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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
CENTRO DE ESTUDIOS EN SALUD-CDC-CAP
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
“MONITOREO PRELIMINAR DEL VIRUS DEL OESTE DEL NILO (VON) EN
AVES DE GUATEMALA”
PROYECTO FODECYT No. 19-03
MARIA EUGENIA MORALES-BETOULLE
Investigadora Principal
GUATEMALA, OCTUBRE DE 2005
INVESTIGADORES ASOCIADOS Y COLABORADORES
a. Equipo de Investigación del Laboratorio de Arbovirología, Centro de Estudios en Salud, Universidad del Valle de Guatemala
1. Licda. Celia Cordón Rosales Investigadora Asociada. Bióloga.
2. Dr. Danilo Álvarez
Investigador Asociado. Médico Veterinario. 3. Licda. Cristina Bailey
Bióloga. Especialista en entomología. 4. Licda. Silvia Sosa
Bióloga. Entomóloga.
5. Licda. Carmen Lucía Contreras Bioquímica. Técnico de laboratorio
6. Lic. Luis Martínez
Bioquímico. Tesista. Presentó tesis de licenciatura a en octubre de 2005. 7. Aquiles García
Técnico de campo
8. Luís López Técnico de campo.
9. Alex Bran
Jornal de campo
b. Colaboradores en Guatemala 1. Dr. Jean-Luc Betoulle
Biólogo. Ornitólogo. Miembro de la Fundación Mario Dary.
c. Colaboradores en el extranjero
1. Dr. Nicholas Komar Virólogo. Especialista en enfermedades infecciosas. Laboratorio de Ecología de Arbovirus. División de Enfermedades transmitidas por vectores, Centros de Prevención y Control de Enfermedades, Colorado, Estados Unidos (DVBID-CDC). Asesor y parte del trabajo de campo y su laboratorio realiza las pruebas confirmatorias de vertebrados no equinos.
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2. Licda. Susan Beckett Biologa. División de Enfermedades transmitidas por vectores, Centros de Prevención y Control de Enfermedades, Colorado, Estados Unidos (DVBID-CDC).
3. Msc. Nicholas Panella
Biologo. División de Enfermedades transmitidas por vectores, Centros de Prevención y Control de Enfermedades, Colorado, Estados Unidos (DVBID-CDC).
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INDICE
RESUMEN......................................................................................................................................8 ABSTRACT ....................................................................................................................................9 I PARTE........................................................................................................................................10
I.2 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 10 I.3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA................................................................. 11 I.4 OBJETIVOS E HIPÓTESIS..................................................................................... 14
I.3.1 Objetivos .............................................................................................................................................. 14 I.3.1.1 Objetivo General ........................................................................................................................ 14 I.3.1.2 Objetivos específicos ................................................................................................................. 14 I.3.1.3 Hipótesis .................................................................................................................................... 14
I.5 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 15 I.4.1 Las Variables ............................................................................................................................................... 15
I.4.1.1 Variables dependientes ........................................................................................................................ 15 I.4.1.2 Variables independientes ..................................................................................................................... 15
I.4.2 Indicadores................................................................................................................................................... 15 I.4.3 Método ......................................................................................................................................................... 15
I.4.3.1 Actividades de Campo ......................................................................................................................... 15 I.4.3.2 Registro de Información ...................................................................................................................... 18 I.4.3.3 Pruebas de Laboratorio ........................................................................................................................ 18
I.4.4 Análisis estadístico....................................................................................................................................... 22 I.4.4.1 Análisis de datos de aves migratorias y residentes............................................................................... 22 I.4.4.2 Análisis de resultados de laboratorio. .................................................................................................. 22
II PARTE ......................................................................................................................................23 II.1 RESULTADOS Y DISCUSION ..................................................................................... 23
II.1.1 Determinación de la proporción de aves migratorias versus residentes en los diferentes sitios y épocas de estudio. ................................................................................................................................................................. 23 II.1.2 Resultados obtenidos por captura en redes de niebla. ................................................................................. 23 II.1.3 Resultados por Censos de Aves .................................................................................................................. 26 II.1.4 Determinación de la incidencia de anticuerpos contra VON en muestras de aves residentes (silvestres y domesticas)........................................................................................................................................................... 28
II.1.4.1 Resultados del ELISA de Bloqueo ..................................................................................................... 29 II.1.4.2 Validación de la prueba de ELISA de bloqueo por la prueba estándar de oro, PRNT........................ 30 II.1.4.3 Correlación entre la incidencia de VON y la proporción de aves migratorias .................................... 33
II.1.5 Estudio preliminar de los zancudos presentes en los tres sitios de estudio de Izabal .................................. 35 II.1.6 Implementación de Bases de Datos para el registro, análisis y presentación de la información colectada durante la ejecución del proyecto ......................................................................................................................... 37 II.1.7 Talleres para la vigilancia y colecta de Aves muertas:................................................................................ 38 II.1.8 Presentación de un póster informativo........................................................................................................ 41
III PARTE.....................................................................................................................................42 III.1 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 42 III.2 RECOMENDACIONES ................................................................................................ 44 III.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ......................................................................... 45
IV PARTE.....................................................................................................................................48 IV.1 EJECUCION FINANCIERA DE LOS RECURSOS SOLICITADOS A FODECYT................................................................................................................................................... 48
V. PARTE .....................................................................................................................................49 V.1 ANEXOS ........................................................................................................................... 49
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LISTADO DE FIGURAS Figura 1. Ciclo de Transmisión del Virus del Oeste del Nilo (según CDC, 2005, sitio de internet). _____ 12 Figura 2. Vía de migración de las aves de la región Norte hacia la región mesoamericana (Según Rappole
et al., 2000)._________________________________________________________________________ 12 Figura 3. Mapa de placa para ELISA de Bloqueo para diagnóstico serológico de VON. Donde se coloca
controles negativos (C-), controles positivos (C+), blancos y muestras en orden correlativo. _________ 19 Figura 4. Variación del porcentaje de aves migratorias por sitio según método captura con redes._____ 25 Figura 5. Variación del porcentaje de aves migratorias por sitio según método de censo. ____________ 27 Figura 6. Relación entre incidencia de anticuerpos contra VON en aves residentes y el porcentaje de aves
migratorias según capturas en red._______________________________________________________ 34 Figura 7. Relación entre incidencia de anticuerpos contra VON en aves residentes y el porcentaje de aves
migratorias según censos. ______________________________________________________________ 34
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LISTADO DE CUADROS Cuadro 1. Relación entre meses de trabajo y la época de migración del las aves (según datos de Howell et
al., 2001). __________________________________________________________________________ 16 Cuadro 2. Porcentaje normalizado de aves migratorias por sitio y época de de estudio según el método de
redes. ______________________________________________________________________________ 23 Cuadro 3. Análisis de ANOVA con los datos obtenidos en las redes. _____________________________ 24 Cuadro 4. Porcentaje normalizado de aves migratorias por sitio y época de de estudio según el método de
censos. _____________________________________________________________________________ 26 Cuadro 5. Análisis de ANOVA con los datos obtenidos por los censos. ___________________________ 26 Cuadro 6. Porcentaje transformado de aves residentes positivas contra VON según el método de ELISA de
bloqueo con el anticuerpo monoclonal 3.1112G (ver metodología). _____________________________ 29 Cuadro 7. Comparación de los resultados obtenidos por ELISA de bloqueo y PRNT, con muestras de los
Departamentos de Escuintla, Santa Rosa, Izabal, Chiquimula y Petén. ___________________________ 30 Cuadro 8. Análisis de Χ2 comparando los resultados de ELISA de bloqueo y PRNT. ________________ 31 Cuadro 9. Títulos de PRNT a 90%, en las muestras de aves silvestres, confirmadas como positivas para
anticuerpos contra VON._______________________________________________________________ 32 Cuadro 10. Análisis de correlación de Pearson para datos normalizados de incidencia y porcentaje de
aves migratorias._____________________________________________________________________ 33 Cuadro 11. Zancudos colectados utilizando las trampas de luz –CDC y trampas grávidas en las tres áreas
del estudio de Izabal.__________________________________________________________________ 36
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LISTADO DE ANEXOS
1. Boleta de datos de campo
2. Listado de aves identificadas en Izabal.
3. Mapas de seropositividad en Izabal
4. Aves residentes positivas por ELISA de bloqueo para cada sitio de trabajo
5. Especies de aves muestreadas en cada sitio de trabajo, Izabal
6. Formato de ingreso de información de campo
7. Reporte de base de datos Arbo-epi-aves
8. Agenda del “Taller de presentación de colecta de datos de aves muertas para el monitoreo del Virus del Oeste del Nilo”.
9. Boleta de aves muertas
10. Agenda “Taller sobre Eco-epidemiología y Vigilancia de Encefalitis Arbovirales en Animales”
11. Muestra de póster informativo
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RESUMEN
El proyecto “Monitoreo preliminar del Virus del Oeste del Nilo (VON) en aves de Guatemala”, es un primer esfuerzo por determinar la existencia y el comportamiento de un virus que ha afectado en años recientes a diversos países del continente americano y de otros continentes y que puede tener serias implicaciones a la salud tanto humana como animal. El estudio se desarrolló en tres sitios distintos dentro del departamento de Izabal, sitios considerados diferentes en cuanto a la relación de población entre aves residentes y migratorias. Para determinar esta relación se utilizó dos metodologías de conteo. Una consistió en contabilizar el número de aves capturadas en las redes neblineras utilizadas en el estudio. La otra fue la elaboración de censos por observación y reconocimiento de los cantos característicos de las diversas especies de aves en los tres sitios de trabajo. Este estudio se realizó en cuatro épocas distintas del año, coincidentes con épocas de mucha o poca migración de aves al país. Se obtuvo muestras de sangre de aves residentes capturadas en los sitios de muestreo por medio de las redes neblineras. Estas muestras fueron procesadas en el laboratorio utilizando la prueba de ELISA de bloqueo y PRNT (prueba de reducción-neutralización de placas) para determinar su seropositividad al VON. Las pruebas de laboratorio demostraron ser específicas y sensibles para diagnosticar anticuerpos dirigidos al VON en aves. Los resultados de serología fueron relacionados con la proporción de aves silvestres migratorias versus residentes para confirmar si existe o no una relación entre la seroprevalencia a VON y la proporción de aves migratorias. Tanto por la metodología de redes como por la de censos se logró demostrar que existen diferencias significativas en la proporción de aves migratorias versus residentes en los diferentes sitios y épocas de estudio. Se pudo comprobar que existe mayor proporción de aves migratorias en la zona más silvestre del estudio, Punta de Manabique; respecto a ésta Machacas del Mar que es la zona peri-urbana presenta en general una proporción intermedia y Puerto Barrios, la zona urbana presenta la menor proporción. Con las pruebas serológicas se puso en evidencia la posible circulación del Virus del Oeste del Nilo en la población de aves residentes de Izabal, determinándose por medio del ELISA de bloqueo que Puerto Barrios fue el sitio con mayor incidencia de anticuerpos contra VON seguido de Machacas del Mar y finalmente de Punta de Manabique. Al realizar el análisis de correlación se demostró que, aunque no es estadísticamente significativa, se observa una tendencia a encontrar una relación inversa entre la seropositividad a VON y la proporción de aves migratorias. Finalmente, el estudio ha permitido dar los primeros pasos para implementar un sistema eficiente de vigilancia para determinar la presencia del VON en Guatemala.
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ABSTRACT The project “Preliminary Monitoring of West Nile Virus (WNV) in birds of Guatemala", is a preliminary effort to determine the presence and possible behavior of a virus recently described in the American continent. The study of WNV is of particular concern because of his potential serious implications to human and animal health. Migratory birds are suspected as likely sources of WNV introduction into new regions. However, once WNV has been introduced, the transient nature of migratory birds could divert local infections away from mosquito vectors in transmission foci. Guatemala is located on a geographic bottleneck (the Central American Isthmus) that funnels millions of migrant birds from several North American flyways through a narrow area. To evaluate the effect of migratory bird density on local WNV transmission, we surveyed migrant and resident birds, and assessed infection rates in resident bird populations on the Caribbean Coast (Izabal) of Guatemala during 2005. The study was conducted in four migratory bird seasons at three different sites within the department of Izabal. The 3 study sites were selected based on presumed different levels of migratory bird density. At each site we measured migratory bird relative abundance (no. migratory birds / no. all birds) and an index of WNV transmission (percent WNV seropositivity in resident birds) during different bird seasons. Two-day visits were conducted every 2-3 months from Jan to Aug 2005 in each of three sites. In each visit, a bird census was conducted in five transects selected to represent the predominant microhabitats. In addition, free-ranging wild birds were captured using mist-nets during the first five hours of daylight for 2 consecutive days. Blood samples were collected from captured wild resident birds and domestic birds (mainly chickens) and screened for WNV-specific antibodies using a blocking ELISA test. Positives were confirmed by plaque-reduction neutralization test (PRNT) in order to compare titers for WNV and St. Louis encephalitis virus. A four-fold greater titer for WNV was required to assign WNV as the etiologic agent. Our results show a significant difference in the proportion of migratory versus resident birds among different seasons and sites of study. The laboratory tests allowed us to diagnose antibodies, probably due to past infection with WNV, in birds from Izabal. We observed an inverse relationship between migratory bird abundance (relative to resident birds) and local WNV transmission, but our result was not statistically significant (α=0.05).
Finally, our study allowed us to implement an efficient system of surveillance of WNV in Guatemala. We hope to continue this effort in order to verify our preliminary results.
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I PARTE
I.2 INTRODUCCIÓN
En Guatemala poco se conoce sobre los virus transmitidos por vectores o arbovirus a pesar de que el país puede considerarse como “un medio idóneo de vida” para estos agentes infecciosos. El Virus del Oeste del Nilo (VON) es un Flavivirus transmitido en general por la picadura de zancudos y cuyo huésped amplificador son las aves. Este virus emergente en el continente americano, fue hallado en Nueva York, Estados Unidos en el año 1999. Desde entonces se ha diseminado en todo el norte de América, la región Caribe, México e incluso Sur América. Es generalmente admitido que la aves migratorias podrían ser las responsables de diseminar el VON en los sitios en los cuales se le ha encontrado.
Con el fin de saber si el VON está circulando en Guatemala, el Centro de Estudios en Salud (CES)-MERTU/G-CDC-CAP de la Universidad del Valle de Guatemala, en colaboración con el Ministerio de Ganadería Agricultura y Alimentación (MAGA) y la División de Enfermedades Transmitidas por Vectores de los Centros de Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (DVBID, CDC), inició en 2003, un esfuerzo de investigación sobre este tema.
