natalia carrillo lópez - ministerio de educación y
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UNIVERSIDAD DE OVIEDO
Departamento de Medicina
MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA GLÁNDULA
PARATIROIDES EN LA ENFERMEDAD RENAL CRÓNICA:
PAPEL DEL CALCIO, CALCITRIOL, ESTRÓGENOS Y
FACTOR DE CRECIMIENTO FIBROBLÁSTICO 23
Natalia Carrillo López
UNIVERSIDAD DE OVIEDO
Departamento de Medicina
MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA GLÁNDULA
PARATIROIDES EN LA ENFERMEDAD RENAL CRÓNICA:
PAPEL DEL CALCIO, CALCITRIOL, ESTRÓGENOS Y
FACTOR DE CRECIMIENTO FIBROBLÁSTICO 23
Natalia Carrillo López
Nunca, nunca, nunca, nunca, nunca, nunca, nunca, te rindas.
Winston Churchill
Agradecimientos
Una vez finalizada la escritura de la tesis doctoral, me enfrento con el apartado más
complicado de este trabajo, que no es otro que el de los agradecimientos. En unas breves
líneas intentaré sintetizar mi gratitud a aquellas personas que han hecho posible la
elaboración de este proyecto:
Al Dr. Jorge B. Cannata, director de esta tesis doctoral, por confiar en mí desde el
primer momento, cuando entré a formar parte del equipo que dirige en el Servicio de
Metabolismo Óseo y Mineral del Hospital Universitario Central de Asturias.
Al Dr. José Luis Fernández, codirector de la tesis, por su colaboración en la
realización de este trabajo; sin su ayuda hubiese sido mucho más difícil.
Al Dr. Manuel Naves y a la Dra. Isabel Rodríguez, por su ayuda en la realización de
este estudio y por las ideas que aportaron a la realización del mismo.
A los Dres. Carlos Gómez, Bernardino Díaz y Minerva Rodríguez por sus comentarios
clínicos durante el desarrollo del presente trabajo.
A la Dra. Adriana Dusso por permitirme ir a trabajar a su laboratorio de la “Renal
Division” en la Washington University en St. Louis (EEUU) y acogerme de la manera que lo
hizo; el verano de 2009 nunca lo olvidaré, mil gracias.
A los ya Dres. Daniel Álvarez, Ignacio González, Maria Vittoria Arcidiacono y Sara
Panizo, a los casi-casi Dres. Pablo Román y Cristina Alonso y a los recién comenzados en
esta aventura que es la investigación, Diego Tuñón, Sara Barrio, Eduardo Martínez e Iván
Cabezas, grandes compañeros de laboratorio pasados y actuales, por todos los buenos
momentos que hemos compartido trabajando mano a mano.
A Ana Rodríguez, nuestra estupenda e inigualable técnico del laboratorio que, no
sólo está dispuesta a echar una mano en todo momento sino que además supuso un punto
de apoyo clave durante el desarrollo de esta tesis doctoral; gracias amiga.
A Mercedes Serrano, Ángeles González y Carmen Sanz, excelentes enfermeras,
dispuestas en todo momento a colaborar, apoyarte y animarte moralmente en los
momentos más críticos.
Agradecimientos
A Marisa Rodríguez, Sandra Álvarez, Cristina Riesgo y Mónica Guerrero muchísimas
gracias por toda vuestra ayuda administrativa durante mi estancia en el Servicio de
Metabolismo Óseo y más concretamente durante la escritura de esta tesis doctoral; no sé
qué habría hecho sin vosotras…
A Eloína Martínez y Nieves Vega, por esos ratos de sobremesa tan agradables que
por cortos que fuesen, hacían que desconectase y me relajase para comenzar de nuevo la
tarde con ánimo y fuerzas.
A Carlos y Gloria, mucho más que amigos, disponibles las 24 horas del día para
solucionar cualquier problema y por hacer suyas mis alegrías y mis penas.
A mis padres, a quienes se lo debo todo. Por confiar siempre en mí, por animarme y
darme fuerzas cada día y porque sin vosotros nunca hubiese llegado hasta aquí.
A Dani, por su apoyo y compresión que me permite poder lograr lo que me
proponga. Gracias por tus buenos consejos y sobretodo por escucharme (eso es algo que
haces muy bien). Gracias por ser parte de mi vida; eres lo mejor que me ha pasado.
A mis padres
A Dani
Abreviaturas
ABREVIATURAS
A: Absorbancia
ADHR: Raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ADNc: ADN copia
ARHR: Raquitismo hipofosfatémico autosómico recesivo
ARN: Ácido ribonucleico
ARNm: ARN mensajero
ARNr: ARN ribosómico
BSA: Albúmina sérica bovina
CaSR: Receptor sensor de calcio
CKD-MBD: Alteraciones óseas y minerales en la ERC
CT: Ciclo umbral
DBD: Dominio central de unión al ADN
DBP: Proteína de unión a vitamina D
DMO: Densidad mineral ósea
DXA: Densitómetro radiológico digital de doble energía
E2: 17β-estradiol
EGFR: Receptor del factor de crecimiento epidérmico
Egr-1: Factor de respuesta temprana de crecimiento tipo 1
ER: Receptor estrogénico
ERE: Elemento de respuesta a estrógenos
ERC: Enfermedad renal crónica
FGF23: Factor de crecimiento fibroblástico 23
FGFR: Receptor de FGF
FSH: Hormona folículo estimulante
GADPH: Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa
HEK293: Células de riñón embrionario humano 293
Abreviaturas
IL: Interleuquina
IRMA: Ensayo immunorradiométrico
kDa: KiloDaltons
LH: Hormona lutenizante
MAPK: Quinasa de la proteína activada por mitógeno
Na-Pi II: Co-transportador de sodio y fosfato tipo II
ODR: Osteodistrofia renal
OPG: Osteoprotegerina
OVX: Ovariectomía
PBS: Tampón fosfato salino
PCNA: Antígeno nuclear de proliferación celular
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
PKC: Proteína quinasa C
PTH: Parathormona
PTHR1: Receptor de PTH tipo 1
PTHrP: Péptido relacionado con la PTH
qRT-PCR: PCR cuantitativa a tiempo real
RXR: Receptor X retinoide
SDS: Dodecil sulfato sódico
TGF-α: Factor de crecimiento transformante alfa
TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa
UMR106: Células de osteosarcoma de rata 106
U.R.: Unidades relativas
VDR: Receptor de vitamina D
VDRE: Elemento de respuesta a vitamina D
XLH: Hipofosfatemia ligada al cromosoma X
Índices
INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
ASPECTOS GENERALES ASOCIADOS CON EL CONCEPTO DE ERC ..................................... 3
Hiperparatiroidismo secundario en la ERC ...................................................................... 6
Insuficiencia estrogénica en la ERC .................................................................................. 7
PARATHORMONA: ASPECTOS GENERALES Y REGULACIÓN DE SU SECRECIÓN ................ 8
Regulación de los niveles de PTH ................................................................................... 10
Reguladores clásicos .................................................................................................. 11
Otros reguladores de la PTH ...................................................................................... 18
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .................................................................................... 27
HIPÓTESIS DE TRABAJO .................................................................................................29
OBJETIVOS ....................................................................................................................29
MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 31
INTRODUCCIÓN A LA METODOLOGÍA ...........................................................................33
TÉCNICAS GENERALES DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL ................................................33
Animales ........................................................................................................................ 33
Extracción de las glándulas paratiroides ........................................................................ 34
Inducción de enfermedad renal crónica ........................................................................ 35
Realización de la ovariectomía ...................................................................................... 36
Determinaciones bioquímicas y análisis de la densidad mineral ósea .......................... 37
ESTUDIOS IN VITRO .......................................................................................................37
Modelo de cultivo de tejido paratiroideo ...................................................................... 37
Respuesta de las glándulas paratiroides al calcio ..................................................... 38
Respuesta de las glándulas paratiroides al calcitriol ................................................. 39
Cultivo de la línea celular osteoblástica UMR106.......................................................... 39
ESTUDIOS IN VIVO .........................................................................................................40
TÉCNICAS COMUNES IN VITRO/IN VIVO ........................................................................42
Extracción de ARN.......................................................................................................... 42
Síntesis de adn copia (ADNc) ......................................................................................... 43
PCR convencional ........................................................................................................... 43
PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) ..................................................................... 43
Índices
Sistema de detección de secuencias .......................................................................... 43
Análisis de la expresión génica .................................................................................. 44
Extracción de proteínas ................................................................................................. 46
Western blot .................................................................................................................. 47
Tinción inmunohistoquímica.......................................................................................... 48
Análisis estadístico ......................................................................................................... 49
PUBLICACIONES ................................................................................................51
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................83
ESTUDIO IN VITRO DE LA REGULACIÓN DE LA PTH POR CALCIO Y CALCITRIOL .............. 85
EFECTO DE LOS ESTRÓGENOS SOBRE LA REGULACIÓN DE LA PTH ................................. 95
CONCLUSIONES ............................................................................................... 107
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 111
OTRAS PUBLICACIONES ................................................................................... 133
Índices
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Interrelaciones entre calcio, fósforo, PTH, FGF23 y calcitriol .....................................................................5
Figura 2. Estructura de la PTH ..................................................................................................................................9
Figura 3. Estructura del CaSR .................................................................................................................................13
Figura 4. Mecanismo de acción del calcitriol unido al VDR ....................................................................................16
Figura 5. Cascada de señalización de FGF23 ..........................................................................................................20
Figura 6. Ejes PTH-vitamina D y hueso-FGF23-riñón ..............................................................................................21
Figura 7. Mecanismos de acción genómicos de los estrógenos ..............................................................................23
Figura 8. Aspecto del campo quirúrgico una vez abierto el cuello de la rata..........................................................35
Figura 9. Modelo de ERC propuesto por Ormrod y Miller .......................................................................................36
Figura 10. Modelo de cultivo de tejido paratiroideo ..............................................................................................38
Figura 11. Esquema del diseño experimental del estudio in vivo ............................................................................41
Figura 12. Método de la Comparación del Ciclo Umbral (CT)..................................................................................45
Figura 13. Comparación de pendientes entre el gen problema y el control endógeno ...........................................46
Figura 14. Puesta a punto del modelo de cultivo de las glándulas paratiroides .....................................................86
Figura 15. Análisis de los niveles de ARNm de PTH mediante qRT-PCR ..................................................................88
Figura 16. Análisis de los niveles de CaSR tras 24 horas de cultivo con diferentes concentraciones de calcio .......89
Figura 17. Análisis de los niveles de VDR tras 24 horas de cultivo con diferentes concentraciones de calcio .........90
Figura 18. Análisis de los niveles de VDR tras 24 horas de cultivo con calcitriol .....................................................92
Figura 19. Análisis de los niveles de CaSR tras 24 horas de cultivo con calcitriol....................................................93
Figura 20. Tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal anti-PCNA ...............................................94
Figura 21. Niveles séricos de iPTH en los diferentes grupos del estudio in vivo ......................................................97
Figura 22. Detección de ERα y ERß en las glándulas paratiroides. .........................................................................98
Figura 23. Niveles séricos de calcitriol y fósforo en los diferentes grupos del estudio in vivo ...............................100
Figura 24. Niveles séricos de FGF23 en los diferentes grupos del estudio in vivo) ................................................101
Figura 25. Análisis de los niveles de ARNm de en las glándulas paratiroides .......................................................103
Índices
Figura 26.Efecto del E2 sobre FGF23 en células osteoblásticas tras 24 horas de cultivo ...................................... 104
Figura 27. Efecto del E2 sobre FGF23 en células osteoblásticas tras 48 horas de cultivo ..................................... 104
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Análisis de diferentes parámetros bioquímicos y de la DMO .................................................................. 96
INTRODUCCIÓN
Introducción
3
El riñón y el hueso son los principales reguladores de la homeostasis del calcio y del
fósforo. El riñón, a través de la captación activa o el filtrado de calcio y fósforo a nivel del
túbulo proximal, es capaz de regular la homeostasis de dichos elementos en individuos
sanos. Por su parte, el hueso actúa como principal reservorio de calcio y fósforo pudiendo
ser movilizados si así fuera necesario. La hormona paratiroidea (PTH), la 1,25-
dihidroxivitamina D (calcitriol), y el factor de crecimiento fibroblástico 23 (FGF23) son las
principales hormonas involucradas en la regulación de calcio y fósforo. En pacientes con
enfermedad renal crónica (ERC) progresiva, los mecanismos homeostáticos normales están
alterados produciéndose un aumento de los niveles de FGF23 y PTH y una disminución de
los niveles de calcitriol. En estadios avanzados de enfermedad renal crónica, la mayoría de
estos pacientes presentan hiperfosfatemia, hipocalcemia e hiperparatiroidismo secundario,
además de un incremento en los niveles de FGF23 y un descenso de calcitriol. A lo largo de
la introducción de la presente tesis doctoral se describirá la función que juega cada uno de
estos factores en condiciones fisiológicas y en situaciones de ERC así como su regulación.
ASPECTOS GENERALES ASOCIADOS CON EL CONCEPTO DE
ENFERMEDAD RENAL CRÓNICA
La ERC se define como una disminución progresiva del filtrado glomerular que se
asocia, a medida que la insuficiencia renal avanza, con la pérdida de las funciones ejercidas
por el riñón.1 Entre estas funciones destacan la función hormonal, la regulación de la
homeostasis del medio interno, la excreción de sustancias derivadas del metabolismo
nitrogenado y otras funciones metabólicas. El deterioro progresivo de la función renal
determina la aparición de un conjunto de cambios hormonales y metabólicos entre los que
destacan las alteraciones del metabolismo de la vitamina D, del calcio, de la PTH y del
equilibrio ácido base, así como la acumulación en sangre de un conjunto desustancias no
bien definidas que se engloban con el término de toxinas urémicas.
El mantenimiento de la homeostasis del calcio y el fósforo es un proceso complejo
que depende de factores endocrinos y paracrinos, dentro de los primeros se encuentran las
Introducción
4
denominadas hormonas calciotropas: PTH, calcitonina, calcitriol y el FGF23.2 La regulación
hormonal se produce fundamentalmente a tres niveles: hueso, intestino y riñón.3-4
La progresión de la ERC conduce a un descenso en los niveles séricos de calcio y a
una tendencia a la retención de fósforo, a lo que la glándula paratiroides responde
incrementando la síntesis y liberación de PTH y el hueso estimulando la síntesis de FGF23.
En el hueso la PTH estimula tanto la resorción, a través de los osteoclastos, como la
formación ósea, activando los osteoblastos. Sin embargo, el balance neto es negativo, con
la consiguiente salida de calcio y fósforo del hueso.5 En el riñón, la PTH y el FGF23
aumentan la excreción tubular de fósforo y la PTH disminuye la excreción de calcio. El
aumento de PTH estimula la 1-α-hidroxilasa renal y con ello la síntesis de calcitriol,6
favoreciendo por un lado la absorción intestinal de calcio y de fósforo y por otro, la
inhibición de la síntesis de PTH. A su vez, el descenso de función renal disminuye la
excreción de fósforo, hecho que se traduce en ligeros aumentos del fósforo sérico que
tiene dos efectos, uno a nivel de la glándula paratiroides aumentando la síntesis de PTH y el
otro a nivel óseo estimulando la síntesis de FGF23. Ambos favorecen a nivel del túbulo
renal la excreción de fósforo. En el riñón el FGF23 inhibe la síntesis de 1-α-hidroxilasa y en
consecuencia los niveles de calcitriol y en la glándula paratiroides inhibe la síntesis y
secreción de PTH7-8 (Figura 1).
Introducción
5
Figura 1. Interrelaciones entre calcio (Ca2+
) y fósforo (P) y sus hormonas, PTH, FGF23 y calcitriol (1,25(OH)2D3). La capacidad del calcio para aumentar FGF23, y del bajo y alto fósforo para incrementar y disminuir respectivamente los niveles séricos de calcitriol no se muestran en la imagen. (Adaptado de Silver y col.
9).
En los individuos con función renal normal o con ERC grado 1, 2 ó 3, todos estos
mecanismos de regulación están interrelacionados y se encuentran activos, y el efecto
combinado de aumento de la PTH y de FGF23 es aumentar los niveles séricos de calcio y
disminuir los de fósforo. A medida que la ERC progresa y alcanza estadios más avanzados,
estos mecanismos de regulación van progresivamente alcanzando su nivel máximo de
regulación. A partir de estadios avanzados de ERC grado 4 y 5, estos mecanismos ya no son
suficientes y la homeostasis mineral se encuentra seriamente comprometida, donde
pequeñas reducciones en la función renal son capaces de provocar importantes
desequilibrios metabólicos.1
La ERC avanzada constituye, por tanto, un cuadro con serias consecuencias para el
hueso y algunos tejidos blandos (hiperparatiroidismo secundario, calcificaciones vasculares
y valvulares y calcifilaxis).4, 10-13 A su vez, esta situación se agrava por factores
sobreimpuestos como son la respuesta ante distintas modalidades terapéuticas14 y tipos de
enfermedad renal,15 acidosis,15 edad,16 sexo y raza.17
Introducción
6
El conjunto de estas alteraciones óseas y del metabolismo mineral asociadas con la
ERC se han definido durante 60 años como osteodistrofia renal (ODR);18 término que
englobaba, no sólo la respuesta espontánea del hueso frente a la ERC a consecuencia del
hiperparatiroidismo secundario, sino también a las distintas condiciones clínicas y
terapéuticas del paciente.19 Actualmente, el término ODR ha sido reemplazado por el
término “alteraciones óseas y minerales en la ERC” (en inglés CKD-MBD)20 que integra todas
las alteraciones bioquímicas, esqueléticas y calcificaciones extraesqueléticas que ocurren
como consecuencia de las alteraciones del metabolismo mineral en la ERC, quedando
restringido el término ODR a las alteraciones histológicas de la morfología y arquitectura
ósea propias de la ERC.
