciclos. Cuando terminó la homogeneización del tejido, se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos a 4 °C; El sobrenadante se recolectó en otro tubo para la cuantificación proteica por análisis de ácido bicinconínico (BCA, Pierce Chemical Company) y la determinación de los péptidos y receptores a estudiar.

La muestra fue sometida a ELISA utilizando el principio Sandwich. La microplaca ELISA provista en este ensayo ha sido recubierta previamente con un anticuerpo específico para humanos: ANG-1 (Angiopoyetina 1, Elabscience, E-EL-H5703), ANG-2 (Angiopoyetina 2, Elabscience, E-EL-H0008), HIF-1α (Factor Inductor de Hipoxia 1 Alfa, Elabscience, E-EL-H1277) y ANG-R-Tie2 (Receptor de Angiopoyetina Tie2, Elabscience, E-EL-H0340). Se añaden patrones o muestras a las placas de micro ELISA y se combinan con el anticuerpo específico. Luego, un anticuerpo de detección biotinilado específico para péptido o receptor y conjugado Avidina-Peroxidasa de rábano (HRP), se adiciona sucesivamente a cada microplaca y se incuba. Los componentes libres fueron arrastrados. La solución de sustrato se agregó a cada microplaca. Solo aquellos que contienen péptido o receptor, anticuerpo de detección biotinilado y conjugado Avidin-HRP aparecerán de color azul.

La reacción enzima-sustrato se termina por la adición de una solución que la detiene y el color se vuelve amarillo. La densidad óptica (OD) se mide espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm. El valor de OD es proporcional a la concentración de péptido o receptor humano. La concentración de péptido o receptor se calcula en las muestras comparando la OD de las muestras con la curva estándar y por último se cuantifican. Las fotografías de los procesos se detallan en el Anexo No 2.

6.11. Análisis estadístico Para cada una de las variables categóricas se muestran frecuencias y porcentajes. En el caso de las variables cuantitativas entre ellas las sustancias proteicas analizadas se muestran las medidas de tendencia central (Media o mediana) y de dispersión (Desviación estándar, valores mínimos y máximos) que describen su comportamiento en cada uno de los grupos de dientes. Los mismos son expresados en pmol (Picomoles) de sustancia por mg (Miligramos) de tejido pulpar. Los gráficos de barras se utilizan para ilustrar de igual forma el comportamiento de cada sustancia. Se aplicó una prueba de Kolmogorov-Smirnov la serie de valores correspondientes a cada sustancia para determinar si presentaban un comportamiento normal o no. Finalmente se realizaron pruebas t de Student para determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (Con desarrollo radicular completo e incompleto) para las variables con comportamiento normal, así como pruebas de U Mann-Whitney para las variables con comportamiento no paramétrico.

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Para explorar la relación entre los estadios de Nolla y los factores angiogénicos se efectuarán pruebas de correlación. Para datos normales: Coeficiente de correlación de Pearson y no normales: Coeficiente de correlación de Spearman. Los datos fueron tabulados en una hoja de cálculo de Microsoft Excel y posteriormente, los análisis estadísticos fueron ejecutados mediante el programa SPSS versión 22. Se tomarán medidas estadísticamente significativas cuando el valor de P sea inferior a 0.05; es decir, un nivel de confianza del 95%.

6.12. Consideraciones éticas

Esta investigación cumple con los principios consignados en la Declaración de Helsinki y CIOMS. En cuanto a normatividad nacional, aplica la Resolución 8430 de 1993, que dicta los principios de investigación médica en humanos. El riesgo será mayor que el mínimo, ya que es un estudio experimental donde al paciente se le realizará una exodoncia. El estudio fue aprobado en primera instancia por el comité de investigación de la Facultad de Odontología y posteriormente por el Comité de Ética de la Universidad Cooperativa de Colombia- Campus Pasto. El acta se adiciona como un documento adjunto (Anexo No 4). Previamente, se explica a los pacientes y sus acudientes, los riesgos y beneficios de la investigación (Procedimiento quirúrgico, radiografías periapicales como ayudas diagnósticas y controles postquirúrgicos sin costo). Su participación fue voluntaria y puede desistir de la misma cuando lo desee. La confidencialidad de los datos se protegerá mediante el uso únicamente de su número de identificación. Antes de la realización de la cirugía debe firmar tres documentos: Consentimiento informado para la participación del estudio, consentimiento informado para la donación de órganos y habeas data. Adicionalmente el asentimiento informado, si es menor de edad (Anexo No 3). La custodia de la información se hará en un computador de un miembro del grupo. A este equipo tendrán acceso únicamente los integrantes del mismo. Se guardará con número de identificación. Si llegado el caso se presenta un evento adverso se controlará prestando primeros auxilios y posteriormente el paciente debe acudir a su EPS. Cabe resaltar que todos los procedimientos serán supervisados por el cuerpo docente la facultad de Odontología de Universidad Cooperativa de Colombia.

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7. RESULTADOS

Se analizaron en total 40 muestras de tejido pulpar, 20 provenientes de dientes con desarrollo radicular incompleto y 20 con desarrollo radicular completo. De las 20 muestras, 3 no cumplían con el peso mínimo para realizar el procesamiento y fueron descartadas. Por lo tanto se tomaron 3 dientes más pertenecientes a pacientes que cumplían los criterios de inclusión. Cada participante aportó únicamente un diente al estudio.

7.1. Análisis de datos sociodemográficos

Para el grupo con ápice abierto el promedio de edad fue de 17.05 años (SD ± 1.19 años; IC 95%= 16.49-17.60), la edad mínima fue 16 y máxima 20, con una mediana de 17 años. Este grupo estuvo conformado por 13 mujeres (65%) y 7 hombres (35%). La totalidad de los dientes de este grupo presentaron un estadio Nolla 8 (100%). La media de diámetro apical clínico fue de 5.35 mm y su mediana 5 mm (SD ± 0.48; IC 95%= 5.12-5.57). Al microscopio el calibre fue en promedio 5.47 mm (SD ± 0.46; IC 95%= 5.25-5.68) con una mediana de 5.25 mm. El promedio de cárpules de anestesia utilizados para efectuar la extracción fue 1.74 (SD ± 0.73 cárpules; IC 95%= 1.35-2.04) y el tiempo promedio de exodoncia fue de 230 segundos (SD ± 104.99; IC 95%= 181.26-279.53). Para el grupo con ápice cerrado, el promedio de edad fue de 22.25 años (SD ± 3.61; IC 95%= 20.55-23.94), siendo la edad mínima 16 y máxima 29 con una mediana de 23 años. Estuvo conformado por 14 mujeres (70%) y 6 hombres (30%). Todos presentaban un estadio de Nolla 10. El promedio de diámetro apical clínico fue 0.25 con una mediana de 0.2 mm (SD ± 0.11; IC 95%= 0.19-0.31) y en el microscopio, la media fue de 0.3 mm y la mediana 0.25 mm (SD ± 0.11; IC 95%= 0.24-0.35). El número de cárpules promedio, empleadas para anestesia fue 1.8 (SD ± 0.69; IC 95%= 1.47-2.12) y la media de tiempo que duró la exodoncia fue 194 segundos (SD ± 90.48; IC 95%= 152.45-237.14). Estos resultados se resumen en la tabla No 7.