El proyecto FODECYT 19-03 se inscribe en el marco de estas investigaciones. Con el objetivo de realizar un estudio sobre la posible presencia del VON en aves residentes de Izabal se solicitó en diciembre de 2003 al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología el financiamiento necesario para realizar un “Monitoreo Preliminar del Virus del Oeste del Nilo en Aves de Guatemala”. Gracias al apoyo recibido por SENACYT, hemos podido realizar en el Departamento de Izabal, un estudio en el que se ha buscado relacionar la presencia de las aves migratorias con la presencia del Virus del Oeste del Nilo. Este estudio tiene un fuerte componente ornitológico que ha permitido demostrar que en uno de los departamentos con más fuerte presencia de aves migratorias del país (Izabal), las aves residentes han estado muy probablemente afectadas por VON.
El reporte que se presenta a continuación resume los resultados obtenidos durante la ejecución del proyecto FD19-03. Los hallazgos descritos gracias a este trabajo son de gran importancia para la salud humana y animal en el país. A nivel internacional, la futura publicación de estos resultados aportará datos importantes para la mejor comprensión de la ecología de VON en los países de América Latina.
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I.3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En el continente americano se ha descrito la circulación de numerosos arbovirus (virus transmitidos por artrópodos) pertenecientes a diferentes familias que pueden ser responsables de zoonosis. Por ejemplo, en Brasil entre 1954 y 1998 se aisló en la amazonia brasileña 187 arbovirus diferentes de los cuales 32 son patógenos para los humanos (Vasconcelos, et al., 2001). Dentro de estos virus hay algunos que han circulado como agentes patógenos para la población humana desde hace muchos años en la región y que actualmente han aumentado su incidencia o distribución geográfica (virus re-emergentes) y otros que circulan desde hace relativamente poco tiempo (virus emergentes). Un ejemplo relevante, de virus emergente con implicaciones en salud humana y animal, es el Virus del Oeste del Nilo (VON). Descrito en el África en 1937, el VON llegó a las Americas en 1999 causando brotes de encefalitis en humanos y equinos en el estado de Nueva York en los Estados Unidos (CDC, 1999). Este virus es un Flavivirus, perteneciente a la familia Flaviviridae, género Flavivirus, serogrupo del virus de la encefalitis Japonesa (Burk and Monath, 2001). Su ciclo de transmisión implica a un insecto vector, por lo general un mosquito del género Culex, sin embargo mosquitos de otros géneros como Ochlerotatus o Aedes pueden también ser vectores del VON (Kilpatrick et al., 2005). Los reservorios naturales de este virus son las aves pero también pueden ser hospederos ocasionales los humanos y equinos (ver Figura 1). Recientemente se ha descrito la infección por el VON en otros mamíferos como hámsters, lobos, perros, monos, venados e incluso en reptiles como los lagartos (Sbrana et al., 2005; Campbell et al., 2002; McLean et al., 2002; Miller et al., 2003, Ratterre et al., 2003; Lichtensteiger, 2003; Miller et al., 2005; Read et al., 2005; Jacobson et al., 2005; ver revista por van der Meulen et al., 2005). Debido a su amplio espectro de vectores y hospederos el VON es un virus con un alto potencial de expansión.
En América latina, se ha descrito en los últimos años por métodos serológicos de
diagnóstico la presencia del virus del Oeste del Nilo en aves o caballos de México, de la Republica Dominicana, Jamaica, Cuba, El Salvador, Puerto Rico, (Loroño-Pino et al., 2003; Blitvich et al., 2003(a); Komar, O. et al., 2003; Dupuis et al., 2003; Kouri and Guzman., 2005; Cruz et al., 2005; Dupuis et al., 2005 ). Se publicó incluso el aislamiento del virus a partir de un cuervo (Corvus corax) en el estado de Tabasco, al Sur de México y a partir de un caballo de Nuevo León. Los autores sugieren que el aislado de Tabasco podría haber sido introducido a México por las aves migratorias de la península de Yucatán (Estrada-Franco et al., 2003; Blitvich et al., 2004). Como lo habían predicho Rappole y colaboradores (2000), el virus del Oeste del Nilo se ha ido encontrando en México y el Caribe según las vías de migración Norte-Sur de las aves (Fig. 2).
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Figura 1. Ciclo de Transmisión del Virus del Oeste del Nilo (según CDC, 2005, sitio de internet).
Figura 2. Vía de migración de las aves de la región Norte hacia la región mesoamericana (Según Rappole et al., 2000).
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En Guatemala, las dos principales vías de migración de las aves que van y vienen del Norte de América son la región caribe y la costa pacífica. Debido a que un virus emergente como VON, en una región que reúne las condiciones ideales para su amplificación y transmisión podría causar serios impactos, nuestro centro inició en septiembre de 2004 el “Monitoreo preliminar de la presencia del virus del Oeste del Nilo en la región de Izabal” (Proyecto FD 19-03). Para la realización de este proyecto se estableció una colaboración entre el Centro de Estudios en Salud-MERTU/CDC-CAP, Universidad del Valle de Guatemala, la División de Enfermedades Transmitidas por Vectores (DVBID-CDC) de Fort Collins, Colorado; y la Fundación Mario Dary, co-administradora del Refugio de Vida Silvestre Punta de Manabique, Izabal.
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I.4 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 Objetivo General Establecer la presencia del virus del Oeste del Nilo en tres sitios del departamento de Izabal, Guatemala.
I.3.1.2 Objetivos específicos
a. Implementar la metodología de captura y muestreo de aves para la detección y vigilancia del virus del Oeste del Nilo en tres sitios de Izabal, Guatemala.
b. Implementar la metodología que permita determinar la proporción de aves migratorias y residentes en los sitios de estudio en diferentes épocas de la migración de las aves.
c. Aplicar las técnicas de ELISA de bloqueo y PRNT (neutralización de placas) para monitorear la presencia y distribución del virus del Oeste del Nilo.
d. Evaluar si existe alguna relación entre la presencia de aves migratorias y la seropositividad de las aves residentes.
e. Implementar un sistema de vigilancia de aves vistas muertas como indicador de posible presencia del VON. Esto se aplicará inicialmente en áreas protegidas.
f. Entrenar a guardarecursos, técnicos, estudiantes y profesionales, para recopilar datos de aves muertas.
g. Divulgar información sobres los riesgos y formas de prevención del VON.
I.3.1.3 Hipótesis
1. Existe diferentes proporciones de aves migratorias versus residentes según el sitio y época de estudio
• Esto se verificará comparando la proporción de aves migratorias en tres sitios diferentes (Punta de Manabique= zona costera silvestre, Machacas del Mar= zona peri-urbana y Puerto Barrios= zona urbana), durante cuatro diferentes estaciones de migración de las aves
2. Existe una relación inversa entre la seroprevalencia a VON y la proporción de aves migratorias versus residentes
• Se calculará la seroprevalencia en aves residentes (silvestres y domésticas) para cada hábitat
3. La presencia de aves muertas podría ser un indicador de la presencia de VON • Se entrenará a personas que colaborarán con el reporte y colecta de aves
muertas y se verificará por pruebas moleculares si estas están infectadas por el VON.
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I.5 MATERIALES Y MÉTODOS
I.4.1 Las Variables
I.4.1.1 Variables dependientes La principal variable dependiente es la seropositividad de las aves residentes muestreadas en cada uno de los sitios de muestreo, resultado de las pruebas de laboratorio desarrolladas.
I.4.1.2 Variables independientes La densidad de población de las aves migratorias y residentes en los diversos lugares estudiados, en las diferentes épocas de migración de las aves silvestres hacia el país.
I.4.2 Indicadores Los indicadores en este estudio se refieren a:
• Número total de aves capturadas por sitio y por época del año, siendo el mismo un indicativo del grado de la presencia de más o menos aves migratorias versus aves residentes.
• Número de aves residentes seropositivas también según sitio de captura y época del año.
• Número de aves silvestres muertas reportadas y número de aves silvestres muertas procesadas por pruebas moleculares con resultado positivo a VON.
I.4.3 Método
I.4.3.1 Actividades de Campo
I.4.3.1.1 Sitios de trabajo y estaciones para tomar muestras. Se tomaron muestras de sangre de aves, en tres sitios del Municipio de Puerto Barrios, Departamento de Izabal. Estos sitios difieren, posiblemente, en términos de densidad de aves migratorias registradas en el área, según estudios de la Fundación Mario Dary, (FUNDARY). También existe diferencias de hábitat y urbanización en los 3 sitios (Fundary-ONCA, 2001). El sitio número uno es el área protegida de Punta de Manabique, un humedal ubicado en zona costera y en teoría con una densidad elevada de aves migratorias. El área de trabajo se halla a una longitud N 15º 30.049’, latitud W 88º 49.591’ y 5 m de altitud. Se define como un área límite entre los hábitats de duna, y plantación de árboles frutales, cuya sombra permite la retención de la avifauna del bosque original. Además, esta plantación constituye un cerco vivo, entre la zona habitada y el bosque tropical cenagoso y manglar. El sitio número dos es la Finca Machacas del Mar, localizada a una longitud W 88º 32.157’, latitud N 15º 45.772’ y 9m de altitud. Esta finca está caracterizada
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por ser una zona peri-urbana de bosque secundario y de actividad ganadera. En este sitio también se ha descrito la presencia de aves migratorias. En principio estas están en menor cantidad en este sitio con respecto al sitio 1, Punta de Manabique; en mayor cantidad con respecto al sitio 3, ciudad de Puerto Barrios. Finalmente, el sitio tres es el Instituto Luis Pasteur, ubicado en la ciudad de Puerto Barrios, localizado a una longitud W 88º 35.764’, latitud N 15º 43.512’ y 12m de altitud, caracterizado por ser una zona urbana costera. Se considera a este sitio como el que posee la menor densidad de aves migratorias.
El primer viaje de campo se realizó en el mes de septiembre de 2004, para confirmar los sitios de captura y muestreo. Luego se repitieron viajes en los meses de enero, marzo, junio y agosto de 2005. Estas épocas corresponden a distintas estaciones de migración de las aves neárticas como lo muestra el cuadro 1.
Época de Migración Mes Estatus aves migratorias en el Municipio de Puerto Barrios
Ivernal Enero Estancia de ciertas aves migratorias en la zona
Migración Pre-nupcial Abril Paso de aves migratorias en dirección norte Estival Junio Ausencia de aves migratorias. Migración Post nupcial Agosto Llegada de aves migratorias a la zona y
paso de estas en dirección Sur Cuadro 1. Relación entre meses de trabajo y la época de migración del las aves (según datos de Howell et al., 2001).
I.4.3.1.2 Captura de aves silvestres por medio de redes de niebla.
La captura de las aves silvestres se realizó empleando redes de niebla (Avinet®). Se colocó un máximo de 21 redes, cubriendo entre 175 a 205 metros, dependiendo de la disponibilidad geográfica y de la seguridad en cada hábitat de trabajo. En general, se trató de ubicar las redes en un corredor de vuelo para las aves del área. Las redes se abrieron diariamente al amanecer (aproximadamente a las 5:00 AM) y permanecieron abiertas como máximo hasta las 11:00 AM. Se revisó las mismas cada 10-20 minutos dependiendo de: factores climáticos, éxito de la captura, etc. En cada sitio de trabajo, se capturó y tomó muestras de sangre durante dos días consecutivos. Las aves silvestres capturadas se guardaron temporalmente en bolsas de tela. Luego estas se clasificaron, se les tomó los datos morfométricos y se determinó cuando esto fue posible su edad y sexo. Las aves migratorias y aves del listado CITES, se procesaron de la misma forma y luego se liberaron, sin ser muestreadas. Las aves residentes que no se hallaban en el listado de aves protegidas CITES, se pesaron para estimar el volumen de sangre a tomar. Todos los datos obtenidos fueron registrados en una boleta de campo (Ver anexo número 1, Boleta de datos de campo).
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I.4.3.1.3 Captura de aves domésticas. Las aves domésticas residentes, generalmente fueron gallinas (Gallus gallus) pertenecientes a personas que habitan cerca de los sitios de trabajo. Se incluyó en el estudio otras aves de corral como pijijes (Dendrocygna automnalis).
I.4.3.1.4 Toma de muestra de sangre de las aves. Para las aves silvestres, se tomó como máximo un volumen correspondiente al 1% del peso del ave, lo que permite obtener la muestra sin riesgo para la vida y salud del animal. El volumen mínimo de muestra necesario para poder elaborar los ensayos serológicos (ELISA y PRNT) corresponde a 0.3 mL por lo que de no poder sacarse esta cantidad, el ave fue liberada sin ser muestreada. Para tomar la sangre de la vena yugular o braquial del ave se empleó jeringas de 1 cc con aguja No. 26 o 27 (Beckton Dickinson, Nueva Jersey, Estados Unidos). La muestra se almacenó en tubos Microtainer ® (Becton Dickinson, Nueva Jersey, Estados Unidos) dejándolos reposar por al menos 30 minutos a temperatura ambiente para que se separara el suero. Se indujo el proceso de separación por inversión del tubo, de 8 a 10 veces. Luego se centrifugó las muestras a 3000 RPM por 10-20 minutos para separar el tejido sanguíneo. Cada tubo se conservó en hielo seco, hasta su posterior almacenamiento en el laboratorio de la UVG a -20ºC. Para las aves domésticas, las muestras de sangre se tomaron de la vena braquial o de la yugular y se procesaron de igual forma que para las aves silvestres. I.4.3.1.5 Identificación de las muestras en el campo.
Las muestras de aves se identificaron mediante un sistema alfanumérico. Se colocó la letra “A” indicando su identidad como ave, y se asignó luego un número a cada uno de los sitios de muestreo (A001, A002…) por fecha de trabajo. A cada individuo muestreado se le asignó un número correlativo para indicar el orden en que se tomó la muestra en cada sitio (A001-01, A001-02…) Este sistema permitió identificar a cada individuo según el sitio al que pertenece, y la fecha en la que se muestreó. Con ello se dio seguimiento a su historia serológica durante el estudio.