HIPERPARATIROIDISMO SECUNDARIO EN LA ERC
La progresión de la ERC y la hiperfunción en la glándula paratiroides tiene como
consecuencia más directa el incremento de los niveles sistémicos de PTH. A lo largo de los
años, se han ido identificando un cúmulo de factores que colaboran en el desarrollo y la
progresión del hiperparatiroidismo secundario, y que a veces condicionan un aumento de la
morbi-mortalidad de los pacientes con ERC grados 3-5.11
El primer factor patogénico descrito como desencadenante del hiperparatiroidismo
secundario fue la hipocalcemia.21 Aunque los niveles de calcio pueden verse alterados por
distintas causas, el principal responsable de esta hipocalcemia es un descenso en la síntesis
de calcitriol como consecuencia del descenso de producción de 1-α-hidroxilasa a nivel
tubular renal secundario a la pérdida de parénquima renal funcionante.21-22 Este descenso
de los niveles de calcitriol reduce la absorción intestinal de calcio y favorece la tendencia al
descenso de los niveles plasmáticos del mismo. La disminución del calcio sérico estimula la
síntesis y secreción de PTH en las glándulas paratiroides que a su vez ejerce acciones en el
hueso, en el riñón e indirectamente en el tracto digestivo tratando de normalizar el calcio
sérico. Además, varios estudios han descrito un efecto inhibitorio directo del calcitriol sobre
la síntesis de la hormona.23-24
A principios de los años setenta, se confirmó que la hiperfosforemia también tenía
Introducción
7
un papel relevante en la etiopatogenia del hiperparatiroidismo secundario.21, 25 En un
principio, el incremento en la secreción de PTH se atribuyó a la capacidad del fósforo para
disminuir los niveles de calcio sérico.26 Sin embargo, a lo largo de la década siguiente se
comprobó que la estimulación de la PTH se produce también a otros niveles. Por un lado, el
fósforo inhibe la síntesis de 1-α-hidroxilasa renal y con ello la síntesis de calcitriol.27-28
Además, el fósforo tiene un efecto directo e independiente del calcio sobre la síntesis de
PTH21, 28-29 y sobre la proliferación de las células de la glándula paratiroides.30-31
Por último, al igual que ocurre con la ERC avanzada y los niveles elevados de urea y
creatinina sérica, conocidos como “uremia”, el fósforo es capaz de inducir resistencia
esquelética a la PTH,32-33 que en términos prácticos implica que se necesiten niveles de PTH
más elevados que en los individuos con función renal normal para mantener el mismo
remodelado óseo.
En los últimos años se han hecho grandes aportes al conocimiento de los
mecanismos involucrados en la progresión del hiperparatiroidismo secundario, tanto en su
fisiopatología como en sus bases moleculares.23, 25, 34-36 Sin embargo, el manejo clínico de
este cuadro sigue siendo complejo y difícil.16, 37-38 Su importancia se ha acentuado al
demostrarse las implicaciones del hiperparatiroidismo secundario y de las alteraciones del
eje calcio-fósforo-vitamina D en la morbi-mortalidad cardiovascular de los pacientes en
diálisis.10-12
INSUFICIENCIA ESTROGÉNICA EN LA ERC
Además de las alteraciones metabólicas descritas anteriormente como
consecuencia de la pérdida de función renal, en las mujeres con ERC son frecuentes a
edades tempranas ciclos anovulatorios, amenorreas, alteraciones del ciclo menstrual e
incluso infertilidad.39-40 La causa de estas alteraciones es un defecto en la regulación
hipotalámica de la secreción de gonadotropinas que se traduce en unos menores niveles de
17β-estradiol, descenso de los niveles relativos de las hormonas folículoestimulante (FSH) y
hormona lutenizante (LH) y un aumento en los niveles de prolactina. Además, en
situaciones de ERC parece disminuir el catabolismo de los estrógenos y afectar a la
Introducción
8
farmacocinética del 17β-estradiol exógeno.41
El conjunto de todas estas alteraciones conlleva a un incremento en el riesgo de
sufrir alteraciones, tales como aumento del riesgo de ateroesclerosis y enfermedad
coronaria, disminución de la capacidad cognitiva y alteraciones del metabolismo óseo,
tanto en edades tempranas como en la postmenopausia.42-44 En esta última, el riesgo se ve
incrementado como consecuencia de los efectos aditivos de la deficiencia estrogénica y de
la ERC. Las alteraciones del metabolismo óseo y mineral como consecuencia de la ERC, tales
como déficit de calcitriol, retención de fósforo, hipocalcemia y alteración de la función
paratiroidea,45-46 unidas a la deficiencia estrogénica que tiene lugar en la menopausia,
llevan a proponer terapias combinadas de 17β-estradiol con calcitriol como una buena
alternativa en la prevención de la pérdida de masa ósea en estados de insuficiencia renal y
ovárica, debido a un posible efecto sinérgico de ambas hormonas.47
PARATHORMONA: ASPECTOS GENERALES Y REGULACIÓN DE SU
SECRECIÓN
Las glándulas paratiroides son glándulas endocrinas situadas en la cápsula del
tiroides, adheridas a ésta en su cara posterior, pero separadas de la sustancia tiroidea por
una fina cápsula conjuntiva. Las glándulas paratiroides se encuentran constituidas por dos
tipos celulares, las células principales y las células oxífilas, entre las que hay un armazón de
fibras reticulares que soportan una rica red capilar y fibras nerviosas.48-49 Mientras que las
células principales son las responsables de sintetizar y secretar PTH,50 la función de las
células oxífilas no está clara, aunque todo parece indicar que son células principales
envejecidas o vacías que no secretan más hormona,51 por tanto, la función de las glándulas
paratiroides es sintetizar y secretar PTH con el fin de mantener, junto con la calcitonina
producida en el tiroides y con los mecanismos que regulan la absorción y excreción de
calcio, los niveles séricos de calcio en intervalos normales.
La PTH es un polipéptido de 84 aminoácidos que se sintetiza en las glándulas
paratiroides. En humanos, el gen de la PTH está localizado en el brazo corto del cromosoma
Introducción
9
11 y contiene tres exones.52 El exón 1 codifica la región 5´ no traducida, el exón 2 codifica la
secuencia señal y parte de la pro-hormona y, por último, el exón 3 codifica el resto de la
pro-hormona y la región 3´ no traducida (Figura 2A).53-54 La PTH se sintetiza como un
precursor inmaduro de 115 aminoácidos de vida media corta denominado pre-pro-PTH.
Este precursor contiene una secuencia amino(N)-terminal de 25 residuos (secuencia pre),
rica en aminoácidos hidrofóbicos, que es eliminada durante la traducción liberándose pro-
PTH a la luz del retículo endoplásmico. Posteriormente, la pro-PTH es procesada en el
aparato de Golgi, donde una peptidasa elimina 6 aminoácidos del extremo N-terminal
(secuencia pro) dando lugar a un péptido de 84 aminoácidos que constituye la hormona
madura y cuya secuencia está muy conservada entre las distintas especies (Figura 2B). Estas
dos secuencias que se eliminan durante el procesamiento, son críticas para el transporte
específico al retículo endoplásmico y para la correcta obtención de la forma madura de la
hormona. La secuencia contiene además un extremo carboxi(C)-terminal que tiene un
posible papel en asegurar el procesamiento y el transporte de la hormona al aparato
secretor de la paratiroides.55
Figura 2. Estructura de la PTH. A) Esquema del gen de la PTH. La región codificante se representa en color anaranjado (parte de los exones 2 y 3). B) Secuencia de aminoácidos de la PTH humana señalando las diferencias con otras especies. Los porcentajes de identidad con respecto a la secuencia de humanos para bovino, porcino y rata son, respectivamente: 86%, 86% y 75%.(Adaptado de Coleman y col.
56).
VAL GLUH2N -5 10 15
20
2530
35
45 50
55
6065
70
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Humana Bovina Porcina Rata
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SER
PRO
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3´5´
Exón 1 Exón 2 Exón 3
Pre-pro-PTH
Intrón 1
Intrón 2
3´5´
Exón 1 Exón 2 Exón 3
Pre-pro-PTH
Intrón 1
Intrón 2
A B
Introducción
10
Finalmente, la PTH madura o PTH intacta (iPTH) se almacena en unos gránulos de
secreción citoplasmáticos desde los cuales la hormona puede secretarse a la circulación
sistémica o degradarse.57-58 La hormona que se secreta es básicamente la iPTH aunque en la
circulación puede sufrir más cortes proteolíticos dando lugar a diversos péptidos
paratiroideos circulantes con diferente función y que actúan a través de diferentes
receptores.59
La iPTH es la responsable de las funciones clásicas sobre hueso, riñón y la síntesis de
1-α-hidroxilasa induciendo la síntesis de calcitriol,3-4 con el último fin de aumentar el calcio
plasmático. Estas acciones clásicas de la iPTH están mediadas por un receptor, el PTHR1,
común para la PTH y para la proteína relacionada con la PTH (PTHrP),60 presente en muchos
tejidos. Sin embargo, existen también los denominados fragmentos C-terminales a los que
les falta algún aminoácido en la posición N-terminal de la molécula, que presentan efectos
biológicos antagónicos a los de la molécula intacta, es decir, poseen efectos
hipocalcemiantes, hiperfosfatémicos e hipofosfatúricos.61-63 Estos fragmentos de tipo C-
terminal ejercen su acción a través de un receptor diferente al PTHR1, el CPTHR, que aún
no está bien definido ni clonado.61, 64
Debido a esta variedad de péptidos paratiroideos y a la diferente función de cada
uno de ellos, la glándula paratiroidea libera iPTH y/o fragmentos C-terminales dependiendo
de los niveles de calcemia; mientras que en situación de hipocalcemia la proporción de iPTH
secretada es mayor, en condiciones de hipercalcemia se incrementa la cantidad de
fragmentos C-terminales secretados.
REGULACIÓN DE LOS NIVELES DE PTH
La regulación de los niveles de PTH se encuentra controlada por un mecanismo
complejo de retroalimentación, en el cual, los niveles de calcio iónico,65 el calcitriol66 o sus
derivados,67-68 o los niveles bajos de fósforo69 inhiben la secreción de PTH, denominándose
a estos tres factores como reguladores clásicos de la función paratiroidea. Sin embargo, se
han descrito también otros factores que pueden actuar sobre la glándula paratiroides
modificando la síntesis y/o secreción de PTH entre los que se encuentran los estrógenos,70
Introducción
11
el magnesio, los corticoides, ciertas citocinas71 y más recientemente se ha añadido a esta
lista el FGF23, capaz de inhibir directamente la síntesis y secreción de PTH.8
REGULADORES CLÁSICOS
Fósforo
El fósforo es uno de los factores que actúa directamente sobre las glándulas
paratiroides regulando la síntesis y secreción de PTH. El aumento en los niveles de fósforo
sérico produce un importante incremento en la secreción de PTH que durante mucho
tiempo se creyó que se debía fundamentalmente a un efecto indirecto del fósforo sobre los
niveles de calcio y calcitriol.72 Sin embargo, estudios posteriores tanto in vivo como in
vitro,29, 73-75 han demostrado un efecto directo del fósforo sobre la secreción de la PTH por
mecanismos independientes del calcio y calcitriol. Por otro lado además, el fósforo es capaz
de regular a nivel post-transcripcional la expresión del gen de la PTH.76 En este proceso
estarían implicadas diversas proteínas citosólicas, capaces de unirse a secuencias
específicas en la región 3´ no traducida de la molécula del ácido ribonucleico mensajero
(ARNm), que estabilizarían el transcrito de PTH y evitarían su degradación. Por el contrario,
en presencia de niveles bajos de fósforo, se produciría un descenso de estos factores
protectores y se desestabilizaría el ARNm, favoreciendo su degradación.77
El fósforo también ha demostrado ser un importante estímulo proliferativo para las
células de la glándula paratiroides; numerosos estudios han demostrado que en animales
con ERC, una dieta alta en fósforo ocasiona una hiperplasia de las glándulas paratiroides sin
que se observen cambios en los niveles de calcio y calcitriol.31, 29, 78 El mecanismo
subyacente por el cual el fósforo estimula la hiperplasia de paratiroides guarda relación con
su capacidad para activar las vías de proliferación mediadas por el factor de crecimiento
transformante α (TGF-α) y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).79-80
Calcio. Receptor sensor de calcio
El calcio iónico extracelular es el principal regulador de la glándula paratiroides.3
Niveles de calcio iónico extracelular bajos estimulan la secreción de PTH en cuestión de
Introducción
12
segundos-minutos, mientras que niveles elevados inhiben la liberación de la hormona y
además favorecen su degradación dentro de las propias células paratiroideas.3, 77, 81 El
resultado es una respuesta de la glándula paratiroides de tipo sigmoidal en la que pequeños
cambios en calcio iónico extracelular provocan grandes variaciones de PTH, consiguiéndose
su máxima inhibición en hipercalcemia. Basándose en estas observaciones se desarrolló el
concepto de set-point, el cual representa la concentración de calcio necesaria para reducir
en un 50% la secreción de PTH.82-85 En los pacientes urémicos, el set-point del calcio, se
encuentra desplazado hacia la derecha,34, 86 es decir, se requiere un mayor nivel de calcio
iónico extracelular para reducir la PTH. Estos hallazgos hicieron sospechar sobre la
existencia de un receptor sensor de calcio (o receptor sensible a calcio, CaSR) en la
membrana de las células paratiroideas, capaz de regular la secreción de PTH en función de
los niveles de calcio iónico extracelular. En 1993 dicho receptor fue clonado y caracterizado
en glándulas paratiroides bovinas, demostrando tener no sólo propiedades de receptor sino
también de sensor de calcio.87 El CaSR es un receptor de la familia de receptores acoplados
a proteínas G formado por un largo dominio extracelular de 612 aminoácidos. A
continuación posee un dominio de anclaje a la membrana formado por siete hélices
transmembrana, característico de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G y
finalmente, un dominio citoplasmático que corresponde con el extremo carboxilo de la
molécula (Figura 3).88
Aún no se conocen en su totalidad los mecanismos moleculares por los que el CaSR
ejerce sus acciones, aunque sí se ha demostrado que es capaz de activar múltiples cascadas
de señalización. Los agonistas del CaSR activan las fosfolipasas C, A2 y D tanto en células
renales de embrión humano (HEK293) transfectadas con el CaSR, como en células
paratiroides bovinas en cultivo.89 El aumento del calcio iónico extracelular provoca la
activación de la fosfolipasa C a través de la subunidad Gq del receptor. La fosfolipasa C
metaboliza al fosfatidil inositol 4,5 difosfato liberando inositol 1,4,5 trifosfato. Esto produce
un aumento del calcio citosólico a través de la movilización de los depósitos celulares y de
la activación de canales de calcio voltaje-dependientes y de otros canales no específicos.
Por otro lado, la subunidad Gi del CaSR inhibe la adenilato ciclasa, y con ello disminuyen los
Introducción
13
niveles de AMP cíclico. El aumento del calcio iónico extracelular también produce
incrementos en la liberación de ácido araquidónico en células HEK293 transfectadas con el
CaSR pero no en las mismas células no transfectadas, indicando que el CaSR está implicado
en la activación de la fosfolipasa A2.89 Del mismo modo, el calcio iónico extracelular también
es capaz de incrementar la formación de fosfatidilbutanol, un marcador de activación de la
fosfolipasa D, demostrando que el CaSR está implicado en la activación de dicha señal
intracelular. Como resultado final de la activación del CaSR se produce la inhibición de la
síntesis y liberación de PTH.
Figura 3. Estructura del CaSR. Los residuos ácidos se representan en rojo. PKC: Protein-quinasa C. (Adaptado de Brown y col.
88).
Además de su papel en la regulación del metabolismo de la PTH, el CaSR y el calcio
tienen un efecto inhibitorio sobre la proliferación celular de la glándula paratiroides. La
activación del CaSR por el calcio permite la fosforilación de ERK, quinasa involucrada en la
proliferación celular,90 apostando por tanto por la activación del CaSR por calcio como
factor proliferativo en la glándula paratiroides. Sin embargo, estudios en pacientes con
Péptido señal
9 sitios de N-glicosilación
1 2 3 4 5 6 7
Regiones implicadas en
la unión de Ca+2
P
PP
P
Sitios potenciales de fosforilación por PKC
7 hélices transmembrana(Característico de receptores
acoplados a proteínas G)
NH2
HCOO
1
Péptido señal
9 sitios de N-glicosilación
1 2 3 4 5 6 7
Regiones implicadas en
la unión de Ca+2
P
PP
P
Sitios potenciales de fosforilación por PKC
7 hélices transmembrana(Característico de receptores
acoplados a proteínas G)
NH2
HCOO
1
Introducción
14
ERC,91-92 y en modelos de experimentación animal93 han establecido una relación inversa
entre la hiperplasia de la glándula paratiroides y el descenso en los niveles del ARNm y
proteína de CaSR probablemente como un mecanismo de respuesta frente a la
proliferación puesto que se ha demostrado que el descenso en la expresión de CaSR es
secundario a la hiperplasia de la glándula.94 En conjunto, estos resultados indicarían que el
CaSR juega un papel fundamental en el desarrollo, progresión y función de las glándulas
paratiroides en la ERC.