Tabla No 7: Datos sociodemográficos de los participantes del estudio. Fuente: SPSS Versión 22.

VARIABLE CON ÁPICE ABIERTO CON ÁPICE CERRADO

EDAD (Años) 17.05 (SD 1.19) IC 95%= 16.49-17.60 Me= 17 (RQ=16-17)

22.25 (SD 3.61) IC 95%= 20.55-23.94 Me= 23 (RQ= 19.5-24)

SEXO Femenino= 13 (65%) Masculino= 7 (35%)

Femenino= 14 (70%) Masculino= 6 (30%)

ESTADÍO NOLLA 8 (100%) 10 (100%)

DIÁMETRO APICAL CLÍNICO (mm)

5.35 (SD 0.48) IC 95%= 5.12-5.57 Me= 5 (RQ= 5-6)

0.25 (SD 0.11) IC 95%= 0.19-0.31 Me= 0.2 (RQ= 0.2-0.35)

DIÁMETRO APICAL MICROSCÓPICO

(mm)

5.47 (SD 0.46) IC 95%= 5.25-5.68 Me= 5.25 (RQ= 5.2-5.85)

0.3 (SD 0.11) IC 95%= 0.24-0.35 Me= 0.25 (RQ= 0.2-0.4)

CARPULES DE ANESTESIA

1.7 (SD 0.73) IC= 1.35-2.04 1.8 (SD 0.69) IC 95%= 1.47-2.12

TIEMPO DE EXODONCIA (seg)

230.4 (SD 104.9) IC 95%= 181.2-

279.5

194.8 (SD 90.48) IC 95%= 152.4-

237.1 SD= Desviación estándar. IC 95%= Intervalo de confianza al 95%. Me= Mediana. RQ= Rango intercuartílico.

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7.2. Análisis bivariado

Se realiza la prueba de normalidad de Kormogorov-Smirnov para determinar el comportamiento de las variables cuantitativas. El resultado concluyó que tanto la edad, como el diámetro apical clínico y microscópico no presentan un comportamiento normal, ya que se rechaza la hipótesis nula; mientras que la cantidad de anestésico y el tiempo de exodoncia son paramétricas. Los resultados de la prueba se observan en la tabla No 8.

Tabla No 8: Resultado pruebas de normalidad variables cuantitativas. Fuente: SPSS Versión 22.

VARIABLE EDAD DIÁMETRO APICAL CLÍNICO

DIÁMETRO APICAL

MICROSCÓPICO

CARPULES DE ANESTESIA

TIEMPO DE EXODONCIA

Valor P 0.0002* 0.00001* 0.00000* 0.1277 0.23857 *Valor estadísticamente significativo a un nivel del 95% (p0.05).

Posteriormente se exploran diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos de desarrollo radicular. Para los datos cuantitativos, se ejecutan dos tipos de pruebas: t de student en variables paramétricas y U Mann-Whitney para variables no paramétricas. Para variables categóricas se ejecuta chi cuadrado. Todos los valores se pueden observar en la tabla No 9.

Tabla No 9: Resultado pruebas de significancia estadística. Fuente: SPSS Versión 22.

VARIABLES EDAD SEXO ESTADIO NOLLA

DIÁ

ME

TR

O

AP

ICA

L

CL

ÍNIC

O

DIÁ

ME

TR

O

AP

ICA

L

MIC

RO

SC

ÓP

ICO

CA

RP

UL

ES

DE

AN

ES

TE

SIA

TIEMPO DE EXODONCIA

Valor P 0.0000a* 0.736b 0.000b* 0.00000b* 0.00000a* 0.6606c 0.2579c

*Valor estadísticamente significativo a un nivel del 95% (p0.05). a Prueba de U Mann-Whitney. b Prueba chi2. c t-student.

Considerando las variables cuantitativas, los resultados afirman que entre los grupos con desarrollo radicular completo e incompleto, hay diferencias estadísticamente significativas en las medianas de edad, diámetro apical clínico y microscópico. La edad fue inferior en el grupo con ápice abierto; dado que a edades superiores, se finalizan los procesos de mineralización y cierre apical. También es característico de los dientes inmaduros tener un mayor calibre apical. Por otro lado, no se evidenciaron diferencias en los promedios de cárpules de anestesia y tiempo de exodoncia. Es relevante considerar que a pesar de no haber diferencia en el tiempo de exodoncia, este fue superior en dientes inmaduros dado que la mayoría no ha completado su proceso eruptivo y se encuentra impactado, por consiguiente su exodoncia presenta mayor complejidad. Para variables categóricas, se concluye que no hay diferencias entre el sexo de los individuos participantes; mientras que en estadio de Nolla las diferencias son estadísticamente significativas.

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7.3. Análisis de factores angiogénicos

Para las sustancias proteicas estudiadas también se ejecutó la prueba de Kolmogorov-Smirnov, la cual mostró que las variables ANG-1 y ANG-2 presentan un comportamiento normal; mientras que las variables HIF-1α y TIE-2 presentaron un comportamiento no paramétrico. Comportamiento de ANG-1: El promedio general de ANG-1 fue de 0.3624 pmol/mg (SD ± 0.2118 pmol/mg; IC 95%= 0.2946-0.4301), encontrando que su expresión fue significativamente mayor en los dientes con desarrollo radicular completo. El valor mínimo fue 0.0112 pmol/mg y el máximo 0.7019 pmol/mg. La media de ANG-1 fue de 0.2518 pmol/mg (SD ± 0.2185 pmol/mg; IC 95%= 0.1495-0.3540) para dientes con desarrollo radicular incompleto y de 0.4729 pmol/mg (SD ± 0.1364 pmol/mg; IC 95%= 0.4090-0.5367) para dientes con desarrollo radicular completo; siendo la diferencia en promedios entre los dos grupos de 0.2211 pmol/mg. Al analizar esta diferencia mediante el test t de student, se encuentra que la misma fue estadísticamente significativa con un valor de p=0.001 (p<0.05). La tabla No 10 y gráfica No 1 describen el comportamiento de ANG-1.

Tabla No 10: Expresión de ANG-1 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo. Fuente: SPSS Versión 22.

t-Student p=0.001 (p<0.05)

Gráfica No 1: Expresión de ANG-1 en dientes con ápice abierto y cerrado. Fuente: SPSS Versión

22.

Comportamiento de ANG-2: Con respecto a ANG-2, la media general fue de 0.0329 pmol/mg (SD ± 0.0287 pmol/mg; IC 95%= 0.0237-0.0420). El valor mínimo fue 0.0010 pmol/mg y el máximo 0.0928 pmol/mg. En dientes con ápice abierto, el promedio fue de 0.0211 pmol/mg (SD ± 0.0270 pmol/mg; IC 95%= 0.0084-0.0337); mientras que


N MEDIA (PMOL/MG)

DESVIACIÓN ESTÁNDAR

MÍNIMO MÁXIMO

Incompleto 20 0.2518 0.2185 0.0112 0.6402

Completo 20 0.4729 0.1364 0.2314 0.7019

Total 40 0.3624 0.2118 0.0112 0.7019

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para ápice cerrado fue de 0.0447 pmol/mg (SD ± 0.0870 pmol/mg; IC 95%= 0.0325-0.0568). La diferencia entre las dos formas de desarrollo fue de 0.023 pmol/mg. El test t de student arrojó que la diferencia no fue estadísticamente significativa con un valor de p=0.008 (p<0.05). La tabla No 11 y gráfica No 2 muestran el comportamiento de ANG-2.

