aplicaciones microscopia

Métodos en Biología, Seminarios

Curso 2009/10

Aplicaciones generales

Observación

Examen

Descripción

Comparación

Representación

Gráfica

Fotográfica/Vídeo

3-D

Rango de resoluciónde los microscopios

Rango de resolución de los microscopios

Lupa estereoscópica

Microscopioóptico

Microscopioelectrónico

Usos de la lupa estereoscópica Observación macroscópica

Reconocimiento taxonómico

Disecciones

Ventajas: Preparación sencilla

Trabaja a bajo aumento

Con amplitud de campo

Crea imágenes tridimensionales

Usos del microscopio óptico Observación de órganos, tejidos, células y orgánulos

Tipo de Microscopio Fundamento Uso

Campo claro Observación directa ampliada de la

muestra. Se visualiza según las

diferencias de absorción

El más sencillo y más utilizado. Permite ver colores originales y

tinciones histológicas. Se pueden incluir filtros para aumentar el

contraste

Campo oscuro Observación de luz dispersada por la

muestra

Muestras transparentes y/o vivas. Hay que iluminar mucho la

muestra. Útil para análisis cuantitativos

Contraste de fases Basado en los cambios del índice de

refracción de la luz al atravesar una

muestra. Convierte diferencias de fase

en diferencias de intensidad

Muestras transparentes y/o vivas. Observación de ciclos celulares y

orgánulos (mitocondrias, lisosomas, cromosomas, nucléolos, etc.). Si

hay pared celular, se debe incluir la muestra en un medio con índice

similar

Contraste diferencial

de interferencia

(Nomarsky)

Basado en la interferometría. Ofrece

una imagen en relieve, de acuerdo a los

cambios de absorbancia de la muestra

Como anterior, pero se intensifica el contraste, al evitarse el halo que

rodea la muestra. Se puede medir el índice de refracción de un

material

Polarización Basado en la birrefringencia,

consecuencia de la organización de

algunas moléculas

Estructuras moleculares largas, paralelas o apiladas, con una

orientación (células musculares, colas de espermatozoides,

cloroplastos, bastones, cadenas de ADN, huso mitótico)

Fluorescencia Basado en la absorción de luz por un

fluoróforo y su emisión en otra longitud

de onda

Detección de cantidades mínimas de algún material (anticuerpos,

histonas, actina, miosina); visualización de componentes de difícil

observación y determinación de su orientación (ácidos nucleicos);

detección de anomalías (bandas cromosómicas)

Usos de diversos microscopios ópticos

Microscopía de campo claro Microscopía de contraste de fases

Microscopía de interferencia Microscopía de campo oscuro

Preparación de muestras permanentes Fijación:

El fijador inmoviliza, mata y preserva las células, las hace más permeables a los colorantes y establece puentes cruzados entre sus moléculas, de manera que quedan estabilizadas y bloqueadas en su posición original.

Fijadores: alcohol, aldehídos activos (formaldehído, glutaraldehído).

Inclusión Se incluyen en un medio que ofrezca consistencia (ceras, resinas).

Sección Los tejidos suelen ser cortados en finas rebanadas (secciones). Por

ejemplo, con un microtomo (10-5-10-6m). Se suelen extender en un portaobjetos. (Sección por congelación: utiliza un criostato - microtomo en cámara

fría. Evita los pasos anteriores).

Extensión Sobre un portaobjetos. El uso de cubreobjetos evita la desecación, el abarquillamiento de la

muestra y que la superficie líquida actúe como lente.

Microscopio de campo claro

Larva nauplius

de balano

Alga verde filamentosa Spirogyra Link, 1820

Ojo de hámster

Amoeba proteus (Pallas, 1766)

Microscopio de campo claroConductos colectores de la orina, riñón

(hematoxilina y eosina)

Sección de raíz

(safranina y verde rápido)

Tinción

Colorantes orgánicos (verde malaquita, negro Sudán, azul de Coomassie). Algunos tienen una afinidad específica por ciertos componentes celulares (p.e. hematoxilina con moléculas con carga negativa).

Colorantes cada vez más específicos, según se ha ido conociendo la química celular.

Colorantes cualitativos, fluorescencia. Por ejemplo, fluoresceína, rodamina.

Microscopio de campo oscuro


Larva nauplius

de balano

Foraminíferos

Células sanguíneas

humanas

Microscopio de campo oscuro Se puede producir un pseudo-

campo oscuro sin necesidad de tener los accesorios apropiados; sólo moviendo el diafragma y el condensador.