Aunque la expresión del CaSR, tanto de su ARNm como de su proteína, puede verse
alterada en multitud de circunstancias, en la mayoría de los casos las razones por las que
esto ocurre no han sido esclarecidas. Si bien la principal acción del CaSR es detectar
cambios en el calcio extracelular, su expresión en glándulas paratiroides y en riñón no
parece depender de los niveles del mismo. Estudios in vivo han demostrado que animales
alimentados con una dieta alta o baja en calcio no muestran diferencias en los niveles de
CaSR en dichos tejidos, sugiriendo que el calcio no tiene un efecto regulador sobre su
propio receptor.95-96 Sin embargo, otros autores han descrito un aumento en los niveles de
óseos de CaSR en ratas con ERC y dieta alta en calcio, aunque la expresión del receptor en
las glándulas paratiroides y/o riñón no fue evaluada.97
Además de la posible regulación del CaSR por el calcio, también se ha sugerido un
cierto efecto de otros reguladores de la PTH, como el fósforo y el calcitriol, sobre la
expresión del receptor, si bien los resultados son contradictorios. Algunos estudios han
descrito que una dieta alta en fósforo es capaz de reducir la expresión del CaSR,93-94, 98
mientras que por el contrario, otros estudios previos con animales in vivo no habían podido
encontrar cambios en la expresión de CaSR en glándulas paratiroides con dieta alta o baja
en fósforo.36, 99 Por otro lado, también se ha descrito que el calcitriol podría regular el CaSR,
aunque en este campo los resultados son todavía contradictorios. Mientras que algunos
autores no detectan variaciones en los niveles de CaSR ni en glándulas paratiroides ni en
riñón con calcitriol,96 otros sólo encuentran aumento de CaSR en condiciones de normo- e
hipercalcemia.95, 100 Se ha especulado que este efecto del calcitriol sobre el CaSR podría
estar mediado a través de elementos de respuesta a vitamina D (VDRE), que también están
Introducción
15
presentes en el promotor del gen del CaSR.101
Por último, otros factores que han sido descritos como capaces de modificar los
niveles del CaSR son el aluminio y los calcimiméticos. Existen estudios que han demostrado
que el aluminio es capaz de reducir de forma dosis dependiente los niveles de ARNm de
PTH en ratas con ERC102 y que también es capaz de inhibir la expresión génica del CaSR a
través de un mecanismo post-transcripcional, si bien no se observaron cambios a nivel de
proteína.103 Por otro lado, los calcimiméticos, fármacos utilizados como alternativa
terapéutica al calcitriol para el tratamiento del hiperparatiroidismo secundario, actúan
como moduladores alostéricos del CaSR aumentando su sensibilidad al calcio y provocando
un desplazamiento hacia la izquierda del set-point del calcio con el consiguiente rápido
descenso de los niveles de PTH.104-107 Además, ha sido demostrado recientemente que los
calcimiméticos incrementan los niveles de CaSR en ratas urémicas.98, 108
Calcitriol. Receptor de vitamina D
El calcitriol es también un importante regulador de la glándula paratiroides y ejerce
un efecto directo sobre la PTH, inhibiendo la síntesis del ARNm.77
El calcitriol actúa sobre la glándula paratiroides a través de su receptor específico,
el receptor de vitamina D (VDR), un receptor de alta afinidad y especificidad que pertenece
a la familia de los receptores esteroideos/tiroideos. Cuando el calcitriol se une a su
receptor, se produce la translocación del complejo calcitriol-VDR al núcleo de la célula,
formando un heterodímero con el receptor retinoide X (RXR). El complejo calcitriol-VDR-
RXR se une a VDRE presentes en la región promotora del gen de la PTH, bloqueando su
trascripción (Figura 4).77, 109-110 Además, el calcitriol es capaz de inhibir indirectamente la
secreción de PTH aumentando la absorción de calcio en el intestino y a la vez, estimulando
la resorción de los depósitos óseos de calcio.110
En el hiperparatiroidismo secundario de la ERC, se ha demostrado que en las
glándulas paratiroides existe una reducida densidad de VDR en comparación con individuos
sanos.66 Esta reducción es parcialmente responsable de una menor respuesta al calcitriol y
por tanto de un inadecuado control en la transcripción del gen de la PTH que en última
Introducción
16
instancia, induce un aumento en los niveles de PTH. De hecho, en el hiperparatiroidismo
secundario severo, donde el crecimiento glandular es predominantemente nodular, se
observa una disminución en la densidad de receptores VDR que es en gran parte la
responsable en muchos casos de la falta de respuesta de los pacientes al tratamiento con
calcitriol.67
Figura 4. Modelo simplificado del mecanismo de acción del calcitriol unido al VDR. El calcitriol se transporta en sangre unido a DBP (proteína de unión a vitamina D) y no se conoce todavía el mecanismo exacto por el que entra en la célula diana (unido a DBP o por simple difusión). En el citoplasma parte se degrada y parte se une al VDR, que dimeriza con el RXR (receptor retinoide X) en el núcleo y dicho heterodímero se unirá a las secuencias VDRE (elementos de respuesta a vitamina D) en el ADN de diferentes genes induciendo (flecha verde) o reprimiendo (flecha roja) su transcripción. (Adaptado de Brown y col.
111).
El calcitriol es también un importante regulador de la proliferación de la glándula
paratiroides y otros tejidos.31, 112 Niveles bajos de calcitriol favorecen la proliferación
celular, mientras que niveles altos protegen de la aparición de la hiperplasia de la
glándula.31, 34, 113-114 Dicho efecto estaría debido, al menos en parte, a cambios en el calcio
sérico, puesto que el déficit de calcitriol ejerce los mismos efectos que una dieta baja en
calcio.31 Sin embargo, se ha observado que el calcitriol puede ejercer un efecto
antiproliferativo independiente del calcio,79 que se acompaña de un freno en el incremento
del TGF-α y EGFR, principales responsables del desarrollo de hiperplasia en la glándula
paratiroides.79-80
PTHPTHrP
Colágeno tipo1c-mycIL-2
1α- hidroxilasa
CalbindinaOsteocalcinaOsteopontina24-hidroxilasa
p-21Β3-integrina
DBP
calcitriol
VDR
RXR
coactivador
Factor basalde transcripción
ARN polimerasa II
PTHPTHrP
Colágeno tipo1c-mycIL-2
1α- hidroxilasa
CalbindinaOsteocalcinaOsteopontina24-hidroxilasa
p-21Β3-integrina
PTHPTHrP
Colágeno tipo1c-mycIL-2
1α- hidroxilasa
CalbindinaOsteocalcinaOsteopontina24-hidroxilasa
p-21Β3-integrina
DBP
calcitriol
VDR
RXR
coactivador
Factor basalde transcripción
ARN polimerasa II
Introducción
17
A diferencia de lo que ocurre con el calcio y el CaSR, el calcitriol regula la expresión
de su propio receptor -VDR-, estimulando su síntesis y aumentando su vida media;115-116 por
ello, el déficit de calcitriol observado en pacientes con ERC se asocia con un descenso en los
niveles de VDR en la glándula paratiroides.117 Hasta la fecha, todos los estudios del efecto
del calcitriol sobre los niveles de VDR han sido llevados a cabo in vivo,100, 118-119 demostrando
que la regulación de VDR por calcitriol había sido efectiva sólo en condiciones de
hipercalcemia y normocalcemia y no en hipocalcemia, y postulando que los niveles de
calcio parecen críticos para el control de los niveles de VDR.
A pesar de que el VDR es el receptor específico del calcitriol y de otros activadores
del VDR, el calcio es capaz también de regular los niveles de VDR. Diversos trabajos in vivo e
in vitro han descrito este efecto en glándulas paratorides.100, 119-120 Esta tendencia ha sido
también descrita en otros trabajos demostrando que el calcio ejerce un claro efecto sobre
la expresión del VDR de manera indirecta, a través del ácido araquidónico liberado como
consecuencia de la activación del CaSR por el calcio.100, 121 Este efecto del calcio sobre el
VDR ha sido recientemente observado también en riñón en células del túbulo proximal.122
Así, el incremento de la PTH inducido por hipocalcemia produce un descenso de los niveles
de VDR en el riñón que se corrige, al menos parcialmente, cuando se recuperan los niveles
normales de calcio. El mecanismo subyacente por el cual el calcio incrementa los niveles de
VDR podría estar mediado por el CaSR.120, 122
Existen estudios que han demostrado que el fósforo podría modificar la expresión
del VDR, si bien este efecto podría ser tejido-específico ya que en el intestino el fósforo
podría aumentar la expresión de VDR mientras que en riñón podría disminuirla.123
Del mismo modo que ya se ha comentado que los calcimiméticos modulan el CaSR,
también han demostrado ser capaces de actuar directamente sobre el VDR aumentando su
expresión y facilitando por tanto la reducción de síntesis de PTH.108, 124 Sin embargo, el
mecanismo molecular responsable del efecto de los calcimiméticos sobre el VDR se
desconoce hasta el momento.
Introducción
18
OTROS REGULADORES DE LA PTH
Factor de crecimiento fibroblástico 23 (FGF23)
Además de los clásicos reguladores de la PTH y el metabolismo mineral,
recientemente se ha descrito al FGF23 como otro factor importante involucrado en la
regulación del eje calcio-fósforo-vitamina D-PTH.
El FGF23 es una proteína de 32 kiloDaltons (kDa) que se sintetiza mayoritariamente
en el hueso, concretamente en los osteocitos y osteoblastos aunque también se ha
detectado la expresión de FGF23 en otros tejidos como en el timo, nódulos linfáticos y
cerebro. 125-127 En el año 2000, el FGF23 fue clonado por primera vez en ratones y se definió
como un nuevo miembro de la familia de los factores de crecimiento fibloblásticos
(FGFs).127 En humanos, el gen del FGF23 se encuentra localizado en el brazo corto del
cromosoma 12 y codifica una proteína de 251 aminoácidos, con un dominio N-terminal
homólogo en todos los miembros de la familia de los FGFs, y con un dominio C-terminal
único característico de este factor.128 Posteriormente a su clonación, se definió al FGF23
como responsable de diversas enfermedades como la hipofosfatemia ligada al X (XLH),129 el
raquitismo hipofosfatémico autosómico dominante (ADHR),130 el recesivo (ARHR)131 y la
osteomalacia inducida por tumores;132 todas ellas caracterizadas por hipofosfatemia,
hiperfosfaturia y mineralización ósea defectuosa. Estos hallazgos junto con estudios
experimentales in vivo,133-137 han permitido caracterizar al FGF23 como una de las
fosfatoninas más potentes que inducen pérdida renal de fósforo.
Los diferentes FGFs ejercen sus acciones sobres sus tejidos dianas mediante su
unión con uno de los cuatro receptores específicos (FGFR). Estudios in vitro han
demostrado que el FGF23 es capaz de activar los receptores FGFR1c, 3c y 4c.138-139 Sin
embargo, la afinidad que el FGF23 presenta por estos receptores es baja y requiere de la
unión de un co-receptor para aumentar su afinidad por su receptor y así ejercer sus
funciones. El co-receptor necesario para la activación del FGFR por FGF23 es klotho, una
proteína transmembrana responsable de la especificidad tisular del FGF23.138, 140-141
Mientras que el extremo N-terminal del FGF23 se une y activa al FGFR, es la región C-
Introducción
19
terminal del FGF23 la que interacciona con klotho.142-143 Todo estos hallazgos permitieron
explicar porqué los ratones mutantes nulos para FGF23 o para klotho presentaban un
fenotipo idéntico, caracterizado por envejecimiento prematuro, hiperfosfatemia,
hipercalcemia, niveles séricos de calcitriol elevados e incluso calcificaciones vasculares.135,
144-145 A pesar de que klotho puede unirse a FGFR1c, 3c y 4c y aumentar su afinidad al
FGF23,142 estudios recientes han mostrado que la señalización de FGF23 dependiente de
klotho está restringida al FGFR1c y que ni FGFR3c ni FGFR4c son los principales mediadores
del efecto de FGF23 en el riñón,143, 146 definiendo al FGFR1c como el receptor crítico para el
FGF23. En resumen, FGF23 forma un complejo con el heterodímero klotho-FGFR en la
superficie de las células diana y activa cascadas de señalización intracelular como la
activación del factor de respuesta temprana de crecimiento 1 (Egr-1), la fosforilación del
sustrato 2a del FGFR, ERK, p38, JNK y AKT.138, 140, 143 Además, se ha descrito que el complejo
FGF23-FGFR-klotho permite la inducción del factor Nab-2, correpresor específico de Egr-1
capaz de suprimir la actividad transcripcional de Egr-1,147 estableciendo así un sistema de
retroalimentación negativo para regular las actividades fisiológicas de FGF23 (Figura 5).
El riñón es el principal órgano diana del FGF23 donde éste ejerce su acción
fosfatúrica. El FGF23 en las células del túbulo proximal suprime la expresión del co-
transportador de sodio-fosfato tipo II (Na-Pi II), responsable de la reabsorción tubular del
fosfato adquirido con la dieta, provocando una mayor excreción de fósforo por la orina.135,
148 En este sentido, es importante reseñar que si bien el co-transportador Na-Pi II se
encuentra en las células de túbulo proximal, la acción que ejerce FGF23 tiene lugar a nivel
distal149 y por lo tanto no debe descartarse la existencia de un factor paracrino, aún sin
identificar, responsable de mediar los efectos del FGF23 a nivel proximal. Además de la
supresión del co-transportador Na-Pi II, el FGF23 suprime la expresión del enzima 1-α-
hidroxilasa renal, responsable de la síntesis de calcitriol135, 148 y estimula la expresión de la
24-hidroxilasa, enzima responsable de hidrolizar el calcitriol generando metabolitos con
menor actividad biológica.
Introducción
20
Figura 5. Cascada de señalización de FGF23. La señalización FGF23-FGFR requiere a klotho como co-factor para la inducción de moléculas de señalización intracelular como Egr-1. También se muestra la inducción de Nab-2 por FGF23 capaz de bloquear Egr-1. (Adaptado de Razzaque y col.
150).
Además del riñón, la glándula paratiroides, al co-expresar klotho y FGFR1 en sus
células, puede definirse como otro órgano diana para el FGF23.144, 151 El posible efecto del
FGF23 sobre la de PTH ha sido un tema controvertido pues los resultados sobre si FGF23
estimula o inhibe la PTH eran contradictorios. Mientras que un trabajo con ratones
transgénicos que sobreexpresaban FGF23 mostraba hipofosfatemia y niveles bajos de
calcitriol y PTH,136 otros trabajos también con ratones transgénicos para el FGF23
mostraron una hiperplasia de la glándula paratiroides que se correlacionaba con altos
niveles de PTH.133-134 Además se ha descrito que en pacientes con ERC no sólo los niveles de
FGF23 y de PTH se encuentran elevados152 sino que los niveles de FGF23 se correlacionan
con la progresión del fallo renal,153-154 el desarrollo de hiperparatiroidismo secundario,155 así
como con mortalidad en pacientes diálisis.156 Todo ello parece indicar que el FGF23 podría
estimular la PTH. Sin embargo, trabajos recientes han demostrado que el FGF23 es capaz,
tanto in vivo como in vitro, de inhibir la síntesis y secreción de PTH a través de la activación
de la vía de las MAPKs,8, 157 y que la coexistencia de niveles elevados de FGF23 y PTH en
pacientes urémicos con hiperparatiroidismo secundario son consecuencia de un descenso
Introducción
21
en los niveles de klotho y FGFR1 en la glándula paratiroides que hacen a la glándula
resistente al FGF23.158-159 Además del riñón y de las glándulas paratiroides, otros posibles
órganos diana para el FGF23 son la glándula pituitaria y el plexo coroideo cerebral, al
presentar ambos expresión de klotho y FGFR1; si bien la función de FGF23 en estos tejidos
es desconocida por el momento.
Tradicionalmente, las alteraciones en la homeostasis del fósforo en la ERC se veían
desde la perspectiva del eje PTH-vitamina D, donde la principal función del eje era el
mantenimiento de los niveles de calcio séricos, y donde la PTH era la principal hormona
fosfatúrica. Sin embargo, la homeostasis de fósforo es más compleja y el eje PTH-vitamina
D en muchas ocasiones no podía explicar las alteraciones observadas. Con el
descubrimiento del FGF23 y el conocimiento de su papel en el mantenimiento de la
homeostasis del fósforo, se ha definido un nuevo eje, el hueso-FGF23-riñón, capaz de
regular la homeostasis del fósforo y del calcitriol independientemente del eje PTH-vitamina
D (Figura 6).
Figura 6. A) Eje PTH-vitamina D. La principal función de este eje es regular la homeostasis del calcio. Un descenso en los niveles séricos de calcio estimula la secreción de PTH que actúa en el riñón para reducir la excreción de calcio, estimular la 1-α-hidroxilasa y favorecer la excreción de fosfato y en el hueso favoreciendo la resorción ósea liberando calcio y fósforo. El incremento de 1,25(OH)2D3 actúa en el intestino para aumentar la absorción de calcio que suprime la PTH. B) Eje hueso-FGF23-riñón. El FGF23 sintetizado en el hueso actúa sobre el riñón disminuyendo los niveles séricos de fosfato e inhibiendo la síntesis de 1,25(OH)2D3, estimulando la excreción de fosfato e inhibiendo la 1-α-hidroxilasa, respectivamente. Además FGF23 actúa directamente sobre la glándula paratiroides inhibiendo la síntesis de PTH.(Adaptado de Stubbs y col.
160).
Absorción Ca2+
Absorción PO42+
Ca2+ sérico
PTH
1,25(OH)2D3
Liberación Ca2+
Liberación PO42+
Reabsorción Ca2+
Reabsorción PO42+
A
Absorción Ca2+
Absorción PO42+
1,25(OH)2D3 PO42+ sérico
FGF23-
-
-
PTH
1,25(OH)2D3
Reabsorción PO42+
B
Introducción
22
Estrógenos
Los estrógenos son hormonas esteroideas que se sintetizan principalmente en el
ovario a partir del colesterol y en respuesta a los estímulos de las gonadotropinas, FSH y LH.
Los estrógenos ejercen sus efectos sobre sus órganos diana a través de sus receptores
específicos, los receptores estrogénicos (ERs). Los ERs pertenecen a la familia de los
receptores nucleares, localizados principalmente en el citoplasma. Durante varios años se
pensó que sólo existía un tipo de receptor, hoy conocido como ERα. Sin embargo en los
años 90, se identificó otra proteína codificada por un gen diferente, que se denominó
ERβ.161-162 Ambos receptores tienen una estructura similar, característica de la familia de los
receptores nucleares. Presentan un dominio central de unión al ácido desoxirribonucleico
(ADN) (DBD) altamente conservado donde se encuentran dos dominios denominados dedos
de zinc que reconocen secuencias presentes en el promotor de los genes diana
denominadas elementos de respuesta a estrógenos (ERE)163 y que pueden mediar en la
activación transcripcional.