Tabla No 11: Expresión de ANG-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo. Fuente: SPSS Versión 22.

t-Student p=0.008

Gráfica No 2: Expresión de ANG-2 en dientes con ápice abierto y cerrado. Fuente: SPSS Versión

22.

Comportamiento de HIF-1α: La cantidad media de HIF-1α en general fue de 0.0174 pmol/mg (SD ± 0.0178 pmol/mg; IC 95%= 0.0117-0.0230) y su mediana fue 0.0103 pmol/mg. El valor mínimo de esta fue 0.0021 pmol/mg y el máximo 0.0832 pmol/mg, lo que hace concluir que presenta valores muy dispersos. En dientes con desarrollo radicular incompleto, la media de HIF-1α hallada fue 0.0118 (SD ± 0.0134 pmol/mg; IC 95%= 0.0055-0.0180) y su mediana fue 0.0086 pmol/mg; mientras que en dientes con desarrollo radicular completo, el promedio es 0.0230 pmol/mg (SD ± 0.0202 pmol/mg; IC 95%= 0.0135-0.0324) y la mediana 0.0123 pmol/mg; siendo superior en este último grupo. La diferencia entre las medianas encontrada fue 0.0037 pmol/mg. Como corresponde a una variable no paramétrica, se aplica un test U Mann-Whitney que da como resultado p=0.001 (p<0.05) justificando diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de los grupos. Lo anterior se puede detallar en la tabla No 12 y gráfica No 4.

Tabla No 12: Expresión de HIF-1α en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo. Fuente: SPSS Versión 22.


N MEDIA (PMOL/MG)


MÍNIMO MÁXIMO

Incompleto 20 0.0211 0.0270 0.0010 0.0928

Completo 20 0.0447 0.0259 0.0041 0.0870

Total 40 0.0329 0.0287 0.0010 0.0928

40

U Mann-Whitney p=0.001

Gráfica No 3: Expresión de HIF-1α en dientes con ápice abierto y cerrado. Fuente: SPSS Versión 22.

Comportamiento de TIE-2: La media general de TIE-2 fue 0.0068 pmol/mg (SD ± 0.0054 pmol/mg; IC 95%= 0.0050-0.0085) y su mediana fue 0.0053 pmol/mg. En dientes con ápice abierto el valor medio de TIE-2 corresponde a 0.0038 (SD ± 0.0015 pmol/mg; IC 95%= 0.0030-0.0045) y su mediana 0.0036 pmol/mg. Por otra parte, para dientes con ápice cerrado la media fue 0.0099 (SD ± 0.0061 pmol/mg; IC 95%= 0.0070-0.0127) y su mediana 0.084 pmol/mg. La mediana fue superior para el último grupo con 0.0048 pmol/mg de mas. Aplicando el test U Mann-Whitney el valor de p fue menor a 0.001, lo que quiere decir que la diferencia entre las medianas fue estadísticamente significativa, como lo muestra la tabla No 13 y la gráfica No 4.

Tabla No 13: Expresión de TIE-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo. Fuente: SPSS Versión 22.

U Mann Whitney p<0.001

Gráfica No 4: Expresión de TIE-2 en dientes con ápice abierto y cerrado. Fuente: SPSS Versión 22.


N MEDIA (PMOL/MG)


MEDIANA MÍNIMO MÁXIMO

Incompleto 20 0.0118 0.0134 0.0086 0.0021 0.0645

Completo 20 0.0230 0.0202 0.0123 0.0065 0.0832

Total 40 0.0174 0.0178 0.0103 0.0021 0.0832


N MEDIA (PMOL/MG)


MEDIANA MÍNIMO MÁXIMO

Incompleto 20 0.0038 0.0015 0.0036 0.0011 0.0068

Completo 20 0.0099 0.0061 0.0084 0.0016 0.0236

Total 40 0.0068 0.0054 0.0053 0.0011 0.0236

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Finalmente, la tabla No 14 resume los niveles de los 4 factores angiogénicos estudiados.

Tabla No 14: Expresión de ANG-1, ANG-2, HIF-1α y TIE-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo. Fuente: SPSS Versión 22.


ANG-1 ANG-2 HIF-1α TIE-2

Media SD Media SD Me SD Me SD

Incompleto 0.2518 ± 0.2185 0.0211 ± 0.0270 0.0086 ± 0.0134 0.0036 ± 0.0015 Completo 0.4729 ± 0.1364 0.0447 ± 0.0259 0.0123 ± 0.0202 0.0084 ± 0.0061

Valor P 0.001* 0.008 0.001** <0.001** Me= Mediana. * Valor estadísticamente significativo prueba t-student. ** Valor estadísticamente significativo prueba U Mann-Whitney.

7.4. Correlación entre desarrollo radicular y los factores angiogénicos

Para explorar si hay una correlación entre el grado de desarrollo radicular dado por los estadios de Nolla, suponiendo que es una variable discreta; se debe considerar la naturaleza de las variables angiogénicas a evaluar. En el caso de ANG-1 y ANG-2 son variables paramétricas, mientras que HIF-1α y TIE-2 son no paramétricas; por consiguiente se aplicará el coeficiente de correlación de Pearson para las angiopoyetinas 1 y 2; y de Spearman para los factores restantes. Se explora el supuesto de linealidad, el cual asume un incremento proporcional en las dos variables. Empero, no es posible corroborarlo, dado que para este estudio el estadio de Nolla es una variable discreta; sumado a lo anterior, hay una mayor dificultad para explorar grados intermedios de desarrollo radicular entre estadios. Por ende, solo se halló un estadio Nolla para cada tipo de desarrollo radicular, aunque no necesariamente debe suceder así. Puede que los dientes con las características requeridas en esta investigación varíen entre estadio 7 y 9. Se va a asumir que el supuesto de linealidad se cumple, dado que las escalas de Nolla avanzadas son características de la culminación del cierre apical. Con la toma del grado de desarrollo radicular Nolla como variable discreta, al aplicar la prueba de normalidad, esta variable cumple con este requisito (p=1.0) y por ende cumpliría con los dos supuestos adicionales, en cuanto a distribución paramétrica y varianza constante. Al aplicar el coeficiente de Pearson y Spearman los resultados dados se indican en la tabla No 15.

Tabla No 15: Resultados de los coeficientes de correlación de Pearson y Spearman para ANG-1, ANG-2, HIF-1α y TIE-2 en pulpas de dientes con desarrollo radicular incompleto y completo.

Fuente: SPSS Versión 22.

VARIABLE ANG-1 ANG-2 HIF-1α TIE-2

COEFICIENTE DE CORRELACIÓN 0.7667a* 0.5786a* 0.7805b* 0.8529b* a Coeficiente de correlación de Pearson b Coeficiente de correlación de Spearman

*Valor estadísticamente significativo a un nivel del 95% (p0.05).