I.4.3.1.6 Determinación del porcentaje de aves migratorias en cada sitio de estudio Con el fin de determinar el porcentaje de aves migratorias versus residentes en cada sitio de estudio, se utilizó dos metodologías. Una de estas es el conteo de aves migratorias y residentes capturadas en las redes. La otra, consistió en realizar censos por dos ornitólogos especializados. Los censos de aves fueron realizados según la metodología de puntos de conteo durante cada uno de los viajes de campo. Se hicieron cinco (5) transectos diferentes, en micro-hábitats diferentes, dentro de cada sitio de estudio (Punta de Manabique, Machacas del Mar y Puerto Barrios). Los conteos se realizaron entre las 6 y las 9 a.m. durante 30 minutos por transecto. En el período de 30 minutos se caminó a lo largo del transecto contando
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durante 3 minutos las aves vistas y escuchadas; se hizo una pausa de 1 minuto durante la cual se siguió contabilizando y luego se continuó el conteo marchando por 3 minutos y así sucesivamente. La trayectoria de cada transecto fue registrada utilizando un Sistema de Posicionamiento Global (GPS) con receptores con una precisión de ±10 metros. Los datos de censos fueron registrados en una base de datos. I.4.3.1.7 Colecta de zancudos en los tres sitios de estudio Las muestras de zancudos se colectaron utilizando 93 trampas de luz modificadas por el Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) a un metro de altura del suelo. También se colocó 51 trampas grávidas durante 12 noches de colecta por períodos de 12 horas, distribuidas en los tres diferentes sitios ecológicos: Punta de Manabique (zona costera), Puerto Barrios (zona urbana) y Machacas del Mar (zona peri-urbana). Los zancudos colectados en el campo fueron conservados a -70ºC hasta su clasificación por entomólogos especializados del Centro de Estudios en Salud, UVG.
I.4.3.2 Registro de Información
Las muestras obtenidas se registran en la base de datos de Microsoft Access “Muestras” con la que se llevó el control de los ingresos y de la ubicación de las muestras en el laboratorio de Arbovirología de la UVG. Por otro lado, se utilizó una segunda base de datos “Arbo-epi aves y mosquitos”en Microsoft Access para registrar la información de las aves muestreadas, tanto silvestres como domésticas. Se registraron datos sobre ubicación y fecha de muestreo, así como información de cada ave muestreada, incluyendo especie, edad, sexo, parámetros individuales como tamaño de alas, pico y cola, además de peso. Se registró también el tipo y número o color de banda utilizada para la identificación del ave, con el objeto de reconocerla en caso de ser recapturada. Ver CD adjunto, Bases de datos MERTU/G-UVG, Proyecto Eco-WNV.
I.4.3.3 Pruebas de Laboratorio
I.4.3.3.1 ELISA de Bloqueo. Se siguió el protocolo reportado por Blitvich et al., 2002. Únicamente se emplearon los 60 pozos internos de una placa para ELISA con pozos de fondo plano Costar® (Corning Incorporated, Nueva York, Estados Unidos). La distribución de muestras y controles en la placa se realizó como se muestra a continuación:
18
1 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11
A
N N N N N N N N N N N N B
N C(-)
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 C(-) N
C
N C(-)
M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 C(-) N
D
N Blanco M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 Blanco N
E
N C(+) M25 M26 M27 M28 M29 M30 M31 M32 C(+) N
F
N C(+) M33 M34 M35 M36 M37 M38 M39 M40 C(+0 N
G
N M41 M42 M43 M44 M45 M46 M47 M48 M49 M50 N
H
N N N N N N N N N N N N Figura 3. Mapa de placa para ELISA de Bloqueo para diagnóstico serológico de VON. Donde se coloca controles negativos (C-), controles positivos (C+), blancos y muestras en orden correlativo.
• Procedimiento
Las soluciones preparadas antes de iniciar el ensayo son las siguientes: buffer para sensibilización del cual se preparó 1L consistente en Carbonato de Sodio 50mM, Bicarbonato de sodio 50mM a pH 9.6 almacenado a 4ºC; buffer de bloqueo del cual se preparó 200 mL, debido a que se debía utilizar una solución fresca cada 15 días. Éste consiste en una solución de PBS (a concentración final de 0.01M de Buffer de fosfato, 0.0027 M de cloruro de potasio y 0.137 M de cloruro de sodio), leche descremada Dos Pinos ® a concentración final de 5% y Tween 20® al 0.1% (Sigma, San Luis Missouri, Estados Unidos). La solución se ajustó a un pH de 7.4 a 25ºC y se almacenó a 4ºC; finalmente el buffer de lavado del cual se prepararó 1L consistente en una solución de PBS (a concentración final de 0.01M de Buffer de fosfato, 0.0027 M de cloruro de potasio y 0.137 M de cloruro de sodio), y Tween 20® al 0.1% (Sigma, San Luis, Missouri, Estados Unidos). Esta solución se almacenó a temperatura ambiente. Según el mapa propuesto, se colocó en la placa de ELISA 4 controles negativos, correspondientes a suero normal de gallina, 4 controles positivos, correspondientes a suero de caballo infectado con VON y dos blancos constituidos por buffer de bloqueo para determinar la señal de fondo (Según el Dr. B. Blitvich, com. pers.). Las muestras se colocaron en orden correlativo, procesándose 50 muestras por placa. Inicialmente se sensibilizó los 60 pozos internos de la placa con 100uL del antígeno de VON diluido por un factor de 1/900 en buffer de sensibilización. El
19
antígeno fue enviado por el Doctor Brad Blitvich de la Universidad Estatal de Colorado, y el mismo se preparó inoculando células ATC-15 obteniendo el antígeno por sonicación. La placa se incubó a 4ºC durante una noche. Al día siguiente se lavó la placa cuatro veces con buffer de lavado. Se bloqueó los 60 pozos empleados añadiendo 200 uL de buffer de bloqueo a cada pozo y se incubó la placa a 37ºC por al menos 40 minutos, o como máximo 3 horas. Luego de la incubación se descartó el buffer de bloqueo. Se añadió según el orden establecido en el mapa de la placa, 50 uL de una dilución (factor 1/10) en buffer de bloqueo de los sueros (controles negativos, positivos y muestras). En los pozos asignados para blanco se agregó 50uL de buffer de bloqueo. La placa se incubó a 37ºC por dos horas. Finalizada la incubación se lavó la placa cuatro veces con buffer de lavado. Se añadió a cada pozo, exceptuando en los pozos de blanco, 50 uL de una dilución 1/2000 en buffer de bloqueo, del anticuerpo monoclonal 3.1112G (1mg/mL). Éste es específico para el epítopo NS1 de VON y Kunjin virus (Chemicon International, Temecula, California, Estados Unidos). En los pozos de blanco se añadió 50 uL de buffer de bloqueo. La placa se incubó a 37ºC por una hora. Luego de incubar, se lavó la placa cuatro veces con buffer de lavado. Se añadió a cada pozo, 50 uL de una dilución 1/2000, en buffer de bloqueo, del anticuerpo conjugado -conejo anti-IgG de ratón conjugado a Peroxidasa de Rabano (Zymed Laboratories, San Francisco California, Estados Unidos). La placa se incubó a 37ºC por una hora. Finalizada la incubación se lavó la placa cuatro veces con buffer de lavado y se añadió a cada pozo 75 uL de la solución de revelado ABTS®, solución sustrato para peroxidasa ABTS y solución de peroxidasa B (KPL Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos). El ensayo finalizó tomando la lectura de la absorbancia a 415 nm, por intervalos de 5 minutos aproximadamente. Se detuvo la lectura cuando el promedio de absorbancia de los controles negativos excedio el valor de 0.3. Las lecturas se realizaron en un lector de placa de ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, California, Estados Unidos) empleando el programa Soft Max Pro® (Molecular Devices, Sunnyvale, California, Estados Unidos) para la toma y procesamiento de los datos. Las lecturas se transfirieron a una hoja de cálculo de Microsoft Excel para poder determinar el Porcentaje de inhibición. Este valor representa la proporción de anticuerpos contra VON presentes en el suero de la muestra. El porcentaje de inhibición se estimó según lo indicado por Blitvich, et al., 2003.
% Inhibición = 100 – (TS – B) x 100
(CS-B)
TS = Absorbancia de suero muestra desconocida; CS = Absorbancia promedio de suero control negativo B = Absorbancia promedio de fondo o blanco
Fórmula 1. Determinación del porcentaje de inhibición en ELISA de bloqueo.
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• Criterios para el diagnóstico La determinación del promedio de los controles negativos se hizo eliminando el valor más alto y más bajo registrado. Se promedió las lecturas intermedias. Se utilizó el valor promedio de absorbancia de los dos blancos. Finalmente, el diagnóstico de la muestra se realizó según estos criterios: a) > 30 % indica la presencia de anticuerpos VON b) 15% - 30-% indica que la presencia de anticuerpos contra VON es dudosa c) < 15% indica que la muestra es negativa para anticuerpos contra VON Para todas las muestras se siguió el protocolo antes indicado. Los resultados obtenidos se ingresaron en la base de datos en Microsoft Acces, llamada “Resultados”. Se validó la concordancia de los resultados obtenidos por la prueba de ELISA de bloqueo enviando parte de las muestras procesadas al CDC (Fort Collins, Colorado). A estas muestras, se les realizó un análisis confirmatorio por la técnica de reducción de placas por neutralización (PRNT).
I.4.3.3.2 Prueba de Reduccion de Placas por Neutralización (PRNT) El estándar de oro para la detección serológica de los falvivirus como VON, es el ensayo de Reducción de Placas por Neutralización (PRNT por sus siglas en inglés). Este ensayo requiere de laboratorios con medidas especiales de bioseguridad con los cuales aún no contamos en el Centro de Estudios en Salud por lo que fue realizado por nuestros colaboradores en el CDC de Fort Collins, U.S.A. Con esta técnica se puede determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes contra antígenos virales. Este ensayo fue descrito por Beaty, et al., en 1995 y cosiste en preparar diluciones seriadas (por un factor de ½) de los sueros. Luego, se añade 0.1 ml de cada dilución a un equivalente en volumen de una dilución del virus que contenga 200 unidades formadoras de placa (PFU por sus siglas en inglés). En nuestro caso se hizo la prueba tanto con VON como con el virus de la encefalitis de San Louis, que es el flavivirus mas cercano a VON reportado en el continente americano. Esta mezcla se incuba a 37º por 1 hr o a 4º durante una noche. Luego se toma 0.1ml de la mezcla y se inocula sobre la superficie de un cultivo celular. El cultivo, en movimiento, se incuba entre 28-37º por 45 min. Finalmente, se cubre el cultivo con un medio que contenga 1% agar y se observa diariamente para ver si aparecen parches o placas de lísis. Se incluyen controles con virus mezclado con suero normal, virus con suero inmune, y control de reactivos (diluyente). Al terminar el ensayo se realiza un conteo de las placas formadas en presencia de los sueros test y controles. El grado de disminución de las placas refleja el grado de neutralización provocada por los anticuerpos presentes en el suero analizado. Un resultado se considera positivo cuando se da una reducción en el conteo de placas del 90% comparado con el control (Lennette et al., 1995). En el caso de VON y SLE, un suero se considera positivo para VON si su título es al menos 4 veces mayor al titulo observado con SLE e inversamente. Si los sueros son positivos con ambos virus, pero la diferencia no excede ese rango, se dice que el suero es positivo para un flavivirus no determinado.
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I.4.4 Análisis estadístico
I.4.4.1 Análisis de datos de aves migratorias y residentes El objetivo del análisis estadístico fue, determinar si había diferencias en el porcentaje de aves migratorias respecto a residentes en cada sitio y época de estudio; de existir diferencias se pretendía determinar si estas son significativas. El primer paso consistió en normalizar los porcentajes de aves migratorias obtenidos, aplicando la transformación de arcoseno (sin-1)1, según Zar (1998):
⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
++
++ 1
1arcsin1
arcsin21
nx
nx
π180
Fórmula 2. Transformación de arcoseno.
Donde: x= conteo de aves migratorias por censo o capturadas en red
n= conteo total de aves migratorias y residentes en censo o capturadas en red.
Posteriormente se aplicó una prueba de ANOVA de dos factores sin repetición. Se calculó la incidencia de anticuerpos contra VON en las aves residentes muestreadas, para cada sitio. Puesto que el número de muestras es relativamente reducido, se estimó el porcentaje de positivos reuniendo los resultados de las muestras de aves silvestres y las domésticas. Los porcentajes de incidencia se normalizaron mediante la transformación de arcoseno (sin-1). Con el fin de verificar nuestra segunda hipótesis, la posible existencia de una relación inversa entre el porcentaje de aves migratorias y la incidencia de anticuerpos contra VON en aves residentes, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para datos normalizados.
I.4.4.2 Análisis de resultados de laboratorio.
La validación preliminar del ensayo de ELISA de bloqueo se realizó mediante una prueba de X2 con un nivel de confianza del 95%. Se calculó la especificidad y sensibilidad del ELISA de bloqueo respecto a la prueba estándar de oro, PRNT.
1 La transformación de Arcoseno convierte las proporciones en grados. Al ser transformado un porcentaje se obtiene un valor (en grados) entre 0 y 90.
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II PARTE II.1 RESULTADOS Y DISCUSION
II.1.1 Determinación de la proporción de aves migratorias versus residentes en los diferentes sitios y épocas de estudio.
Para este estudio, se eligió tres sitios en el departamento de Izabal que
corresponden a áreas en donde se piensa que hay diferentes proporciones de aves migratorias versus residentes. Además, las fechas en que se realizó el trabajo de campo, corresponden a diferentes épocas de migración de las aves que provienen del Norte de América (Ver antecedentes y metodología).
Para evaluar la proporción de aves migratorias se utilizó dos metodologías como se explica en la sección VIII (Metodología). A continuación se presentan los análisis realizados con cada una de ellas.
II.1.2 Resultados obtenidos por captura en redes de niebla. Se comparó la proporción de aves migratorias y residentes capturadas en las redes
de niebla en diferentes épocas de migración de las aves como se muestra en el cuadro 2. De 68 individuos capturados en las redes, se identificó 44 especies diferentes pertenecientes a 15 familias y 7 órdenes (Ver anexo 2: Listado de aves identificadas en Izabal).
Como se observa en el cuadro 2, los resultados en las redes corresponden bastante bien a lo esperado en los meses de enero, abril y agosto. Lo esperado era tener un mayor porcentaje de aves migratorias en Punta de Manabique; respecto a Manabique, Machas tiene un menor porcentaje de migratorias y Puerto Barrios es el sitio con el menor porcentaje de aves migratorias. En cuanto al mes de Junio los resultados también se ajustan a lo esperado dado que este mes corresponde a la época en que no se espera tener aves migratorias en el país.
Mes Sitio
#Aves migratorias
capturadas en red
#Aves residentes
capturadas en red
% transformado de aves migratorias capturadas en red
Machacas 24 17 49.80 P. Barrios 10 44 25.90 Enero Manabique 27 10 58.29 Machacas 15 31 35.05 P. Barrios 14 28 35.50 Abril Manabique 31 13 56.80 Machacas 0 30 5.17 P. Barrios 0 25 5.65 Junio Manabique 0 23 5.89 Machacas 2 1 52.50 P. Barrios 1 2 37.50 Agosto Manabique 35 4 70.43
Cuadro 2. Porcentaje normalizado de aves migratorias por sitio y época de de estudio según el método de redes.
