M Y C O B A C T E R I U M

Mycobacterium es el nico gnero de la familia de las bacterias Mycobacteriaceae. Porlas caractersticas nicas entre otros gneros bacterianos y por la importancia mdica delas mismas, se estudian en la subrama de la Microbiologa llamada micobacteriologia.

El gnero Mycobacterium est formado por bacilos aerbios inmviles y no esporuladoscon un tamao de 0,2 a 0,6 x 1 a 10 mcm, algunos de los cules son patgenos quecausan graves enfermedades en los mamferos, incluyendo tuberculosis y lepra.

Caractersticas:

Bacilos aerobios obligados Inmviles No esporulados Miden de 0.2 um a 0.4 um x 2 um a 10 um Son bacilos acido alcohol resistentes, debido a la complejidad de la pared celular

que poseen. In vitro, su crecimiento es lento, dividindose cada 12 o 24 horas .

Las caractersticas ms importantes del genero Mycobacterium, estn determinadas porla complejidad de su pared celular. Las Micobacterias poseen una pared celularcompleja y rica en lpidos. Esta pared celular es la responsable de muchas de laspropiedades caractersticas de las bacterias:

Su cido alcohol resistencia Crecimiento lento Resistencia a detergentes Resistencia a antibacterianos comunes Antigenecidad

Los lpidos de la pared celular de los microorganismos pertenecientes a los generosMycobacterium, Nocardia y Corynebacterium, constituyen ms del 60% del peso secode la pared bacteriana. En sus paredes contienen unas molculas llamadas cidosmiclicos.

Adems, la pared celular de las Micobacterias contiene una capa de pptidoglicano,cuya estructura es similar a la encontrada en las paredes de las bacterias gramnegativos,denominado; lipoarabinomanano (LAM) esta molcula es compleja, y se extiende desde

la membrana plasmtica hasta la superficie celular. El LAM es anlogo desde el puntode vista estructural y funcional al lipopolisacrido de las bacterias gramnegativas.

El pptidoglicano est unido a un polisacrido ramificado llamado arabinogalactano porenlaces fosfodister. Los extremos distales del arabinogalactano estn esterificados conel cido miclico de alto peso molecular. Estos glucolpidos de alto peso moleculartienen un esqueleto carbonado cuya longitud oscila entre C78 y C90. En mycobacteriumtuberculosis, el nico cido miclico 6,6 dimicoliltrehalosa es conocido como elfactor cordn.El complejo peptidoglicano-cido micolico-arabino-galactano forma el esqueleto de lasparedes celulares de las micobacterias.2

A. Mycobacterium tuberculosis3

Es el agente causal de la tuberculosis, una de las enfermedades infectocontagiosas msletales y antiguas que afecta al ser humano y que posee una amplia distribucin en elmundo, produciendo cada ao la muerte de alrededor de 2 millones de personas. Quienla describi por primera vez, el 24 de marzo de 1882, fue Robert Koch, a quienposteriormente (en 1905) se otorg el premio Nobel de Fisiologa o Medicina.

Desafortunadamente an no se conoce con claridad cules son los principales factoresde virulencia de M.tuberculosis involucrados en el desarrollo de la patogenicidad deeste microorganismo.

Fisiopatologa:

Es una bacteria alcohol-cido resistente, frecuentemente incolora, aerbica estricta. Sucrecimiento est subordinado a presencia de oxgeno y al valor del pH circundante. Esmuy resistente a las condiciones de fro, congelacin y desecacin. Por el contrario, esmuy sensible a las de calor, luz solar y luz ultravioleta. In vitro se destruye mediantepasteurizacin a 80 C.

Su multiplicacin es muy lenta: se divide cada 16 a 20 horas. Ante circunstanciasadversas puede entrar en estado latente, y retrasar su multiplicacin desde algunos dashasta varios aos. El reservorio natural de M. tuberculosis es el ser humano, tanto elsano infectado como el enfermo.

Puede causar enfermedad en cualquier rgano del cuerpo. Lo ms frecuente es lainfeccin en los pulmones. De ah, por va sangunea o linftica, se propaga a otrosrganos. Los sntomas aparecen cuando las lesiones son ya muy extensas. En estascondiciones, el diagnstico se establece cuando el padecimiento est muy avanzado.

Los sntomas que lo delatan son: fiebre, sudoracin, adelgazamiento, expectoracinpurulenta y tos. Provocan lesiones tisulares (tubrculos). Donde participan linfocitosCD4+ y citotxicos generan respuesta inmune. Por su parte, las clulas NK (naturalkiller) eliminan macrfagos y linfocitos infectados.

El medio de cultivo ms usado y ms adecuado es el de Lowenstein Jensen. Tambin seutiliza el medio Ogawa. Para que el desarrollo de la bacteria sea visiblemacroscpicamente (a simple vista) sobre el medio de cultivo se requieren por lo menos15 das, y hasta ocho semanas de incubacin. Se debe incubar un promedio de 30 das.Sus colonias son de color blanco cremoso, esfricas, secas, rugosas, opacas, polimorfasy de dimensiones variables.

Los laboratorios especializados realizan pruebas de susceptibilidad antibitica(antibiogramas) de las cepas aisladas y que oponen resistencia al tratamientoconvencional.

M. tuberculosis resistentes

Un problema que se est extendiendo en los ltimos aos es la aparicin de M.tuberculosis resistentes a antibiticos. En funcin de la las resistencias a antibiticosque presentan las distintas cepas, podemos distinguir:

Multiresistentes (MDR): Que son bacterias que desarrollan resistencia frente arifampicina (RMP) e isoniacida (INH), que son los tratamientos de primera lnea.

Ultrarresistentes (XDR): Bacterias resistentes a drogas de primera lnea y a cualquiermiembro de la familia de las fluoroquinolonas y al menos frente a uno de segunda lnea(kanamicina (KAN) o capromicina (CPM)).

Han sido identificadas mutaciones en un nmero limitado de genes y regionesintergnicas (IGRs) en cepas resistentes de M. tuberculosis, pero an no estnclaras todas las causas genticas de la resistencia a antibiticos

Diagnstico

El diagnstico de la presencia de los Mycobacterium se puede realizar por microscopade los frotis de esputo, pus, lquido cerebro espinal, orina, heces fecales, ganglioslinfticos y otros tejidos, mediante el empleo del mtodo de Ziehl-Neelsen caractersticopara bacterias cido -alcohol resistentes.