Los resultados de acuerdo al coeficiente de correlación nos hacen concluir que hay un alto grado de correlación. En Pearson da 0.76 para ANG-1, lo que quiere decir que presenta un grado de correlación fuerte. Por otra parte para

42

ANG-2 da 0.5786, que indica un grado de correlación moderadamente positivo, siendo estos dos resultados estadísticamente significativos. Para Spearman, el coeficiente en los dos factores angiogénicos (HIF-1α y TIE-2), es superior a 0.70; lo que indica una relación muy fuerte, siendo de relevancia estadística. Con relación a los coeficientes de correlación, se llega a concluir que hay una asociación fuerte positiva para ANG-1, HIF-1α y TIE-2 con el grado de desarrollo radicular dado por los estadios de Nolla; mientras que para ANG-2 fue moderadamente positiva, siendo estadísticamente significativos para todos los factores angiogénicos.

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8. DISCUSIÓN

La vascularización es esencial para el desarrollo y funcionamiento normal de todos los tejidos, incluyendo la PD. Por consiguiente, los vasos sanguíneos desempeñan un papel fundamental en la supervivencia de la misma. Las células pulpares intervienen en procesos angiogénicos para mantener este equilibrio, por medio de la inducción de factores de crecimiento, que promueven la proliferación y migración de varias células, entre ellas las células endoteliales; por lo tanto desempeñan una función en la formación, recuperación y mantenimiento de la PD (13). El presente estudio propuso determinar los niveles de factores angiogénicos ANG-1, ANG-2, HIF-1α y su receptor TIE-2, en dientes con desarrollo radicular completo e incompleto dada su importancia en procesos fisiológicos como la odontogénesis y patológicos como la formación de neoplasias. Sumado a lo anterior destacar su valor en el campo emergente de la ingeniería tisular y procesos de revascularización pulpar. Los datos encontrados muestran diferencias estadísticamente significativas de ANG-1, HIF-1α y TIE-2 entre dientes con desarrollo radicular completo e incompleto, siendo mayores en el primer grupo. Al respecto se destaca que la presencia de angiopoyetinas; no solo es vital en la formación de la vasculatura; sino también en la maduración y estabilización de los vasos sanguíneos. Es relevante considerar que las estructuras vasculares se forman antes de la perfusión, por lo que en cierta medida adquieren una adaptación a la señalización proporcionada por el oxígeno; lo que explicaría mayores niveles de factores angiogénicos en dientes que finalizaron su formación pulpar (22). De igual manera, los dientes con ápice cerrado; por lo general se encuentran completamente erupcionados y por ende pueden estar expuestos a múltiples condiciones adversas que requieren un mayor suministro de oxígeno. Es más, la misma interacción con el medio oral lo podría explicar, puesto que el diente se expone a microorganismos, toxinas, y por su contacto con antagonista, a trauma oclusal (92,119). En estudios realizados en modelos animales, es relevante considerar la función de la ANG-1, de proveer estabilidad a vasos sanguíneos ya maduros, mantener a las células endoteliales quiescentes y que estas no se activen hasta recibir un estímulo; asimismo regular el número y diámetro de vasos sanguíneos y por último promover la estabilidad en el reclutamiento de pericitos (127). Lo anterior, está en directa relación con las funciones angiogénicas en órganos ya consolidados. No obstante, en ese mismo estudio se mostró que al inactivar la ANG-1 durante la formación tisular, los tejidos desarrollaban defectos vasculares múltiples (128). Por ende, se puede afirmar que si bien, ANG-1 es esencial para mantener la homeostasis en órganos con desarrollo concluido,

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también es prioritaria durante la organogénesis y por ende odontogénesis, evitando defectos vasculares (96). Es de destacar además que la expresión de los factores angiogénicos varía dependiendo del tejido y la demanda funcional del órgano en el que se presenta. En el caso de los dientes, los niveles de ANG-1, fueron mayores a otros factores, y es por esta razón que puede suponer un proceso de estabilización vascular en los dos tipos de formación radicular. En los dientes con ápice cerrado, puede reflejar la necesidad de factores proangiogénicos, producto de la reducción en el flujo de oxígeno dada al disminuir el suministro sanguíneo; que es consecuencia del cierre apical. Igualmente por haber erupcionado, es posible esté en función (129). La actividad de ANG-1 es dependiente de la unión a su receptor de tirosina kinasa. La quiescencia de las células presentes en la formación de vasos sanguíneos se logra mediante la conexión de ANG-1/TIE-2. La alteración de la misma no modifica la formación de los vasos, pero podría estar relacionada con defectos vasculares (130). TIE-2 se encontró en menor medida en dientes inmaduros, empero es propio afirmar que un estadio Nolla 8; característico de los dientes estudiados, es indicador de una etapa de finalización de la formación radicular y por ende su función puede estar ligada a la de ANG-1 en el mantenimiento de la homeostasis propia de órganos completamente formados. Lo anterior ha sido demostrado por múltiples experimentos que encontraron capilares en diferentes localizaciones con actividad de TIE-2, que no solamente están en el tejido pulpar, sino también en numerosos odontoblastos y zonas de dentina y predentina, igualmente en otras células que conforman los tejidos periodontales. Comparando la actividad en el germen dental y al cesar la formación radicular, se puede afirmar que su comportamiento no mostró diferencias; lo que concluye que la activación de TIE-2 induce remodelación vascular, pero al mismo tiempo mantiene la estabilidad de los vasos y la supervivencia de las células endoteliales, independiente a su unión con ANG-1 (67). Por otra parte, la presencia de niveles superiores de ANG-2, sumado a los valores de HIF-1α son evidencia de que las células de la PD se encontraban hipóxicas y que los vasos sanguíneos iniciaban una desestabilización. Esto responde a la acción de ANG-2/TIE-2, que incluso en presencia de altos niveles de ANG-1, inhibe la fosforilación de TIE-2 e inicia el proceso angiogénico en PD de dientes con formación radicular completa (17,103). Esto justificaría que ANG-2 actúe como factor proangiogénico, limitando la presencia de las células endoteliales a áreas de remodelación vascular a priori o desempeñando un papel fundamental en la germinación endotelial, la remodelación de la pared de los vasos y el reclutamiento de células murales,