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Debido a que el diseño experimental de este estudio pretendía hacer una evaluación preliminar y no un muestreo representativo fue necesario aplicar la formula de transformación de Arcoseno para tener porcentajes que puedan ser analizados por pruebas estadísticas y que correspondan en la medida de lo posible a un modelo biológico. Las pruebas de hipótesis que se seleccionaron para este estudio se basan en el supuesto de que los datos provienen de una población con distribución normal. Según la teoría estadística, los datos de proporciones provienen de distribuciones binomiales, por lo tanto deben ser transformados antes de poder aplicar las pruebas paramétricas convencionales. La transformación de Arcoseno cumple este propósito. Se usa para transformar una distribución binomial (como la de proporciones) a una normal. Luego de esta transformación se realizó un ANOVA (Análisis de varianza) de dos factores sin repetición. Con esta prueba, se evaluó si la proporción de aves migratorias estaba relacionada con las variables “sitio” y “época” de estudio (Ver Cuadro 1, sección VIII y cuadro 2 esta sección). A continuación se presenta los resultados de este ANOVA.
Factor gl (grados de libertad)
SS (suma de cuadrados)
MS (cuadrados medios)
F p (F>Fcrit)
Sitio 2 947.01 437.90 6.062 0.0362 Época 3 4040.20 1346.70 17.22 0.0023
Residuo (error)
6 469.00 78.20
TOTAL 11 5456.21 1862.80 Cuadro 3. Análisis de ANOVA con los datos obtenidos en las redes.
Las hipótesis nulas (Ho 1 y Ho 2) propuestas para este análisis son las siguientes: Ho 1= El porcentaje de migratorias es igual para los tres sitios Ho 2= El porcentaje de migratorias es igual para las cuatro épocas Las hipótesis alternativas (Ha 1 y Ha 2) serían entonces: Ha 1 = El porcentaje de aves migratorias es distinto en al menos un sitio Ha 2 = El porcentaje de aves migratorias es distinto en al menos una época Las conclusiones luego de los análisis son las siguientes: 1. Por sitio:
p < 0.05, por tanto se puede rechazar Ho con un 95% de confiabilidad y se acepta Ha2. Por época:
p < 0.01, por tanto se rechaza Ho con un 99% de confiabilidad y se acepta Ha Con el fin de ilustrar los resultados de las redes se realizó una gráfica en la que se resume los resultados obtenidos por sitio a lo largo de todo el estudio. Ver Figura 4.
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Figura 4. Variación del porcentaje de aves migratorias por sitio según método captura con redes.
Al inicio de este trabajo no se tenía certeza de observar diferencias significativas
entre los sitios de estudio puesto que esta hipótesis se basaba únicamente en observaciones ornitológicas previas. Como se puede observar en la grafica 4, existe evidencia de que las proporciones de aves migratorias sí se ajustan a nuestro planteamiento: mayor porcentaje en Manabique respecto a Machacas y en éste mayor porcentaje que en Puerto Barrios. En cuanto a la variable “época de estudio”, las diferencias eran esperadas puesto que corresponden a distintas épocas de migración de las aves por lo que no nos sorprendió la aceptación de la hipótesis H a 2.
A pesar de que los resultados apoyan nuestras hipótesis, consideramos que no se puede asumir con certeza que éstos reflejen una realidad ecológica dado el posible sesgo en esta metodología. En efecto, en las redes se captura únicamente aves de talla relativamente pequeña y con un rango de vuelo cercano al suelo. Por otra parte, la colocación de redes depende mucho de factores externos como accesibilidad, seguridad, conservación del hábitat, etc. Finalmente, un factor no menos importante, podría ser el hecho que las aves residentes puedan poseer un mejor conocimiento de su entorno, percatarse de la presencia de las redes y evitar su paso por estas mismas. Este posible sesgo puede explicar la importante dispersión de los datos que se observa en la gráfica 4, en donde vemos una importante dispersión respecto a la mediana y valores extremos que pueden ser bastante elevados (ver caso de Manabique). En cada sitio se trabajó dos días consecutivos durante cada viaje de campo. Una posible forma de reducir la importante dispersión de los datos sería aumentar el número de repeticiones. Probablemente, esto no eliminaría en su totalidad la influencia de los factores antes mencionados, pero si permitiría incrementar el número de muestras y tener datos más significativos de la población de aves de cada lugar.
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Con el fin de evaluar por otro tipo de metodología, probablemente más representativa, el porcentaje de aves migratorias por sitio y época de estudio, los ornitólogos realizaron censos de aves en cada viaje de campo.
II.1.3 Resultados por Censos de Aves Se comparó la proporción de aves migratorias y residentes registradas durante los
censos realizados en cada sitio, en diferentes épocas de migración de las aves como se muestra en el cuadro 4. En el anexo 2: Listado de aves identificadas en Izabal, se presenta un listado de todas las aves identificadas con certeza por los ornitólogos durante el trabajo de campo. De 2438 individuos registrados en los censos, se logró identificar 97 especies diferentes pertenecientes a 34 familias y 15 órdenes.
Mes Sitio
#Aves migratorias
registradas en censo
#Aves residentes
registradas en censo
% transformado de aves migratorias registradas en
censo
Machacas 2 48 12.73 P. Barrios 0 55 3.84 Enero Manabique 6 41 21.60 Machacas 36 50 40.40 P. Barrios 21 59 31.01 Abril Manabique 10 23 33.75 Machacas 4 43 17.80 P. Barrios 2 51 12.36 Junio Manabique 16 28 37.26 Machacas 24 53 34.08 P. Barrios 14 51 27.95 Agosto Manabique 18 44 32.81
Cuadro 4. Porcentaje normalizado de aves migratorias por sitio y época de de estudio según el método de censos.
Como se observa en el cuadro 4, los resultados de los censos corresponden a lo esperado en los meses de enero y junio. Es decir: se observó un mayor porcentaje de aves migratorias en Punta de Manabique; un porcentaje intermedio en Machacas y el menor porcentaje en Puerto Barrios. En los meses de Abril y Agosto en cambio, se invirtió la relación entre Punta de Manabique y Machacas, siendo éste último el que presentó el mayor porcentaje de aves migratorias.
Como en el caso de las redes, los datos de censos debieron normalizarse para poder realizar el análisis de ANOVA de de dos factores sin repetición. A continuación se presenta en el cuadro 5 los resultados obtenidos.
Factor gl (grados de libertad)
SS (suma de cuadrados)
MS (cuadrados medios)
F p (F>Fcrit)
Sitio 2 319.27 159.69 3.86 0.083 Época 3 903.18 301.06 77.28 0.020
Residuo (error)
6 248.11 41.35
TOTAL 11 1470.56 502.1 Cuadro 5. Análisis de ANOVA con los datos obtenidos por los censos.
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Las hipótesis nulas (Ho 1 y Ho 2) propuestas para este análisis son las siguientes: Ho 1= El porcentaje de migratorias es igual para los tres sitios Ho 2= El porcentaje de migratorias es igual para las cuatro épocas Las hipótesis alternativas (Ha 1 y Ha 2) serían entonces: Ha 1 = El porcentaje de aves migratorias es distinto en al menos un sitio Ha 2 = El porcentaje de aves migratorias es distinto en al menos una época Las conclusiones luego de este análisis son las siguientes: 1. Por sitio:
p no es < 0.05. Sin embargo se puede rechazar Ho con un 92% de confiabilidad y se acepta Ha
2. Por época: p < 0.05, por tanto se rechaza Ho con un 95% de confiabilidad y se acepta Ha
En condiciones experimentales altamente controladas o para procesos bien
definidos se utiliza generalmente un nivel de confianza del 95% para rechazar una hipótesis nula. Sin embargo, en las áreas biológicas rara vez se cumplen estas condiciones. Por lo tanto, el investigador puede decidir que acepta un nivel de confianza más bajo como suele hacerse en modelos ecológicos en donde se utiliza un nivel de confianza de hasta 80% (Zar, 1998; Fernández y Díaz, 2001). En este caso tomamos un nivel de confianza del 92% como válido para aceptar la hipótesis Ha 1.
Con el fin de ilustrar los resultados de los censos se realizó una gráfica en la que se resume los resultados obtenidos por sitio a lo largo de todo el estudio. Ver Figura 5.
Figura 5. Variación del porcentaje de aves migratorias por sitio según método de censo.
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Al analizar las líneas medianas (representadas por la barra negra en la grafica 18), se puede notar una tendencia a observar un mayor porcentaje de aves migratorias en Punta de Manabique, un porcentaje intermedio en Machacas y uno menor en Puerto Barrios. Sin embargo, podemos notar grandes variaciones en los extremos de las graficas correspondientes a los diferentes sitios. De hecho, en dos de los meses estudiados no se guardó la relación esperada puesto que Machacas presentó un mayor porcentaje de aves migratorias. Este fenómeno se observó en los meses de abril y agosto.
Los datos obtenidos por censos y por redes no se pueden comparar por tratarse de dos metodologías totalmente diferentes. Sin embargo, pensamos que los censos podrían reflejar mejor la proporción de aves migratorias a residentes en cada uno de los sitios. Esto se debe a que los transectos abarcan un terreno mucho más extenso dentro del sitio de estudio. En efecto, según el sitio, se recorrió entre 6 y 12 Ha con esta metodología. Además, en los censos se registró tanto a las aves observadas como a las aves escuchadas (que pueden no movilizarse aunque estén presentes). Finalmente, otro factor importante es el hecho que los censos fueron realizados por dos ornitólogos al mismo tiempo y la contabilización de las aves por transecto se basó en el doble registro.
Al igual que la metodología de redes, este tipo de conteo tiene varios posibles sesgos. Uno de ellos es que, a pesar de haber realizado los transectos en micro-hábitats diferentes, estos se eligieron por conveniencia y no al azar. Por otra parte, cada transecto se recorrió únicamente durante un día por visita. Si las condiciones climáticas cambian esto afecta el comportamiento de las aves por lo que de un día a otro, podríamos tener variaciones debidas únicamente al factor climático, el cual no hemos cuantificado. En estas condiciones, no sabemos cual es el grado real de sensibilidad de la metodología de censos para percibir la proporción de aves migratorias en cada área. Una manera de incrementar la sensibilidad sería tener repeticiones de los conteos en cada transecto lo cual requeriría del trabajo de varios ornitólogos o más días trabajo. No podemos descartar que las variaciones observadas en los meses de abril y agosto sean anecdóticas, por lo que es importante continuar este tipo de estudio a lo largo de varias estaciones y durante varios años para validar las observaciones obtenidas.
De manera general, para aumentar el poder de las pruebas estadísticas como el ANOVA se requiere datos repetidos de un experimento. El propósito principal de este estudio no era conocer un modelo exacto de las condiciones ecológicas de la región, sino hacer una evaluación preliminar de la situación actual en Izabal. El ANOVA de dos factores sin repetición no es útil para encontrar diferencias altamente significativas entre las variables experimentales, pero puede usarse para identificar posibles relaciones que serán útiles en el diseño de experimentos futuros.
II.1.4 Determinación de la incidencia de anticuerpos contra VON en muestras de aves residentes (silvestres y domesticas)
Para hallar evidencia de la circulación de VON en la región de Izabal, se procesó un total de 712 muestras de aves silvestres y domésticas, correspondientes a 37 especies diferentes. Todas estas muestras fueron analizadas por medio del ensayo de ELISA de bloqueo. Un total de 63 muestras positivas y negativas, incluyendo muestras de éste y otros estudios, fueron enviadas al Centro de Control y Prevención de Enfermedades
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(CDC) de Fort Collins, Colorado, U.S.A. para su confirmación por la prueba de PRNT. A continuación se presentan los resultados obtenidos.
II.1.4.1 Resultados del ELISA de Bloqueo En el cuadro 6 se presenta un resumen de los resultados obtenidos en cada sitio y
época de muestreo. Para generar esta tabla se tomó en cuenta todas las aves residentes muestreadas, tanto silvestres como domésticas.
Mes Sitio Total de
residentes muestreados
Muestras positivas
% transformado de aves residentes
positivas
Machacas 40 6 23.45 Barrios 59 16 31.63 Enero
Manabique 27 0 5.45 Machacas 51 6 20.69 Barrios 41 11 31.55 Abril
Manabique 22 1 14.59 Machacas 57 3 14.19 Barrios 53 6 20.29 Junio
Manabique 40 0 4.49 Machacas 35 2 15.21 Barrios 50 12 29.67 Agosto
Manabique 63 0 3.59
Cuadro 6. Porcentaje transformado de aves residentes positivas contra VON según el método de ELISA de bloqueo con el anticuerpo monoclonal 3.1112G (ver metodología).
Como se observa en el cuadro anterior, durante todas las épocas de trabajo se mantuvo una seropositividad más importante en Puerto Barrios, seguida de Machas del Mar y por último de Punta de Manabique. Con estos resultados se generó mapas que ilustran la seropositividad obtenida en el departamento de Izabal así como la cobertura vegetal de nuestros sitios de estudio (Ver anexo 3, mapas de seropositividad en Izabal, mapas Izabal).
Al hacer un análisis por especie y por sitio, pudimos observar que con la excepción de Punta de Manabique, en los otros sitios las gallinas (Gallus gallus) son el grupo con el mayor porcentaje de seropositividad. Esto podría deberse a que también es el grupo con mayor cantidad de muestras. Sin embargo, en Punta de Manabique no se reportó ninguna gallina positiva. La única ave positiva en este sito fue una paloma silvestre (Leptotila cassini). Ver anexo 4: Aves residentes positivas por ELISA de bloqueo, con detalle de los resultados por mes, sitio y especie.
Cabe mencionar que para las muestras positivas por ELISA de bloqueo, se hizo al menos 3 repeticiones para disminuir el riesgo de reportar falsos positivos. El ELISA de bloqueo fue realizado con el anticuerpo monoclonal 3.1112G que permite distinguir el VON del Virus de Encefalitis de San Louis (SLE). El SLE pertenece al mismo serogrupo y comparte características ecológicas con el VON. Por ser SLE el virus mas cercano al VON en Norte America, es admitido que el ELISA de bloqueo es una de las mejores técnicas para detectar anticuerpos específicos de VON. En nuestro país, el único
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flavivirus cercano a VON reportado con anterioridad es precisamente SLE, aislado a partir de zancudos infectados al final de los años 70 (Cupp et al., 1986). Sin embargo, dado que en Guatemala, hay poco conocimiento de los flavivirus que circulan no podemos excluir la posibilidad que otro flavivirus cercano (no necesariamente conocido) pueda generar resultados positivos con el monoclonal 3.1112G. Por esta razón, es necesario verificar nuestros resultados por la prueba considerada como el estándar de oro, la prueba de reducción de placas por neutralización o PRNT por sus siglas en inglés.