El mecanismo de acción de los estrógenos es complejo. Los estrógenos actúan
sobre sus órganos diana a través de acciones genómicas o no genómicas mediadas por los
ERs. Las acciones genómicas son consideradas como la vía clásica de señalización
estrogénica. Es un proceso de unos 30-45 minutos de duración, sin embargo el tiempo
necesario para conseguir una cantidad de proteína adecuada puede llevar incluso horas.164-
166 A través de esta vía, los estrógenos atraviesan la membrana plasmática por difusión
pasiva, y una vez en el citoplasma se unen a los ERs. La interacción ligando-receptor
produce un cambio conformacional que permite la translocación del complejo al núcleo.167-
169 Una vez en el núcleo, el ER se une directamente y con gran afinidad a las regiones ERE
presentes en los promotores de los genes diana (Figura 7A).170 Además de esta clásica
unión al ERE, otros promotores génicos requieren un segundo factor de transcripción de
unión al ADN, como los factores Sp-1 o AP-1. En este caso, el complejo estrógenos-ER se
une a las proteínas Sp-1 o AP-1 responsables del anclaje del ER al ADN (Figura 7B).171-172
Además de estos posibles mecanismos de acción de los estrógenos, en muchos promotores
de genes regulados por estrógenos, la secuencia de los EREs no está completa (½ ERE) y por
Introducción
23
lo tanto la unión del ER es muy débil y no permite la regulación del gen en cuestión. En
estos casos, en la región promotora del gen, cerca de donde se encuentran estos sitios ½
ERE, se encuentran secuencias específicas de unión de proteínas Sp-1 y AP-1 que permiten
que el ER unido a proteínas Sp-1/AP-1 pueda anclarse al ADN simultáneamente;
directamente al ERE, e indirectamente a través de las proteínas Sp-1/AP-1 reforzando la
unión al promotor y permitiendo la regulación del gen (Figura 7C).173
Como ya se ha comentado anteriormente, estas vías de señalización genómica
necesitan cierto tiempo para que ocurran; sin embargo, existen tejidos capaces de
responder a estrógenos en segundos o minutos a través de mecanismos de señalización no
genómicos que involucran a ERs presentes en la membrana plasmática.174 La unión de los
estrógenos al ER de la membrana desencadena la activación de diferentes mecanismos de
transducción de señales mediados por quinasas,165, 175-179 que en último término, implican
efectos de control de la proliferación, la diferenciación y la apoptosis celular.
Figura 7. Mecanismos de acción genómicos de los estrógenos. A) El estrógeno reconoce a su ER que se une a su sitio ERE específico en el promotor del gen. B) El complejo estrógeno-ER se une a proteínas AP-1 o Sp-1 responsables de la unión del complejo al ADN. C) Cooperación entre el ½ ERE y las proteínas AP-1 y Sp-1 para realizar la unión al promotor del gen.
mRNASíntesis proteína
ERE ½ ERESp-1 AP-1 Sp-1AP-1
A BC
E2
ER Sp-1
AP-1
Sitio de unión de Sp-1 en el ADN
Sitio de unión de AP-1 en el ADN
Elemento de respuesta a estrógenos
Introducción
24
Los estrógenos ejercen su acción sobre determinados órganos como el sistema
reproductor, el hígado,180 el tejido mamario181 e incluso el sistema nervioso central.182 Sin
embargo, el papel y función mejor establecidos son los que ejercen los estrógenos sobre el
hueso. Los estrógenos actúan directamente sobre el hueso disminuyendo por un lado la
formación y actividad osteoclástica y disminuyendo la vida media de los osteoclastos al
provocar un incremento en su tasa de apoptosis; y por otro disminuyendo la síntesis de
diversas citoquinas como la interleuquina 1 (IL-1), la IL-6 o el factor de necrosis tumoral α
(TNF-α), lo que también contribuye a inhibir la resorción ósea. Además, los estrógenos
actúan directamente sobre los osteoblastos estimulando su proliferación y diferenciación
aumentando la síntesis de osteoprotegerina (OPG) y disminuyendo la de RANKL.164-165, 183-184
Sin embargo, el papel protector que los estrógenos ejercen sobre el hueso no se
debe exclusivamente a los efectos directos que éstos ejercen sobre las células óseas, sino al
efecto que los estrógenos pueden ejercer sobre el eje calcio-fósforo-vitamina D-PTH. Este
eje juega un papel clave en la regulación de remodelado óseo puesto que cualquier
variación en alguno de los factores del eje puede modular el efecto final de los estrógenos
sobre las células óseas. Los estrógenos son capaces de aumentar la expresión de VDR en el
duodeno,185 aumentar la absorción de calcio,186 actuar sobre los canales de calcio tipo
TRPV5 (Transient Receptor Potential Vanilloid 5) incrementando el influjo del calcio187 e
inhibir el co-transportador Na-Pi II del túbulo proximal induciendo hipofosfatemia.188 Todas
estas variaciones conducen a alteraciones del metabolismo fosfo-cálcico que en último
término provocan modificaciones en los niveles de PTH.
En estadios de deficiencia estrogénica, donde el equilibrio entre formación y
resorción ósea se encuentra desplazado hacia este último, el metabolismo fosfo-cálcico se
encuentra seriamente comprometido y como consecuencia, los niveles séricos de PTH se
encuentran aumentados. A este respecto, existen diversos trabajos en los que se ha
descrito que el tratamiento estrogénico parece ser el responsable de inhibir la secreción de
PTH en mujeres postmenopáusicas.189-190 Sin embargo, hasta la fecha se desconoce si el
mecanismo de acción de los estrógenos sobre la glándula paratiroides es directo (lo que
implicaría la presencia de ERs en las glándulas paratiroides) o indirecto, modificando otros
Introducción
25
factores reguladores de la función paratiroidea.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis y objetivos
29
HIPÓTESIS DE TRABAJO:
Dado la complejidad del estudio de los mecanismos de regulación de la glándula
paratiroides en modelos experimentales in vivo, el cultivo in vitro de glándulas paratiroides
puede proporcionar un modelo adecuado para el estudio del efecto de los distintos
factores implicados en dicha regulación. Los mecanismos por los que el calcio y el calcitriol
regulan la PTH están mediados por sus propios receptores (CaSR y VDR), pero cada uno de
estos factores podría a su vez regular tanto los niveles de su propio receptor como de
manera cruzada el otro receptor.
Los mecanismos por los que los estrógenos son capaces de inhibir la glándula
paratiroides son controvertidos. Dichos mecanismos podrían ser directos sobre la glándula
paratiroides, lo que implicaría la presencia de ERs en la misma, o indirectos a través de la
interacción con otros factores conocidos involucrados en la regulación de la paratiroides.
OBJETIVOS:
1. Analizar el efecto del calcio y el calcitriol sobre la expresión de CaSR y VDR en
glándulas paratiroides cultivadas in vitro.
Objetivos específicos:
1.1 Estudiar el efecto del calcio sobre la expresión de CaSR y del VDR en un
modelo de cultivo in vitro de tejido paratiroideo.
1.2 Analizar el efecto del calcitriol sobre la expresión de CaSR y del VDR en un
modelo de cultivo in vitro de tejido paratiroideo.
2. Estudiar el mecanismo por el cual los estrógenos disminuyen la PTH actuando sobre la
glándula paratiroides.
Hipótesis y objetivos
30
Objetivos específicos:
2.1 Analizar si la glándula paratiroides de rata posee ERα y ERß con objeto de
investigar si los estrógenos pueden actuar de forma directa sobre la glándula
paratiroides.
2.2 Analizar en un modelo in vivo de ratas con ERC y ovariectomía (OVX) si los
estrógenos pueden actuar sobre la PTH a través de mecanismos indirectos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material y métodos
33
INTRODUCCIÓN A LA METODOLOGÍA
La metodología utilizada en esta tesis doctoral se encuentra parcialmente descrita
en las publicaciones que se incluyen más adelante. Sin embargo, debido a la limitación de
espacio, las técnicas no han podido describirse en profundidad y se detallarán en este
apartado de material y métodos.
En primer lugar, se describen de modo general los animales de experimentación
utilizados, tanto en los estudios in vivo como en los ensayos con tejido paratiroideo in vitro.
También se detallan los procedimientos quirúrgicos a los que los animales fueron
sometidos (extracción de glándulas paratiroides, nefrectomía y OVX), así como las
determinaciones bioquímicas realizadas en el estudio. A continuación, se especifica la
metodología de los estudios in vitro, incluyendo el modelo de cultivo de tejido paratiroideo
y el cultivo de la línea celular osteoblástica. Posteriormente, se describen los estudios in
vivo, el diseño experimental y los diferentes tratamientos administrados. Por último, se
describen aquellas técnicas comunes a los estudios in vivo e in vitro, y que incluyen análisis
de la expresión génica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional
(RT-PCR y PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR), análisis de expresión proteica como
Western Blot e inmunohistoquímica en diferentes tejidos y el análisis estadístico de los
resultados.
TÉCNICAS GENERALES DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL
ANIMALES
Para realizar todos los experimentos se utilizaron 212 ratas Wistar macho y 24 ratas
Sprague-Dawley hembras de 4 y 6 meses de edad respectivamente procedentes del
animalario de la Universidad de Oviedo donde se mantuvieron estabulados en una misma
dependencia, con una temperatura de entre 20 y 24oC, suministrándoles comida y bebida
ad libitum. Como alimento se les proporcionó una dieta estándar (dieta A04, Panlab SL,
Barcelona, España) que contenía 0,6% de fósforo y 0,6% de calcio. Los animales fueron
Material y métodos
34
manipulados en todo momento de acuerdo a lo dispuesto en la normativa legal vigente y,
en particular, al Real Decreto 1207/2005 sobre protección de animales de experimentación
y otros fines científicos. Los ensayos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de
Experimentación Animal de la Universidad de Oviedo.
EXTRACCIÓN DE LAS GLÁNDULAS PARATIROIDES
Debido a la dificultad que supone identificar y aislar las glándulas paratiroides,
algunos autores utilizan la tiroparatiroidectomía.191 En nuestro caso, sin embargo, se optó
por la paratiroidectomía. Para proceder con la extracción de las glándulas paratiroides, el
animal se anestesió introduciéndolo en una urna con CO2 y una vez anestesiado, se
desangró por punción cardiaca. Se colocó la rata en decúbito prono sobre un tablero
cubierto por una sábana de quirófano y se abrieron las patas delanteras a modo de cruz
enganchándolas al tablero para que no se cerrasen. Se hizo una incisión en la línea media a
lo largo de todo el cuello, desde el esternón a la mandíbula y lateralmente siguiendo el
borde superior de las clavículas hacia afuera. La grasa y el tejido celular subcutáneo se
retiraron hacia los lados quedando las dos glándulas salivales al descubierto. A partir de
este momento la manipulación se realizó bajo un estereomicroscopio (Olympus SZ-ST,
Tokyo, Japón) con una fuente de luz fría Leica L2 (Leica, Weztlar, Alemania), con el fin de
ampliar la zona y mejorar el campo de visión sin desecarlo por el calor de una luz
convencional. Una vez identificados los dos haces del músculo esternocleidomastoideo se
cortaron y separaron lateralmente (Figura 8). Los dos haces del músculo esternohiodeo que
protegen la tráquea se seccionaron y se separaron en su parte inferior dejando a la vista la
tráquea, el tiroides y, a lo largo del trayecto dorso lateral de cada lóbulo tiroideo, un
músculo muy delgado debajo del cual se encuentran unas formaciones nacaradas de
consistencia dura que son las glándulas paratiroides que fueron aisladas del tejido tiroideo
y extraídas convenientemente.
Material y métodos
35
Figura 8. Aspecto del campo quirúrgico una vez abierto el cuello de la rata. Si las secciones se hacen más amplias no es necesario el uso de separadores (Adaptado de Waynforth H. B.
192).
INDUCCIÓN DE ENFERMEDAD RENAL CRÓNICA
En la mayoría de estudios,193-195 la ERC se induce mediante nefrectomía 5/6 en dos
tiempos quirúrgicos, con una semana de intervalo en la actuación sobre uno u otro riñón.
No obstante, en nuestro laboratorio esta técnica fue modificada, ampliándose la reserción
del riñón hasta una nefrectomía 7/8 (Figura 9), según el modelo descrito por Ormrod y
Miller.196 El objetivo fue lograr un mayor grado de insuficiencia renal. La intervención se
realizó, además, en un único tiempo, tras observarse un grado de insuficiencia renal y una
mortalidad similar –e incluso menor– a la que se obtenía con la realización en dos tiempos,
pero con la ventaja del consiguiente ahorro de tiempo.197
Material y métodos
36
Figura 9. Modelo de ERC propuesto por Ormrod y Miller. La parte rayada representa el tejido que se secciona.
En primer lugar se realizó la nefrectomía total del lado derecho. Para ello, se rasuró
al animal en la región lumbar y se practicó una incisión de los planos cutáneo y muscular.
Una vez localizado el riñón, se procedió a la extirpación total del mismo, previa ligadura del
pedículo renal. Finalmente se suturó el músculo y la piel. A continuación se realizó la
nefrectomía contra-lateral. Tras localizar el riñón, se practicó la sección de los polos
superior e inferior, así como del tercio externo del parénquima renal. Por último, y del
mismo modo que se hizo con el riñón derecho, se suturó el músculo y la piel.
Como anestésico se utilizó una combinación de medetomidina (Dontor, Orion
Corporation, Espoo, Finlandia) y ketamina (Ketolar, Warner-Lambert Company, NJ, EEUU)
por vía intraperitoneal, administrada a una dosis de 0,16 mg/kg y 42 mg/kg
respectivamente. Como antagonista del anestésico se utilizó atimepazol (Antisedan, Orion
Corporation) a una dosis de 0,08 mg/kg. Durante la intervención, y con objeto de minimizar
la hemorragia se utilizó un vasoconstrictor (Espongostan Film, Intersurgical España SA,
Madrid, España), mediante compresión en el lugar de corte.
REALIZACIÓN DE LA OVARIECTOMÍA
En la rata, los ovarios se encuentran situados uno a cada lado del abdomen, por
debajo del riñón. Por ello, la extirpación de los ovarios derecho e izquierdo se llevó a cabo a
continuación, pero en el mismo acto quirúrgico que las nefrectomías derecha e izquierda,
Material y métodos
37
respectivamente. Para ello, colocando a la rata en posición decúbito lateral, se localizó el
útero, se pinzó en su extremo, justo debajo del ovario, y se procedió al corte de este último.
La misma operación se repitió para la escisión del ovario izquierdo.
DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS Y ANÁLISIS DE LA DENSIDAD MINERAL ÓSEA
En el estudio in vivo, la determinación de los parámetros bioquímicos generales en
suero (calcio, fósforo, urea y creatinina) se llevó a cabo utilizando un autoanalizador
multicanal (mod. Hitachi 717®, Boehringer Mannheim, Berlín, Alemania). La determinación
de la iPTH sérica se llevó a cabo mediante un método inmunorradiométrico (IRMA)
utilizando un anticuerpo específico para rata (IRMA rat PTH® Kit, Immunotopics, San Juan
Capistrano, CA, EEUU). La determinación del 17β-estradiol (E2) y de 1,25(OH)2D3 se llevó a
cabo mediante radioinmunoensayo (Diagnostic Systems Laboratorios Inc., Webster, TX,
EEUU y IDS Ltd, Boldon, Tyne & Wear, Reino Unido; respectivamente). Los niveles séricos
de FGF23 se determinaron mediante un kit comercial de ELISA (Enzyme-linked
Immunoabsorbent Assay) “tipo sandwich” específico para rata (Kainos Laboratories, Tokyo,
Japón). En los estudios in vitro, se determinó el pH y la concentración de calcio iónico con
un analizador (mod. 634, Ciba-Corning Diagnostic Corp., Medfield, MA. EEUU).
La densidad mineral ósea (DMO) se midió a niveles de octavo proximal en la tibia
derecha con un densitómetro radiológico digital de doble energía (DXA) (Hologic QDR-100,
Bedford, MA, EEUU) utilizando un programa específico para animales de pequeño
tamaño.198
ESTUDIOS IN VITRO
MODELO DE CULTIVO DE TEJIDO PARATIROIDEO
Se utilizaron un total de 212 ratas Wistar macho de 4 meses de edad. Una vez
extraídas, las glándulas paratiroides se depositaron en cestas de propileno con una
membrana de Nylon semipermeable de 12 µm de poro acopladas a placas de cultivo de 12
mm de diámetro (Costar®, Cambridge, Reino Unido). Este sistema facilita el manejo de las
Material y métodos
38
glándulas y evita pérdidas de tejido durante el periodo de cultivo (Figura 10).
Figura 10. Modelo de cultivo de tejido paratiroideo. Las glándulas se depositan sobre cestas y se introducen en placas de 12 mm de diámetro.
Las glándulas se cultivaron en un incubador (mod. Stuart SI60D, Bibby Scientific
Limited, Staffordshire, Reino Unido) a 37oC y en agitación constante. A cada pocillo se le
añadieron 2 mL de un medio de cultivo no comercial, descrito por Almadén y col.199 Dicho
medio se preparaba fresco antes de cada experimento y contenía: NaCl 125 mM, KCl 5,9
mM, MgCl2 1,2 mM, glucosa 12 mM, HEPES 25 mM, albúmina sérica bovina (BSA) 0,1%,
(todo ello de Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EEUU), L-glutamina 4 mM, penicilina 100 U/mL,
estrepto-micina 100 µg/mL, piruvato sódico 1 mM (todo ello de Biochrom AG, Berlín,
Alemania) e insulina 0,1 U/mL (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) ajustado a pH 7,4.
El fósforo se añadió como una mezcla de NaH2PO4 y Na2HPO4 (Sigma-Aldrich) en una
proporción 1:2. De este modo se consigue una concentración final de fósforo en el medio
de 1 mM. Finalmente, se añadió CaCl2 (Sigma-Aldrich) a concentraciones variables (0,6 mM;
1,2 mM ó 2,0 mM) en función de cada experimento.
RESPUESTA DE LAS GLÁNDULAS PARATIROIDES AL CALCIO
Para cada uno de los experimentos (n=11) se utilizaron 24 glándulas paratiroides
divididas de forma aleatoria en 3 grupos de 8 glándulas cada uno. Antes de comenzar el
placa
Cesta
pocillo
pocillo Cesta
Glándulas
paratiroides
Membrana
Material y métodos
39
ensayo (0 horas), las glándulas se lavaron durante 8 horas a 37oC en agitación constante
con 2 mL de medio de cultivo con una concentración de calcio 0,6 mM, con el fin de
permitir la estabilización de la secreción de PTH tal y como se había observado en previos
trabajos.29, 199-200 Tras el período de lavado y para estudiar el efecto del calcio sobre a
funcionalidad de las glándulas paratiroides, se sustituyó el medio de cultivo por medio
fresco con las tres concentraciones de calcio a ensayar (0,6 mM, 1,2 mM, 2,0 mM). Los
diferentes grupos de glándulas se cultivaron durante 24 horas, realizando un cambio de
medio a las 12 horas. Una vez finalizado el experimento, las glándulas fueron recogidas y
procesadas para la extracción del ARN total para analizar la síntesis de PTH y la expresión
génica de CaSR y VDR y para la inclusión en parafina para el análisis mediante
inmunohistoquímica de los niveles proteicos de CaSR y VDR. Los protocolos seguidos en
cada uno de estos casos se detallarán en el apartado de técnicas comunes in vivo/in vitro.