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asumiendo la demanda funcional presente en desarrollo radicular completo (131). En nuestro estudio, los valores de ANG-2 no aportaron diferencias estadísticamente significativas. Se destaca que desarrolló una tendencia a valores superiores, pero esta no fue tan marcada como HIF-1α. Este proyecto también se evaluó HIF-1α, ya que esta proteína depende del oxígeno, y su expresión indica que el tejido pulpar está sometido a un ambiente hipóxico. Esto radica en que HIF-1α en normoxia es vulnerable a la degradación proteasomal (132). Es bien sabido que para la transcripción de HIF-1, se necesitan los activadores HIF-1α y β. Con respecto a HIF-1β es una proteína constitutiva, que está presente en la célula inactiva hasta que se une a HIF-1α para transcribir HIF-1 y así iniciar la actividad proangiogénica (132,133). La presencia de altos niveles de HIF-1α en los dientes con cierre apical, indica una baja concentración de oxígeno en el tejido pulpar; que puede responder al inicio de la angiogénesis, desencadenando la unión de ANG-2/TIE-2 y VEGFA/VEGFR2 o VEGFA/NRP1 (17), buscando mantener un adecuado metabolismo celular y una alta concentración de oxígeno (26). Se ha observado un alto nivel de HIF-1α en dientes bajo movimientos de ortodoncia (134), estos hallazgos podrían aplicarse a los resultados de la presente investigación, donde estímulos tales como trauma dental y masticación en pulpas de dientes con raíz completa podrían elevar los niveles de HIF-1α con respecto a los dientes con cierre apical incompleto, que están libres de oclusión. No obstante, niveles bajos de HIF-1α, apoyan la noción de que la vía HIF juega un papel importante en la adaptación fisiológica al oxígeno, siendo este autoregulador y necesario para el crecimiento y desarrollo normales en correlación con demanda energética de las células presentes (14). La tensión de oxígeno en algunos órganos varía del 2 al 9% en condiciones fisiológicas. En condiciones patológicas, los niveles en áreas hipóxicas, pueden decaer a un 1% o incluso valores inferiores. Se requiere oxígeno para la generación de ATP, que es necesaria para proporcionar energía libre a las células a través de fosforilación oxidativa mitocondrial. Cuando sucede esto, se inicia la transcripción génica, a través de la estimulación de factores inducibles por hipoxia, y se activan procesos adaptativos que pueden mejorar supervivencia celular con limitada cantidad de oxígeno (94). Los bajos niveles de los factores angiogénicos investigados, en dientes que no terminan su formación radicular podría indicar dos tipos de actividad celular proliferación y síntesis (89). Por un lado, la proliferación celular, que requiere bajas concentraciones de oxígeno y bajo gasto energético en dientes con ápice abierto; por otro lado, la formación de tejido mineralizado requiere la generación de nuevos vasos para aumentar la concentración de oxígeno necesaria para las reacciones metabólicas en los dientes maduros; la

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respuesta de los mismos al estrés necesita una mayor demanda energética (135) . VEGF es la vía principal para iniciar la angiogénesis en la PD (136,137). Sin embargo, ANG-2 también se ha estudiado como una forma de iniciar la respuesta angiogénica (17). En el presente estudio, ANG-2 se expresó en en dientes con apice abierto y cerrado sin diferencias significativas entre los grupos. Contrastado con el reporte de Gomez-Sosa y cols (2019), que encontró que ANG-2 tenía una diferencia significativa entre los dientes con ápice abierto y cerrado, lo que podría deberse a la variación en los criterios de inclusión de los dientes con formación radicular incompleta. En nuestra investigación, se tomaron dientes inmaduros con un diámetro apical mayor de 5 mm; mientras que en el estudio de Gomez-Sosa y cols, el grupo de dientes con ápice inmaduro tenía un orificio apical entre 3 y 5 mm. La posible explicación de esta diferencia en la pulpa de los dientes con formación radicular incompleta es que cuanto mayor sea la apertura apical, menor será el tejido hipóxico, lo que respalda los hallazgos en HIF-1α en este proyecto (129). Como se mencionó anteriormente, TIE-2 es el receptor de ambos ligandos ANG-1 y ANG-2 (103). Este receptor se encontró significativamente más alto en los dientes con ápice cerrado, lo que podría deberse al aumento de los niveles de ANG-1 y ANG-2, para una fuerte actividad angiogénica en dientes maduros. En estos últimos se debe tener en cuenta, que su función puede preparar a los tejidos ante estímulos que generen procesos inflamatorios. Mientras que en ápice abierto puede responder al mantenimiento de una red madura de vasos (17). El aumento de la actividad angiogénica en dientes completamente formados, podría deberse a una intensa actividad metabólica para producir más dentina en los dientes con una cavidad pulpar más pequeña y un tejido pulpar más denso que los dientes con ápice abierto. Esto coincide con los hallazgos de Gómez-Sosa y cols que observaron una mayor actividad angiogénica de los dientes con apice cerrado asociados con todas las actividades oclusales, como la masticación, el trauma oclusal y el bruxismo (17,119). En este estudio, los dientes maduros estaban en oclusión, mientras que los inmaduros no. Los niveles de factores angiogénicos hallados en dientes que no han completado su formación radicular pueden explicarse por la falta de exposición a factores ambientales. El hecho de estar sometidos ante numerosos agentes que pueden inducir estados de inflamación y por consiguiente hipoxia; conllevan incluso a la mineralización de tejidos estimulando la reparación de la PD, por medio de generación de dentina reparativa; como lo muestran estudios in-vitro estimulando la expresión de ARNm de osteocalcina (OCN), fosfoproteína ácida de matriz de dentina (DMP-1), sialoproteína ósea (BSP) y sialofosfoproteína de dentina (DPSS) (8) . Dentro de las limitaciones de la presente investigación, encontramos que no se realizaron ensayos inmunohistoquímicos; y por ende no fue posible establecer

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qué células de PD expresan cada proteína o la localización histológica de los factores angiogenicos. En su lugar, se realizó una prueba ELISA, debido a que en contraste con RT2-PCR, el propósito del estudio era verificar la expresión de estas proteínas en la PD, no la capacidad génica para sintetizarlas. Estadísticamente llama la atención los resultados de HIF-1α, puesto que su valor extremo superior es muy elevado; lo que lleva a concluir que algunos de los dientes de la muestra presentaban niveles muy altos de hipoxia y es extraño dado que los dientes no presentaban patología alguna. Esto puede indicar que gracias a las condiciones oclusales del diente varía la presencia de HIF. Otra de las limitaciones a mencionar, es el modelo utilizado para la realización del estudio; puesto que el tercer molar esta asociado a gran cantidad de alteraciones, no solo de erupción, sino patologías quísticas, infecciosas e inflamatorias; razón por la cual las cantidades de ANG-2 pueden responder a procesos de este tipo, mas no al inicio de procesos angiogénicos. Cabe aclarar que éticamente los terceros molares y premolares que deben ser extraidos por motivos ortodónticos, permiten el estudio, sin incurrir en violación a los principios de bioética. Se resalta también que hay estudios en donde ANG-2 esta elevada, incluso con pulpa sana. En cuanto al grado de correlación entre el desarrollo apical y los factores estudiados, al parecer presentan un comportamiento lineal; no obstante es necesario encontrar dientes con estadios de Nolla diferente para corroborar esta relación; además observar si el comportamiento positivo en la variable independiente, influencia un incremento proporcional en la variable dependiente o no. Sumado a lo anterior, es ideal corroborar esta relación con una medida más exacta, proporcionada por tomografías. No obstante, el uso de las mismas está sujeto a un dilema ético, por la radiación consecuente. Finalmente se acepta que se requiere más investigación para comprender el proceso angiogénico en la PD, su respuesta a diferentes alternativas terapéuticas en diferentes niveles de desarrollo radicular, así como las diferentes vías de desestabilización y estabilización vascular.

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9. CONCLUSIONES

Los niveles de los factores angiogénicos ANG-1, HIF-1α y su receptor TIE-2 fueron mayores en dientes que presentaban un desarrollo radicular completo en comparación con dientes que presentaban ápice abierto; siendo estas diferencias estadísticamente significativas.