En los mataderos se utilizan las lesiones macroscpicas caractersticas. Tambin, seemplean las pruebas de tuberculina alrgica mediante la reaccin cutnea en losanimales y el hombre. Pueden emplearse mtodos biolgicos mediante la inoculacin deconejos, caballos y pollos, donde Mycobacterium tuberculoso mata al curiel;Mycobacterium bovis mata al conejo y al curiel, y Mycobacterium aviar mata al pollo,este es el nico que la elimina y puede matar al conejo pero sin tuberculomas visibles enlas vsceras.

En la tuberculosis tambin se pueden usar pruebas de fijacin de complemento yreacciones de hemoaglufinacin indirecta. Para el diagnstico en el laboratorio a partirde rganos de animales se pue- den enviar pulmones, rganos digestivos y ganglios, endependencia de la localizacin de las lesiones.

En Cuba se fabrica y se usa de forma rutinaria la tuberculina mamfera para eldiagnstico preventivo indirecto de la tuberculosis. Esta tuberculina contiene productosmetablicos y estrados de cepas de Mycobacterium tuberculoso humano y bovino, lacual se inocula por va intradrmica en dosis de 1,2 mL en la regin cervical ya que enesta las reacciones son ms intensas que en el pliegue anocaudal. Las reaccionespositivas se aprecian a las 72 horas por una hinchazn firme.

La paratuberculosis se diagnostica de acuerdo con el cuadro clnico, tpico de diarreascrnicas, caquexia y engrosamiento de la mucosa intestinal con aspecto cerebriforime.Otros mtodos de diagnstico son la demostracin de bacilos cido-alcohol resistentesen extensiones de heces fecales o raspado intestinal, la prueba alrgica endovenosa de laJohnina que produce inquietud, temblores y fiebre a las 4 u 8 horas. Adems existe unaprueba alrgica cutnea de aplicacin intradrmica, cuya reaccin positiva en la tabladel cuello debe producir un aumento de ms de 3 minutos en 48 horas.

Para el diagnstico, no basta con los sntomas clnicos, sino que es necesario elaislamiento en el laboratorio mediante la siembra de muestras adecuadas y la tincin atravs del mtodo de Ziehl-Neelsen, adems de utilizar diferentes pruebas bioqumicas yde la caracterizacin de los cultivos.

B. Mycobacterium leprae,4,5

Mycobacterium leprae, es una especie bacteriana, tambin conocida con el nombre debacilo de Hansen, es la bacteria que causa la lepra o "enfermedad de Hansen". Esintracelular y pleomrfica, aunque usualmente tiene forma de bastn, es cido-alcoholresistente, aerobia y slo remotamente emparentada con Mycobacterium tuberculosis.

Fue la primera bacteria patgena descubierta en tejidos infectados. Fue descubierta en1874 por G. Armauer Hansen en Noruega. Presenta una longitud entre 1 y 7 micras y unespesor entre 0,3-0,5 micras. Este organismo nunca ha podido ser multiplicadoexitosamente en un medio de cultivo artificial.

Mycobacterium leprae es sensible a las dapsonas (el primer tratamiento efectivodescubierto para la lepra), pero resistente a los antibiticos desarrolladosposteriormente. Normalmente se necesita una combinacin de dapsona, rifampicina yclofazimina (tratamiento recomendado por la OMS).

El Mycobacterium leprae se trasmite a travs de los objetos contaminados, por contacto.Esta condicin se favorece cuando disminuye la temperatura. No se ha podidocomprobar su suceptibilidad en los animales, pero se ha comprobado que afecta en granmedida al hombre (provoca la lepra).

Los grmenes del gnero Mycobacterium no forman esporas, son cido-alcoholresistente, inmvil, aerobios obligados, grampositivos y crecen lentamente en losmedios de cultivo.

Son bacilos cido-resistentes que tienden a agruparse en heces o masas globulares(globis), en los frotis de raspados de piel o mucosas.

No se ha podido cultivar este microorganismo en medios artificiales. Se desarrollanlesiones locales cuando los bacilos de la lepra humana inoculan en la planta de las patasde ratones y armadillos.

Patogenia

Produce la lepra, una enfermedad granulomatosa crnica, de comienzo insidioso, quetiene un perodo de incubacin de varios aos.

La lepra es una infeccin causada por el Mycobacterium leprae que es un parsitointracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitariasmononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Schwann de losnervios.

Clasificacin:

Existen dos tipos diferentes de Mycobacterium leprae: el lepromatoso y el tuberculoide.

a. Tipo lepramotoso

En l, el curso es el progresivo, con lesiones nodulares cutneas; involucracin insidiosade troncos nerviosos; bacilos cido-resistentes abundantes en las lesiones cutneas, yuna prueba cutnea de la lepromina negativa (extracto de tejido lepromatoso).

b. Tipo tuberculoide

En l, el curso es benigno, con lesiones maculares cutneas, involucracin grave de lostroncos nerviosos de iniciacin brusca, con pocos bacilos presentes en las lesiones y unaprueba cutnea de lepromina positiva.

I. PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS

Una vez que la muestra fue recolectada, el proceso siguiente es la descontaminacin-digestin. Las micobacterias son ms resistentes que las dems bacterias de floranormal o microbiota debido a la alta cantidad de l pidos en su pared celular , porconsecuente estas son ms resistentes a las soluciones acidas y alcalinas quenormalmente eliminan a las dems bacterias. De esta manera, es posible utilizar agentesdescontainantes o bactericidas que eliminen a la microbiota normal que las acompaenen la muestra a analizar. El cult ivo microbiolgico de las micobacterias se llevaen promedio hasta 3 semanas, por lo que es importante eliminar la microbiota normalpara evitar un sobrecrecimiento de estas y as obtener un mejor crecimiento el cultivo.