RESPUESTA DE LAS GLÁNDULAS PARATIROIDES AL CALCITRIOL
Para analizar la respuesta de las glándulas paratiroides al calcitriol, se llevaron a
cabo 10 experimentos. Cada experimento se realizó con 16 glándulas paratiroides que se
dividieron aleatoriamente en 2 grupos. Tras el período de lavado de 8 horas con medio de
cultivo con una concentración de calcio final de 0,6 mM, el medio de cultivo se sustituyó
por medio de cultivo fresco con la misma concentración de calcio que el medio del período
de lavado suplementado con calcitriol a una concentración final de 10-8 M o con vehículo
(etanol). El período de cultivo ensayado en los experimentos de calcitriol fue 48 horas,
tiempo elegido en función de trabajos previos donde se había demostrado que ese período
era necesario para observar un descenso significativo de la síntesis y secreción de PTH.103,
200 Tras las 48 horas de cultivo, las glándulas se recogieron para su posterior procesamiento
y análisis de CaSR y VDR.
CULTIVO DE LA LÍNEA CELULAR OSTEOBLÁSTICA UMR106
Para llevar a cabo el estudio in vitro de la regulación del FGF23 por E2 se utilizó una
línea celular de osteosarcoma de rata (UMR106) (Health Protection Agency Culture
Collections, Salisbury, Reino Unido). Las células se cultivaron en placas de cultivo 10 cm de
Material y métodos
40
diámetro hasta subconfluencia en medio de cultivo αMEM sin rojo fenol con suero
descomplementado al 10% (Sigma-Aldrich), penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100
µg/mL (Biochrom AG) a 37oC en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Alcanzada la
subconfluencia, se les cambió el medio de cultivo por medio suplementado con BSA al
0,25% durante 24 horas. Tras este período de adaptación las células se cultivaron con las 3
concentraciones de E2(Sigma-Aldrich), 10-10 M, 10-8 M y 10-6 M). Las tres concentraciones a
ensayar se prepararon mediante diluciones seriadas con etanol. Un cuarto grupo de células
se cultivó con vehículo (etanol) a modo de control. Las células se cultivaron durante
períodos de cultivo de 24 y 48 horas y tras ese período se recogieron para la posterior
extracción de ARN o proteínas para el análisis de la expresión génica y proteica de FGF23.
ESTUDIOS IN VIVO
Para el análisis del efecto del E2 sobre la PTH, se utilizaron 24 ratas Sprague-Dawley
de 6 meses de edad que habían alcanzado su pico de masa ósea. Del total de los animales,
20 de ellos fueron sometidos a nefrectomía 7/8 y OVX (ERC+OVX), tal y como se ha
detallado en el apartado anterior, con el fin de que desarrollasen insuficiencia renal y
estrogénica. Una semana después de la intervención quirúrgica, los animales sometidos a
ERC+OVX se dividieron aleatoriamente en tres grupos para la administración del
tratamiento. El E2 (Sigma-Aldrich) se disolvió en una pequeña cantidad de etanol y
posteriormente se diluyó en aceite de maíz, a modo de excipiente, a una concentración
adecuada para suministrar a cada rata dosis una de 15 ó 45 µg/kg peso/día.
Los tres grupos de tratamiento fueron:
- Grupo 1 (E2-15, n=8): Recibió E2 a dosis de 15 µg/kg peso/día.
- Grupo 2 (E2-45, n=5): Recibió E2 a dosis de 45 µg/kg peso/día.
- Grupo 3 (Placebo, n=7): Recibió excipiente (aceite de maíz) a dosis de 0,8 mL/kg
peso/día.
Además de estos tres grupos se utilizó un cuarto grupo de animales de la misma
edad con ERC y función ovárica normal (Grupo control con ERC, n=4) que recibió el
Material y métodos
41
correspondiente tratamiento placebo y un quinto grupo de animales con la misma edad al
que no se le realizó ninguna manipulación (Grupo de referencia, n=5) (Figura 11).
Figura 11. Esquema del diseño experimental del estudio in vivo y de los tratamientos administrados. ERC: Enfermedad renal crónica; OVX: ovariectomía.
Todos estos tratamientos se administraron mediante inyección intraperitoneal, 5
días por semana durante 8 semanas. Tras las 8 semanas del tratamiento se procedió al
sacrificio de los animales, mediante introducción en una urna con CO2. Al sacrificio se
recogieron los siguientes tejidos y muestras necesarias para llevar a cabo las distintas
determinaciones, almacenándose tal y como se detalla a continuación:
- La tibia derecha se recogió para realizar el análisis densitométrico.
- La tibia izquierda se sumergió en un inhibidor de ARNasas (RNAlater®, Ambion
Inc., Austin, TX, EEUU) a -70oC hasta su posterior utilización para el análisis de la
síntesis de FGF23.
- El útero se pesó para utilizarlo como marcador tisular de reemplazo
estrogénico.
- Las glándulas paratiroides se sumergieron en inhibidor de ARNasas a -70oC
hasta su posterior utilización para el análisis de la síntesis de PTH y expresión
génica de klotho.
- El trozo de riñón restante tras la nefrectomía fue recogido en inhibidor de
ARNasas para posteriormente analizar la expresión génica de klotho.
GRUPO CONTROL CON ERC (n=4)
GRUPO DE REFERENCIA NORMAL (n=5)
SacrificioGRUPOS DE TRATAMIENTO
Placebo17-β-estradiol (15 µg/kg/día) (E2-15) 17-β-estradiol (45 µg/kg/día) (E2-45)
Inicio deltratamiento
1 semana 8 semanas
Intervención
GRUPO ERC + OVX (n=20)
Material y métodos
42
A su vez, de un grupo de animales normales de la misma edad y sexo, se
recogieron, las glándulas paratiroides, el útero y la tibia izquierda para realizar el posterior
análisis de expresión génica y proteica de ERα y ERβ.
TÉCNICAS COMUNES IN VITRO/IN VIVO
EXTRACCIÓN DE ARN
La extracción de ARN total se llevó a cabo en diferentes tejidos y células: glándulas
paratiroides, útero, riñón, tibia y células UMR106. En las paratiroides, tanto en el estudio in
vitro como en el in vivo y dado el pequeño tamaño de las mismas, el ARN total se extrajo
partiendo no de glándulas individuales sino de un conjunto de 8 glándulas. Sin embargo, en
el útero, la tibia y el riñón el ARN se extrajo de forma independiente en cada animal. En el
caso del cultivo in vitro de osteoblastos el ARN total se extrajo de una placa de 10 cm de
diámetro en subconfluencia.
Para la extracción de ARN total se empleó una modificación de la técnica en un solo
paso descrita por Chomczynski y col.201 Este método se basa en el uso de una mezcla de
isotiocianato de guanidina y fenol en una solución monofásica (TRI REAGENT™, Sigma-
Aldrich).
El hueso, por su dureza, previo a la homogenización con el reactivo, se sumergió en
nitrógeno líquido y se trituró con la ayuda de un mortero. Los tejidos y cultivos celulares e
disgregaron en 1 mL de reactivo TRI™ utilizando un homogeneizador de tejidos acoplado a
una cuchilla de 5 mm (OMNI International, Marietta, GA, EEUU). El ARN total se extrajo
siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y la pureza del ARN se
determinaron con un espectrofotómetro UV-VIS (Nanodrop Tech., Wilmington, DE, EEUU)
midiendo la absorbancia (A) a 260 y 280 ηm. En una solución de ARN puro, este cociente
tiene un valor teórico de 2,0. Un valor inferior sería indicativo de contaminación con
proteínas o fenol durante el proceso de extracción. En nuestro caso, se descartaron
aquellas muestras con una relación A260/A280 menor de1,5.
Material y métodos
43
SÍNTESIS DE ADN COPIA (ADNc)
La obtención de los ADNc se llevó a cabo a partir de 1 µg de ARN total extraído
previamente utilizando el kit comercial High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
(Applied Biosystems; Foster City, CA, EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante. El
ADNc obtenido se mantuvo a -20oC hasta su utilización.
PCR CONVENCIONAL
Una vez obtenidos los ADNc en las glándulas paratiroides, útero y tibias
procedentes de ratas normales, se amplificaron mediante PCR para la detección de ERα y
ERβ con oligonucleótidos específicos diseñados a partir de las secuencias del GenBank
NM_000125 del ERα y NM_001437 del ERβ (ERα sentido: 5´-GCA CAA GCG TCA GAG AGA
TG-3´; ERα antisentido: 5´-GCA CTC TCT TTG CCC AGT TG-3´; ERβ sentido: 5´-GGT GTG GGT
ACC GTA TAG TG-3´; ERβ antisentido: 5´-ATC ATG TGC ACC AGT TCC TTG-3´). Para ello se
emplearon 0,1 µg de ADNc, 0,2 µg de los oligonucleótidos específicos, 0,8 U de Taq ADN
polimerasa y 0,2 mM de DNTPs en un volumen de reacción final de 50 µL. El programa
utilizado fue de 30 ciclos, donde cada uno consistió de 15 segundos de desnaturalización a
95oC, 15 segundos de renaturalización a 60oC y 30 segundos de extensión a 42oC. Los
productos de reacción fueron analizados en un gel de agarosa al 1,5%, y se comprobó que
el tamaño de los fragmentos analizados se correspondía con el tamaño esperado.
PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL (qRT-PCR)
SISTEMA DE DETECCIÓN DE SECUENCIAS
Los experimentos de qRT-PCR se realizaron en un sistema de PCR a tiempo real
modelo ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Para analizar la expresión de los genes
problema PTH, CaSR, VDR, ERα, ERβ, FGF23 y klotho se utilizaron ensayos prediseñados
(Taqman® Gene Expression Assays Rn 00566882_m1, Rn 00566496_m1, Rn 00566976_m1,
Rn00562166_m1, Rn00562610_m1, Rn00590709_m1 y Rn00580123_m1 respectivamente,
Applied Biosystems).
Material y métodos
44
Para llevar a cabo el análisis de la expresión diferencial es necesario normalizar los
resultados frente a un gen constitutivo. En este caso, los resultados se normalizaron frente al
gen constitutivo ARN ribosómico (ARNr) 18s, utilizando también un ensayo prediseñado
(Eukaryotic 18s rRNA Endogenous Control, Applied Biosystems). Todas las secuencias se
detectaron con reactivos Taqman® (Taqman® Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems).
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
Para cuantificar la expresión relativa de los genes PTH, CaSR, VDR, ERα, ERβ, FGF23 y
klotho se utilizó una aproximación conocida como comparación del ciclo umbral.202 El término
ciclo umbral (CT) se refiere al ciclo de PCR en el cual la fluorescencia emitida por la muestra
supera un valor arbitrario predefinido (umbral), por encima del cual se considera que hay
amplificación. Este método permite, de forma rápida y sencilla, la cuantificación relativa de la
expresión de un gen en una muestra problema respecto a una muestra calibradora. Para
comparar ambas muestras es necesario además estandarizar la cantidad de ADNc molde en las
reacciones de PCR. Por ello, los resultados deben normalizarse frente a un gen constitutivo, que
actuaría como control endógeno.
En nuestros experimentos de cultivo in vitro de glándulas paratiroides, la muestra
problema fue el ADNc del tejido paratiroideo cultivado con 1,2 mM y 2,0 mM de calcio y con
10-8 M de calcitriol, mientras que la muestra calibradora fue ADNc de tejido cultivado con 0,6
mM de calcio y ausencia de calcitriol, respectivamente. En los experimentos de cultivo de
osteoblastos la muestra problema fue el ADNc del extracto celular cultivado con E2, y la muestra
calibradora fue ADNc de extracto celular cultivado con vehículo. En el caso del estudio in vivo la
muestra problema fue el ADNc del tejido paratiroideo, óseo y renal de los animales de los
grupos E2-15, E2-45, y grupo control con ERC, mientras que la muestra calibradora fue ADNc de
esos mismos tejidos pertenecientes a los animales del grupo Placebo. En todos los casos se
utilizó como control endógeno el gen ARNr 18s. La expresión relativa de PTH, CaSR, VDR, ERα,
ERβ, FGF23 y klotho en las muestras problema con respecto a las calibradoras se calculó
utilizando la fórmula de la Figura 12.
Sin embargo, para poder utilizar el método de comparación de CT, es necesario
comprobar previamente, mediante experimentos de validación, que la eficiencia de la PCR para
Material y métodos
45
los genes problema (PTH, CaSR, VDR, ERα, ERβ, FGF23 y klotho) y del control endógeno (18s)
es similar y además próxima al 100%.
Figura 12. Método de la Comparación del Ciclo Umbral (CT). A modo de ejemplo se representa el caso del cultivo de la línea osteoblástica UMR106 con o sin 17β-estradiol (E2), donde la muestra problema es aquella cultivada con E2 y la muestra calibradora aquella cultivada en ausencia de E2 (con vehículo).CT (ciclo umbral): Ciclo de PCR en el cual la señal emitida por la muestra supera un valor arbitrario predefinido (umbral) por encima del cual se considera que hay amplificación.
Una eficiencia de reacción cercana al 100% implica que, en cada ciclo de PCR, se duplica
la cantidad de ADN y hay, por tanto, un incremento exponencial en el número de copias del
amplicón. Sin embargo, dependiendo de las condiciones de la reacción (secuencia de los
oligonucleótidos, calidad del ADNc molde, tamaño del amplicón) la eficiencia puede variar. Por
este motivo, es imprescindible determinar y comparar las eficiencias de reacción de los distintos
genes a estudio.
La eficiencia de PCR se calcula a partir de la pendiente de la recta que se obtiene al
representar los valores de CT frente al logaritmo decimal de la concentración de ADNc molde.
Una eficiencia en la reacción de PCR del 100% supone una pendiente en esta recta de -3,32234.
La eficiencia real, sin embargo, suele ser inferior al 100%, por lo que las pendientes estarán
siempre por debajo de este valor. En general, son válidas las pendientes comprendidas entre -
3,32 y -3,90234.
Por otro lado, cuando se va a analizar la expresión génica, no es suficiente con que las
Material y métodos
46
eficiencias del gen problema y del control endógeno sean elevadas. Es necesario además que
ambas sean similares, ya que si las pendientes son muy distintas la relación entre ambos genes
depende en gran medida de la cantidad de ADNc molde. Cuando la concentración de ADNc
molde es elevada, se obtienen unos valores de CT muy distintos a los que se obtendrían con
concentraciones más bajas (Figura 13A). Por el contrario, si las pendientes son similares, la
relación se mantiene en todo el rango de concentraciones y no depende de la cantidad de
muestra inicial (Figura 13B).
Figura 13. Comparación de pendientes entre el gen problema y el control endógeno. A) Pendientes muy diferentes. B) Pendientes similares.
Para cada uno de los genes a ensayar se llevaron a cabo los experimentos de validación
obteniéndose en todos los casos pendientes mayores de -3,9 y rectas paralelas al compararlas
con el gen constitutivo.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
La extracción de proteínas se llevó a cabo de glándulas paratiroides, útero y células
osteoblásticas. En el caso de las glándulas paratiroides y al igual que ocurrió al extraer el
ARN, las proteínas se extrajeron de 10 glándulas paratiroides y no de las glándulas
individualmente. Para la extracción de las proteínas los tejidos y las células se sumergieron
en un tampón de extracción de proteínas. En el caso de las glándulas paratiroides y útero,
donde se quería detectar ERα y ERβ, al ser proteínas mayoritariamente nucleares, se utilizó
un tampón alto en sales con el fin de favorecer la extracción de dichas proteínas. El tampón
contenía NaCl 500 mM, HEPES (pH 7,0) 50 mM y un cóctel de inhibidores de proteasas 1X
Log (ADNc)
CT Control Endógeno
Gen problema
A
Log (ADNc)
CT
Control Endógeno
Gen problema
B
ΔCT1
ΔCT2
ΔCT1
ΔCT2
ΔCT1 ≠ΔCT2 ΔCT1 =ΔCT2
Material y métodos
47
(Complete™ Mini, Roche Diagnostics, Gmbh, Mannheim, Alemania). En la extracción de
proteínas de los cultivos celulares, el tampón de extracción utilizado fue uno de
características estándar cuya composición era: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 1%,
deoxi-colato sódico 0,5%, EDTA 1,0 mM y SDS 0,1%. Una vez embebido el tejido en el
tampón correspondiente, se disgregó en el homogeneizador de tejidos descrito
anteriormente. La muestra se sonicó durante 1 minuto a 4oC para evitar la degradación de
las proteínas y se sometió a ultracentrifugación a 14000 G durante 20 minutos a 4oC. Tras
ese período se recogieron las proteínas presentes en el sobrenadante de la muestra. La
cuantificación de las proteínas se realizó mediante el método estándar de Bradford (Bio-
Rad, Hercules, CA, EEUU).203 Las proteínas ya cuantificadas se almacenaron a -70oC hasta su
posterior utilización.
WESTERN BLOT
Los diferentes extractos proteicos se sometieron a electroforesis en geles de
acrilamida de 0,75 mm de grosor en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) con un
tampón de electroforesis, según el método descrito por Laemmli y col.204 Para el estudio de
los ERs se utilizaron 20 µg de proteínas totales procedentes de glándulas paratiroides y de
útero, mientras que para el estudio del FGF23 en osteoblastos en cultivo se utilizaron 30 µg.