Pluma de ave

http://olympusmicro.com/primer/anatomy/componenthome.html

Microscopio de contraste de fasesCélula epitelial

Alga

diatomea


Microscopio diferencial de interferencia

Rotífero

Miocito de corazón de ratón adulto

(contraste de fase y diferencial de interferencia)


Microscopio de polarización

Rodilla de vaca, red de colágeno en cartílago

Perforaciones en membranas

externas de la diatomea

Triceratium favusEhrenberg, 1840

Pelo de mamífero

Piel de cebolla

Microscopio de fluorescencia

Tinciones fluorescentes

Proteínas celulares fluorescentes

Célula en mitosis

Se han observado tres elementos fluorescentes: microtúbulos en verde, centrómeros en rojo, ADN en azul


Nanopartículas fluorescentes o puntos cuánticos

(cristal)

Tinciones fluorescentes y nanopartículas

Proteína nuclear en verde (Alexa 488) y microtúbulos en rojo (nanopartículas con estreptavidina)

Anticuerpo primario

Anticuerpos secundarios

Inmunofluorescencia



Célula cancerígena humana en división

ADN en azul, proteína del centrómero en verde, microtúbulos en rojo

Célula endotelial de arteria pulmonarde vaca

Núcleo en azul (DAPI), microtúbulos en verde (anticuerpo unido a FITC), filamentos de actina en rojo (faloidinaunida a TRITC)

Microscopio electrónico de transmisión

Microscopio de fluorescencia(Antitubulina fluorescente)


Usos del microscopio electrónico Observación de órganos, tejidos, células, orgánulos y moléculas

Reconocimiento de patologías, virus, nanopartículas, etc.

Tipo de Microscopio Inglés Fundamento Uso

Transmisión

(MET)

Transmission

(TEM)

La imagen es formada por

los electrones que atraviesan

la muestra

Muestras <2·10-7 m

Transmisión Barrida

(METS)

Scanning

Transmission

(STEM)

Como MET, pero se va

barriendo una cuadrícula

Muestras <2-7·10-8 m

Bajo Voltaje

(MEBV)

Low Voltage

(LVEM)

Como MET, pero, al trabajar

con un voltaje menor, se

mejora de forma significativa

el contraste de los elementos

más claros

Muestras <2·10-8 m

Barrido

(MES)

Scanning

(SEM)

La imagen es formada por

los electrones emitidos por la

muestra

Cualquier tipo de

muestra. Ofrece

tridimensionalidad,

pero menor resolución

Lámina de oro

Átomos a 0.2·10-9m

Preparación de muestras para ME Muestras grandes (órganos, tejidos, células)

Fijación:

Glutaraldehído (une proteínas)

Tetróxido de osmio (une bicapas lipídicas y proteínas)

Alternativamente, criofijación

Inclusión:

Resina monomérica (metacrilato de metilo)

Alternativamente, inclusión de resina en frío (criosustitución)

Sección:

Ultramicrotomo (secciones inferiores a 2·10-7m)

Alternativamente, criofractura

Polimetacrilato de metilo

Preparación de muestras para ME

Muestras grandes (órganos, tejidos, células)

Réplica o sombreado metálicos

Usos del METSistema nervioso,

axones de neuronas con mielina (células de Schwann)

Sección de corazón de rata

Arriba, MET; Abajo, MEBV

Usos del MES

Estereocilios de una célula pilosa del oído interno de la rana toro

A: MES; B: Microscopio diferencial de interferencia; C: MET

Preparación de muestras para ME Muestras pequeñas

(macromoléculas, moléculas)

Réplica metálica

Tinción negativa o contraste negativo:

Sal de metal pesado (p.e. sal de ácido fosfotúngstico, yoduro de cadmio, uranil acetato).

La imagen es el resultado de la intensidad relativa del haz electrónico en cada punto, que es proporcional al grosor de la película opaca.

Empleado con éxito en bacteriófagos, virus y proteínas.

Cadenas helicoidales de moléculas globulares de actina



Crio-electromicroscopía

Crio-EM de GroEL

(Escherichia coliMigula, 1895)

Hibridos de ARN y ADN en

disolución

Filamentos de ADN extraídos del bacteriófago T4

Campo oscuro



Immunogold (puntos negros / nanopartículas)

Localización de cuatro proteínas del cuerpo polar del huso en levadura

Representación gráfica

Mano alzada

Cámara lúcida o tubo de dibujo

Representación fotográfica/vídeo Cámaras

Objetivos digitales

Pantallas de vídeo (ME)

Representación fotográfica/vídeo Falso coloreado (ME)

Arteria con célulassanguíneas

Polen de Amaranthaceae

Bacilo Vibrio vulnificus

Farmer, 1980

Representación 3-D Microscopio óptico

Deconvolución

Cromosomas politenos de

Drosophila Fallen, 1823

Representación 3-D

Microscopio óptico

Confocalización (fluorescencia)

Estado de gástrula de

Drosophila Fallen, 1823

Grano de polen de

flor de la pasión

Representación 3-D

Reconstrucción de unamitocondria de levadura

Microscopio óptico y electrónico

Reconstrucción a partir de secciones

Reconstrucción de la cápsula proteínica del virus de la Hepatitis B

Reconstrucción de única partícula (ME)

Representación 3-D Microscopio electrónico

Tomografía electro-microscópica (EM), o crio-electrónica (CE)

Complejo de Golgi

Complejoproteínicode la cubiertade un retrovirus

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