No se encontró diferencia estadísticamente significativa en el promedio de ANG-2 estudiado entre los grupos con ápice abierto y cerrado; se destaca que esta angiopoyetina fue superior en dientes con completo desarrollo radicular.

Entre los dos grupos se encontraron diferencias estadísticamente significativas para edad, diámetro apical clínico y radiográfico, dadas las características de los dientes requeridos en la investigación; no obstante, las variables restantes no mostraron este tipo de diferencias.

Existe una correlación entre el estadio de Nolla presente con la cantidad de factores angiogénicos. Es decir que hay una relación positiva fuerte entre un grado de desarrollo radicular superior con los niveles de para ANG-1, HIF-1α y TIE-2. Mientras que para ANG-2 fue moderadamente positiva. Todos estos resultados fueron estadísticamente significativos.

Es preciso realizar más estudios para comprender el comportamiento de estas proteínas durante las diferentes fases del proceso odontogénico, dada su importancia en futuros tratamientos en ingeniería tisular.

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10. RECOMENDACIONES

• Se recomienda en futuras investigaciones incrementar el tamaño de muestra y explorar más el comportamiento de las angiopoyetinas considerando sobretodo el grupo con completo desarrollo radicular y diferentes exposiciones.

• Establecer otra forma de medición de los estadios de Nolla que me permita corroborar la correlación positiva entre estos y los promedios o medianas de las angiopoyetinas estudiadas. Se sugiere la tomografía como una alternativa mas fiable.

• Evaluar la localización de los factores angiogénicos, puesto que la

concentración de los mismos puede variar dada su ubicación.

• Indagar en relación al comportamiento tan variable del HIF-1α, sobretodo a qué responde esta expresión en dientes con ápice cerrado.

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63

12. ANEXOS

Anexo No 1

FECHA: _____________________________________________ ESTUDIANTE A CARGO: _______________________________ DATOS RELEVANTES: ________________________________:

DATOS DE IDENTIFICACIÓN

NÚMERO DE DOCUMENTO

SEXO

EDAD

DIENTE


ESTADÍO DE NOLLA

No DE CARPULES DE ANESTESICO

TIEMPO DE EXODONCIA

CANTIDAD DE LA MUESTRA

DESCRIPCIÓN RADIOGRÁFICA

FECHA Y HORA DE ALMACENAMIENTO

OBSERVACIONES

DIÁMETRO APICAL CLINICO

DIÁMETRO APICAL MICROSCOPICO

DATOS DE LABORATORIO

VALOR HIF-1α

VALOR ANG-1

VALOR ANG-2

VALOR TIE-2

VALOR RECEPTORES

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

ESPECIALIZACIÓN EN ENDODONCIA INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS

NIVELES DE HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2 EN PULPA DENTAL DE TERCEROS

MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E INCOMPLETO

64

Anexo No 2

Imágenes que muestran la toma de muestra, almacenamiento y procesamiento del tejido pulpar

A. Medición de ápice en radiografía panorámica.

B. Preparación del diente para exodoncia.

65

C. Recolección de la muestra.

D. Medición de ápice clínico con dentímetro.

66

E. Preparación de la mesa de trabajo, realización de guía de corte, separación y toma de muestra.

67

F. Adición de sustrato y centrifugación.

G. Prueba ELISA.

F. Cuantificación de proteinas.

68

H. Sonicación y vortex.

70

Anexo No 3

Yo _________________________________________, identificado con número de cédula ________________ de la ciudad de _______________, en calidad de paciente o acudiente de _________________________________________, mediante la firma de este consentimiento informado, voluntariamente accedo a participar en el estudio “NIVELES DE HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2 EN PULPA DENTAL DE TERCEROS MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E INCOMPLETO” el cual tiene

como objetivo evaluar los niveles de factores angiogénicos en terceros molares. En los puntos posteriores se explica cómo será su participación en el estudio paso a paso.

En la actualidad se encuentra en tratamiento de ortodoncia (Con brackets) o de cirugía oral. Después del análisis detallado del caso con todas las radiografías o exámenes necesarios (Radiografía panorámica y/o de perfil, modelos de estudio y/o fotografías intra y extraorales) y como parte del mismo tratamiento se necesita la realización de exodoncia de los dientes _______. Se explica que el diente a extraer no tiene patología alguna.

Las condiciones médico-odontológicas y demás datos de relevancia presentes en la historia clínica serán únicamente de uso de los investigadores y por tanto se mantendrá el anonimato de su identidad.

Para la participación en el estudio, máximo se dispondrá de una hora, no deberá asumir costo alguno, Exceptuando los gastos propios del tratamiento de ortodoncia.

Este tipo de tratamiento no tendrá repercusión alguna, puesto que el destino final del diente será la exodoncia. Para evitar el dolor durante el procedimiento se aplicará una solución anestésica especial sin sustancias que reducen el sangrado; luego se realiza la exodoncia del diente.

Las complicaciones de este tipo de procedimiento serán propias a la aplicación de anestesia entre ellas dolor posterior, inflamación o hematoma, reacciones alérgicas, ruptura de aguja, pérdida de la sensibilidad en la zona, laceración en tejidos blandos.

Posterior a la preparación del conducto se realiza la exodoncia convencional del diente, teniendo como riesgos inherentes al procedimiento dolor, sangrado, inflamación, infección postquirúrgica, pérdida de la sensibilidad de la zona, dificultad para abrir la boca, fractura dentoalveolar, de restauraciones o de instrumentos, movilidad del diente contiguo, laceración de tejidos entre otros. La extracción deberá realizarse siendo lo menos traumática posible y con una técnica que vaya por encima del hueso; no se usará sutura y se enviará analgésico como parte del manejo de dolor postquirúrgico. Este procedimiento será realizado en las clínicas de cirugía oral de 1 a 3 pm bajo la supervisión de un cirujano oral o maxilofacial.

Los beneficios que obtendrá con su participación en el estudio serán la toma de ayudas diagnósticas (Radiografías periapicales), necesarias para el procedimiento, el control postquirúrgico de la zona intervenida y la realización de la exodoncia de forma gratuita.

Como paso siguiente, del diente extraído se toma una muestra de pulpa dental seccionando el diente ya que se encuentra en su interior.

Las muestras se envían mediante un medio de transporte adecuado para las mismas a la ciudad de Bogotá. Si es del interés del participante una vez se conozcan los resultados se puede acceder a los mismos, previo acuerdo con los investigadores.

Si llegara a resultar un evento adverso o si como voluntario así lo decide puede desistir de su participación en el estudio en el momento que lo decida.

Los resultados obtenidos también pueden utilizarse para futuras investigaciones respetando el anonimato del paciente.

Si hay alguna inquietud con respecto al estudio o se presenta algún tipo de complicación se puede comunicar con el Dr. Luis Fernando López, asesor al teléfono celular 3006148843.

El propósito de la investigación en netamente científico y no hay conflicto de interés en la realización del mismo. La Universidad Cooperativa de Colombia, por medio del comité de Ética le concedió el aval al estudio. Cualquier complicación sujeto a la realización de cada uno de los pasos del estudio puede ser tratado en el servicio de urgencias odontológicas en la clínica de la facultad; no obstante si estos eventos de salud no son odontológicos como paciente debe acudir a su EPS. Cabe aclarar que todos los procedimientos serán supervisados . Declaro que he comprendido todo el documento a cabalidad y que se me ha resuelto todo interrogante derivado de la lectura del mismo. Una copia me será entregada. Se firma a los ____ días del mes de _____________ del 2020.