En cada uno de los geles se cargó una calle con marcadores de peso molecular para
identificar las proteínas problema (Rainbow™ Molecular Weight Markers, GE Healthcare UK
Ltd, Buckinghamshire, Reino Unido). Las proteínas separadas por su peso molecular se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Hybond™ P membrane, GE Healthcare UK)
utilizando un tampón de transferencia. La transferencia se llevó a cabo en frío y en
agitación durante 1 hora a un voltaje constante de 100 v. Una vez finalizada la
transferencia, las membranas fueron bloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente
con leche en polvo desnatada al 5% en un tampón fosfato salino (PBS) para evitar uniones
inespecíficas. Transcurrido ese tiempo, las membranas se mantuvieron toda la noche con el
anticuerpo primario correspondiente en la dilución adecuada (anticuerpo monoclonal de
ratón frente a ERα en dilución 1:1000, de Acris antibodies Gmbh, Hiddenhausen, Alemania;
Material y métodos
48
anticuerpo policlonal de conejo frente a ERβ en dilución 1:1000; anticuerpo policlonal de
cabra frente a FGF23 en dilución 1:100 y anticuerpo policlonal de conejo frente a
gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en dilución 1:25000; estos últimos de
Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EEUU). Al día siguiente, la membrana se
sometió a 3 lavados de 10 minutos cada uno con una solución de lavado compuesta por
PBS y Tween-20 (Sigma-Aldrich) y seguidamente la membrana se incubó durante 1 hora a
temperatura ambiente con el anticuerpo secundario ligado a peroxidasa específico para
cada anticuerpo primario disuelto adecuadamente en solución de lavado (anticuerpo frente
a ratón, frente a conejo o frente a cabra). La membrana se sometió a otros 3 lavados de 10
minutos cada uno con solución de lavado y posteriormente se levó a cabo la detección de la
proteína mediante detección cromógena mediante el kit comercial Pierce® ECL Western
Blotting Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, EEUU). La cuantificación relativa de la
intensidad de las bandas obenidas en el Western Blot se realizó con el programa
informático Quantity One 1-D Analysis Software v4 y el escáner GS-800 Calibrated
Densitometer (ambos de Bio-Rad, Hercules, CA, EEUU).
TINCIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA
Las tinciones immunohistoquímicas se llevaron a cabo sobre cortes de tejido
parafinado de 5 µm de espesor de glándulas paratiroides cultivadas in vitro y de glándulas
paratiroides y útero de ratas normales utilizando los sistemas EnVision+® (Dako
Cytomation, Glostrub, Dinamarca) y rat ABC Staining System (Santa Cruz Biotechnology),
siguiendo las instrucciones del fabricante. La contratinción se llevó a cabo con hematoxilina
(Sigma-Aldrich).
En el estudio in vitro de glándulas paratiroides cultivadas con calcio y/o calcitriol,
para la detección del CaSR se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo, cedido por los Drs.
Alex Brown y Eduardo Slatopolsky93 de la Renal Division, (Washington University School of
Medicine, San Luis, MO, EEUU), que reconoce una secuencia de 23 aminoácidos dentro del
dominio extracelular del receptor (residuos 203 a 226). Para la detección del VDR se utilizó
un anticuerpo monoclonal de rata frente a una secuencia del dominio C-terminal del dedo
Material y métodos
49
de zinc de unión al ADN (residuos 89 a 105) (Chemicon-Millipore, Billerica, MA, EEUU).
La proliferación celular se detectó con un anticuerpo monoclonal murino dirigido
frente al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA, Clon PC-10, Zymed Laboratories
Inc., San Francisco, EEUU).
En el estudio de detección de los ERs en las glándulas paratiroides y útero, para la
detección del ERα y ERβ se utilizaron los mismos anticuerpos utilizados para la realización
del Western Blot.
Para cada glándula se analizaron tres cortes no consecutivos. Todas las muestras se
procesaron a la vez con objeto de homogenizar las condiciones de trabajo (grado de
desenmascaramiento del antígeno y tiempos de incubación con los anticuerpos primario y
secundario y el sustrato).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis estadístico de los resultados se realizó con el paquete informático SPSS 12.0
(SPSS Inc. Chicago, IL, EEUU) para Windows. Para el análisis estadístico de los marcadores
bioquímicos, así como el peso corporal, el peso del útero, la DMO a nivel de tibia proximal, los
resultados obtenidos de qRT-PCR y Western blot se empleó la prueba paramétrica de la t de
Student (t-Student). Las correlaciones entre diferentes parámetros séricos fueron realizadas
utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (r). En todos los casos se consideró como
significación estadística una p<0,05.
PUBLICACIONES
Publicaciones
53
A continuación, se incluyen las 4 publicaciones derivadas de los estudios que tienen
mayor relación con el conjunto de experimentos que se presentan en esta tesis doctoral.
Publicación 1. Simultaneous changes in the calcium-sensing receptor and the
vitamin D receptor under the influence of calcium and calcitriol. Nephrol Dial Transplant,
23(11):3479-3484, 2008.
Publicación 2. Papel de calcio, calcitriol y sus receptores en la regulación de la
paratiroides. Nefrología, 29 (2): 103-108, 2009.
Publicación 3. Indirect regulation of PTH by estrogens may require FGF23. J Am Soc
Nephrol, 20(9):2009-2017, 2009.
Manuscrito 4. Estrogens and bone disease in chronic kidney disease: Role of
FGF23. Aceptado para publicación en Current Opinion in Nephrology and Hypertension.
Publicación 1
55
Publicación 1
56
Publicación 1
57
Publicación 1
58
Publicación 1
59
Publicación 1
60
Publicación 2
61
Publicación 2
62
Publicación 2
63
Publicación 2
64
Publicación 2
65
Publicación 2
66
Publicación 3
67
Publicación 3
68
Publicación 3
69
Publicación 3
70
Publicación 3
71
Publicación 3
72
Publicación 3
73
Publicación 3
74
Publicación 3
75
Manuscrito 4
77
Manuscrito 4
78
Manuscrito 4
79
Manuscrito 4
80
Manuscrito 4
81
Manuscrito 4
82
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y discusión
85
ESTUDIO IN VITRO DE LA REGULACIÓN DE LA PTH POR CALCIO Y
CALCITRIOL
Como primer objetivo de esta tesis doctoral nos planteamos estudiar el efecto de
dos reguladores clásicos de la función paratiroidea, calcio y calcitriol, sobre la expresión
simultánea de sus receptores específicos, CaSR y VDR. Varios trabajos describen el efecto
de estos reguladores sobre la secreción de PTH a través de sus receptores, si bien la
mayoría son utilizando modelos in vivo,95-96, 100-101, 119, 118 lo que conlleva una problemática a
la hora de interpretar los resultados obtenidos dada la gran complejidad de los mismos y el
gran número de factores que influyen en la regulación de la secreción de PTH. Variaciones
en estos factores pueden enmascarar el efecto real de nuestro factor a estudio. Por ello, los
estudios in vitro, a pesar de encontrarse más alejados de la realidad, nos permiten realizar
variaciones de un único factor manteniendo constantes los demás permitiéndonos conocer
la verdadera función del factor sometido a estudio.
No obstante, los estudios in vitro han estado siempre limitados; en primer lugar por
la falta de una línea celular paratiroidea y en segundo lugar por la reducida funcionalidad
de las células paratiroides cuando se cultivan aisladas.205-206 Existen numerosos estudios in
vitro sobre la viabilidad y funcionalidad de los cultivos primarios en monocapa de células
paratiroides basándose en la digestión del tejido paratiroideo con colagenasa para
dispersar las células paratiroideas.157, 205-209 Desafortunadamente, y a pesar de la simplicidad
en la obtención de las células, las células paratiroideas en monocapa a menudo pierden la
capacidad de responder a los cambios de calcio extracelular, probablemente debido a un
descenso en los niveles de ARNm y de proteína del CaSR, fenómeno observado tras unas
horas de cultivo.205-206 El mantenimiento de la arquitectura tridimensional del tejido parece
crítico para el mantenimiento de la funcionalidad de las células paratiroideas. Así, Ritter y
col. obtuvieron un sistema de cultivo en el que células paratiroides cultivadas en una matriz
de colágeno desarrollaban una arquitectura pseudotisular que las mantenía funcionales, en
respuesta al calcio, a largo plazo; si bien este modelo de cultivo requiere un período de
establecimiento de las pseudoglándulas de varias semanas.210
Resultados y discusión
86
Para el desarrollo del primer objetivo de esta tesis doctoral utilizamos un modelo
de cultivo in vitro de glándulas paratiroides puesto a punto previamente en nuestro
laboratorio que permitía el estudio de la respuesta de las glándulas al calcio y al calcitriol a
medio-largo plazo.200 Los resultados de la puesta a punto de este modelo de cultivo
mostraron que el tejido paratiroideo de rata cultivado in vitro inmediatamente tras su
extracción, mantiene su viabilidad durante 6 días en cultivo, con viabilidades celulares por
encima del 80%, y su funcionalidad, medida ésta como secreción basal de PTH y respuesta
al calcio y al calcitriol, durante 4 días en cultivo.200 Si bien las glándulas paratiroides
responden al calcio tras cuatro días en cultivo, observándose un aumento de la secreción
de PTH cuando éstas son cultivadas con una concentración de calcio baja (0,6 mM), la
misma respuesta se observa cuando éstas son cultivadas durante 24 horas (Figura 14), por
lo que se eligió este período de cultivo para el estudio del efecto del calcio sobre la
expresión del CaSR y VDR. Además, se ha observado que estímulos prolongados con
concentraciones de calcio elevadas pueden desencadenar un mecanismo protector de la
glándula frente a la activación a largo plazo del CaSR.211 Por otro lado, en cuanto al
calcitriol, la mayor respuesta de las glándulas se observó tras 96 horas en cultivo
alcanzándose un 90% de inhibición en la secreción de PTH, sin embargo tras 48 horas ya se
observó el efecto del calcitriol alcanzándose una inhibición de la secreción de PTH del 50%
(Figura 14), por lo que los ensayos con calcitriol fueron realizados cultivando las glándulas
durante 48 horas.
Figura 14. A) Secreción de PTH intacta (iPTH) de glándulas paratiroides cultivadas con diferentes concentraciones de calcio. B) Respuesta de las glándulas paratiroides al calcitriol medida como secreción de iPTH tras diferentes períodos de tiempo en cultivo (modificada de Álvarez-Hernández y col.
200).
Días en cultivo
Secr
eció
n i
PTH
(%)
250
200
150
100
50
01 2 3 4
Ca 1,2 mM
Ca 0,6 mM
0
20
40
60
80
100
12 24 36 48 60 72 84 96
Calcitriol 10-9 M
Control
Tiempo (horas)
Secr
eci
ón
iPT
H(%
)
A B
*
Resultados y discusión
87
Con las condiciones de cultivo ya establecidas, estudiamos el efecto del calcio sobre
la expresión de CasR y VDR en glándulas paratiroides recién extraídas cultivadas durante 24
horas con tres concentraciones de calcio diferentes (0,6 mM, 1,2 mM y 2,0 mM).
Previamente al comienzo del ensayo con las diferentes concentraciones de calcio, las
glándulas se sometieron a un período de lavado durante 8 horas pues en la puesta a punto
de nuestro modelo200 así como en otros trabajos publicados por otros autores29, 199 se había
observado que durante las primeras horas de cultivo tenía lugar una elevada secreción de
PTH, probablemente como consecuencia de la liberación masiva de la hormona
almacenada en las vesículas de secreción.
A modo de validación del modelo y para comprobar que bajo estas condiciones las
glándulas paratiroides respondían al calcio, medimos la síntesis de PTH cuantificando los
niveles de su ARNm mediante qRT-PCR. Tras 24 horas en cultivo, pudimos observar un
descenso significativo de los niveles de ARNm de PTH que se correspondía con una
inhibición del 50% cuando las glándulas eran cultivadas con una concentración 1,2 mM de
calcio, inhibición que no se ve incrementada al cultivar con las glándulas con
concentraciones de calcio superiores (2,0 mM) (Figura 15). Resultados similares han sido
encontrados previamente en ensayos in vivo81, 212 donde los niveles séricos de PTH no se
veían disminuidos a medida que aumentaba la hipercalcemia. Recientemente, Rodríguez y
col. observaron resultados similares en un ensayo in vitro al cultivar glándulas paratiroides
durante un período de tiempo inferior (6 horas) con diferentes concentraciones de calcio,
obteniendo la mayor secreción de PTH cuando éstas se cultivaban con una concentración
de 0,6 mM de calcio y una inhibición de un 50% cuando eran cultivadas con
concentraciones de calcio mayores.124
Resultados y discusión
88
Figura 15. Análisis de los niveles de ARNm de PTH mediante qRT-PCR en glándulas paratiroides cultivadas in vitro durante 24 horas con tres concentraciones de calcio diferentes (0,6, 1,2 ó 2,0 mM). Los valores están normalizados frente al ARNr 18s y representan la media de 6 ensayos independientes. p<0,05 respecto al grupo de glándulas cultivadas con 0,6 mM de calcio. U.R.: Unidades relativas.
Una vez validado el modelo analizamos el efecto del calcio sobre los niveles de
ARNm y de proteína de CaSR y VDR. Como puede observarse en la Figura 16, tras 24 horas
de cultivo los niveles de ARNm y de proteína de CaSR no sufrieron variaciones al duplicar o
incluso triplicar la concentración de calcio presente en el medio de cultivo. Por lo tanto, ese
descenso observado en la síntesis de PTH debe ser ocasionado por la activación del CaSR y
no por un aumento en la expresión génica del receptor. Es decir, aunque la principal acción
del CaSR es detectar cambios extracelulares de calcio, la expresión y los niveles del CaSR en
glándulas paratiroides no parece depender de los niveles de calcio extracelular. Estudios in
vivo han demostrado previamente que animales alimentados con una dieta alta o baja en
calcio no muestran diferencias en los niveles de CaSR en glándulas paratiroides, sugiriendo
que el calcio no tiene un efecto regulador sobre su propio receptor.95-96 No obstante, a la
hora de interpretar y analizar estos resultados es fundamental tener en cuenta que en los
estudios in vivo las variaciones en uno de los factores que regulan la PTH, pueden inducir a
su vez cambios en los otros factores que también son capaces de regular la PTH;96, 100
pudiendo enmascarar o afectar el verdadero efecto del factor que estamos estudiando. Sin
0,6 mM 1,2 mM 2,0 mM
0
20
40
60
80
100
Concentración de calcio
100
44 42
AR
Nm
PT
H/1
8s (%
U.R
.)
* *50,0 ± 7,8 49,2 ± 8,7
Resultados y discusión
89
embargo, en nuestro estudio, la única variación a la que las glándulas paratiroides se
encuentran sometidas durante el cultivo son las variaciones del factor de estudio, el calcio,
y por tanto los resultados obtenidos son única y exclusivamente debidos al calcio y no a
otro factor. Los resultados de nuestro trabajo permiten por tanto corroborar los resultados
previos obtenidos por otros autores. 95-96
Figura 16. Análisis de los niveles de CaSR. A) Análisis de los niveles de ARNm mediante qRT-PCR en glándulas paratiroides cultivadas in vitro durante 24 horas con tres concentraciones de calcio diferentes (0,6, 1,2 o 2,0 mM). Los valores están normalizados frente al ARNr 18s y representan la media de 6 ensayos independientes. U.R.: Unidades relativas. B) Tinción inmunohistoquímica frente a CaSR en glándulas paratiroides cultivadas en las mismas condiciones que en el apartado A). (Aumentos x20).Imágenes representativas de 5 experimentos.
Por otro lado, y simultáneamente al análisis de los niveles de ARNm y de proteína
de CaSR, se cuantificaron los del VDR. Nuestros resultados demuestran que a pesar de que
el VDR es el receptor específico del calcitriol y otros metabolitos activos de la vitamina D, la
expresión génica y proteica del VDR es modulada por el calcio, mostrando un incremento
de los niveles de ARNm y de proteína al incrementar la concentración de calcio en el medio
de cultivo que se hace significativa sólo con la mayor concentración de calcio ensayada
(Figura 17). Este mismo efecto ha sido observado previamente tanto in vivo100, 118-119 como
in vitro100, si bien en este caso el período de cultivo fue 3 veces menor que el utilizado en
0
40
80
120
160
200
240
280
0,6 mM 1,2 mM 2,0 mM
Concentración de calcio
AR
Nm
CaS
R/1
8s (%
U.R
.)
100
120 112
A
112,8 ± 13,4
119,8 ± 13,6
B0,6 mM calcio 1,2 mM calcio
2,0 mM calcio Control negativo
Resultados y discusión
90
nuestro estudio. Esta tendencia también se ha descrito en otros trabajos demostrando que
el calcio ejerce un claro efecto sobre la expresión del VDR de manera indirecta, a través del
ácido araquidónico liberado como consecuencia de la activación del CaSR por el calcio.100,
121 Del mismo modo, este efecto del calcio sobre el VDR se ha observado también en riñón
en células del túbulo proximal.213 De esta forma, el incremento de la PTH inducido por
hipocalcemia produce un descenso de los niveles de VDR en el riñón que se corrige, al
menos parcialmente, cuando se recuperan los niveles normales de calcio. Recientemente,
diversos trabajos han demostrado que el mecanismo por el cual el calcio incrementa los
niveles de VDR en células del túbulo proximal y en glándulas paratiroides está mediado por
la activación del CaSR y requiere la fosforilación de las MAPK ERK y p38alfa.120, 122 A modo
de visión global, todos estos resultados ponen de manifiesto la clara interrelación y
cooperación existentes entre CaSR y VDR con el último fin de mantener la homeostasis
mineral y en el caso concreto del tejido paratiroideo de mantener la regulación de los
niveles de PTH.
Figura 17. Análisis de los niveles de VDR. A) Análisis de los niveles de ARNm mediante qRT-PCR en glándulas paratiroides cultivadas in vitro durante 24 horas con tres concentraciones de calcio diferentes (0,6, 1,2 o 2,0 mM). Los valores están normalizados frente al ARNr 18s y representan la media de 6 ensayos independientes. p<0,05 respecto al grupo de glándulas cultivadas con 0,6 mM de calcio. U.R.: Unidades relativas. B) Tinción inmunohistoquímica frente a VDR en glándulas paratiroides cultivadas en las mismas condiciones que en el apartado A). (Aumentos x20). Imágenes representativas de 5 experimentos.
0,6 mM 1,2 mM 2,0 mM
Concentración de calcio
0
40
80
120
160
200
240
280
AR
Nm
VD
R/1
8s (%
U.R
.)
100
164
195
*
A163,5 ± 26,6
203,4 ± 12,21,2 mM calcio
2,0 mM calcio Control negativo
0,6 mM calcio
B
Resultados y discusión
91
El segundo objetivo de este estudio fue investigar el efecto que ejerce el calcitriol
sobre la expresión simultánea de CaSR y VDR. En trabajos previos realizados en nuestro
laboratorio habíamos observado cómo la concentración de calcio en el medio de cultivo
interfería en la inhibición de la PTH por calcitriol.103 En dicho trabajo pudimos observar
cómo el calcitriol tras 48 horas de cultivo es capaz de llevar una inhibición en la secreción
de PTH 4 veces mayor cuando la concentración de calcio en el medio de cultivo es menor.103
Dado que en el presente estudio nuestro objetivo era el análisis de los niveles de CaSR y
VDR en la regulación de la PTH, el medio de cultivo utilizado contenía una concentración de
calcio baja (0,6 mM) que permitiera observar el efecto mayor del calcitriol, no sólo sobre la
PTH sino también sobre los niveles de CasR y VDR.
