Microscopia electrnica de transmisinIntroduccin. El microscopio electrnico no es mas que uno de los muchos aparatos cuyo fundamento es la ptica electrnica. El nombre que resulta justificado por la estrecha analoga existente entre su formulacin terica y la de la ptica clsica. No hay posibilidad de estudiar la ptica electrnica sin enfrentarse con una de las consecuencias aparentemente paradjicas de la fsica terica moderna: la dualidad onda-corpsculo, cuando los electrones inciden como paquetes de ondas sobre los tomos de una muestra, las colisiones pueden representarse, y a veces con gran precisin como colisiones del tipo bola de billar. Sin embargo, Si la muestra contiene un cristal en una cierta orientacin, los electrones debern representarse por ondas para dar cuenta de las reflexiones.La prueba crucial para demostrar la existencia de las propiedades ondulatorias de los electrones fue laobservacin de la difraccin y de la interferencia de las ondas de los electrones. Al final del siglo se haban reunido muchos datos sobre la emisin de la luz por los tomos de un gas al ser excitados por una descarga elctrica. Observada a traves de un espectroscopio con una abertura en forma de rendija estrecha. Las bandas formadas obedecen a las diferentes longitudes de onda que conforman el espectro luminoso. En similar forma y utilizando el espaciado conocido de los tomos de un cristal se calculo la longitud de onda que poda producir dicho mximo y se encontr la correspondencia con la energa de los electrones que eran utilizados. El electrn haba adquirido un comportamiento ondulatorio. Este comportamiento de onda puede ser tratada en igual forma que el tratamiento hecho sobre la luz por medio de una lente de vidrio. En contra posicin, el vidrio no actuara de igual forma sobre la onda de electrones, era necesario utilizar otro tipo de lente (las magnticas).Los electrones procedentes de un filamento caliente se ven acelerados por una gran diferencia de tensin en el tubo. El haz de electrones se hace paralelo mediante lentes de enfoque magntico. los electrones inciden sobre un blanco muy delgado y luego se enfocan mediante una segunda lente magntica que es equivalente a la lente objetivo de un microscopio ordinario. La tercera lente magntica juega el papel del ocular de un microscopio. Proyecta el haz de electrones sobre una pantalla fluorescente donde se realiza la observacin de la imagen.1. Breve Historia.Las ideas que llevaron a la puesta a punto del microscopio electrnico de alta resolucin tuvieron su origen en muy diversos estudios, el descubrimiento del electrn como partcula cargada con masa en reposo; los haces de estas partculas se pueden desviar y concentrar mediante campos elctricos y magnticos con este principio se construyo el primer oscilgrafo y dio pie para que Luis de Broglie en 1924 lanzara su extraordinaria hiptesis segn la cual haba de asociar una naturaleza ondulatoria a cada partcula material, Y en particular a los electrones. Dedujo la formula para la logitud de onda de dichas ondas materiales donde es la constante de Planck, la masa de la partcula y su velocidad. Si se sustituyen valores de esta ecuacin para un electrn acelerado por un potencial de 60.000 voltios, resulta una longitud de onda de solo 0,05 , lo que representa 1/100.000 de la luz visible. Poco despus, en 1926, E. Schrdinger comenzo el desarrollo de la mecnica ondulatoria haciendo uso de las analogas mecnico-pticas demostradas por W.R. Hamilton en 1830, y combinndolas con las ideas de De Broglie. En 1927 La hiptesis de De Broglie fue confirmada experimentalmente con haces electrnicos por Davisson y Germer en los Estados Unidos y por Thomson y Reid en Inglaterra. Los primeros en desarrollar el microscopio electrnico fueron Ersr Ruska y Max Knoll, hacia la dcada de 1930 (Bozzula y Bartlerr, 1997). Con el desarrollo del microscopio electrnico se lleg al territorio celular desconocido hasta el nivel del nanometro, pero el escaso poder de penetracin del haz de electrones hizo necesario el desarrollo de tcnicas que dejaran las muestras a examinar de extraordinaria finura (una millonsima