Los procesos de digestin-descontaminacin, solo pueden ser establecidos y realizadospor laboratorios clasificados en el nivel II de servicios . Estos procesos requierende un manejo cuidadoso dentro de una campana de seguridad junto con todas lasmedidas de bioseguridad disponibles en las instalaciones del laboratorio de nivel II .

1 . DIGESTION Y DESCONTAMINACIN

Como anteriormente se ha mencionado, una vez obtenida la muestra a analizar y esconsiderado el diagnstico microbiolgico por cult ivo , se debe de tener en cuenta elproceso de digestin-descontaminacin antes del inoculo en el medio de cult ivo .

Las muestras; respiratorias, lquidos de lavado gstrico, heces, orina, tejidospostmortem., son las muestras ms frecuentemente sometidas al proceso de digestin-descontaminacin, en especial si estas presentan una consistencia mucosa o que deantemano es reconocida como una muestra que trae consigo un exceso de microbiota.Los agentes ms comnmente utilizado para este proceso son los que a continuacin sedescriben:

Agentes ms utilizados para la descontaminacin de las muestras

AGENTE COMENTARIOS

N-acetil-L-cistenams 2 % de NaOH .

Solucin de descontaminacin leve con una agente mucolticoNALC para liberar las micobacterias atrapadas en el mucus. Lmitede exposicin al NaOH de 15 minutos.

Ditiotreitol ms 2%de NaOH .

Agente mucoltico muy efectivo usado con NaOH al 2%. El nombrecomercial del ditiotreitol es Sputolysin. El reactivo es ms costosoque el NALC. Lmite de exposicin al NaOH de 15 minutos.

Fosfato trisdico al 13% ms cloruro debenzalconio(Zephiran).

Preferido por los laboratorios que no pueden controlarcuidadosamente el tiempo de exposicin a la solucin dedescontaminacin.

El Zephiran debe ser neutralizado con lecitina y no inoculado amedio de cultivo sobre la base de huevo

NaOH al 4 %

Es la solucin tradicional de descontaminacin y concentracin. Eltiempo de exposicin debe de ser cuidadosamente controlado a noms de 15 minutos. El NaOH al 4 % ejerce accin mucoltica parapromover la concentracin para la centrifugacin.

Fosfato trisdico al 13%

Puede ser utilizada para la descontaminacin de muestras cuando eltiempo de exposicin se puede controlar en forma precisa. No es tanefectivo como la mezcla FTS-Zephiran.

cido oxlico al 5 % Ms til en el procesamiento de muestras quecontienenPseudomona aeruginosa como contaminante.

Cloruro de cetilpiridioal 1% ms 2% deNaCl

Efectivo como solucin de descontaminacin para muestras deesputo enviadas a otros laboratorios. El bacilo tuberculoso hasobrevivido 8 das de trnsito sin prdida significativa.

* N-actil-L-cistena (NALC). Es el agente ms frecuentemente utilizado en los laboratoriosclnicos:

1.1. PRINCIPIO DEL N-ACETIL-L-CISTENA MS 2 % DE NAOH.

Las micobacterias se recuperan de manera ptima a partir de materiales clnicos cuandose libera de mucina, lquidos corporales y clulas (digestin). La N-acetil-L-Cistena(NALC) es un agente mucoltico que en concentraciones del 0,5 al 2% puede digerircon rapidez el esputo adherente y otras muestras mucoides en el trmino de 2 minutos.El crecimiento de las micobacterias en los medios de cultivo tambin se incrementacuando la concentracin de microorganismos competidores es mnima(descontaminacin). El agregado de hidrxido de sodio al 4 % (NaOH 4%)a la mezclade digestin, hasta alcanzar un concentracin final del 2%, es el procedimientodescontaminante utilizado con ms frecuencia.

1.2. PROCEDIMIENTO ESTNDAR DE DIGESTIN-DESCONTAMINACINESTANDR DESARROLLADO POR KUBICA Y COL. EN LOS "CENTERSFOR DISEASE CONTROL (CDC). "

1. Preparacin: Se prepara la sustancia digestiva acetilcistena-lcali como sigue:

Mezclar 50 mL de citrato trisdico-3 H2O al 2,94% (0,1M) con 50 mL de NaOH al 4%.agregar a esta solucin 0,5 g de N-acetil-L-cistena (NALC) en polvo antes de usarla.

El NaOH (el cual se convierte en una solucin al 2% despus de mezclar partes igualescon la muestra) sirve como agente descontaminante. En ocasiones la concentracin deNaOH debe ser aumentada al 3% (solucin original al 6%), en pocas de calor o en eltratamiento de muestras provenientes de pacientes con grandes cavidadees pulmonaresasociadas con descontaminacin bacteriana persistente.

El NALC es un agente mucoltico sin actividad anti-bactericida que licua el mucus porclivaje de puentes disulfuro, lo cual libera las micobacterias y hace ms fcilconcentrarlas mediante centrifugacin con alta velocidad.

2. Utilizar tubos de centrfuga de plstico de 50 mL con tapas de cierre hermtico parael procesamiento de todas las muestras. Agregar la mezcla digestiva NALC en unvolmenes igual al de la muestra. Tpicamente se utiliza un volumen de 10 - 15 mL demuestra. Cerrar bien fuerte la tapa.

3. Homogenizar la mezcla con un mezclador vortex durante 15 - 20 minutos, agitandolos tubos peridicamente. Se debe poner adecuada atencin al tiempo de digestin, elcual no debe de exceder de los 20 minutos, de lo contrario ser menor la probabilidad deobtener un cult ivo positivo.

4. Despus del paso de la digestin-descontaminacin,agregar buffer fosfato a pH 6,8 (preferentemente hecho conagua estril) hasta el anillo superior del tubo. Mezclar bien.*NOTA. El buffer fosfato hace menos probable lasdesviaciones bruscas de pH y tambin sirve para lavar lamuestra, para diluir y neutralizar las sustancias txicas ypara reducir la densidad de la muestra de modo que lacentrifugacin sea ms efectiva para la sedimentacin delos microorganismos.

5. Concentrar las muestras por centrifugacin a 2.000 -3.000 revoluciones durante 15-20 minutos. Puede utilizarse

una centrfuga refrigerada a velocidades ms altas para aumentar ms la cantidad demicobacterias.