Como puede verse en la Figura 18, en condiciones de bajos niveles de calcio, el
calcitriol fue capaz de incrementar no sólo los niveles de ARNm sino también de proteína
de su propio receptor en glándulas paratiroides tras 48 horas de cultivo. Este efecto se ha
descrito previamente in vivo tanto en estudio clínicos como experimentales utilizando
calcitriol100, 118-119, 214-215 o más recientemente maxacalcitol.68, 216 En cualquier caso, es
importante remarcar que la regulación al alza del VDR por el calcitriol sólo ocurre en
condiciones de hipercalcemia y normocalcemia y no en hipocalcemia, señalando que los
niveles de calcio parecen ser críticos para la regulación del VDR por el calcitriol.100, 118-119 Sin
embargo, con nuestro estudio hemos demostrado por primera vez, utilizando un modelo in
vitro, que el calcitriol aumenta no sólo los niveles de ARNm sino también de proteína tras
un período largo de exposición incluso cuando las concentraciones de calcio son bajas.
Además, de acuerdo con los resultados obtenidos previamente respecto a los niveles de
VDR cuando las glándulas se cultivan con diferentes concentraciones de calcio, este efecto
del calcitriol sobre el VDR no puede ser atribuido a un posible efecto indirecto del calcio
sobre el VDR mediado por el CaSR sino que debe atribuirse únicamente al calcitriol, puesto
que tanto el grupo de glándulas cultivadas en ausencia de calcitriol como el grupo cultivado
con él fueron cultivados con la misma concentración baja de calcio.
Resultados y discusión
92
Figura 18. Análisis de los niveles de VDR. A) Análisis de los niveles de ARNm mediante qRT-PCR en glándulas paratiroides cultivadas in vitro durante 48 horas con vehículo (grupo control) o con 10
-8 M
de calcitriol. Los valores están normalizados frente al ARNr 18s y representan la media de 6 ensayos independientes. p<0,05 respecto al grupo control. U.R.: Unidades relativas. B) Tinción inmunohistoquímica frente a VDR en glándulas paratiroides cultivadas en las mismas condiciones que en el apartado A). (Aumentos x20). Imágenes representativas de 4 experimentos.
Además, encontramos que el calcitriol, a pesar de su efecto sobre el VDR,
incrementa los niveles de ARNm y de proteína del CaSR (Figura 19). Estos resultados están
de acuerdo con hallazgos previos de estudios in vivo donde se analizó la expresión génica
de CaSR en tejido renal y paratiroideo.95, 217 Si bien es importante señalar que en estos
estudios in vivo el efecto del calcitriol sobre la expresión de CaSR sólo se hizo efectivo en
estadios de normo- e hipercalcemia, señalando una vez más, que nos niveles de calcio
parecen ser críticos para la regulación del CaSR por calcitriol.95 Canaff y col. demostraron,
en un estudio in vivo con ratas, que tras 15 horas de la administración de calcitriol se
producía un incremento en la expresión génica del CaSR tanto en paratiroides como en
riñón.101 En este mismo trabajo se demostró además que el promotor del gen del CaSR
presenta VDRE; validando la hipótesis de que el calcitriol es capaz de regular al alza la
expresión del CaSR a través de los VDRE de su promotor independientemente de los niveles
de calcio.
A
218,7 ± 42,6
Control Calcitriol
100
150
200
250
300
350
400
AR
Nm
VD
R/1
8s (%
U.R
.)
100
176
*
Calcitriol
Control negativo
Control
B
Resultados y discusión
93
Figura 19. Análisis de los niveles de CaSR. A) Análisis de los niveles de ARNm mediante qRT-PCR en glándulas paratiroides cultivadas in vitro durante 48 horas con vehículo (grupo control) o con 10
-8 M
de calcitriol. Los valores están normalizados frente al ARNr 18s y representan la media de 6 ensayos independientes. p<0,05 respecto al grupo control. U.R.: Unidades relativas. B) Tinción inmunohistoquímica frente a CaSR en glándulas paratiroides cultivadas en las mismas condiciones que en el apartado A). (Aumentos x20). Imágenes representativas de 4 experimentos.
Por otro lado, la proliferación celular y/o la hiperplasia de la glándula paratiroides
han sido asociadas por muchos autores con un descenso en la expresión génica de CaSR y
de VDR.93, 215 Además, algunos autores han demostrado que la hiperplasia de la glándula
ocurre antes que el descenso de los niveles de CaSR en ratas urémicas.94 Aunque tras 24 y
48 horas de cultivo no es esperable encontrar cambios en proliferación celular, se realizó
una tinción frente a PCNA para medir la proliferación y tal y como puede verse en la Figura
20, no se encontró ninguna célula positiva para este anticuerpo. Esta falta de proliferación
no es sorprendente debido a la baja tasa de proliferación que tiene este tejido.218-220
A
218,7 ± 42,6
*
Control Calcitriol
100
150
200
250
300
350
400
AR
Nm
CaS
R/1
8s (%
U.R
.)
100
196
*212,8 ± 39,9
Calcitriol
Control negativo
Control
B
Resultados y discusión
94
Figura 20. Tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal anti-PCNA. En la parte superior de la imagen: Glándulas cultivadas 24 horas con tres concentraciones de calcio (0,6 mM, 1,2 mM, 2,0 mM); en la parte inferior de la imagen: Glándulas paratiroides cultivadas durante 48 horas con vehículo (grupo control) o calcitriol 10
-8 M y muestra de riñón utilizado como control positivo de la
tinción. (Aumentos 20x).
Como resumen de este primer objetivo de la tesis doctoral en el que pretendíamos
analizar in vitro la regulación de la PTH a través de los receptores de calcio y vitamina D
hemos podido demostrar que mientras que el calcio no es capaz de regular los niveles de su
propio receptor, CaSR, regula al alza los niveles del VDR y que el calcitriol, incrementa tanto
los niveles de ARNm como de proteína de ambos receptores en condiciones de bajo calcio.
Este efecto in vitro del calcitriol sobre CaSR y VDR no había sido previamente estudiado al
mismo tiempo como se ha realizado en nuestro estudio. Además en todos nuestros
experimentos, la medida simultánea de los niveles de ARNm de CaSR y VDR y los niveles de
proteínas ha sido estudiada tras largos períodos de cultivo (24 y 48 horas) comparados con
otros estudios in vitro donde el período de cultivo fue menor (6 horas) y en los que sólo se
midió VDR.100
0,6 mM calcio 1,2 mM calcio
Control Calcitriol Control positivo
2,0 mM calcio
Resultados y discusión
95
EFECTO DE LOS ESTRÓGENOS SOBRE LA REGULACIÓN DE LA PTH
Los estrógenos previenen las pérdidas óseas en la mujer postmenopáusica221
actuando directamente sobre el hueso,222 inhibiendo la diferenciación y estimulando la
apoptosis osteoclásticas, y estimulando la proliferación y diferenciación osteoblásticas.164,
183-184 Pero además el tratamiento estrogénico es capaz de prevenir las pérdidas óseas, al
menos en parte, inhibiendo la resorción ósea mediada por la PTH.223 De acuerdo con esto,
es posible que los estrógenos actúen no sólo directamente sobre las células óseas, sino
también indirectamente modificando la síntesis y/o la secreción de PTH. A este respecto,
existen diversos trabajos en los que se ha descrito que el tratamiento estrogénico parece
ser el responsable de inhibir la secreción de PTH en mujeres postmenopáusicas.189-190 Este
posible efecto regulador de los estrógenos sobre la PTH podría deberse a una acción directa
sobre la glándula paratiroides, posiblemente mediada por los ERs presentes en las células
paratiroideas; si bien los estrógenos también podrían actuar indirectamente, modificando
los niveles de calcio, fósforo u otros mediadores que a su vez modificarían los niveles de
PTH. Por ello, el segundo objetivo principal de esta tesis doctoral fue conocer el/los
mecanismo/s involucrados en el efecto de los estrógenos sobre la función paratiroidea.
Para ello utilizamos un modelo animal de insuficiencia renal y estrogénica puesto a
punto previamente en nuestro laboratorio.47, 224-225 En estos trabajos pudimos demostrar lo
crítico que es el período de insuficiencia estrogénica previo al tratamiento. El tratamiento
estrogénico administrado de forma tardía, tras 4 semanas de insuficiencia estrogénica, no
resulta eficaz para prevenir o revertir las pérdidas de hueso trabecular ocasionadas como
consecuencia de la insuficiencia renal y ovárica; mientras que tras sólo 1 semana de
insuficiencia estrogénica el tratamiento es capaz de prevenir esas pérdidas.224 De acuerdo
con estos resultados, para el presente estudió se estableció un período de deprivación
estrogénica de 1 semana previo al inicio del tratamiento. Asimismo ensayamos dos dosis
diferentes de E2 (15 µg/kg/día y 45 µg/kg/día), que se encuentran dentro del intervalo de
dosis utilizadas al extrapolar a pacientes que reciben tratamiento hormonal sustitutivo,226 y
que dan lugar a respuestas dosis dependientes en cuanto a la prevención de las pérdidas
óseas.47, 225
Resultados y discusión
96
En una primera aproximación, y con el fin de evaluar el nivel de reemplazo
conseguido con el tratamiento estrogénico así como el efecto del mismo sobre la masa
ósea, se cuantificaron los niveles séricos de E2 así como el peso del útero y la DMO en todos
los animales. La deprivación estrogénica en ratas con ERC mostró, tal y como se esperaba,
un descenso significativo en el ratio peso del útero/peso del animal así como en los niveles
séricos de E2, junto con un descenso significativo en la DMO en la zona proximal de la tibia
(Tabla 1), probablemente provocada por un incremento en la resorción ósea.47, 183, 225, 227 Por
otro lado, los animales que recibieron el tratamiento estrogénico aumentaron la relación
peso del útero/peso del animal así como los niveles séricos de E2. Sin embargo, mientras
que la dosis baja de E2 (15 µg/kg/día) revirtió parcialmente la insuficiencia estrogénica y
evitó la pérdida de masa ósea, fue la dosis alta de E2 (45 µg/kg/día) la que consiguió revertir
completamente el déficit estrogénico y prevenir la pérdida de masa ósea (Tabla 1),
confirmando por tanto la validez del modelo y la efectividad de los tratamientos.
Tabla 1. Análisis de diferentes parámetros bioquímicos así como de la DMO a nivel de tibia proximal al final del estudio en los diferentes grupos.
a,bp<0,05 con respecto a los grupos ERC y placebo
respectivamente.
En cuanto al posible efecto inhibitorio de los estrógenos sobre los niveles de PTH, el
tratamiento estrogénico evitó el aumento no sólo los niveles de PTH sino también los
niveles de su ARNm en una forma dosis dependiente, comparada con el grupo placebo. Tal
y como puede verse en la Figura 21, la dosis alta de E2 fue la que alcanzó niveles de PTH
similares a los del grupo de animales con ERC sin insuficiencia estrogénica. Es importante
NORMALES ERCERC+OVX
Placebo E2-15 E2-45
Peso útero (mg) 496,00±161,43 494,33±65,58 181,83±122,61a 352,38±98,20a,b 300,00±44,22a,b
Peso corporal (mg) 310,00±26,05 320,50±24,42 353,00±36,99 312,50±18,63b 333,40±9,24
Peso útero/peso corporal (mg/g) 1,60±0,48 1,58±0,24 0,53±0,38a 1,12±0,27a,b 0,90±0,14a,b
17β-estradiol (pg/mL) 45,2±22,6 32,03±13,07 12,63±3,16a 23,64±13,52b 35,86±3,28b
DMO (g/cm2) 0,28±0,01 0,28±0,02 0,25±0,02a 0,26±0,02 0,28±0,02b
Creatinina (mg/dL) 0,6 0±0,00 1,03±0,08 1,01±0,08 1,06±0,10 0,90±0,04
Urea (mg/dL) 30,60±5,41 69,50±11,03 67,33±3,50 72,00±14,15 65,00±6,04
Resultados y discusión
97
señalar a este nivel que el descenso observado de los niveles de PTH se debe
exclusivamente al tratamiento con E2 y no a la ERC que presentan los animales de los
diferentes grupos pues todos ellos presentan un grado similar de insuficiencia renal,
medido como niveles séricos de urea y creatinina (Tabla 1). Si bien algunos autores apoyan
nuestros resultados,189-190 otros no han observado este efecto inhibitorio de los estrógenos
sobre la PTH,185, 228 probablemente debido a diferencias en el diseño del estudio, la edad de
los animales, las dosis de E2 empleadas o la función renal.
Figura 21. A) Niveles séricos de IPTH de los diferentes grupos del estudio (ERC y ERC +OVX tratados con Placebo, E2-15 y E2-45).
a,bp<0,05 respecto a los grupos ERC y placebo, respectivamente. La barra
horizontal representa el rango (media ± desviación estándar) del grupo de ratas normales. B) Análisis de los niveles de ARNm de PTH medidos por qRT-PCR. U.R.: Unidades relativas, referidas al grupo placebo. La línea horizontal representa los niveles de ARNm de PTH del grupo de ratas normales.
Los mecanismos por los cuales los estrógenos podrían inducir una reducción de la
síntesis y secreción de PTH se desconocen hasta el momento. Teniendo en cuenta que el
mecanismo de acción de los estrógenos requiere la presencia de ERs en el tejido diana, si
las glándulas paratiroides expresaran ERs, el E2 podría actuar directamente sobre la
glándula paratiroides y modificar la PTH; sin embargo, este aspecto es todavía
controvertido. Mientras algunos autores han descrito la falta de ERs en tejido
paratiroideo,229-231 otros han demostrado que las glándulas paratiroides son órganos diana
ERC ERC + OVX
A
a
b
0
10
20
30
iPT
H(p
g/m
L)
PLACEBO E2-15 E2-45
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
AR
Nm
PT
H /1
8s (U
.R.)
PLACEBO E2-15 E2-45
B
ERC ERC + OVX
12,37 ± 2,09
20,26 ± 6,5617,27 ± 9,07
12,06 ± 3,27
0,45
0,80
1,00
0,44
Resultados y discusión
98
de los estrógenos, y que éstos incrementan la expresión de PTH.70 Los diferentes resultados
obtenidos en los distintos estudios pueden ser debidos a las distintas aproximaciones
experimentales, a las distintas dosis de estrógenos ensayadas, distintos períodos de
tratamiento probados o diferentes procedimientos empleados para la extracción de las
glándulas (paratiroidectomía229-231 o tiroparatiroidectomía70).
En nuestro estudio, analizamos la presencia del ERα y del ERß en glándulas
paratiroides procedentes de ratas con funciones renal y ovárica normales, tanto a nivel de
ARN como a nivel de proteína, mediante cuatro técnicas experimentales diferentes (RT-
PCR, qRT-PCR, Western Blot e inmunohistoquímica). Sin embargo, a pesar de la diversidad
de técnicas empleadas, no se detectó ninguno de los ERs, incluso cuando se utilizó una
concentración de anticuerpo primario para ambos receptores 20 veces mayor en el tejido
paratiroideo que en el útero (utilizado como control positivo) en el análisis
inmunohistoquímico (Figura 22).
Figura 22. Detección de ERα y ERß en las glándulas paratiroides. A) Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% de la PCR realizada en diferentes tejidos con oligonucléotidos específicos para ERα (calles 2, 3, y 4) y ERß (calles 5, 6 y 7), el plásmido pUC18/Hae III se utilizó como marcador de peso molecular (MPM) (calle 1). B) Western Blot de ERα y ERß en glándulas paratiroides y útero. Como control de carga se empleó un anticuerpo frente a GAPDH. C) Tinción de inmunohistoquímica frente a ERα y al ERß en glándulas paratiroides y útero. Es importante remarcar que las diluciones de los anticuerpos utilizadas en esta técnica fueron 1:50 en el tejido paratiroideo y 1:1.000 en el uterino. Contratinción con hematoxilina (Aumentos x20).
37 kDa
56 kDa
67 kDa
GLÁNDULAS PARATIROIDESÚTERO
GAPDH
ERß
ERα
B)ÚTERO
GLÁNDULAS PARATIROIDES
ERα
ERß
C)
A)
1 2 3 4 5 6 7
298 pb
257 pb
ERα
ERß
MP
M
Tib
ia
Úte
ro
G.p
arat
iroi
des
Tib
ia
Úte
ro
G.p
arat
iroi
des
ERα ERß
Resultados y discusión
99
Este hallazgo de ausencia de ERs en las glándulas paratiroides descarta la
posibilidad de un efecto directo de los estrógenos sobre la PTH. Sin embargo, el gen de rata
de la PTH presenta al menos 7 posibles sitios EREs que pueden ser activados por otros
factores distintos a los ERs, tales como el RXR.232-233 Además, algunos autores han descrito
que los estrógenos pueden inducir la expresión génica de los receptores RXRα y RXRγ en
diversos tejidos,234 por lo que el efecto de los estrógenos sobre la PTH podría estar mediado
por los RXRs. Sin embargo, los mecanismos de acción de los estrógenos requieren
necesariamente la presencia de los ERs,174 por lo que en ausencia de los mismos no podría
producirse un incremento de los niveles de RXR en las glándulas paratiroides y esta vía
alternativa de activación de los EREs debe descartarse.