_______________________ _______________________ FIRMA DE PACIENTE FIRMA TESTIGO # 1

_______________________ FIRMA DE TESTIGO # 2



CONSENTIMIENTO INFORMADO

71

Yo _________________________________________, menor de edad, identificado con terjeta de identidad _____________ de la ciudad de ______________, en calidad de paciente y acompañado con mi tutor o acudiente de ___________________________________, mediante la firma de este asentimiento informado, voluntariamente accedo a participar en el estudio “NIVELES DE HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2 EN PULPA DENTAL DE TERCEROS MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E INCOMPLETO” el cual tiene como objetivo evaluar los niveles de factores que

contribuyen a la formación de vasos sanguíneos en terceros molares. En los puntos posteriores se explica cómo será su participación en el estudio paso a paso.

Como menor de edad y a pesar de que el tutor firme el consentimiento informado, el menor es libre de participar o no en la investigación y la ultima palabra de esta decisión esta en el adolescente.

En la actualidad se encuentra en tratamiento de ortodoncia (Con brackets) o de cirugía oral. Después del análisis detallado del caso con todos los exámenes diagnósticos (Radiografía panorámica y/o de perfil, modelos de estudio y/o fotografías) y como parte del mismo tratamiento se necesita el retiro de los dientes _______. Se explica que el diente a extraer esta sano y no tiene alteración alguna.

Las condiciones médico-odontológicas y demás datos de relevancia consignados en la historia clínica serán únicamente de uso de los investigadores y por tanto se mantendrá oculta su identidad. Además, se almacenarán en un único computador.

Para la participación en el estudio, máximo se gastará una hora, no deberá asumir costo alguno, ni incurrirá en gastos adicionales producto de los procedimientos (Exceptuando los gastos propios del tratamiento de ortodoncia).

Este tipo de tratamiento no tendrá repercusión alguna, puesto que el diente será retirado. Para evitar el dolor durante el procedimiento se aplicará una anestesia especial; luego se realiza el retiro del diente.

Las complicaciones de este tipo de procedimiento serán propias a la aplicación de anestesia entre ellas dolor posterior, inflamación, reacciones alérgicas, ruptura de aguja, pérdida de la sensibilidad en la zona, laceración en tejidos blandos.

Posteriormente se realiza la exodoncia convencional del diente, teniendo como riesgos del procedimiento dolor, sangrado, inflamación, infección posterior, parestesia o pérdida de la sensibilidad de la zona, dificultad para abrir la boca, fractura dentoalveolar, de restauraciones o de instrumentos, movilidad del diente contiguo, laceración de tejidos entre otros. La extracción deberá realizarse siendo lo menos traumática posible y con una técnica que vaya por encima del hueso; puede requerir sutura y se enviará analgésico para evitar el dolor posterior. Este procedimiento será realizado en las clínicas de cirugía oral de 1 a 3 pm bajo la supervisión de un cirujano oral o maxilofacial.

Los beneficios que obtendrá con su participación en el estudio serán la toma de ayudas diagnósticas (Radiografías periapicales), necesarias para el procedimiento, el retiro del diente y el control gratuito de la zona intervenida.

Como paso siguiente, del diente extraído se toma una muestra de pulpa dental seccionando el diente ya que se encuentra en su interior.

Las muestras se envían mediante un medio de transporte adecuado para las mismas a la ciudad de Bogotá. Si es del interés del participante una vez se conozcan los resultados se puede acceder a los mismos, previo acuerdo con los investigadores.

Si llegara a resultar un evento adverso o si como voluntario así lo decide puede desistir de su participación en el estudio en el momento que lo decida.

Los resultados obtenidos también pueden utilizarse para futuras investigaciones respetando el anonimato del paciente.

Si hay alguna inquietud con respecto al estudio o se presenta algún tipo de complicación se puede comunicar con el Dr. Luis Fernando López, asesor al teléfono celular 3006148843.

El propósito de la investigación en netamente científico y no hay conflicto de interés en la realización del mismo. La Universidad Cooperativa de Colombia, por medio del comité de Ética le concedió el aval al estudio. Cualquier complicación sujeto a la realización de cada uno de los pasos del estudio puede ser tratado en el servicio de urgencias odontológicas en la clínica de la facultad; no obstante si estos eventos de salud no son odontológicos como paciente debe acudir a su EPS. Cabe aclarar que todos los procedimientos serán supervisados. Declaro que he comprendido todo el documento a cabalidad y que se me ha resuelto todo interrogante derivado de la lectura del mismo. Una copia me será entregada. Se firma a los ____ días del mes de _____________ del 2020. _______________________ _______________________ FIRMA DEL MENOR FIRMA ACUDIENTE

_______________________ FIRMA DE TESTIGO # 2

HUELLA DIGITAL



ASENTIMIENTO INFORMADO

72

Yo ____________________________________________, identificado con número de cédula ___________________ de la ciudad de _______________, en calidad de paciente o acudiente de ________________________________________, mediante la firma de este consentimiento informado, voluntariamente accedo a donar el/los dientes ______ para la investigación “NIVELES DE HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2 EN PULPA DENTAL DE TERCEROS MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E INCOMPLETO”.

El procedimiento propuesto consiste en donar voluntariamente el/los diente/s ______________, los cual después de un análisis exhaustivo requieren retirarse por motivos ortodónticos y/o funcionales. La necesidad de uso del diente y/o sus tejidos se hace con fines investigativos. En este caso se extraerá diente y se tomara una muestra de pulpa dental, tejido que se ubica alrededor del diente. Las muestras donadas se almacenarán en el laboratorio de la Universidad Cooperativa de Colombia campus Pasto para su posterior análisis teniendo en cuenta los requerimientos de la resolución 8430 de 1993, que rige los principios de investigación en salud. Adicionalmente es importante que conozca los siguientes puntos: 1. Los datos personales serán retirados de las muestras mediante código numérico o solo se almacenarán con el número de

identificación, lo cual mantendrá el anonimato de su identidad. Asimismo, usted podrá ejecutar los derechos de acceso, rectificación y oposición al tratamiento de datos de carácter personal, y de revocación del consentimiento en cualquier momento de la investigación. Para ello deberá ponerse en contacto con el personal responsable de los datos de la investigación.

2. Usted tiene derecho a disponer de la información sobre el uso concreto que se ha dado a las muestras en los proyectos de investigación en los cuales se han usado y quién es el investigador principal. La decisión de permitir utilizar las muestras para fines de investigación es totalmente voluntaria. Su decisión, sea cual fuere, no tendrá penalización alguna, ni afectará en ningún modo los cuidados odontológicos y la asistencia que usted pueda necesitar en el futuro.

3. Se resalta que la donación del tejido y/u órgano se realiza con fines netamente investigativos, es decir no recibirá ninguna compensación económica o de otro tipo por las muestras donadas. Las muestras no serán vendidas o distribuidas a terceros con fines comerciales. Aunque si pueden necesitarse para futuros estudios.