II.1.4.2 Validación de la prueba de ELISA de bloqueo por la prueba estándar de oro, PRNT Sesenta y tres muestras fueron enviadas al CDC de Fort Collins en donde fueron
probadas por la técnica de PRNT utilizando tanto VON como SLE como se describe en la sección VIII, Metodología. Todos los sueros positivos con PRNT fueron específicos de VON puesto que presentaron al menos 4 diluciones de diferencia con respecto al virus SLE. En el cuadro 7, a continuación se muestra un resumen de esta confirmación.
Resultado Ensayo Tipo de ave
Positivo Negativo Total Doméstica 39 12 ELISA de
Bloqueo con monoclonal
3.1112G Silvestre 4 8
63
Doméstica 35 16 PRNT90 para VON Silvestre 4 8 63
Cuadro 7. Comparación de los resultados obtenidos por ELISA de bloqueo y PRNT, con muestras de los Departamentos de Escuintla, Santa Rosa, Izabal, Chiquimula y Petén. Con estos resultados se procedió a realizar la prueba de Chi cuadrado que permite validar el ensayo de ELISA de bloqueo respecto al estándar (PRNT). Los resultados obtenidos se describen en el cuadro 8 presentado a continuación.
30
Ensayo Resultado Total
Positivo 39 PRNT Negativo 24 Positivo 43 ELISA Negativo 20
Prueba de Χ2 nivel de confianza al 95%
Anticuerpos VON
No anticuerpos
VON Prueba Positiva 39 4 Prueba Negativa 0 24
Resultados
% Sensibilidad 100.00 Especificidad 85.71
Cuadro 8. Análisis de Χ2 comparando los resultados de ELISA de bloqueo y PRNT.
Como se observa en el cuadro 8, la prueba de ELISA de bloqueo tuvo un 100% de sensibilidad para las aves. Esto implica que fue capaz de detectar todas la muestras positivas a VON. La especificidad del ensayo fue de 85.71 % lo cual indica que con esta técnica no se logró distinguir la totalidad de muestras negativas. En otra palabras, en nuestras manos, el ELISA de bloqueo generó aproximadamente un 15% de falsos positivos. Estos falsos positivos corresponden a cuatro muestras de gallinas cuyo índice de inhibición en el ELISA osciló entre 30-35% (ver sección VIII, Metodología). Este es un rango muy cercano al punto de corte del ensayo que es 30%. Según comunicación personal del Dr. Brad Blitvich, es posible que el valor de lectura de los blancos en la prueba, genere estos falsos positivos por lo que en el futuro se recomienda ajustar la técnica a las condiciones de nuestro laboratorio.
Por medio del PRNT se pudo confirmar la presencia de anticuerpos positivos contra VON en 3 aves residentes, silvestres de Izabal. Estos resultados se muestran en el cuadro numero 9. Como se puede constatar en dicho cuadro, en los tres sitios de estudio (Manabique, Machacas y Puerto Barrios) se pudo confirmar la presencia de VON por las técnicas serológicas. De las especies confirmadas como positivas, destacan el Turdus grayi de Machacas del Mar y el Quiscalus mexicanus de Puerto Barrios. El T. grayi es la especie que mas se capturó en este sitio, lo cual permite pensar que podría ser un buen blanco para monitorear la actividad del VON (ver Anexo 5, especies de aves muestreadas en cada sitio de trabajo). Por otra parte, aves de este mismo genero así como del genero Quiscalus, han sido descritas previamente como posibles amplificadores del VON (Komar et al., 2003). De hecho en otros países de la región caribe se ha descrito recientemente seropositvidad en aves del genero Turdus, como lo es T. plumbeus en Guantánamo, Cuba (Dupuis et al., 2005).
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Título Interpretación Especie Sitio de captura Fotografía
Leptotila cassini
Punta de Manabique
80 WNV
80 WNV Turdus grayi Machacas del Mar
80 WNV Quiscalus mexicanus
Puerto Barrios
Cuadro 9. Títulos de PRNT a 90%, en las muestras de aves silvestres, confirmadas como positivas para anticuerpos contra VON.
A pesar de del pequeño porcentaje de falsos positivos, el ELISA de bloqueo
muestra ser una muy buena técnica para diagnosticar presencia de anticuerpos contra VON en las aves. Basándonos en estos datos, consideramos que los resultados del ELISA son lo suficientemente validos para indicar presencia de VON en las aves muestreadas. A partir del conjunto de resultados obtenidos podemos concluir que es muy probable que el Virus del Oste del Nilo esté circulando en Guatemala. Sin embargo, mientras no se tenga un asilado viral no podemos decir con certeza del 100% que es el VON. A raíz de estos hallazgos, decidimos alertar a las autoridades de salud humana y animal (Ministerio de Salud, Ministerio de Agricultura Ganadería y Alimentacion, Consejo Nacional de Areas Protegidas) con el fin de que estas tomen las medidas que consideren pertinentes. Por el momento, se recomienda no divulgar la información contenida en este informe hasta que las autoridades concernientes no nos hayan oficialmente autorizado a hacerlo.
La hipótesis generalmente aceptada par la introducción de VON a una nueva región involucra a las aves migratorias como posibles vehículos. Con el fin de tener datos
32
prelimi
.1.4.3 Correlación entre la incidencia de VON y la proporción de aves migratorias Una de nuestras hipótesis de trabajo plantea la existencia de una relación inversa
o y época de estu
sitio necesita establecerse en las aves residentes. Para qu
loqueo se realizó un análisis de correlación de Pearson. Con este análisis se pudo e
Cuadro 10. Análisis de correlación de Pearson para datos normalizados de incidencia y porcentaje de aves migratorias.
0% Ho: no existe relación entre la incidencia de Anticuerpos contra VON en aves
nares sobre el comportamiento ecológico que pudiera presentar el VON en el país, se buscó la posible relación entre la seropositvidad de las aves residentes y la presencia de las aves migratorias.
II
entre la incidencia de VON y las proporciones de aves migratorias en cada sitdio (ver inciso 2, sección VII). El fundamento de esta idea es que, si bien el VON podría ser vehiculado por las
aves migratorias, al llegar a un nuevo e esto suceda deben coincidir en esos “nuevos sitios” al menos tres factores: 1)que
existan vectores competentes; 2) que existan hospederos amplificadores y 3) que exista la probabilidad de que el vector infectado coincida con el ave residente. De esta forma, si en una población existe un número muy elevado de aves migratorias respecto a las residentes deberíamos tener menos oportunidades de que el virus potencialmente traído por esas aves se establezca en la población residente. Esto se debe a una simple cuestión de probabilidad. En efecto, si por 99 aves migratorias existe una sola ave residente la “probabilidad” de que esta sea infectada es del 1%. En el caso de los sitios en donde haya aves migratorias pero predominen las residentes, debería observarse una tendencia inversa. Este planteamiento es válido únicamente si en cada sitio se cumplieran las dos primeras premisas mencionadas anteriormente (tener vectores y hospederos competentes por igual).
A partir de los resultados obtenidos por las dos metodologías de conteo y el ELISA de b
valuar si la tendencia de los resultados concuerda con nuestra hipótesis. El resultado de este análisis es presentado en el cuadro 10.
Nivel de confianza propuesto para modelos biológicos: 8
residentes y el porcentaje de aves migratorias.
Censo r= -0.7830 < -0.3797 < 0.2482
p= 0.2233
Conclusión Se .
acepta la Ho
Redes
r= -0.6 .4240 p= 0.5372
931 < -0.1980 < 0
Conclusión Se o. acepta la H
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A continuación se presentan las graficas de correlación obtenidas con estos resultados (Figuras 6 y 7).
Figura 6. Relación entre incidencia de anticuerpos contra VON en aves residentes y el porcentaje de aves migratorias según capturas en red.
Figura 7. Relación entre incidencia de anticuerpos contra VON en aves residentes y el porcentaje de aves migratorias según censos.
34
En el cuadro 10 y figura 6, se puede observar que con los datos de redes no existe relación inversa entre la incidencia de anticuerpos contra VON en aves residentes y el porcentaje de aves migratorias.
En el caso de los censos (Figura 20), sí se percibe una ligera tendencia negativa entre la incidencia de anticuerpos contra VON en aves residentes y el porcentaje de aves migratorias. Según el análisis de correlación (cuadro 10), estos datos no son significativos por tener un nivel de confianza de 78%. Este valor es inferior al límite de 80% aceptado para modelos biológicos. Aunque estadísticamente no existe correlación, consideramos que sí se nota una tendencia a que aumente la incidencia de anticuerpos contra VON cuando disminuye la proporción de aves migratorias. Como ya se expuso, las metodologías utilizadas en este estudio presentan ciertas limitaciones experimentales que podrían influir en el resultado del análisis de correlación. Una de estas es el número reducido de muestras colectado de aves residentes. Como posible solución para mantener aproximadamente constante y en cantidad suficiente el número de muestras, se puede proponer el uso de poblaciones centinelas como por ejemplo gallinas. Otro factor que debe considerase es que para tener un tamaño de muestra significativo al analizar la incidencia en cada sitio, se sumó el total de individuos positivos domésticos y silvestres. Al hacer esto no se tomó en cuenta el hecho que para cada sitio se tiene diferencias en las especies capturadas, en general no se tiene ni la misma cantidad, ni el mismo tipo de especies por sitio (ver Anexo 5, especies de aves muestreadas en cada sitio de trabajo). Aunque se desconoce si las especies muestreadas difieren de manera significativa en la susceptibilidad a una infección por VON, si existiera diferencias, esto podría generar un importante sesgo en la interpretación de los resultados.
Finalmente es necesario tener información sobre los posibles vectores que circulan en los sitios estudiados para luego analizar si estos pueden ser competentes para la transmisión del VON.
En la siguiente sección se presentan resultados preliminares de un estudio de vectores que se ha empezado a realizar en paralelo con el trabajo del proyecto FD 19-03.
II.1.5 Estudio preliminar de los zancudos presentes en los tres sitios de estudio de Izabal
Con el objetivo de empezar a conocer la diversidad de zancudos y para determinar
los posibles vectores de VON presentes en los sitios de estudio del proyecto FD 19-03, se realizó capturas de zancudos adultos por medio de lamparas de luz
Con este esfuerzo se identificó hasta el momento un total de 38 especies, pertenecientes a 9 géneros. Las especies que se colectaron más comúnmente en las tres áreas de estudio y en las diferentes épocas fueron: Culex nigripalpus y Culex chidesteri. Otras especies colectadas fueron: Aedes aegypti, Ae. euplocamus, Ae. sp., Ae. taeniorhynchus,, Anopheles apicimacula, An. neomaculipalpus, An. Vestitipennis, An. sp., Coquilletidia nigricans, Cq. venezuelensis, Culex bihaicola, Cx. Corriges/lactator, Cx. Complejo coronador, Cx. declarator mollis, Cx. erethyzonfer, Cx. erraticus, Cx. inflictus, Cx. interrogator, Cx. quinquefasciatus, Cx. sardinae, Cx. taeniopus, Cx, thobaldi, Deinocerites cancer, Haemagogus sp., Mansonia dyari, Ma. Titillans, Psorophora confinnis, Ps. lineata, Uranotaenia lowii, Ur. Orthodoxa, Ur. Pulcherrima y Ur. Sociales.
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En el cuadro 11 se pueden ver las especies colectadas según el tipo de trampa y el lugar de colecta. De las tres áreas estudiadas Machacas del Mar tiene el mayor número de especies colectadas (29), le sigue Punta de Manabique con 19 especies y Puerto Barrios con 17. El método de colecta que capturó el mayor porcentaje de zancudos fue la trampa de luz-CDC.
Areas de estudio Machacas Pto Barrios Manabique ESPECIE/TRAPS CDC GRA CDC GRA CDC GRA Aedes aegypti 0 0 0 1 0 0 Aedes euplocamus 1 0 0 0 0 0 Aedes sp 1 0 1 1 1 0 Aedes taeniorhynchus 1 0 0 0 0 0 Anopheles apicimacula 1 0 0 0 0 0 Anopheles neomaculipalpus 1 0 0 0 0 0 Anopheles vestitipennis 1 0 0 0 1 0 Anopheles sp 1 0 1 0 0 0 Coquilletidia nigricans 1 0 0 0 1 0
Coquilletidia venezuelensis 1 0 1 0 1 0 Coquilletidia sp. 1 0 1 0 1 0 Culex bihaicola 1 0 0 0 0 0 Culex chidesteri 1 0 1 0 1 0 Culex corniger/lactator 0 0 1 0 0 0 Culex coronator complex 1 0 1 1 1 0 Culex declarator mollis 1 0 0 0 0 0 Culex erethyzonfer 0 0 1 0 0 0 Culex erraticus 1 0 0 0 1 0 Culex inflictus 1 0 0 0 0 0 Culex interrogator 1 0 1 1 1 0 Culex nigripalpus 1 0 1 1 1 0 Culex quinquefasciatus 1 0 1 1 0 0 Culex sardinerae 0 0 0 0 1 0 Culex taeniopus 1 0 0 0 1 1 Culex theobaldi 1 0 0 0 1 0 Culex sp 1 0 1 1 1 0 Deinocerites cancer 0 0 1 0 1 0 Haemagogus sp 0 0 1 1 0 0 Mansonia dyari 1 0 0 0 0 0 Mansonia titillans 1 0 0 0 1 0 Mansonia sp 1 0 1 0 1 0 Psorophora confinnis 1 0 1 0 0 0 Psorophora lineada 0 0 0 1 0 0 Psorophora sp 1 0 1 0 0 0 Uranotaenia lowii 1 0 0 0 0 0 Uranotaenia orthodoxa 0 0 0 0 1 0 Uranotaenia pulcherrima 0 0 0 0 1 0 Uranotaenia sociales 1 0 0 0 0 0 TOTAL 29 0 17 9 19 1
Cuadro 11. Zancudos colectados utilizando las trampas de luz –CDC y trampas grávidas en las tres áreas del estudio de Izabal.
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Los zancudos capturados y clasificados se analizarán posteriormente por métodos
moleculares recientemente implementados en nuestros laboratorios para la detección de Virus del Oeste del Nilo y otros flavivirus. Esta información es de suma importancia para establecer la identidad de los posibles vectores en cada sitio de trabajo en particular y en el país en general.