Una vez descartado el posible efecto directo de los estrógenos sobre la glándula
paratiroides, analizamos otros factores involucrados en la regulación de la PTH y su posible
regulación con el tratamiento estrogénico. Uno de los factores claramente implicado en la
regulación de la función paratiroidea es el calcitriol, si bien no existe una evidencia clara del
papel que ejerce éste en la regulación de la PTH por estrógenos. Hay trabajos
experimentales que sugieren que los estrógenos no modifican los niveles séricos de
calcitriol,185, 235-236 sin embargo, otros autores han mostrado que los estrógenos podrían
modular la expresión del VDR236-237 y disminuir los niveles séricos de calcitriol.237-238 En
nuestro estudio, observamos un claro descenso significativo de los niveles séricos de
calcitriol dependiente de la dosis de estrógenos (Figura 23A). Esta reducción en los niveles
séricos de calcitriol estuvo acompañada, tal y como se ha descrito anteriormente, de un
descenso en la síntesis y secreción de PTH (Figura 21); hecho relativamente sorprendente
puesto que, según la clásica regulación de la PTH por el calcitriol, un descenso en los niveles
de calcitriol estimularía la síntesis de PTH,110 a menos que un tercer factor, en este caso los
estrógenos, estuviese interfiriendo en la regulación calcitriol-PTH, disminuyendo ambos.
Otro posible factor involucrado en la regulación de la función paratiroidea y que
podía estar involucrado en el mecanismo inhibitorio de los estrógenos sobre la PTH es el
fósforo. Varios trabajos han descrito que los estrógenos pueden inhibir el co-transportador
renal Na-Pi II, aumentando por tanto la excreción renal de fosfato por la orina provocando
Resultados y discusión
100
hipofosfatemia.188, 239-240 De acuerdo con esto, el tratamiento estrogénico provocó un
descenso significativo de los niveles séricos de fósforo en comparación con el grupo
placebo, alcanzando valores similares a los del grupo de animales con ERC sin insuficiencia
ovárica (Figura 23B). Dado que el fósforo es un claro regulador de la PTH que aumenta su
síntesis y secreción,73 la reducción en los niveles séricos de fósforo, secundaria al
tratamiento estrogénico, podría ser responsable al menos en parte de la reducción
observada en los niveles de PTH.
Figura 23. Niveles séricos de A) calcitriol y B) fósforo en los diferentes grupos del estudio (ERC y ERC +OVX tratados con Placebo, E2-15 y E2-45).
a,bp<0,05 respecto a los grupos ERC y placebo,
respectivamente. La barra horizontal representa el rango (media ± desviación estándar) del grupo de ratas normales.
Con el reciente descubrimiento del FGF23 como una potente fosfatonina capaz de
incrementar la excreción urinaria de fósforo inhibiendo la reabsorción de fosfato
dependiente del del co-transportador Na-Pi II en el túbulo proximal,133, 241 no debe
descartarse el posible papel que este factor puede jugar en la regulación de la PTH por los
estrógenos. El FGF23 interviene en la regulación del fósforo y la PTH y, además, inhibe el
A
b
b
0
20
40
60
80
1,25
(OH
) 2D
3(p
g/m
L)
ERC
PLACEBO E2-15 E2-45
ERC + OVX
ab b
0
2
4
6
8
PLACEBO E2-15 E2-45
Fó
sfo
ro s
éric
o (m
g/d
L)
B
ERC ERC + OVX
40,09 ± 33,51
42,47 ± 11,5320,52 ± 9,50
4,56 ± 2,06
4,84± 0,63
5,93 ± 0,704,72 ± 0,61 4,63 ± 0,75
Resultados y discusión
101
enzima 1-α-hidroxilasa, provocando un descenso en los niveles séricos de calcitriol.242 El
FGF23 también puede actuar directamente sobre la vía de las MAPK de la glándula
paratiroides inhibiendo la síntesis y secreción de la PTH.8
Los hallazgos de nuestro estudio son compatibles con los efectos conocidos del
FGF23. Además, tal y como se refleja en la Figura 24, el tratamiento estrogénico
incrementó significativamente los niveles séricos de FGF23 y de ARNm en hueso en una
forma dependiente de dosis, junto con los descensos significativos descritos anteriormente
en los niveles séricos de fósforo, calcitriol y PTH. Por lo tanto, de acuerdo con estos
resultados, el posible efecto regulador de los estrógenos sobre la PTH puede deberse, al
menos en parte, al FGF23.
Figura 24. A) Niveles séricos de FGF23 en los diferentes grupos del estudio (ERC, y ERC +OVX tratados con Placebo, E2-15 y E2-45).
a,bp<0,05 respecto a los grupos ERC y placebo, respectivamente. La barra
horizontal representa el rango (media ± desviación estándar) del grupo de ratas normales. B) Análisis de los niveles óseos de ARNm de FGF23 medidos por qRT-PCR en la tibia. U.R.: Unidades relativas, referidas al grupo placebo. La barra horizontal representa los niveles de ARNm de FGF23 del grupo de ratas normales.
ab
0
150
300
450
600
750
900
FG
F23
sér
ico
(pg/
mL)
ERC
PLACEBO E2-15 E2-45
ERC + OVX
ab
A
b
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
ARN
mF
GF
23/1
8s (U
.R.)
PLACEBO E2-15 E2-45
B
ERC ERC + OVX
424,16± 184,79
308,93 ± 35,25
461,91 ± 96,12
662,71 ± 161,88
1,91± 0,82
1,00 ± 0,00
2,06 ± 0,79
2,51 ± 0,52
Resultados y discusión
102
Es importante resaltar que los niveles séricos de PTH y de fósforo de las ratas del
grupo con ERC se encontraron en el rango de valores que presentaban las ratas normales
(Figura 21 y Figura 23B). Tras 8 semanas de uremia, era esperable observar un incremento
en los niveles séricos de PTH y de fósforo, sin embargo el moderado fallo renal que
presentaban los animales, equivalente al estadio 3 de la ERC en pacientes, no permitió que
los animales desarrollasen un alto grado de hiperparatiroidismo secundario. Nuestros
resultados están de acuerdo con trabajos experimentales recientes con ratas con
enfermedad renal poliquística autosómica dominante.243-244 La evolución natural de estos
animales hace que tras diez semanas desarrollen azotemia alcanzando la uremia tras 40
semanas de evolución, sin embargo variaciones en los niveles séricos de fósforo y PTH no se
observan tras ese período de tiempo a menos que los animales sean alimentados con una
dieta alta en fósforo. Por otro lado, Graciolli y col. demostraron, utilizando un modelo
experimental de ratas con nefrectomía 5/6, similar al empleado por nosotros, que los
animales con ERC que no recibían una dieta alta en fósforo no sufrían cambios en los
niveles séricos de fósforo a pesar de la ERC.245 Por tanto, no es sorprendente que los niveles
séricos de fósforo y de PTH no se encuentren incrementados en nuestro grupo de animales
con ERC.
Por otro lado, es sabido que el mecanismo de acción del FGF23 requiere la
presencia de su co-receptor klotho en sus tejidos diana. Recientemente, Nakatani y col.
demostraron que ratones dobles mutantes nulos para FGF23 y klotho mostraban
hiperfosfatemia, un incremento en la expresión del co-transportador Na-Pi II y un aumento
en los niveles de 1-α-hidroxilasa con el consiguiente incremento en los niveles séricos de
calcitriol; características comunes a los ratones mutantes nulos individuales de FGF23 o
klotho.141 El tratamiento con FGF23 del doble mutante no provocó variaciones en los
niveles séricos de fósforo, sin embargo sí se observó en ratones mutantes nulos para FGF23
y no para klotho, demostrando por tanto la necesidad de klotho para que FGF23 ejerza su
acción. En el presente estudio pudimos observar un incremento de los niveles de ARNm de
klotho en el tejido paratiroideo dependiente de la dosis de E2 administrada (Figura 25). Sin
embargo, trabajos previos sugieren que los estrógenos suprimen potencialmente la
Resultados y discusión
103
expresión de klotho en tejidos diana de los estrógenos.246 No obstante, de acuerdo con
nuestros resultados de ausencia de ERs en las glándulas paratiroides, no puede
considerarse al tejido paratiroideo como diana para los estrógenos y por tanto el efecto de
los estrógenos sobre la expresión de klotho en este tejido no se debe por tanto a un efecto
directo de los mismos sino probablemente al efecto estimulador de FGF23 sobre la
expresión de klotho.8 Por otro lado, no se observaron cambios en los niveles de ARNm de
klotho a nivel renal a pesar de que el riñón sí es un órgano diana de los estrógenos al
presentar ERs, probablemente debido a que elevados niveles de FGF23 pueden contrastar o
enmascarar el efecto inhibidor de los estrógenos sobre klotho en el riñón.
Figura 25. Análisis de los niveles de ARNm de klotho medidos por qRT-PCR en las glándulas paratiroides de los diferentes grupos del estudio. U.R.: Unidades relativas, referidas al grupo placebo. La línea horizontal representa los niveles de ARNm de klotho del grupo de ratas normales.
Con el fin de estudiar el posible efecto directo de los estrógenos sobre el
metabolismo del FGF23, y puesto que la síntesis de FGF23 ocurre mayoritariamente en el
hueso, realizamos experimentos in vitro utilizando una línea celular de osteoblastos. Los
resultados demuestran que en presencia de una concentración constante de fósforo que
evita posibles variaciones del FGF23, el E2 incrementa significativamente los niveles de
ARNm y de proteína de FGF23 de una manera dependiente de la concentración de E2 tras
24 horas de cultivo (Figura 26). Además, observamos que el incremento de FGF23 era aún
mayor al duplicar el tiempo de tratamiento en cultivo de 24 a 48 horas (Figura 27).
ERC
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
PLACEBO E2-15 E2-45
ERC + OVX
AR
Nm
klo
tho/
18s
(U.R
.)
1,45
1,001,11
1,58
Resultados y discusión
104
Figura 26. Estudio in vitro del efecto del E2 sobre FGF23 en células osteoblásticas tras 24 horas de cultivo. A) Niveles de ARNm de FGF23 medidos mediante qRT-PCR en osteoblastos cultivados durante 24 horas en ausencia (control) o presencia de diferentes concentraciones de E2 (10
-10 M, 10
-8 M y 10
-6
M). U.R.: Unidades relativas, referidas al grupo control. B) Imagen representativa del análisis de FGF23 mediante Western Blot en osteoblastos cultivados durante 24 horas en ausencia (control) o presencia de diferentes concentraciones de E2 (10
-10 M, 10
-8 M y 10
-6 M). GAPDH fue utilizado como
control de carga. ap <0,05, frente al grupo control.
Figura 27. Estudio in vitro del efecto del E2 sobre FGF23 en células osteoblásticas tras 48 horas de cultivo. A) Niveles de ARNm de FGF23 medidos mediante qRT-PCR en osteoblastos cultivados durante 4 horas en ausencia (control) o presencia de diferentes concentraciones de E2 (10
-10 M, 10
-8 M y 10
-6
M). U.R.: Unidades relativas, referidas al grupo control. B) Imagen representativa del análisis de FGF23 mediante Western Blot en osteoblastos cultivados durante 48 horas en ausencia (control) o presencia de diferentes concentraciones de E2 (10
-10 M, 10
-8 M y 10
-6 M). GAPDH fue utilizado como
control de carga. ap <0,05, frente al grupo control.
FGF-23/GAPDH: 1,00±0,10 1,42±0,14a 1,51±0,19a 1,80±0,12a
A
AR
Nm
FG
F23
/18s
(U.R
.)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
CONTROL 10-10 M E2 10-8 M E2 10-6 M E2
aa
a
B
GAPDH
FGF23
CONTROL 10-10 M E2 10-8 M E2 10-6 M E2
37 kDa
32 kDa
1,00 ± 0,00
1,37 ± 0,021,48 ± 0,07
1,65 ± 0,06
1,00±0,09 1,61±0,11a 2,27±0,18a 2,85±0,12a
a
a
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
CONTROL 10-10 M E2 10-8 M E2 10-6 M E2
37 kDa
32 kDa
CONTROL 10-10 M E2 10-8 M E2 10-6 M E2
FGF-23/GAPDH:
A
AR
Nm
FG
F23
/18s
(U.R
.)
B
GAPDH
FGF23
1,00 ± 0,00
1,65 ± 0,17
1,99 ± 0,48
2,33 ± 0,43
Resultados y discusión
105
Sin embargo, el mecanismo por el cual los estrógenos estimulan FGF23 se
desconoce por el momento. De acuerdo con las acciones clásicas de los estrógenos,247 los
ERs presentes en el núcleo podrían unirse a EREs presentes en el promotor del gen del
FGF23 de manera independiente o bien a través de los factores AP-1 y/o Sp-1 para regular
la transcripción génica. Sin embargo, también es posible que el mecanismo de acción esté
mediado por ERs presentes en la membrana de las células que desencadenan cascadas de
señalización intracelular responsables de la regulación del FGF23. Tras un análisis
exhaustivo del promotor de rata de FGF23 mediante un programa informático, hemos
podido identificar posibles sitios EREs así como diversos posibles sitios de unión de AP-1 y
Sp-1. De acuerdo con estos resultados, la vía genómica de acción de los estrógenos es una
posibilidad a tener en cuenta en la regulación del FGF23 por E2 y abre un nuevo campo de
investigación por el cual empezar a estudiar los mecanismos implicados en dicha
regulación.
Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos en relación con el segundo
objetivo principal de esta tesis doctoral podemos afirmar que la regulación de la PTH por
los estrógenos es indirecta y que FGF23 puede ser uno de los candidatos responsables de
dicha regulación.
Todo ello nos hace reflexionar sobre el posible papel de los estrógenos en la ERC.
En ausencia de fallo renal y otras alteraciones del metabolismo óseo y mineral, la
meticulosa regulación de la PTH por el calcio, fósforo y vitamina D puede resultar casi
suficiente para explicar los principales aspectos involucrados en la regulación fisiológica de
la glándula paratiroides. En este punto, el posible papel fisiológico de los estrógenos sobre
la PTH puede ser mínimo y clínicamente irrelevante y la regulación de la PTH por el FGF23
dependiente de los estrógenos quedaría relegada a un segundo plano. Sin embargo, es
probable que en estadios tempranos de la ERC, la cascada de señalización de los estrógenos
ayude a provocar incrementos en los niveles de FGF23 que contribuirían a disminuir los
niveles séricos de fósforo. En estas condiciones, incrementos de los niveles séricos de
FGF23, dependientes o independientes de los estrógenos, juegan un papel importante en el
control de los niveles séricos de fósforo y de calcitriol que en presencia de niveles
Resultados y discusión
106
normales/elevados de calcio aumentarían las posibilidades de desarrollar calcificaciones
extraóseas. Por lo tanto en esta situación, los estrógenos podrían ejercer una función
protectora, reduciendo el riesgo de desarrollar alteraciones y/o calcificaciones vasculares
en estos pacientes. En estadios más avanzados de la ERC, donde la regulación de los niveles
séricos de fósforo se encuentra seriamente comprometida, el posible efecto regulador del
FGF23, dependiente o independiente de los estrógenos, es prácticamente inexistente
pudiendo ejercer efectos más adversos que beneficiosos.156
CONCLUSIONES
Conclusiones
109
En glándulas paratiroides cultivadas in vitro:
1. El calcio no modificó los niveles de su propio receptor, el receptor sensor de
calcio, a nivel de ARNm ni de proteína tras 24 horas de cultivo.
2. El calcio reguló al alza los niveles de ARNm y de proteína del receptor de
vitamina D tras 24 horas.
3. El calcitriol, después de 48 horas de cultivo, incrementó los niveles del receptor
de la vitamina D y del receptor sensor de calcio con bajas concentraciones de
calcio (0,6 mM) tanto de ARNm como de proteína.
4. No se observaron cambios en la proliferación celular de las glándulas
paratiroides tras 24 y 48 horas de cultivo con calcio y calcitriol respectivamente.
5. Estos resultados sugieren una cooperación entre el calcio y calcitriol en la
modulación tanto de su propio receptor como la del otro receptor.
En cuanto al estudio del efecto de los estrógenos sobre la regulación de la función
paratiroidea:
6. Las ratas con insuficiencia renal y ovárica en ausencia de tratamiento
estrogénico mostraron valores séricos de PTH y de ARNm en las glándulas
paratiroides más elevados que aquellas con insuficiencia renal y función ovárica
normal tras 8 semanas de evolución.
7. El tratamiento con 17ß-estradiol disminuyó de forma dosis dependiente los
niveles de PTH con respecto a las ratas tratadas con placebo, alcanzando
niveles similares a las ratas controles con insuficiencia renal y función ovárica
normal.
8. No se detectaron receptores estrogénicos α ni β en glándulas paratiroides de
rata mediante ninguna de las técnicas empleadas: RT-PCR convencional, PCR
cuantitativa a tiempo real, western blot e inmunohistoquímica, descartando el
efecto directo de los estrógenos sobre la inhibición de la PTH.
9. El tratamiento con 17ß-estradiol produjo un descenso dosis dependiente de los
Conclusiones
110
niveles séricos de calcitriol y fósforo comparado con las ratas tratadas con
placebo. Si bien el descenso de fósforo puede explicar en parte el descenso
observado en los niveles de PTH, el descenso de los niveles de calcitriol fue en
contra de la conocida correlación inversa entre calcitriol y PTH, sugiriendo la
participación de otros factores en la regulación de la PTH por los estrógenos.
10. Los animales tratados con 17ß-estradiol mostraron incrementos de FGF23 en
suero, así como de ARNm en hueso de manera dosis dependiente, indicando un
posible papel del FGF23 en la regulación de la PTH por estrógenos.
11. Las células osteoblásticas UMR106 mostraron un incremento de la expresión de
FGF23 cuando dichas células se cultivaron con concentraciones crecientes de
17ß-estradiol y tiempo de cultivo, indicando que los estrógenos regulan el
FGF23.
12. Todos estos hallazgos en su conjunto indican un posible papel del FGF23 sobre
la regulación de la función paratiroidea por estrógenos.
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OTRAS PUBLICACIONES
Otras publicaciones
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A continuación y en un primer bloque, se incluyen otras 3 publicaciones recientes
que, si bien no pertenecen a los estudios que se han presentado en esta tesis doctoral,
guardan estrecha relación con ella. Por último, en un segundo bloque, se incluyen otras 6
publicaciones en las que el doctorando participó activamente y que sirvieron para sentar
algunos de los aspectos metodológicos o conceptuales sobre los que parcialmente se
sustenta la presente tesis doctoral.
PUBLICACIONES RELACIONADAS CON LA TESIS DOCTORAL:
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models. Expert Opin. Drug Discov, 5(3):1-11, 2010.
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publicación en Menopause, 2010.
Manuscrito III. Lanthanum activates calcium-sensing receptor and enhances
sensitivity to calcium. Aceptado para publicación en Nephrol Dial Transplant, 2010.
OTRAS PUBLICACIONES:
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