6. Despus de la centrifugacin, decantar todo el sobrenadante cuidadosamente en unrecipiente a prueba de salpicaduras que contenga un desinfectante fenlico. Limpiar laboca del tubo con una torunda de algodn embebida con fenol al 5 %. Agregar unapequea cantidad de buffer-fosfato pH 6,8 (1 - 2mL) y resuspender el sedimento conuna pipeta Pasteur. A pesar de que en el pasado se aconsejaba el agregado de unapequea cantidad de albmina srica, esto ahora se evita porque aumenta lasposibilidades de contaminacin y constituye un retraso potencial en el tiempo dedeteccin.

7. En este ltimo paso, el sedimento es trasferido en una cantidad de 0,2 a 0,4 mL delconcentrado a los medios de cult ivo seleccionados. Adems se preparan tres frotispara tincin y bsqueda de bacilos acidorresistentes.

* NOTA. La baci loscopa realizada en este paso se realiza con el fin de confirmarpositiva la presencia de micobacterias en la muestra mas no interpretar los resultadoscomo un grado o estado de la enfermedad, interpretacin que si es realizada enuna baci loscopia comn en esputo.

2 . C E N T R I F U G A C I N .

Una buena centrifugacin es pieza clave para obtener mayor cantidad de micobacteriasen el sedimento.

Como ya se ha descrito anteriormente, las micobacteriasposeen gran cantidad de lpidos en su pared celular. El lpidotiene el efecto de que el microorganismo tenga muy bajadensidad. Si se pretende que sedimente la mayor cantidad demicroorganismos durante la centrifugacin, la densidad dellquido en el que se suspende la muestra debe ser mantenidatan baja como sea posible, y la fuerza de centrifugacinaplicada a la muestra debe ser tan alta como sea prctico.

En si, la fuerza de centrifugacin a la que se debe someter las muestras para elaislamiento de micobacterias, debe de ser a una fuerza de 3.000 g promedio. A estafuerza de centrifugacin o una mayor, los tubos de vidrio o de plstico puedencolapsarse y deben ser colocados en cubetas precintadas. As mismo a altas velocidadesse genera un calor considerable y suelen requerirse centrifugas refrigerada.6,7

II. MEDIOS DE CULTIVO DE LA MYCOBACTERIAS

El aislamiento de mycobacterias a partir del cultivo de muestras clnicas contina siendofundamental para el diagnstico especfico de las infecciones por estosmicroorganismos. El cultivo ha demostrado ser ms sensible (101-102 bacteriasviables/ml) que el examen microscpico. Adems, el aislamiento del agente causalpermite la identificacin de la especie, los posteriores estudios de sensibilidad frente alos antimicrobianos, as como la monitorizacin del tratamiento y curacin del paciente.Las mycobacterias suelen ser bastante exigentes y requirieren medios ricos y frescos.Existen medios selectivos con diversos antibiticos para prevenir el crecimiento de laflora bacteriana o fngica acompaante.Aunque los medios no selectivos no contienen antibiticos, poseen algunas sustanciasinhibidoras para el control de bacterias contaminantes, como son los colorantes deanilina (verde de malaquita o cristal violeta). Su concentracin suele ser crucial paramantener el equilibrio entre la recuperacin microbacteriana deseada y la posiblecontaminacin a partir de las muestras de territorios no estriles. Si la concentracin esmuy elevada puede llegar a afectar seriamente el crecimiento micobacteriano.En general, para el aislamiento primario a partir de muestras clnicas se prefierenmedios no selectivos, lquidos y, a ser posible, la combinacin de uno lquido y unoslido.

1. MEDIOS SLIDOS.Se pueden dividir en dos grupos bsicos: medios con huevo o con agar.

1.1. Medios slidos con huevo. Son medios ricos que contienen huevo (entero o sloyema), fcula de patata, sales, glicerol y un agente inhibidor como es el verde demalaquita. Las ventajas fundamentales radican en la buena recuperacin de gran parte

de las especies micobacterianas y su buena capacidad tanto, inhibidora de la floracontaminante, como tamponante que permite neutralizar mltiples productos txicospresentes en las muestras clnicas, as como algunos restos de diversos productosdescontaminantes. Adems, poseen una vida media prolongada cuando se conservan a2-8 C (6 meses) y las pruebas fenotpicas de identificacin, realizadas a partir desubcultivos provienen de estos medios, son bastante fidedignas. Sin embargo, sonmedios difciles de preparar (coagulacin a 85-95 C) lo que conlleva algunasvariaciones de un lote a otro. Esto puede influir en la concentracin final de losantimicrobianos en las pruebas de sensibilidad in vitro. Tambin presentan, a veces,algunos problemas para distinguir entre los restos del inculo y el crecimientomicobacteriano. Por ltimo, cuando se contaminan se afecta todo el medio pudiendollegar a licuarse.

El medio ms utilizado es el Lwenstein-Jensen, aunque existen otros en virtud de sumayor (Petragnani) o menor capacidad inhibitoria de la flora acompaante (Coletsos oAmerican Thoracic Society) que depende tan slo de la concentracin de verde demalaquita.

1.2. Medios slidos con agar. Estos medios sintticos, tipo 7H10 y 7H11 deMiddlebrook, son transparentes y permiten una deteccin rpida del crecimientomicobacteriano (10-12 das) que puede distinguirse de los residuos de la muestra en lasiembra. Adems se pueden utilizar para las pruebas de sensibilidad a losantimicrobianos.La inclusin de un 2% de glicerol permite un mejor crecimiento del complejo M.avium-intracellulare. El medio 7H11 contiene un 0,1% de hidrolizado de casena quefavorece la recuperacin de las cepas de M. tuberculosis resistentes a la isoniacida. Losprincipales inconvenientes residen en un precio superior a los medios con huevo, unavida media corta (1 mes a 2-8 C) y una mayor tasa de contaminaciones al contener unaconcentracin menor de verde de malaquita. El almacenaje es delicado ya que un excesode temperatura o exposicin a la luz puede deteriorar el medio y estimular la produccinde formaldehdo que es txico para las micobacterias.