Este estudio puede servir como línea de base ya que da información de las especies presentes y del método de colecta más eficiente. Sin embargo por ser resultados preliminares deja abiertas muchas interrogantes que solo pueden resolverse con un estudio más extenso. Se sugiere que en el futuro se profundice sobre la diversidad de zancudos en el área y se explore la posibilidad de muestrear en diferentes ambientes. Sería importante conocer si las especies de zancudos capturadas varían dependiendo de la altura a la que se coloquen las trampas. Esto permitiría verificar si existe una relación entre la presencia de zancudos ornitofílicos y la altura.
Debemos recordar que según nuestro planteamiento inicial para comparar los sitios con diferentes porcentajes de aves migratorias respecto a la incidencia del VON (asumiendo que los anticuerpos detectados reflejen actividad viral) deberíamos tener vectores y hospederos competentes en cada uno de los sitios. De ninguna forma nuestro estudio refleja la competencia de los zancudos potenciales vectores ni de las aves potenciales hospederas. Lo único que podemos decir con nuestros resultados es que la detección de anticuerpos contra VON refleja la posible presencia del virus en Izabal, en un momento dado. Únicamente cuando podamos demostrar que se ha establecido un ciclo enzoótico en el país por medio de: la persistencia de aves seropositivas; la seroconversión de individuos que hayan sido previamente negativos y se vuelvan positivos; y/o el aislamiento viral (a partir de zancudos o aves muertas), podremos concluir que el VON se estableció en nuestro territorio.
Lo anteriormente expuesto requerirá que se continúe el esfuerzo de investigación en el Departamento de Izabal en donde la evidencia experimental con la que contamos a la fecha nos indica que es un buen candidato a ser un posible foco de transmisión viral. De lograrse una continuidad en estas investigaciones que permita evidenciar un foco de transmisión, debería realizarse un diseño experimental diferente, que tome en cuenta las experiencias adquiridas y que incluya el análisis de otros parámetros que puedan influenciar la ecología del VON (por ejemplo otros posibles hospederos, condiciones climáticas, etc.). Por otra parte, sería deseable extender este tipo de estudio a otros lugares de Guatemala que presenten condiciones ecológicas similares a las de Izabal, es decir presencia de aves migratorias, de potenciales vectores y de aves residentes.
II.1.6 Implementación de Bases de Datos para el registro, análisis y presentación de la información colectada durante la ejecución del proyecto
Como se hizo mención en la sección VIII sobre metodología, específicamente en
la parte de registro de información, durante la ejecución del proyecto se diseñó e implementó dos bases de datos. Estas incluyen información sobre las aves capturadas y las aves muestreadas, así como los resultados obtenidos en la prueba de ELISA de bloqueo. Dichas bases de datos fueron esenciales para la recopilación y ordenamiento de
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la información recabada en el campo, además de facilitar el análisis. Las bases de datos tienen las siguientes características:
II.1.4.5.1 Base de datos Arbo-epi-aves:
Esta base fue diseñada en el programa Microsoft Access, sirve para registrar los datos relacionados con las aves capturadas, tanto silvestres como domésticas, que fueron obtenidos directamente en el campo (ver anexo 6: formato de ingreso de información de campo). Los datos obtenidos proporcionan información específica de cada individuo (principalmente identificación, especie, datos morfométricos, y cantidad de sangre obtenida), así como información del sitio en donde se capturó el ave, es decir ubicación geo-referenciada y administrativa (Departamento, Municipio, Aldea, etc.).
A partir de esta base de datos se generaron reportes periódicos para analizar la información obtenida y relacionarlos con la base de datos de resultados.
La base de datos permite generar reportes que incluyen información de los especimenes capturados en cada uno de los sitios de estudio, así como priorizar los reportes por especie, identificación del ave, fecha de captura, tipo de banda utilizada para identificarla y número de muestras obtenidas desde el inicio de la investigación. La estructuración de esta información permitió verificar datos de animales recapturados y remuestrados, especialmente en el caso de las aves silvestres (ver anexo 7: Reporte de base de datos Arbo-epi-aves).
II.1.4.5.2 Base de datos de Resultados:
Es una base de datos desarrollada en Microsoft Access que recopila los resultados obtenidos luego de realizar la prueba de ELISA de bloqueo, en cada uno de los individuos muestreados. Los resultados pueden ordenarse y presentarse por espécimen, según su identificación individual, fecha de muestreo, la especie a la que pertenece, así como su localización geográfica. En la base de datos aparecen, tanto los resultados de la prueba de ELISA, como la interpretación de los mismos, indicando si se considera la muestra positiva o negativa.
Para las aves muertas, existe una base de datos similar a las anteriores pero que se ha utilizado muy poco por contar con pocos especimenes recopilados. Esta base de datos no se incluye en este documento. Sí se adjunta la boleta de registro de aves muertas como se explica en la siguiente sección.
En el futro, la información generada por este proyecto y proyectos similares, se desea hacer de dominio público a través de la divulgación de la información recopilada en las bases de datos por Internet. Esto requiere trabajo y acuerdos previos con las entidades nacionales de salud.
II.1.7 Talleres para la vigilancia y colecta de Aves muertas:
Durante la ejecución del proyecto, se desarrolló dos talleres relacionados con el tema del VON en Guatemala. Estos talleres estuvieron dirigidos a dos grupos “meta” distintos que tienen relación con la vigilancia de la salud animal en diversas zonas del
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país. El primer taller se desarrolló en el Departamento de Izabal y el segundo en la Ciudad de Guatemala. A continuación se describen los detalles de dichos talleres.
II.1.4.6.1 Taller con OG´s y ONG’s ambientalistas
El “Taller de presentación de colecta de datos de aves muertas para el monitoreo del Virus del Oeste del Nilo”, se llevó a cabo en la Ciudad de Puerto Barrios, Izabal, el día 19 de noviembre del año 2004, en horario de 8 a.m a 12 p.m. (ver anexo 8: Agenda del “Taller de presentación de colecta de datos de aves muertas para el monitoreo del Virus del Oeste del Nilo”). Los objetivos del taller fueron los siguientes:
• Presentar al personal a cargo de áreas protegidas de la región de Izabal,
información sobre el Virus del Oeste del Nilo y los riesgos para poblaciones humanas y la fauna silvestre.
• Introducir a los participantes en el uso de una boleta para reportar aves muertas. • Establecer una red de vigilancia de aves muertas en la región.
Los participantes fueron guarda recursos y directores (o sus representantes) de
diferentes Organizaciones No Gubernamentales, principalmente ambientalistas, con presencia en las áreas protegidas de la región. Además se invitó a representantes de Organizaciones Gubernamentales relacionadas con la salud humana y animal, cuya zona de influencia se encuentra en el Departamento de Izabal.
Las actividades llevadas a cabo en dicho taller fueron:
• Presentación del proyecto desarrollado en los tres sitios de Izabal, haciendo énfasis en la importancia de la participación de guarda recursos y personal de otras organizaciones con presencia en la zona.
• Presentación de la boleta de aves muertas sugerida por el equipo de investigadores. Posteriormente se validó dicha boleta con los participantes, por medio de una mesa redonda de discusión. También se discutió la forma de establecer una red de vigilancia de aves muertas en la zona, con el apoyo de las diferentes organizaciones asistentes.
Como resultado del taller, se acordó por parte de los asistentes, su participación
en la red de vigilancia de aves muertas en Izabal, que básicamente permitirá al equipo de investigación del proyecto, tener acceso a información sobre aves muertas, y si es posible, también a especímenes muertos de aves silvestres. Adicionalmente, se le proporcionó a los asistentes copia, tanto impresa como electrónica, de la boleta de aves muertas, para llevar el registro de las aves encontradas y facilitar el envío de información a los investigadores (ver anexo 9: Boleta de aves muertas).
Al final de la ejecución del proyecto, se cuenta en el laboratorio de CES-MERTU-
CDC con 10 aves silvestres muertas. De estas aves algunas se han empezado a analizar por medio de técnicas moleculares de detección de VON recientemente implementadas
39
en el laboratorio del CES-MERTU/G-UVG. Por el momento no se ha obtenido ningún resultado positivo para VON.
El taller ha sido importante para obtener la colaboración de entidades gubernamentales y no gubernamentales en el monitoreo del VON en el departamento de Izabal.
II.1.4.6.2 Taller con el Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación (MAGA) Los días 11 y 12 de agosto de 2005 se llevó a cabo el “Taller sobre Eco-
epidemiología y Vigilancia de Encefalitis Arbovirales en Animales”, el cual se desarrolló en las instalaciones centrales de la Universidad del Valle de Guatemala en horario de 8:30 a.m. a 16:30 p.m., el día 11 de agosto, y de 8:30 a.m. a 12:30 p.m. el día 12 de agosto (Ver anexo 10: Agenda “Taller sobre Eco-epidemiología y Vigilancia de Encefalitis Arbovirales en Animales”). Los objetivos del taller fueron los siguientes:
• Objetivo General
Que los epidemiólogos del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación (MAGA) amplíen y actualicen sus conocimientos sobre vigilancia epidemiológica, y sobre la respuesta ante un posible brote en poblaciones animales afectadas por encefalitis arbovirales, definiendo acciones para el mejoramiento del sistema de vigilancia para este tipo de enfermedades.
• Objetivos específicos: Reforzar conocimientos de los conceptos básicos sobre vigilancia
epidemiológica. Actualizar conocimientos sobre respuestas ante el aparecimiento de brotes. Determinar planes y acciones sobre la vigilancia de encefalitis arbovirales. Ampliar conocimientos sobre el Virus del Oeste del Nilo, conocer avances del
estudio que se lleva a cabo actualmente en Guatemala, así como experiencias de su vigilancia en otros países.
Reforzar conocimientos sobre bioseguridad, sobre todo en manejo de muestras.
Desarrollar herramientas para notificación de casos, en particular utilización de la boleta de aves muertas.
Como lo menciona el objetivo general, el grupo meta seleccionado para el taller
estuvo conformado por Médicos Veterinarios, epidemiólogos actualmente distribuidos en todo el país como parte del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación. En la actividad se hizo una revisión de la estructura general del sistema de vigilancia y los servicios de salud animal del MAGA con el fin de conocer la estructura organizativa y determinar la forma en que puede concretarse la vigilancia del VON dentro de la misma. Con el apoyo de un epidemiólogo del Centro de Prevención y Control de Enfermedades, (CDC) de Estados Unidos, se abordó los siguientes temas: conceptos básicos sobre vigilancia epidemiológica y manejo de brotes con especial énfasis a arbovirus. Adicionalmente, se discutió alrededor de los objetivos y actividades desarrolladas dentro
40
del proyecto de monitoreo preliminar del Virus del Oeste del Nilo (VON), enfocándose en los siguiente: diagnóstico clínico de las encefalitis equinas; manejo de muestras y bioseguridad y métodos de laboratorio para el diagnóstico del VON. Se recalcó la importancia de la participación de personal del MAGA en la red de vigilancia, incluyendo el reporte y envío de aves muertas al laboratorio del CES-MERTU/G-UVG.
Como resultado del taller, se formalizó la cooperación de los epidemiólogos del
MAGA en la coordinación de actuales y futuras actividades relacionadas con la vigilancia del VON. Esto incluye detección de brotes, envío de muestras de equinos sospechosos con síntomas de encefalitis, reporte y/o envío de aves muertas. Los asistentes al taller manifestaron su interés en continuar trabajando con el CES-MERTU/G-UVG, especialmente en lo que se refiere a la actualización de conocimientos sobre epidemiología y sobre los resultados de la investigación del Virus del Oeste del Nilo en el país.
II.1.8 Presentación de un póster informativo
Como parte de las actividades y productos previstos dentro del proyecto se encuentra la impresión y distribución de un póster informativo. El póster ha sido diseñado con varios objetivos:
a. Informar y sensibilizar sobre el papel de los zancudos como vectores de diversas
enfermedades de importancia para la salud humana. b. Considerar algunas prácticas sencillas para disminuir la crianza del zancudo. c. Apoyar en el control y prevención del piquete de zancudo d. Colaborar reportando aves silvestres muertas, que podrían ser indicadoras de la
presencia del VON en la zona. El póster está dirigido a personal que labora en distintas organizaciones,
gubernamentales y no gubernamentales, ubicadas en zonas con mayor densidad de zancudos, posibles vectores del VON. Entre los grupos meta se encuentra personal de salud pública humana, salud animal, guarda recursos y en general profesionales y técnicos, cuyas actividades y ubicación geográfica (áreas protegidas, zonas rurales, zonas urbanas con presencia de vectores, etc.) podrían eventualmente facilitar la detección de aves muertas.
El póster ha sido revisado y validado por expertos en los temas centrales abarcados, entre ellos profesionales en biología, entomología, epidemiología, medios publicitarios masivos, y sobre todo con experiencia en el tema central que es el Virus del Oeste del Nilo.
El póster será distribuido en lugares considerados estratégicos para alcanzar a la población meta. Entre estos lugares se ha pensado en sedes de organizaciones gubernamentales y no gubernamentales de salud (humana y animal) y de medio ambiente. Otras entidades asociadas con este tipo de actividades y con presencia en zonas de riesgo, sobre todo, instituciones que han participado en los talleres organizados en el marco del proyecto (ver anexo 11: Muestra de póster informativo).
41
III PARTE
III.1 CONCLUSIONES
Las conclusiones se relacionan directamente con los objetivos trazados en el estudio.
1. Durante la ejecución del proyecto “Monitoreo preliminar del Virus del Oeste del
Nilo en aves de Guatemala”, se logró implementar y validar una metodología de captura y muestreo de aves, tanto silvestres como domésticas, que permite obtener muestras de sangre de diversas especies residentes. Esta metodología podría ser implementada en otras regiones del país.
2. La técnica de ELISA de bloqueo utilizada en el CES-MERTU/G-UVG fue
validada por medio de la técnica estándar de oro, PRNT. Los resultados indicaron que esta es una buena técnica (con resultados satisfactorios en cuanto a la especificidad y sensibilidad) para el diagnóstico de anticuerpos dirigidos contra VON en las aves.
3. Tanto por la metodología de redes como por la de censos se logró demostrar que
existen diferencias significativas en la proporción de aves migratorias versus residentes en los diferentes sitios y épocas de estudio. Ninguno de los métodos utilizados, redes o censos, puede considerarse como totalmente confiable para cuantificar la proporción de aves migratorias. La metodología de censos es la que parece presentar una menor influencia del error experimental.