de centmetro) y su examen debe realizarse bajo intenso vaco. Adems de la construccin de instrumentos necesarios para reducir las muestras a cortes ultra finos (Duve, 1988). El primer microscopio electrnico fue usado por ingenieros y fsicos. El uso del microscopio en el campo de la Biologa, fue en sus inicios para estudios puramente descriptivos, pero con el tiempo se ha usado en estudios experimentales. Para el desarrollo y origen de la Biologa Celular fue determinante la aparicin del microscopio electrnico. Actualmente su uso es multidisciplinario (Bozzula y Bartlerr, 1997). En 1926 despus de 15 aos de estudio sobre la trayectoria de los electrones en campos magnticos, H. Busch publico un articulo en el que mostraba que un campo elctrico o magntico con simetra axial era capaz de actuar como una lente para los electrones u otras partculas cargadas. El trabajo de Busch atrajo la atencin de los fsicos del momento hacia una consecuencia prctica importante de las teoras de De Broglie y Schrdinger, y dio origen a una nueva ciencia de instrumentacin que se conoce desde entonces como ptica electrnica, ciencia que busco el desarrollo de la microscopia electrnica (Electron Microscopy, EM).2. Contextualizacin y funcionamiento del microscopio electrnico de transmisin.En el campo de la ciencia fsica moderna es primordial entender el comportamiento tanto del haz de luz como el de electrones, todas las aplicaciones pticas en cuanto a capturas y ampliacin de imgenes que usan este principio prestan gran utilidad para el desarrollo de las ciencias que incursionan en el microcosmos.. Son diversas las tcnicas que cumplen con estos propsitos, entre ellas, son dignas de ser citadas las siguientes:2.1 Microscopia Confocal y de fluorescencia:propia para la observacin de imgenes topogrficas con carcter tridimensional de sus estructuras en diferentes tipos de muestras.2.2 Microscopia electrnica de Barrido y micro anlisis de rayos X:Explora las superficies de las muestras realizando un paneo sobre la misma y capturando la radiacin reflejada la cual se codifica en datos computacionales con la idea de reconstruir la imagen del espcimen.

2.3 Microscopia electrnica de Fuerza Atmica:Una aguja de punta muy fina casi a nivel atmico explora la superficie de la muestra generando entre ambas un campo electro-magntico. El campo sufre variaciones correspondientes a las variaciones de rugosidad de la superficie muestreada. Las variaciones electromagnticas ocasionadas generan una informacin de corriente elctrica que debidamente tratada reconstruye la imagen de la superficie observada.

2.4 Microscopia electrnica de Efecto Tunel:Conserva el mismo principio que el microscopio de fuerza atmica salvo que la intensidad del campo es mayor y realiza exploraciones bajo la superficie.2.5 Microscopia electrnica de transmisin:A diferencia de los anteriores microscopios, este no explora superficies , por el contrario el haz de electrones incidente atraviesa la muestra o espcimen observado y la sombra de detalles finos o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente con propiedades de emisin de luz, ubicada en la parte inferior de la columna. El tener una adecuada preparacin de la muestra da lugar a una excelente definicin de imagen. Son mltiples las facetas el las que interviene este tipo de microscopio. As, en control de calidad sealamientos morfolgicos, conformacin de agregados, tcnicas forenses, determinacin de estratos en restauracin y diferenciacin histolgica entre otros.En la construccin de microscopios electrnicos (1), se han usado con resultados satisfactorios ambos tipos de lentes: electrostticas y magnticas. Con todo, la mayor parte de los microscopios electrnicos hoy da en uso son magnticos; Un esquema clsico de estos aparatos esta representado en la figura 2. Algunos instrumentos no poseen lente condensadora, otros en cambio tienen dos, mientras otro grupo de aparatos posee solamente una lente proyectora. Aunque los detalles de construccin varen de un tipo a otro, se puede obtener una visin cualitativa de conjunto de sistema ptico. La fuente de electrones (2)esta