1.3. Medios selectivos. Son medios no rutinarios con o sin huevo que contienen agentesantimicrobianos para inhibir la contaminacin bacteriana y/o mictica acompaante.

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Cuando se decida utilizarlos, debera hacerse en combinacin con un medio noselectivo.

1.4. Medios especiales. Algunas Micobacterias requieren enriquecimientos especiales,como ocurre en M. haemophilum, donde un suplemento de hemina, hemoglobina ocitrato amnico frrico es necesario.

2. MEDIOS BIFSICOS.

El medio ms conocido es el sistema Septi-Chek que consiste en una botella con unmedio lquido (7H9 de Middlebrook) y suplementos antibiticos y de enriquecimiento,al que se le aade en la parte superior de la botella diversos medios slidos (agarchocolate, Lwenstein-Jensen, 7H10 o 7H11 de Middlebrook). Esto permite distinguirlas contaminaciones y los cultivos mixtos. Adems es posible obtener un crecimientoadecuado tanto en la fase lquida como slida para la identificacin, sin requerir unsubcultivos posterior. En conjunto, sin llegar a la rapidez de deteccin de los sistemasautomticos o semiautomticos, obtiene una sensibilidad similar a stos y mejoraostensiblemente el rendimiento de los medios convencionales. Por lo tanto, este mediorepresenta una buena opcin para los laboratorios con bajo nmero de muestras, al seralgo ms econmico y no precisar un gran equipamiento. Sin embargo, no permitellevar a cabo estudios de sensibilidad a los antimicrobianos.

3. MEDIOS LQUIDOS.

En general, son medios muy enriquecidos que recuperan un mayor nmero demicobacterias y es rpidamente que los medios slidos. Por ello se aconseja incluirlossiempre para el aislamiento primario de muestras clnicas. Adems estos medios seutilizan como base para diversas pruebas de identificacin bioqumica y de sensibilidada los antimicrobianos. Por el contrario, tienen la desventaja de no poder visualizar lamorfologa de la colonia ni valorar los posibles cultivos mixtos. Aparte de los clsicos7H9 de Middlebrook, Dubos, Youmans, Proskauer-Beck, etc., existen una serie desistemas comerciales que, utilizando la base de los convencionales, logran un altorendimiento. Los objetivos actuales para el cultivo de micobacterias, se basan en la

utilizacin de sistemas totalmente automatizados de incubacin y lectura, y en los quepueden realizarse pruebas de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos.

3.1. Medios de lectura manual. Aunque los medios convencionales se puedenconfeccionar en el propio laboratorio, existen medios comercializados que intentanfacilitar la lectura para una rpida deteccin del crecimiento bacteriano. Los msutilizados son el MB Redox y el MGIT, que ofrecen una rentabilidad superior a losmedios slidos y pueden ser una alternativa en laboratorios con un nmero bajo demuestras.

3.1.1. MB Redox. Se basa en el medio de Kirchner con unos suplementos deantibiticos y de enriquecimiento. Para la deteccin del crecimiento micobacterianoincorpora una sal de tetrazolio como indicador redox. Cuando existe un crecimientoactivo, la sal se reduce y precipita en la pared bacteriana. Esto produce unas partculasde color rosa o violeta que se pueden ver directamente. Se trata, por tanto, de un mediosimple, fcil de usar y que no precisa instrumentacin especial alguna.

3.1.2. MGIT (Mycobacterial Growth IndicatorTube). Es un medio fluoromtrico basado en un 7H9 de Middelbrook con uncomponente fluorescente (pentahidrato de rutenio) embebido en silicona. Bajo la luzultravioleta el crecimiento se aprecia mediante la visualizacin de un brillo fluorescenteanaranjado en la superficie y en el fondo del tubo como consecuencia de una deplecinde O2. Es un medio sencillo que permite la lectura manual simultnea de diversoscultivos sin necesitar, al igual que el MB redox, un gran equipamiento, salvo una fuentede luz ultravioleta. Sin embargo, el MGIT tiene el inconveniente de requerir una mayormanipulacin, ya que se le deben aadir los suplementos de antibiticos y deenriquecimiento, y stos, al no utilizar agujas ni jeringuillas, deben aadirse con unapipeta, teniendo que abrir los tapones de rosca de los tubos. Por otro lado, ello lepermite tener una vida media mayor que el MB redox que, al tener ya incorporados lossuplementos debe, adems, conservarse refrigerado (2-8C). El tubo de MGIT es elmismo que se emplea en el sistema automtico de cultivo y deteccin MGIT 960.Asimismo, puede utilizarse para las pruebas de sensibilidad de M. tuberculosis a losantimicobacterianos de primera lnea.

3.2. Sistemas de deteccin automtica o semiautomtica. La introduccin delBACTEC 460 TB en la dcada de los ochenta revolucion el cultivo de estosmicroorganismos, mejorando la recuperacin de todo tipo de micobacterias ydisminuyendo considerablemente el tiempo de deteccin de las mismas. A pesar de serel patrn de referencia desde entonces, sus problemas, sobre todo, derivados de lautilizacin de istopos radiactivos, han llevado al desarrollo de nuevos sistemasautomatizados no radiomtricos como son: ESP II System, MB/BacT ALERT 3D yMGIT 960. Aunque estos sistemas presentan un mayor nmero de contaminaciones, larentabilidad global obtenida hasta la fecha es comparable al sistema radiomtrico.Adems de no utilizar istopos radiactivos, presentan otras importantes ventajas comoson: la automatizacin, la sencillez y la desaparicin de la posible contaminacincruzada al tener mtodos de deteccin que no implican una manipulacin del contenidode los tubos.

3.2.1. Sistema BACTEC 460TB. Es un sistema semiautomtico de cultivo ydeteccin del crecimiento micobacteriano para todo tipo de muestras, incluidas lashemticas. Utiliza el medio lquido 7H12 de Middlebrook que es un caldo base de 7H9de Middlebrook que contiene cido palmtico marcado con 14C. Tras ser metabolizadoel substrato por la bacteria, libera 14CO2 a la fase area que se mide por el aparato ycuyo ndice refleja la cantidad de microorganismo existente en el medio. Este mtodopuede utilizarse tambin para la identificacin presuntiva (utilizando pnitro- amino-hidroxipiofenona -NAP) y pruebas de sensibilidad. No obstante, aunque sigue siendotil, especialmente para las pruebas de sensibilidad, presenta las desventajas de, sobretodo, utilizar istopos radiactivos (14C), no estar automatizado, contaminacin cruzadapotencial, posible produccin de aerosoles durante la manipulacin y lectura, y tener unprecio elevado. En la actualidad est siendo sustituido por los sistemas automatizadosno radiomtricos que se detallan a continuacin.