4. Considerando los resultados de los censos se puede afirmar que existe mayor
proporción de aves migratorias en la zona más silvestre, Punta de Manabique; respecto a esta Machacas del Mar que es la zona peri-urbana presenta en general una proporción intermedia y Puerto Barrios, la zona urbana presenta la menor proporción.
5. Con las pruebas serológicas se puso en evidencia la posible circulación del Virus
del Oeste del Nilo en la población de aves residentes de Izabal, Guatemala.
6. Por medio del ELISA de bloqueo se determinó que Puerto Barrios fue el sitio con mayor incidencia de anticuerpos contra VON seguido de Machacas del Mar y finalmente de Punta de Manabique.
7. Al realizar el análisis de correlación se demostró que, aunque no sea
estadísticamente significativa, se observa una tendencia a encontrar una relación inversa entre la seropositividad a VON y la proporción de aves migratorias.
8. Se han dado los primeros pasos para la implementación de un sistema eficiente de
vigilancia de aves vistas muertas, como indicador de posible presencia del VON. Los guarda-recursos, técnicos, estudiantes y profesionales entrenados colaborarán
42
reportando aves silvestres muertas a las autoridades de salud y al CES-MERTU-CDC.
9. Se cuenta con un poster informativo sobre las formas prácticas de prevenir el
VON, así como otras enfermedades transmitidas por vectores zancudos. El poster también es una herramienta de divulgación para apoyar los reportes de la presencia de aves silvestres muertas en diferentes puntos a nivel nacional.
10. En los Estados Unidos se ha reportado que la presencia de varias especies de aves
silvestres muertas es indicativo de la presencia del VON, sin embargo, en este estudio no fue posible determinarlo.
43
III.2 RECOMENDACIONES
1. Se recomienda, en base a la experiencia adquirida durante el Monitoreo Preliminar del Virus del Oeste del Nilo, mejorar las condiciones experimentales del trabajo de campo. En particular sería deseable tener más reproducibilidad en los datos colectados y aumentar el tamaño de la muestra. Esto requeriría que se realice un esfuerzo más importante en términos de personal y tiempo de trabajo en cada sitio y época de estudio.
2. Para evaluar si realmente el Virus del Oeste del Nilo llega a establecerse de
manera durable en el país, es muy importante continuar este tipo de trabajo de investigación. Se debe incluir en próximos estudios un componente entomológico con el fin de obtener información sobre los posibles vectores y eventualmente llegar a tener un aislado viral. Se recomienda prolongar este tipo de investigación durante varios años e implementarla en otras regiones del país susceptibles de tener la presencia de VON.
3. En el continente americano hace falta información sobre el posible
comportamiento de un virus emergente como el VON. Una vez confirmada la presencia del virus en el país, se considera recomendable que a mediano y largo plazo se continúe con estudios que se enfoquen en la ecología de este y otros flavirirus. Este tipo de estudios debería tomar en cuenta: la posible variación de transmisión viral en función de la presencia de aves migratorias; la relación del virus con la diversidad de reservorios y vectores; el efecto que factores ambientales como la estacionalidad y diversidad de hábitats pueda tener en la transmisión viral; la posible circulación de otros virus relacionados o no al VON. Con este tipo de estudios se podrá acumular elementos de juicio que permitan determinar la importancia real de este tipo de virus para la salud humana y animal. Estas informaciones son esenciales para mejorar en nuestro país, el control y prevención de brotes debidos a VON y otros arbovirus.
4. Para incrementar el nivel de confianza en el ELISA de bloqueo se recomienda
enviar al CDC de Fort Collins, un mayor número de muestras para su confirmación por PRNT. También se sugiere redefinir el punto de corte de la prueba para evitar falsos positivos.
5. Se recomienda no divulgar los resultados reportados en este informe sin
contar previamente con el aval de las entidades nacionales de Salud (Ministerio de Salud y Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación) y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Una vez que se cuente con este aval, se recomienda publicar estos resultados en forma de un artículo científico sometido a una revista internacional revisada por pares.
6. Finalmente se debe continuar y aumentar el esfuerzo de reporte y colecta de aves
muertas por medio de la distribución del póster diseñado en este proyecto (FD19-03).
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III.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Blitvich B., Fernández-Salas I., Contreras-Cordero J., Marlenee N., Gonzalez- Rojas J., Komar N., Gubler D., Calisher C., Beaty B. Serologic Evidence of West Nile Virus Infection in Horses, Coahuila State, Mexico. (a) Emerg. Infect. Dis. 2003; 9: 853-856.
2. Blitvich B., Bowen R., Marlenee N., Hall R., Bunning M., Beaty B. Epitope-
Blocking Enzyme-linked Immunosorbent Assays for the detection of West Nile Virus Antibodies in domestic Mammals. (b) J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 2676-2679.
3. Blitvich B., Fernandez-Salas I, Contreras-Cordero JF, Lorono-Pino MA,
Marlenee NL, Diaz FJ, Gonzalez-Rojas JI, Obregon-Martinez N, Chiu-Garcia JA, Black WC 4th, Beaty BJ. Phylogenetic analysis of West Nile virus, Nuevo Leon State, Mexico. Emerg Infect Dis. 2004 Jul;10(7):1314-7.
4. Campbell G., Marfin A., Lanciotti R., Gubler D. West Nile Virus. The Lancet
Infect. Dis. 2002; 2 : 519-529.
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6. Cupp, E.W., W. Scherer, J. Lok, R. Brenner, G. Dziem, J. Ordonez JV.
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929p.
47
IV PARTE
IV.1 EJECUCION FINANCIERA DE LOS RECURSOS SOLICITADOS A FODECYT
Al final de la ejecución del estudio, quedó pendiente de ejecutar un total de Q. 74.50 en el renglón de Servicios de atención y protocolo. El resto de los recursos fueron gastados y liquidados según lo muestra el formulario general de gastos presentado a continuación.
0 SERVICIOS PERSONALES2 PERSONAL TEMPORAL
29 Otras remuneraciones de personal temporal Q76,600.00 Q76,600.00 Q0.00
3 PERSONAL POR JORNAL Y A DESTAJO31 Jornales Q5,000.00 Q5,000.00 Q0.00
1 SERVICIOS NO PERSONALESPUBLICIDAD, IMPRESIÓN Y ENCUADERNACION
12 121 Publicidad y propaganda Q3,900.00 Q3,900.00 Q0.00122 Impresión, encuadernación y reproducción Q900.00 Q900.00 Q0.00
VIATICOS Y GASTOS CONEXOS13 131 Viáticos en el exterior Q0.00
133 Viáticos en el interior Q12,000.00 Q12,000.00 Q0.00
TRANSPORTE Y ALMACENAJE14 141 Transporte de personas Q100.00 Q100.00 Q0.00
142 Fletes Q0.00
MANTENIMIENTO Y REPARACION DE MAQUINARIA Y EQUIPO16 163 Mantenimiento y reparación de equipo médico, sanitario y de laboratorio Q2,400.00 Q2,400.00 Q0.00
165 Mantenimiento y reparación de medios de transporte Q3,980.00 Q3,980.00 Q0.00
OTROS SERVICIOS NO PERSONALES19 196 Servicios de atención y protocolo Q3,000.00 Q2,925.50 Q74.50
SUBTOTAL SERVICIOS NO PERSONALES Q26,280.00
2 MATERIALES Y SUMINISTROSPRODUCTOS QUIMICOS Y CONEXOS
26 262 Combustibles y lubricantes Q7,094.00 Q7,094.00 Q0.00
OTROS MATERIALES Y SUMINISTROS29 291 Utiles de oficina Q200.00 Q200.00 Q0.00
295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio Q9,400.00 Q9,400.00 Q0.00298 Accesorios y repuestos en general Q926.00 Q926.00 Q0.00
SUBTOTAL MATERIALES Y SUMINISTROS Q17,620.003 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES
MAQUINARIA Y EQUIPO32 323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio Q0.00
329 Otras maquinarias y equipos Q0.00
TOTAL Q125,500.00GASTOS ADMINISTRATIVOS Q12,550.00 Q12,550.00 Q0.00TOTAL FONDOS CONCYT Q138,050.00TOTAL Q137,975.50 Q74.50
MONTO PENDIENTE DE
EJECUTAR
FORMULARIO DE PRESUPUESTO GENERAL DE GASTOS
DESCRIPCION DEL PRESUPUESTO
No. Del Proyecto: FODECYT 19-03
NOMBRE DEL PROYECTO: Monitoreo preliminar del Virus del Oeste del Nilo (VON) en aves de Guatemala
GRUPO RENGLON DESCRIPCIONSUB
GRUPOMONTO
SOLICITADO
MONTO EJECUTADO AL
FINAL DEL PROYECTO
48
V. PARTE
V.1 ANEXOS A continuación se encuentran los anexos citados en el documento.
49
50
ANEXO No. 1
Boleta de datos de campo
ID A
Fecha
Localidad
Municipio
Departamento
M H D A SA J ComentariosHora Tamaño pico
Tamaño ala Peso (g)
Nombre medidor
# Muestra Código # Banda
Altitud
EdadSexoEspecie # RedM R Tamano Cola
Clima
Humedad
Nubosidad
Temperatura
Coordenadas
Longitud
Latitud
1
ANEXO No. 2
Listado de aves identificadas en Izabal
Anexo 2 Listado de aves identificadas durante el trabajo de campo en Izabal.
2
# Especie Nombres comunes Familia Orden
1 Phalacrocorax brasilianus Phalacrocoracidae Pelecaniformes 2 Anhinga anhinga leucogaster Aninga Anhingidae Pelecaniformes 3 Egretta alba egretta Garza blanca Ardeidae Ciconiformes 4 Egretta caerulea Ardeidae Ciconiformes 5 Egretta thula Ardeidae Ciconiformes 6 Bubulcus i. Ibis Ardeidae Ciconiformes 7 Butorides virescens Garza verde Ardeidae Ciconiformes 8 Cathartes aura Cathartidae Ciconiformes 9 Coragyps atratus Cathartidae Ciconiformes
10 Buteo magnirostris Gavilan de camino Accipitridae Falconiformes 11 Buteo nitidus Aguililla gris Accipitridae Falconiformes 12 Herpetotheres cachinnans Falconidae Falconiformes 13 Falco sparverius Halcón Falconidae Falconiformes 14 Falco rufigularis Falconidae Falconiformes 15 Ortalis vetula Chachalaca Cracidae Galliformes 16 Aramus guarauna dolosus Aramidae Galliformes 17 Aramides axillaris Rallidae Galliformes 18 Laterallus exilis Rallidae Galliformes 19 Porphyrula martinica Rallidae Galliformes 20 Jacana s. spinosa Jacana Jacanidae Charadriiformes 21 Pluvialis squatarola Charadriidae Charadriiformes 22 Charadrius semipalmatus Charadriidae Charadriiformes 23 Charadrius v. vociferus Charadriidae Charadriiformes 24 Actitis macularia Scolopacidae Charadriiformes 25 Calidris alba Scolopacidae Charadriiformes 26 Larus atricilla Gaviota Laridae Charadriiformes 27 Columba flavirostris Paloma morada Columbidae Columbiformes 28 Columba livia spp Columbidae Columbiformes 29 Columbina talpacoti Columbidae Columbiformes 30 Columbina inca Tortola colilarga Columbidae Columbiformes 31 Columbina passerina pallescens Tortola comun Columbidae Columbiformes 32 Aratinga astec Perica Psittacidae Psittaciformes 33 Amazona a. autumnalis Loro cachete amarillo Psittacidae Psittaciformes 34 Piaya cayana Cucú Cuculidae Cuculiformes 35 Crotophaga sulcirostris Pijuy Cuculidae Cuculiformes 36 Strix virgata Strigidae Strigiformes 37 Glaucidium brasilianum Aurora Strigidae Strigiformes 38 Nyctidromus albicollis Caprimulgidae Caprimulgiformes39 Phaethornis superciliosus Ermitaño Trochilidae Apodiformes 40 Pygmornis longuemareus Trochilidae Apodiformes
41 Amazilia t. tzacatl Colibrí o gorrion de cola café Trochilidae Apodiformes
3
42 Amazilia rutila Colibrí o gorrion canelo Trochilidae Apodiformes 43 Archilochus colubris Trochilidae Apodiformes 44 Hylocharis eliciae Trochilidae Apodiformes 45 Anthracothorax p. prevostii Trochilidae Apodiformes 46 Trogon sp Trogon Trogonidae Trogoniformes 47 Ceryle t. torquata Martin pescador collarejo Alcedinidae Coraciiformes
48 Chloroceryle amazona mexicana Martin pescador amazona Alcedinidae Coraciiformes