constituida por un hilo de volframio en forma de horquilla, rodeado por una pantalla cilndrica polarizada negativamente respecto al filamento( figura 3). Despus de atravesar el nodo conectado a tierra, la mayor parte de los electrones del haz se pierden en las paredes y aberturas excepto un estrecho cono que atraviesa el diafragma del condensador. La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa, como para variar la abertura de iluminacin relativa en el objeto. Los dimetros de los diafragmas del condensador varan segn el tipo de instrumento, pero suelen estar comprendidos entre 0,1 y 0,5 mm. Despus de atravesar el objeto, donde muchos electrones se esparcen, el haz penetra en el campo de la lente objetivo que produce una imagen aumentada del objeto. En el objetivo se suele colocar un diafragma de 10 a 100 de dimetro para interceptar los electrones esparcidos , pero generalmente esta precaucin se omite en el estudio de muestras muy delgadas en las que el esparcimiento no es excesivo. Puesto que para las distancias usuales entre lente e imagen, el aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a X300, sera necesario el uso de una o mas lentes protectoras que vuelvan a aumentar la imagen primaria.Algunos instrumentos llevan incorporada una pantalla intermedia para facilitar la alineacin, pero no poseen en cambio este accesorio aquellos aparatos dotados de dos lentes proyectoras. La imagen final se observa en una pantalla fluorescente , y separando esta pantalla del camino del haz, se impresiona una placa fotogrfica con dicha imagen. Las dimensiones mas usuales para un microscopio de transmisin pueden ser: Del filamento a la lente condensadora 15 cm, y otro tanto de esta ltima al objeto, mientras que del objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el sistema completo deber ser rgido y capaz de alcanzar un vaco de 0.0001 mmHg con ayudas de bombas de difusin rpidas en serie con bombas rotatorias. Otras partes importantes importantes del aparato que no han sido representadas en los diagramas son la fuente de alimentacin para crear un potencial del haz, fuentes de alimentacin para las lentes magnticas , medidores de vaco, tornillos de alineacin, vlvulas de vaco , controles de aumento y enfoque, etc. De momento, nuestro inters mas inmediato se centra en la tcnica de preparacin de muestras.Comparacin entre microscopia electrnica de transmisin (MET) y microscopia electrnica de barrido (MEB).Preparacin de las muestras El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de agua y preservado en una matriz de resina. Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos para Microcopia electrnica de transmisin, pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su accin se centra en las protenas as:(COOH-protena-NH2)2+ CHO- CH2-CH2-CH2-CHOEntonces:COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el glutaraldehido.2. Lavado: Normalmente se hace con un buffer.Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drsticamente durante el proceso de fijacin. El uso de buffer mantiene el pH fisiolgico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer ms comunes son: fosfato, s-collidine, tris-maleato y cacodylate.3. Fijacin secundaria:es llevada a cabo por la accin del tetrxido de osmio, el cual reacciona principalmente con los lpidos. El tetrxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en una hora.4. Deshidratacin: La filosofa de la deshidratacin es el reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85% 95% y etanol absoluto.5. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisin de fluidos gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de los protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los tejidos despus de la deshidratacin. La concentracin del solvente es minimizada gradualmente incrementando las concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin aumentando la temperatura.

Recipientes de uso comn para la inclusin de las muestras en MET. Normalmente las muestras se marcan con un trozo de papel indicando algn tipo de convencin que ilustre posteriormente su contenido.

Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo, dependiendo del tipo de microtomo utiliza cuchillas de diamante o vidrio (la ms comn). Procesador automtico de tejidos.3. Tcnicas y aplicacionesLa novedad(1) de las condiciones requeridas para la formacin de la imagen opto-electrnica, comparada con la rutina establecida con los microscopios pticos radica en las dificultades inherentes de la formacin de una imagen por electrones , los posibles efectos destructivos de la desecacin en vaco, y la bsqueda de contrastes en la imagen hacen cada vez mas difcil esta tarea. Las suspensiones purificadas son contrastadas utilizando la tcnica de tincin negativa. Para esto, una gota de la suspensin se coloca sobre papel parafinado (Parafilm ) y luego una rejilla de nquel, previamente recubierta con una pelcula de Fomvar se deja flotar sobre la gota durante cinco minutos. El exceso de lquido se retira colocando papel de filtro en los bordes. Posteriormente se realiza la tincin negativa con una solucin de fosfotungstato de potasio al 2% y pH 6,8. Para ello se coloca una gota del contrastante sobre el papel parafinado y luego la rejilla con la muestra se deja flotar sobre ella durante cinco minutos. Las rejillas se observan en un microscopio electrnico de transmisin. Para la observacin del botonamiento de partculas virales, se emplea: una caja de plaqueo, a partir de la cual una porcin de agar, localizada sobre una placa en la monocapa de clulas, se retira y fija con glutaraldehido al 2% en buffer fosfato pH 7,4 y posfija. Despus del proceso de deshidratacin en concentraciones ascendentes de etanol, las muestras se incluyen en resina LR-White . Se realizan cortes ultrafinos de 40 nm. que son contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo para su posterior observacin en el microscopio electrnico de transmisin.4. Ventajas y desventajas.Los elevados costos de los equipos y la debida adecuacin de una infraestructura para el buen funcionamiento hacen que esta tcnica , se convierten en acceso de investigadores privilegiados . Si embargo, es comn contratar estos servicios por horas o por fotografas requeridas.Los costos de reactivos tambin dan un factor decisivo para la eleccin de esta tcnica. Aun cuando este proceso de investigacin sea costoso , proporciona resultados muy precisos de amplia resolucin y magnificacin.La tcnica de preparacin de las muestras cumple con protocolos establecidos, pero son vulnerables y variados al tipo de investigacin que se realice ,contando mas con la experiencia del investigador.La complejidad de los equipos , lo hacen susceptibles a la des calibracin. Nuevamente encontrar las condiciones ptimas requiere de un proceso tedioso y prolongado.La manipulacin de reactivos se torna peligroso por la elevada condicin toxica de los mismos.Las imgenes obtenidas son moncromticas y planas siendo necesario, en algunos casos, un tratamiento posterior mediante anlisis de imgenes con un software especializado.

El microscopio electrnico de transmisin proyecta electrones a travs de una muestra muy delgada de tejido para producir una imagen bidimencional en una pantalla fosforescente. La nitidez de un rea particular de la imagen es proporcional al nmero de electrones que son transmitidos a travs de la muestra (Bozzula y Bartlerr, 1997).http://www.luton.ac.uk/Healthcare/Ross/MITOCHON.HTM This famous first electron micrograph of an intact cell was published in The Journal of Experimental Medicine in March 1945, in "A study of tissue culture cells by electron microscopy," by Keith R. Porter, Albert Claude, and Ernest F. Fullam. The cell is a cultured fibroblast originating from a chick embryo, which was grown by Porter on polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid. The cell was fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in order to prevent evaporation in the electron microscopeUs vacuum chamber. Magnified 1600 times, this first electron micrograph of a cell reveals mitochondria, the Golgi apparatus and a "lace-like reticulum" which Porter later named the "endoplasmic reticulum". The electron microsope used for this historic image was an RCA EMB model, operated by Fullam at the Interchemical Corporation in New York City.http://www.rockefeller.edu/rucal/journey/journey.html

Literatura recomendadaDuve Christin, 1988. La clula viva. Editorial Labor. Madrid, Espaa. pg. 11.Bozzula and Bartlerr. 1997. Electron microscopy. Principles and tecniques for biologists. Jones and Bartlett Publishers. London, UK. pp. 2- 36.1. Cecil, E. 1970. Microscopia Electrnica. Editorial Ediciones Urmo. Mc Graw- Hill Barcelona,Espaa pg 23-55,203-266,315-370.2. Lopez, J. 1972. Fundamentos de la Ciencia y Tcnicas del Vaco. de. Aguilar. /Impreso Madrid Espaa. Pg 92-109.3. Tipler. P. 2000. Fsica ,Quinta Ed. Editorial Reverte /Imprenta Barcelona Espaa.pg 1061-1093, 1101-1163.4.http://emc.brol.sc.edu/5.http://www.uq.02.av/nanoworld/nanohome.html6.http://www.amc.anl.gov/7.Anderson, R., Mascorro, J. ,Anderson , D. 2002 Diseo por microscopia en instrumentacin analtica Volumen (10) numero 6.8.Matthias, R., Matthias, G. , Schemmel, A. 1998. La estabilidad mecnica de la microscopia electrnica Biophisical journal. Volumen (75) pg 3008-3014.