3.2.2. Sistema ESP Culture System II. Es un sistema automtico noradiomtrico de monitorizacin continua, para la deteccin y determinacin de lasensibilidad de micobacterias. La media base consta de un 7H9 de Middlebrook consuplementos antibiticos y de enriquecimiento y unas esponjas de celulosa incluidas enel medio para ofrecer un hbitat natural y mayor superficie de cultivo. La deteccin serealiza mediante sensores de presin que detectan el consumo de oxgeno. El sistema

efecta lecturas cada dos horas generando un grfico para cada cultivo y a travs de unsistema experto determina si el cultivo es positivo o negativo. Tiene capacidad para1920 cultivos simultneos. Admite cualquier mtodo clsico de descontaminacin ypuede utilizarse para todo tipo de muestras, incluyendo sangre y mdula sea. Laspruebas de sensibilidad estn disponibles para tres frmacos: isoniacida, rifampicina yetambutol.

3.2.3. Sistema MB/BacT ALERT 3D. Sistema automatizado de cultivocolorimtrico que detecta la produccin de CO2 como indicador de crecimientobacteriano. El medio utilizado es el bsico 7H9 de Middlebrook suplementado confactores de crecimiento y una solucin antibitica para las muestras de origen no estril.Con una monitorizacin continua, los cultivos permanecen en el incubador-lector sin unmanejo adicional hasta que el equipo notifica su positividad o bien su negatividad tras elperiodo de incubacin fijado.La capacidad de cultivo es variable y muy verstil ya que permite la adicin demltiples armarios incubadoras de 40 cultivos cada uno. Otra ventaja es que puedeutilizarse, al igual que el ESP Culture System II, con todo tipo de nuestras, incluidas lassanguneas. A diferencia de este slo admite el mtodo de descontaminacin de laNaOH-NALC (N-acetil-L-cistena). Recientemente se han empezado a realizar laspruebas de sensibilidad en M. tuberculosis a los antimicobacterianos de primera lnea,sin incluir la pirazinamida. La aplicacin de estas pruebas en la rutina de loslaboratorios clnicos se encuentra en evaluacin.

3.2.4. Sistema BACTEC MGIT 960. Es el ltimo sistema automatizado que haaparecido en el mercado. Este sistema utiliza el medio MGIT, detectando consumo deO2 mediante unos sensores fluoromtricos. Un aspecto relevante de este medio (MGIT)es que los tubos poseen tapones de rosca, evitando el uso de agujas y jeringuillas. Losresultados se proporcionan como positivos o negativos y en unidades de crecimiento.Bsicamente, es un sistema de gran capacidad (960 cultivos) diseado para laboratorioscon un gran volumen de muestras (8.000 por ao aprox.). Este mtodo no puedeutilizarse en muestras hemticas y, al igual que el MB/BacT ALERT 3D, slo admite elmtodo de descontaminacin de NaOH-NALC (N-acetil-L-cistena).Recientemente, se ha introducido para la realizacin de las pruebas de sensibilidad deM. tuberculosis a los antimicobacterianos de primera lnea, incluida la pirazinamida.

Aunque ha sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) y los datosiniciales son muy prometedores, la utilizacin sistemtica de estas pruebas en loslaboratorios de Microbiologa est en proceso de consolidacin y consenso general.

3.2.5. Sistema BACTEC serie 9000. Se trata de un sistema automatizado dehemocultivos convencionales que, mediante un software y un medio de cultivoespecfico, puede utilizarse para la recuperacin de micobacterias en muestrashemticas. Es un sistema colorimtrico con una capacidad de 50 a 240 cultivos quecomplementara el MGIT 960. 7.4. CONDICIONES DE INCUBACIN.La mayora de las especies tienen un buen crecimiento a 35-37C. No obstante, enalgunas muestras clnicas (piel y tejidos blandos) donde pueden intervenir especies (M.marinum, M. chelonae, M. haemphilum, M. ulcerans, etc.) cuya temperatura deincubacin ptima es menor, se debern sembrar e incubar un grupo adicional decultivos entre 25 y 33C. En la actualidad, ello es factible en los cultivos de lecturamanual.

Un aspecto importante para mejorar el crecimiento en los medios slidos es laincubacin con un 5-10% de CO2 que, en el caso del Lwenstein-Jensen, puedereducirse a los primeros 7-10 das tras la siembra, incubando despus en una estufaconvencional.

Como regla general, el tiempo de incubacin debe ser prolongado. Aunque no hay unacuerdo unnime, el periodo de 6-8 semanas parece ser el ms adecuado. Ante lasospecha de una Micobacterias de crecimiento muy lento, muestras sanguneas oaquellas con una baciloscopia o amplificacin gentica positiva, se podra alargar laincubacin 4 semanas ms.La lectura de los cultivos manuales se adaptar a las necesidades y posibilidades de cadalaboratorio. Una recomendacin general sera una lectura a los 3-5 das de la siembra yposteriormente, 2 veces a la semana durante las 4 primeras semanas, seguida de unalectura semanal hasta el final de la incubacin.8

III. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A TUBERCULOSTTICOS

M. tuberculosis adquiere resistencia a los medicamentos antituberculosos mediantemutaciones que se producen en el cromosoma bacteriano. Hasta el momento no existenevidencias de que ocurra otro tipo de mecanismo en M. tuberculosis. Las mutacionesresponsables de la resistencia medicamentosa se producen con una baja frecuencia, peroconstante, y esta frecuencia vara segn el medicamento. La exposicin al medicamentono induce a mutaciones, sino ms bien permite la seleccin y replicacin de losmutantes ya existentes, por destruccin de las bacterias sensibles que de otra maneracompetiran por los nutrientes.9

El mtodo de las proporciones de CANETTI, RIST Y GROSSET es el que se utilizapara establecer la sensibilidad o la resistencia de una cepa de M. tuberculosis a lasdistintas drogas antituberculosas. Este mtodo consiste en medir la proporcin debacterias resistentes que existen en cada cepa.9

UTILIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD

Clnica individual:9

Cuando el paciente ha abandonado, en ms de 2 veces, el tratamiento. Cuando el paciente tiene ms de dos episodios de tratamiento. Cuando el paciente no negativiza (fracaso) luego de 6to mes de tratamiento. En todo paciente VIH/SIDA.