49 Chloroceryle aenea stictoptera Alcedinidae Coraciiformes 50 Momotus momota Mot mot Momotidae Coraciiformes 51 Pteroglossus torquatus Tucaneta Ramphastidae Piciformes 52 Centurus aurifrons Carpintero o cheje Picidae Piciformes 53 Dryocopus lineatus Picidae Piciformes 54 Xiphorhynchus guttatus Dendrocolaptidae Passeriformes 55 Camptostoma imberbe Tyrannidae Passeriformes 56 Oncostoma cinereigulare Tyrannidae Passeriformes 57 Contopus cooperi Tyrannidae Passeriformes 58 Contopus cinereus Tyrannidae Passeriformes 59 Empidomax sp Tyrannidae Passeriformes 60 Myiarchus crinitus Tyrannidae Passeriformes 61 Pitangus sulphuratus Chorcha Tyrannidae Passeriformes 62 Megarhynchus pitangua Tyrannidae Passeriformes 63 Myiozetetes similis Tyrannidae Passeriformes 64 Tyrannus melancholicus Tyrannidae Passeriformes 65 Tityra inquisitor fraserii Tyrannidae Passeriformes 66 Manacus candei Pipridae Passeriformes 67 Hirundo rustica erythrogaster Hirundinidae Passeriformes 68 Hirundo pyrrhonata Hirundinidae Passeriformes 69 Campylorhynchus zonatus Troglodytidae Passeriformes 70 Thryothorus maculipectus Troglodytidae Passeriformes 71 Troglodytes musculus Troglodytidae Passeriformes 72 Dumetella carolinensis Misha Mimidae Passeriformes 73 Catharus mustelinus Turdidae Passeriformes 74 Catharus ustulatus Turdidae Passeriformes 75 Turdus grayi Sensontle Turdidae Passeriformes 76 Sporophila aurita corvina Emberizidae Passeriformes 77 Sporophila torqueola Coronadito Emberizidae Passeriformes 78 Volatinia jacarina Emberizidae Passeriformes 79 Pheucticus ludovicianus Emberizidae Passeriformes 80 Saltator coerulescens Emberizidae Passeriformes 81 Passerina cyanea Emberizidae Passeriformes 82 Passerina ciris Emberizidae Passeriformes 83 Piranga rubra Emberizidae Passeriformes 84 Thraupis episcopis cana Emberizidae Passeriformes 85 Thraupis abbas Emberizidae Passeriformes 86 Euphonia affinis Emberizidae Passeriformes 87 Cyanerpes cyaneus carneipes Emberizidae Passeriformes 88 Mniotilta varia Parulidae Passeriformes 89 Dendroica petechia Chipe Parulidae Passeriformes
4
90 Dendroica magnolia Chipe Parulidae Passeriformes 91 Dendroica palmarum Chipe Parulidae Passeriformes 92 Dendroica dominica Chipe Parulidae Passeriformes 93 Helmitheros vermivora Chipe Parulidae Passeriformes 94 Setophaga ruticilla Chipe Parulidae Passeriformes 95 Seiurus aurocapillus Chipe Parulidae Passeriformes 96 Seiurus noveboracensis Chipe Parulidae Passeriformes 97 Oporornis formosus Chipe Parulidae Passeriformes 98 Lymnothlypis swainsonii Chipe Parulidae Passeriformes 99 Geothlypis trichas Chipe Parulidae Passeriformes
100 Wilsonia citrina Chipe Parulidae Passeriformes 101 Icteria virens Chipe Parulidae Passeriformes 102 Vireo griseus Vireo Vireonidae Passeriformes 103 Vireo olivaceus Vireo Vireonidae Passeriformes 104 Psarocolius montezuma Icteridae Passeriformes 105 Icterus pectoralis Icteridae Passeriformes 106 Icterus gularis Oropendola Icteridae Passeriformes 107 Icterus galbula Oropendola Icteridae Passeriformes 108 Icterus spurius Icteridae Passeriformes 109 Agelaius phoeniceus Icteridae Passeriformes 110 Dives dives Icteridae Passeriformes 111 Quiscalus mexicanus Zanate o clarinero Icteridae Passeriformes 112 Molothrus aeneus Icteridae Passeriformes 113 Scaphidura oryzivora impacifica Icteridae Passeriformes 114 Cyanocorax morio Corvidae Passeriformes
Resumen del total de aves identificadas por medio de las metodologías de censos o redes:
Especie Familia Orden M RCensos 97 34 15 37 60Redes 44 15 7 27 17Total 114 36 15 47 67
M= Migratorios y R= Residentes
5
ANEXO No. 3
Aves residentes positivas por ELISA de bloqueo, por
sitio de trabajo
6
Anexo 3 Aves residentes positivas por ELISA de bloqueo por sitio de trabajo
ABRIL Manabique Machacas Barrios Especie pos N % pos N % pos N %
Centurus aurifrons 0 1 0.00 Chloroceryte aenea strituplera 0 1 0.00
Columbina inca 0 2 0.00 Columbina passerina 0 2 0.00 0 1 0.00 Columbina talpacoti 0 8 0.00
Crotophaga sulcirostris 0 3 0.00 Dendrocygna autumnalis 1 2 50.00
Elaenia flavigaster 0 1 0.00 Gallus gallus 0 12 0.00 5 28 17.86 9 19 47.37
Leptotila cassini 1 1 100.0
0 Manacus candei 0 2 0.00
Momotus momota 0 1 0.00 Myiozetetes similis 0 1 0.00 0 1 0.00
Quiscalus mexicanus 0 1 0.00 1 5 20.00Thryothorus maculipectus 0 1 0.00
Troglodytes aedon 0 1 0.00 Turdus grayi 1 16 6.25 0 4 0.00
ENERO Manabique Machacas Barrios Especie pos N % pos N % pos N %
Chloroceryle americana septentrionalis 0 1 0.00
Colaptes aurifrons 0 1 0.00 Columbina pretiosa 0 1 0.00 Columbina talpacoti 1 19 5.26
Crotophaga sulcirostris 0 3 0.00 0 1 0.00 Dendrocygna autonalis 1 2 50.00
Egretta alba 0 1 0.00 Gallus gallus 0 22 0.00 6 24 25.00 13 28 46.43
Leptotila cassinii cerviniventris 0 1 0.00 Manacus candei 0 2 0.00
Melanerpes aurifrons 0 2 0.00 0 1 0.00 Pitangus sulphuratus 0 1 0.00
Quiscalus mexicanus 1 1 100.0
0 Sporophyla torqueola 0 1 0.00
Thryothorus maculipectus 0 2 0.00 Troglodytes aedon 0 2 0.00
Turdus grayi 0 7 0.00 0 3 0.00
7
JUNIO Manabique Machacas Barrios
Especie pos N %
pos N % pos N %
Centurus aurifrons 0 7 0.00 0 1 0.00 Columba cayennensis 1 1 100.00
Columbina inca 0 5 0.00 0 1 0.00 Columbina talpacoti 0 1 0.00 0 3 0.00
Crotophaga sulcirostris 0 3 0.00 Gallus gallus 0 28 0.00 2 30 6.67 0 29 0.00
Glancidium brasilianum 0 1 0.00 Icterus pectoralis 0 1 0.00 Leptotila cassini 0 1 0.00
Leptotila cassinii cerviniventris 0 1 0.00 Molothrus aeneus 0 1 0.00
Myiarchus tyrannulus 0 1 0.00 Quiscalus mexicanus 3 6 50.00
Thryothorus maculipectus umbrinus 0 1 0.00 Thryothorus rufalbus 0 1 0.00
Troglodytes aedon 0 2 0.00 Turdus grayi 1 15 6.67 2 10 20.00
AGOSTO Manabique Machacas Barrios Especie pos N % pos N % pos N %
Attila spadiceus 0 1 0.00 Chloroceryle americana
septentrionalis 0 1 0.00 Columbina inca 0 1 0.00
Columbina plumbeiceps 0 1 0.00 Columbina talpacoti 0 1 0.00 Contopus cinereus 0 1 0.00
Crotophaga sulcirostris 0 2 0.00 0 1 0.00 Dendrocygna autumnalis 1 2 50.00
Gallus gallus 0 56 0.00 1 25 4.00 11 42 26.19 Leptotila cassini 0 2 0.00
Leptotila p. plumbeiceps 0 1 0.00 Pitangus sulphuratus 0 1 0.00
Thryothorus maculipectus 0 2 0.00 Troglodytes aedon 0 2 0.00
Turdus grayi 1 5 20.00 0 1 0.00
8
9
ANEXO No. 4
Mapas de seropositividad en Izabal
10
11
12
13
ANEXO No. 5
Especies de aves muestreadas en cada sitio
de trabajo, Izabal
14
Anexo 5 Especies de aves muestreadas en cada sitio de trabajo, Izabal.
ESPECIE Machacas
del MarPuerto Barrios
Punta de Manabique Total
Attila spadiceus 0 0 1 1Centurus aurifrons 7 2 2 11Chloroceryle americana septentrionalis 2 0 0 2Chloroceryte aenea strituplera 1 0 0 1Colaptes aurifrons 1 0 0 1Columba cayennensis 0 1 0 1Columbina inca 0 1 9Columbina passerina 0 1 2Columbina plumbeiceps 1 0 0 1Columbina pretiosa 1 0 0 1Columbina talpacoti 0 31 1 32Contopus cinereus 0 1 0 1Crotophaga sulcirostris 11 2 0 13Dendrocygna autumnalis* 0 6 0 6Egretta alba 1 0 0 1Elaenia flavigaste
103
r 1 0 0 1Gallus gallus* 147 145 216 508Glancidium brasilianum 1 0 0 1Icterus pectoralis 1 0 2 3Leptotila cassini 0 0 4 4Leptotila cassinii cerviniventris 0 0 2 2Leptotila p. plumbeiceps 0 0 1 1Manacus candei 0 0 5 5Melanerpes aurifrons 2 1 0 3Meleagris gallopavo* 0 0 1 1Molothrus aeneus 0 0 1 1Momotus momota 1 0 0 1Myiarchus tyrannulus 0 0 1 1Myiozetetes similis 1 0 1 2Pitangus sulphuratus 1 1 2 4Quiscalus mexicanus 0 12 1 13Sporophyla torqueola 0 1 0 1Thryothorus maculipectus 0 0 5 5Thryothorus maculipectus umbrinus 0 0 1 1Thryothorus rufalbus 0 0 1 1Troglodytes aedon 0 7 0 7Turdus grayi 43 18 0 61Total Aves Muestreadas: 223 230 259 712 * Las aves señaladas en negrillas corresponden a aves domesticas
15
16
ANEXO No. 6
Formato de ingreso de información de campo
7 1
ANEXO No. 7
Agenda del “Taller de presentación de colecta de datos de aves muertas para el monitoreo del Virus del
Oeste del Nilo”.
Puerto Barrios, Izabal
18
TALLER DE PRESENTACION DE COLECTA DE DATOS DE AVES MUERTAS PARA EL MONITOREO DEL VIRUS DEL
OESTE DEL NILO
LUGAR: HOTEL VALLE TROPICAL FECHA: 19 DE NOVIEMBRE DE 2004
8 a.m. a 12 p.m. Objetivos del taller:
• Presentar al personal a cargo de áreas protegidas de la región de Izabal, información sobre el Virus del Oeste del Nilo: los riesgos para poblaciones humanas y la fauna silvestre.
• Introducir a los participantes en el uso de una boleta para reportar aves muertas
• Establecer una red de vigilancia de aves muertas en la región. Agenda del Taller:
• 8:00 horas, Palabras de bienvenida por los organizadores • 8:15 -9:15, Presentación del VON (generalidades, modo de
transmisión, papel de las aves en su ciclo de vida) • 9:15-9:45, Presentación del proyecto 19-03, financiado por
CONCYT, a cargo del Centro de Estudios en Salud, UVG y de la Fundación Mario Dary, con colaboración del CDC-Fort Collins
• 9:45-10:15, café • 10:15-10:45, presentación de la boleta de aves muertas • 10:45-12:00, mesa redonda de discusión sobre el establecimiento
de una red de vigilancia de aves muertas. • 12:00-12:15 conclusiones y cierre del taller • 12:15-13:15, almuerzo en el Hotel
19
ANEXO No. 8
Boleta de aves muertas
20
21
22
23
Departamento
Municipio
Localidad / comunidad Pico Tamaño
G Grueso G Grande
Fecha D Delgado M Mediano
Clima* P Pequeño
Color Descripción/observaciones
G M P (cuerpo, patas, alas, pico) G D (golpe, heridas y otros...)
* Calido, Templado o Frío
NOTA IMPORTANTE: SI EL ESPÉCIMEN ESTA EN ESTADO DE DESCOMPOSICIÓN AVANZADA, NO ES NECESARIO COLECTARLOSI ESTA EN BUENAS CONDICIONES, SE COLECTA CON PRECAUCIONES (SIN TOCARLO CON LAS MANOS)
Ficha y especimenes a retornar a Dra. Maria Eugenia Morales o Dr. Danilo Álvarez, Universidad del Valle
Tamaño Pico
Nombre Observador/colector
Fecha
Telêfonos 23640336 al 40 Extensiôn 520 y 521
Correo electrônico: [email protected] y [email protected]
Especie o nombre común
ANEXO No. 9
Agenda del “Taller sobre Eco-epidemiología y
Vigilancia de Encefalitis Arbovirales en Animales”,
Ciudad de Guatemala
24
TALLER SOBRE ECOEPIDEMIOLOGÍA Y VIGILANCIA DE ENCEFALITIS ARBOVIRALES EN ANIMALES
11 y 12 de agosto 2005.
I. Objetivo General Que los epidemiólogos del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación (MAGA) amplíen y actualicen sus conocimientos sobre vigilancia epidemiológica, y sobre la respuesta ante un posible brote en poblaciones animales afectadas por encefalitis arbovirales, definiendo acciones para el mejoramiento del sistema de vigilancia para este tipo de enfermedades.
II. Objetivos específicos: 1. Reforzar conocimientos de los conceptos básicos sobre vigilancia
epidemiológica 2. Actualizar conocimientos sobre respuestas ante el aparecimiento de brotes 3. Determinar planes y acciones sobre la vigilancia de encefalitis arbovirales 4. Ampliar conocimientos sobre el Virus del Oeste del Nilo, conocer avances
del estudio que se lleva a cabo actualmente en Guatemala, así como experiencias de su vigilancia en otros países.
5. Reforzar conocimientos sobre bioseguridad, sobre todo en manejo de
muestras 6. Desarrollar herramientas para notificación de casos
25
III. Agenda: 11 de agosto (Salón I-201, vestíbulo auditórium nuevo)
TEMA ENCARGADO(S) HORARIO
Objetivos generales del taller y descripción de los temas Dr. Danilo Álvarez 08:30 - 08:35Estructura general del sistema de vigilancia y servicios de Salud animal en el Ministerio de Agricultura, ganadería y alimentación Dr. Byron Gil 08:35 - 09:00
Conceptos sobre vigilancia epidemiológica Dr. Augusto López 09-00 - 09:45
Discusión sobre vigilancia epidemiológica Dr. Augusto López 09:45 - 10:30
RECESO 10:30 - 10:45
Qué es un brote y cómo manejarlo Dr. Augusto López 10:45 - 11:15
Preguntas y respuestas sobre brotes Dr Augusto López 11:15 - 11:45
Planes sobre vigilancia Dr. Augusto López 11:45 - 13:00
ALMUERZO 13:00 - 14:00
Vigilancia del Virus del Oeste del Nilo Licda. Celia Cordón 14:00 - 15:00
Discusión sobre detección y notificación de casos (boletas) Dr. Danilo Álvarez y Dr. Augusto López 15:00 - 16:30
12 de agosto (Salón I-104)
TEMA ENCARGADO(S) HORARIO
Diagnóstico clínico de encefalítis equina Dr. Danilo Álvarez 8:30 - 9:00
Medidas de bioseguridad para manejo de muestras Dra. Flora Arana 9:00 - 09:45
Diagnóstico de laboratorio para Virus del Oeste del Nilo Dra. María Eugenia Morales 9:45 - 10:30
RECESO 10:30 - 10:45
Actividades desarrolladas en campo para estudio de VON Dr. Danilo Álvarez 10:45 - 11:00Generalidades sobre reservorios y resultados parciales de estudio sobre VON Luis Martínez 11:00 - 11:45
Vectores en la transmisión de Virus del Oeste del Nilo Licda. Silvia Soza 11:45 - 12:15
Conclusiones y Evaluación de la actividad 12:15 - 12:30
26
ANEXO No. 10
Muestra de Póster informativo
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