4. La donación de un diente tiene unos riesgos dados por el proceso de toma del mismo los cuales son: dolor, sangrado, inflamación, infección postquirúrgica, perdida de sensibilidad en la zona, dificultad para la apertura bucal, fractura dentoalveolar, de restauraciones o de instrumentos, luxación de diente contiguo, laceración de tejidos entre otros.

5. La firma del presente documento no me convierte en donante de órganos a futuro.

DECLARACIONES Y FIRMAS: 1. Declaración del donante

Declaro que he sido informado

Sobre las ventajas e inconvenientes de este procedimiento.

Sobre el lugar de obtención, almacenamiento y el proceso que sufrirán los datos personales y las muestras.

Que mis muestras y datos personales serán proporcionados por código o número de identificación a los investigadores para mantener el anonimato de mi identidad.

Que en cualquier momento puedo revocar el consentimiento y solicitar la eliminación de todos mis datos personales y las muestras que permanezcan almacenadas. Esta eliminación no se extenderá a los datos resultantes de las investigaciones que ya se hubieran llevado a cabo.

Que he comprendido la información recibida y he podido formular todas las preguntas que he creído oportunas. Consiento:

En donar voluntariamente el/los diente/s ______.

Que Universidad Cooperativa de Colombia- Campus Pasto, utilice mis datos y las muestras para investigación en salud, manteniendo la confidencialidad de los mismos.

De ser requerido, acceso a un posible contacto en el futuro en caso de que se estime oportuno añadir nuevos datos a los recogidos y/o tomar nuevas muestras.

Ser informado de los posibles hallazgos de relevancia clínica. Declaro que he comprendido todo el documento a cabalidad y que se me ha resuelto todo interrogante derivado de la lectura del mismo. Una copia me será entregada. Se firma a los ____ días del mes de _____________ del 2020.

_______________________ _______________________ FIRMA DE PACIENTE FIRMA TESTIGO # 1

_______________________ FIRMA DE TESTIGO # 2



CONSENTIMIENTO INFORMADO DONACIÓN VOLUNTARIA DE ÓRGANOS CON FINES INVESTIGATIVOS

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1. Principios generales y postulados.

La Universidad Cooperativa de Colombia, garantiza la protección de derechos como el Habeas Data, la privacidad, la intimidad, el buen nombre y la imagen, con tal propósito todas las actuaciones se regirán por principios de buena fe, legalidad, autodeterminación informática, libertad y transparencia. Quien en ejercicio de la actividad académica e investigativa, siendo estas permanentes u ocasionales pueda suministrar cualquier tipo de información o dato personal a la Universidad Cooperativa de Colombia y en la cual esta actúe como encargada del tratamiento o responsable del tratamiento podrá conocerla, actualizarla y rectificarla. 2. Marco legal La ley de Habeas Data esta regida por:

Constitución Política, artículo 15.

Ley 1266 de 2008

Ley 1581 de 2012

Decretos Reglamentarios 1727 de 2009 y 2952 de 2010, y Decreto Reglamentario parcial

No 1377 de 2013

Sentencias de la Corte Constitucional C – 1011 de 2008, y C - 748 del 2011;

Usted ha sido invitado a participar en un estudio de la Universidad Cooperativa de Colombia Campus Pasto, denominado “NIVELES DE HIF-1α, ANG-1, ANG-2, TIE-2 EN PULPA DENTAL DE TERCEROS MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E INCOMPLETO”. Para ello son requeridos una serie de datos personales que se solicitan en el

formulario de Inscripción en nuestra base de datos.

Antes de que usted. decida entregar sus datos es importante que lea y firme el presente consentimiento a cerca de los detalles del manejo que recibirán sus datos personales. 3. Investigadores responsables del Estudio.

FRANCISCO JAVIER HERNANDEZ ACOSTA* [email protected]. GLORIA MELISA PANTOJA MORA* [email protected]. ANGIE SANTINA RODRIGUEZ GUERRERO* [email protected]. *Residentes Especialización en Endodoncia Universidad Cooperativa de Colombia- Campus Pasto. 4. Propósito de los datos solicitados El propósito que se persigue con la solicitud de sus datos es: EVALUAR LOS NIVELES DE LOS FACTORES ANGIOGÉNICOS HIF-1α, ANG-1, ANG-2 Y SU RECEPTOR TIE-2 EN TERCEROS MOLARES CON DESARROLLO RADICULAR COMPLETO E INCOMPLETO y usted es una persona con las características requeridas para participar en este estudio. La Universidad

Cooperativa de Colombia utilizará los datos que entregue para darle el siguiente tratamiento: almacenamiento físico y a través del grabado digital en una base de datos que permita posteriormente su análisis para fines específicos de investigación. 5. ¿Quiénes conocerán mis datos?

Los responsables del registro de los datos personales son: FRANCISCO JAVIER HERNANDEZ ACOSTA, GLORIA MELISA PANTOJA MORA, ANGIE SANTINA RODRIGUEZ GUERRERO; investigadores principales quien serán las únicas personas que conozcan los datos que usted entregue, ya que a otras personas integrantes del centro que requieran sus datos, la recibirán en forma disociada de su identidad, es decir codificada. En ninguna circunstancia se traspasarán sus datos personales a personas ajenas a la universidad. Con lo anterior queda establecido que no habrá sesión de datos personales a personas ajenas, ni a otros integrantes de algún tipo de organización. 6. ¿A quién le pertenecerán los datos que entregue?

Sus datos personales siempre le pertenecerán. Como dueño o titular de los mismos tiene derecho a solicitarle al responsable del registro que:

Sean modificados.

Sean eliminados del registro de la universidad

Le entregue personalmente una copia del registro que evidencie las modificaciones o eliminación de sus datos personales de la base de datos.

7. ¿A quién puedo llamar para hacer consultas respecto del uso de mis datos?

A los investigadores principales responsables del registro de los datos personales y/o al Subcomité de Bioética de la Universidad Cooperativa de Colombia- Campus Pasto (SCBE-UCC Pasto):

NOMBRE CARGO CONTACTO E-MAIL


Investigador Principal 3014256509 [email protected]

GLORIA MELISA PANTOJA MORA Investigador Principal 3175188282 [email protected]

ANGIE SANTINA RODRIGUEZ GUERRERO

Investigador Principal 3016680529 [email protected]



CONSENTIMIENTO PARA TRATAMIENTOS Y ALMACENAMIENTO DE DATOS PERSONALES

mailto:camilo.pazmiñ[email protected]




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En el siguiente cuadro que se presentan a continuación coloque SI o NO dentro del cuadro.

Confirmo haber leído y entendido la información acerca del manejo de mis datos personales. SI NO

Conocedor de lo anterior doy mi consentimiento para participar y (dado el caso) autorizo la participación de mi hijo(a) en las actividades anteriormente detalladas. (Una copia de este consentimiento me será entregada).

____________________________ __________________________ _____________________ Nombre del participante Firma del Participante Lugar y fecha

__________________________________

Firma del padre, madre o responsable del menor (Si aplica)

niveles de hif-1α, ang-1, ang-2, tie-2 en pulpa dental de

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