Estudios epidemiolgicos9

Para determinar la resistencia primaria (RP) y la resistencia adquirida (RA).

Resistencia Primaria (RP): Es aquella que se observa en pacientes que nuncarecibieron tratamiento antituberculoso.

Resistencia Adquirida (RA): Es aquella que aparece en el curso del tratamiento,usualmente como resultado de un rgimen teraputico inadecuado, fallas en laprescripcin, falta de cumplimiento del tratamiento de parte del paciente.

Los criterios de resistencia son9

Concentracin Crtica: Es la concentracin capaz de inhibir el desarrollo de todas ocasi todas las cepas salvajes (cepas aisladas de pacientes nunca tratados).

Proporcin Crtica: Es la proporcin de mutantes resistentes de una poblacin bacilar,por encima de la cual la cepa es considerada resistente.

Tabla 1. Criterios de Resistencia de M. tuberculosis9

Drogas Concentracin

crtica (mcg/mL)Proporcin crtica (%)

Isoniacida (INH) 0.2 1Estreptomicina (SM) 4.0 1Etambutol (EMB) 2.0 1Rifampicina (RFP) 40.0 1

a = Nmero de bacilos cultivables (colonias en el medio sin droga).b = Nmero de bacilos resistentes de la poblacin total (colonias

desarrolladas en el medio con droga)(b/a)x100 (Para determinar la resistencia de la cepa)

Se cuentan cuidadosamente las colonias desarrolladas en los tubos controles de la serieen que es posible hacerlo; la media de la suma de las colonias contadas en los dos tuboscontrol indica el nmero de bacilos sembrados por tubo.

En la misma serie se cuentan las colonias desarrolladas en cada una de los tubos condroga. La relacin entre el nmero de mutantes resistentes a determinada droga y elnmero de bacilos sembrados (tubos control) multiplicada por 100 da el porcentaje deresistencia a esa droga.

Comparando este porcentaje con la proporcin crtica establecida para esa droga sedetermina si la cepa es sensible o resistente.

MATERIALES PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD9,10

Patrn turbidimtrico, Escala de McFarland N 1. Cepa en estudio. Gradilla de metal. Propipeta. Pipeta de 10 mL. 14 pipetas de 1 mL graduadas en centsimos. Una esptula de acero quirrgico estril. Un matraz con agua destilada estril. Seis tubos, cada uno con 9 mL de agua destilada estril y rotulada: 10-1, 10-2, 10-

3, 10-4, 10-5, 10-6.

Procedimiento9,10

Todo el procedimiento debe realizarse en una Cabina de Bioseguridad Tipo II.

a) Preparacin de la suspensin bacilar:

Distribuir 3 mL de agua destilada estril en tubos de prueba de 20 x 150 mmestril, con tapn de algodn.

Extraer las colonias de la cepa en estudio con una esptula, cogiendo el mayornmero posible.

Colocar las colonias en la pared interna del tubo, humedecer stas con el agua. Triturar las colonias con ayuda de una bagueta esmerilada estril, hasta lograr

homogenizarlas.

Mezclar suavemente con la ayuda de la bagueta, hasta obtener una suspensinhomognea.

Dejar reposar la suspensin por unos minutos hasta sedimentar. Tomar el sobrenadante y ajustar la turbidez de la suspensin (suspensin madre)

comparando con el patrn de turbidez que contiene un miligramo/mL de masabacilar.

b) Preparacin de Diluciones:

Distribuir 9 mL de agua destilada estril a cada uno de los 6 tubos (20x150 mm) Previamente esterilizados y roturarlos del 1 al 6. Preparar diluciones al dcimo de 10-1 a 10-6. Con una pipeta aspirar 1 mL del sobrenadante de la suspensin madre agregar al

tubo rotulado con 10-1, cambiar de pipeta y mezclar bien para homogenizarlo. Tomar 1 mL de la dilucin 10-1 y agregar al tubo rotulado con 10-2, y

homogenizar bien. Continuar con las diluciones as sucesivamente hasta llegar altubo rotulado con 10-6.

Es importante cambiar de pipeta en cada dilucin. Separar los tubos 10-3, 10-5, 10-6.

c) Siembra:

Antes de la siembra verificar si los medios contiene lquido de condensacin, elcual debe eliminarse.

Serie 1. Dilucin 10-3

Se siembra 0,2 mL de la dilucin a cada uno de los siguientes tubos:

2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, es el tubo Control. 1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Isoniacida. 1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Estreptomicina. 1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Etambutol. 1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Rifampicina.

Serie 2. Dilucin 10-5

Se siembra 0,2 ml de la dilucin a cada uno de los siguientes tubos:

2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, es el tubo Control.

1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Isoniacida. 1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Estreptomicina. 1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Etambutol. 1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Rifampicina.

Serie 3. Dilucin 10-6

Se siembra 0,2 mL de la dilucin a 2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, tuboControl.

Para la siembra de las diluciones (10-3, 10-5 y 10-6) se utilizarn pipetasdiferentes de 1 mL graduada al dcimo.

Una vez sembradas las tres series, se toma cada tubo por sus extremosmantenindolo en posicin horizontal y hacindolo rotar suavemente para que lasuspensin sembrada se distribuya sobre toda la superficie del medio.

Los tubos se colocan en una bandeja de madera de fondo inclinado paramantenerlos en posicin horizontal. La bandeja se lleva a estufa de 37 C,cuidando que los tubos no roten, pues si esto sucede las colonias se desarrollarnen el borde del medio y no podrn ser contadas.

Los tubos que se utilizan para el medio de cultivo tienen tapa rosca, stas debenmantenerse sueltas durante las primeras 48 horas o hasta que se evapore la partelquida de la siembra, despus de lo cual se ajustarn fuertemente.

d) Lectura e Interpretacin de Resultados9

Se realizan dos lecturas: 1ra. lectura a las 4 semanas y 2da. lectura a las 6semanas.

Se cuentan cuidadosamente las colonias desarrolladas en los 2 tubos control decada serie, la media de la suma de las colonias contadas indica el nmero debacilos sembrados por tubo.

Luego se cuentan las colonias desarrolladas en los tubos con droga.

Como se sabe que la suspensin madre de la cepa en estudio contiene 1 mg/mL de masabacilar. Sin embargo la cantidad de bacilos en 1 mg de masa bacilar varaconsiderablemente de una cepa a otra; esta variacin puede ser de un milln a 100millones de gmenes. Por ello es necesario sembrar las dos diluciones 10-3 y 10-5.

A veces no es posible contar las colonias en los tubos de control de ninguna de las series10-3 y 10-5, en estos casos las colonias en el tubo 10-6 permitir calcular el nmero decolonias.

En casos en que el nmero de colonias desarrolladas en los tubos de control de la serie10-3 sea inferior a 200, se debe repetir la prueba.

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA PIRAZINAMIDA9,10

PIRAZINAMIDA (PZA) Es una amida del cido pirazinoico, droga activa a pH cidoes bactericida contra Mycobacterium tuberculosis.

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA PIRAZINAMIDA MTODO DE WAYNE

Fundamento:

Las cepas de M. tuberculosis que son sensibles a la pirazinamida poseen la enzimapirazinamidasa, que metaboliza la pirazinamida en cido pirazinoico.

Las cepas pirazinamida resistente han perdido su actividad pirazinamidasa.

Procedimiento:

Con un asa recoger de 5 a 10 mg de masa bacilar de un cultivo de 4 semanas einocular sobre la superficie del medio Dubos.

Incubar a 37C x 4 das. Al cuarto da retirar los tubos de la estufa y agregar 1 ml solucin sulfato ferroso

amoniacal 1% y colocar los tubos a - 4C x 4 horas.

Lectura e interpretacin:

Sensible: Banda rosada de difusin de sal ferrosa indica hidrlisis de lapirazinamida con formacin de cido pirazinoico.

Resistente: No se observa banda rosada.

Figura I. Prueba de sensibilidad a la Pirazinamida.

fuente: Public health Mycobacteriology CDC USA

INDICACIONES PARA LA REALIZACION DE LA PRUEBA DESENSIBILIDAD10

Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes:

Al trmino del quinto mes de tratamiento. En retratamiento. Multitratados. HIV Positivos/SIDA. Para estudios epidemiolgicos de Resistencia Primaria y Adquirida del M.

tuberculosis, a los medicamentos antituberculosos.

RECOMENDACIONES9,10

Los cultivos deben estar acompaados de sus respectivas fichas. Anotar en el tubo el N de identificacin y la fecha de siembra. El cultivo no debe tener menos de 30 das ni ms de 60 das contados a partir de

la fecha de siembra. El nmero de colonias por tubo no deber ser menor de 10 colonias claramente

diferenciadas. El medio no deber estar alcalinizado, acidificado ni contaminado con hongos.

El tubo de cultivo no deber contener lquido, ni el medio encontrarse licuado. Los tubos de cultivo debern estar sellados con cinta adhesiva para asegurar el

cierre hermtico.

Los tubos de cultivo deben enviarse en cajas de material resistente debidamenteacondicionados para evitar la rotura de los tubos.

Anotar la direccin exacta del laboratorio donde se realizar prueba.

IV. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. TORTORA. (2007) Introduccin a la MIcrobiologa. 9 ed. Editorial MdicaPanamericana. Argentina. p. 203.

2. FUNKE. Introduccin a la microbiologa. 9 ,ed. Ed: panamericana: Argentina.2007. Pp: 203- 204.

3. WINN, ALLEN Y COL. (2008) Koneman. Diagnstico Microbiolgico. 6 ed.Editorial Mdica Panamericana. Argentina. pp. 188-191

4. LEDERMAN W. (2007) Una historia personal de las bacterias. Sociedadchilena de infectologa. Chile. p.176

5. Gua de estudio de Microbiologa. (1981). Ministerio de Salud Pblica.Direccin Docente Metodolgica.

6. Agapito,J. Evaluacin del medio Middlebrook 7H11 asociado a sangre humanau ovina para la deteccin de Mycobacterium tuberculosis en muestras deesputo.2009. [Visitado 16 abril 2014] Disponible en:http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342009000300005

7. Recoleccin y procesamiento de muestras. [Visitado 16 abril 2014] Disponibleen:http://www.fcq.uach.mx/phocadownload/Academico/Material_de_Estudio/micobacterias/muestras/muestras_tb.html

8. Esteban, J. Gonzlez, J. Palacios, J. Procedimientos en Microbiologa Clnica -Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas yMicrobiologa Clnica. Visitado [12 de abril del 2014]. Web[http://www.facebook.com/l.php?u=http%3A%2F%2Fwww.seimc.org%2Fcontenidos%2Fdocumentoscientificos%2Fprocedimientosmicrobiologia%2Fseimc-procedimientomicrobiologia9a.pdf&h=iAQGsEAVG]

9. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (Lima). El laboratorio desalud pblica frente a la emergencia de la tuberculosis resistente / CentroNacional de Laboratorios de Salud Pblica. Lima : Ministerio de Salud: InstitutoNacional de Salud, 2001. [Visitado 17 abril 2014] Disponible en:http://www.minsa.gob.pe/pvigia/publicaciones/tuberculosis/4laboratorio_salud_publica.pdf

10. Hospital Rebagliati. Mendoza A. Mtodos para determinar la resistencia a losfrmacos anti-tuberculosis. Lima: Ministerio de Salud: Instituto Nacional deSalud, 2010.[Visitado 17 abril 2014] Disponible en:http://www.slideshare.net/alertomendoza/mtodos-para-detectar-la-resistencia-a-frmacos-anti-tuberculosis