Microscopía de fluorescencia

Biología Celular 2011

Ignacio Durante – Diana Lauff

La microscopía de fluorescencia

Utilidades

• Visualizar partes de la célula: membrana plasmática, núcleo, vacuolas, retículo endoplásmico, etc.

• Estudiar procesos celulares: división celular, muerte celular, cambios en el potencial de membrana, endocitosis y exocitosis.

• Observar determinados iones, cambios de pH, etc.• Diferenciar partículas muy pequeñas que por contraste de fases no

se resolverían.• Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc• Estudiar la interacción entre moléculas in vivo.

Principio de la microscopía de fluorescencia

Las moléculas fluorescentes (fluoróforos) absorben luz de una dada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda, más larga.

Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro.

La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.

Microscopio de Fluorescencia

Diagrama de Jablonski

Fenómeno de Fluorescencia

E = h . = h . c /

1 – Absorción: Excitación electrónica

2 – Relajación vibracional no radiativa: calor

3 – Relajación radiativa: emisión ( emisión > absorción)

jk

S1

S0

Ea

aa

S1

S0

Ea

aa Ee

1 2 3

S1

S0

Ea

aa

Los fluoróforos tienen espectros de emisión y absorción bien definidos.

Existe una diferencia entre los picos de absorción y emisión de un fluoróforo (corrimiento de Stokes) que depende

de la estructura electrónica del fluoróforo.

Los espectros de absorción y emisiónCorrimiento de Stokes

E = h . = h . c /

Los espectros de absorción y emisión

Los espectros de absorción y emisión

La intensidad de fluorescencia emitida varía con la longitud ( de excitación.

La excitación a la max (A), produce la fluorescencia más intensa (A). El perfil o aspecto del espectro no depende de la de excitación.

http://www.mcb.arizona.edu/IPC/spectra_page.htm

FluoróforosFluoróforos más utilizados: moléculas orgánicas simples y proteínas fluorescentes.

Muchas sondas fluorescentes son construidas en torno a de sustancias químicas sintéticas aromáticas orgánicas diseñadas para unirse a una macromolécula biológica (por ejemplo, una proteína o el ácido nucleico) o localizar dentro de una región específica estructural, como el citoesqueleto, mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplasmático, y el núcleo.

Otras sondas son empleadas para supervisar procesos dinámicos y seguimiento de variables ambientales, incluyendo las concentraciones de iones inorgánicos metálicos, pH, ROS, y el potencial de membrana. Indicadores fluorescentes se utilizan además para comprobar la integridad celular (vivos contra muertos y apoptosis), endocitosis, exocitosis, fluidez de la membrana, el tráfico de una proteína, y la actividad enzimática.

Fluoróforos Orgánicos

Derivados sulfonados de otros fluoróforos

Emiten fluorescencia a una mayor intensidad

Barren todo el espectro

Más estables

Solubles en agua

Alexa – Molecular Probes

Núcleo-DAPI

BRC-230 línea celular

Agardhiella subulata

Célula multinucleadaSchizosaccharomyces pombe

4',6-diamidino-2-phenylindole DAPI

Especies reactivas de oxígeno (ROS)

Dihydrorhodamine 123 (DHR123)

DHR123 + H2O2 R123 + H2OO

Anexina-Apoptosis

Ensayo Anexina V

fluorescein isothiocyanate (FITC)

Ensayo Anexina V

Anexina-Apoptosis

Fluoróforos proteicos

238 aa

Ser65Thr

Fluoróforos proteicos

Espectros de excitación y de emisión

Quenching – Atenuación de la fluorescencia

-Procesos de colisión de los estados excitados que reducen la intensidad de fluorescencia

-Mecanismos:

-Transferencia energética (entre moléculas distintas)

- Reacción química (transferencia de energía como energía de activación)

Photobleaching (fading): es la destrucción, usualmente irreversible, del fluoróforo en el estado excitado. Se pueden producir modificaciones químicas (de uniones covalentes, por ejemplo).

Ocurre en condiciones de alta intensidad de iluminación, y de altos niveles de O2.

¿Cómo evitarlo?

Se minimiza el tiempo de exposición y la energía de excitación.

Se usan detectores altamente sensibles, objetivos y filtros ópticos optimizados.

Comercialmente se han desarrollado productos con menor labilidad ante la estimulación lumínica (por ejemplo los fluoróforos Alexa).También se desarrollaron sustancias “antifade” que reducen el bleaching (Slow Fade, Vecta Shield, etc). Sin embargo estas sustancias no se pueden utilizar en células vivas.

Photobleaching

DAPI (núcleos) - MitoTracker Red (mitocondrias) - Alexa Fluor phalloidin (actina)Fibroblastos de ciervo

Las propiedades de queching y el fotobleaching de un fluoróforo pueden ser utilizadas para estudiar la dinámica y la asociación de estructuras marcadas:

• FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

• FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching)

• FRET (Föster Resonance Energy Transfer)

Usos de Quenching y Photobleaching

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

En FRAP se decolora un área específica por altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación de fluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiempo regulares con la iluminación de intensidad baja. Difusión y movilidad de macromoléculas.

Parámetros cinéticos• La proporción entre fracción móvil e inmóvil. • El coeficiente de difusión eficaz Deff • El tiempo de unión (así como ensamble/desensamble) de proteínas a

estructuras macromoleculares.• Formación de complejos proteicos (baja Deff)

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

El área fluorescente es decolorada, ocurre un decrecimiento inicial de la fluorescencia la cual es recuperada por difusión de los componentes del retículo endoplasmático. Se calculan tiempos de difusión media y la fracción móvil.

tm

FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching)

Estrechamente relacionado con FRAP es la pérdida de fluorescencia en el fotoblanqueo. En experimentos de FLIP una región especificada de la célula repetidamente es decolorada y se observa la pérdida de fluorescencia en las partes no blanqueadas de la célula es medida. Se utiliza para observar movimientos en membranas.

Disociación cinética de DDB2

La proteína DDB2 se une al DNA cuando sufre un daño por radiación UV, comenzando el proceso de reparación. Luego DDB2 se disocia del DNA.

Se fusionó DDB2 a YGFP para ver localización subcelular.

Combinación de FRAP y FLIP

Espacio cromosomal

Espacio NO cromosomal

Determinar la dinámica de la Histona H1 (puntos verdes) entre el núcleo ( con ADN) y el espacio intercromosomal (sin ADN)

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

TRANSFERENCIA DE ENERGIA ENTRE FLUOROCROMOS

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), es una interacción que ocurre solo a muy corta distancia entre dos estados de excitación electrónica de dos moléculas fluorescentes en la que la longitud de onda de emisión de una de ellas coincide con la de excitación de la otra.

1. Las moléculas de aceptor y donante deben estar muy próximas (10-100 Å). 2. El espectro de absorción del aceptor debe solapar- se con el espectro de emisión de fluorescencia del donor.

Donante

Aceptor

FRETIntramolecular

FRETIntermolecular

Controles FRET

Ventajas:

• Trabajar in vitro y con células vivas de mamíferos, no sólo levaduras.

• Alta resolución temporal (milisegundos) y espacial (submicrones).• La interacción con otras proteínas puede darse en cualquier lugar

de la célula, no necesitan ser enviadas al núcleo.

Desventajas:

• Deben expresarse proteínas de fusión, donde ambas partes deben permanecer funcionales.

• Si las PFs están muy distantes unas de otras (a > 80 Aº) o mal orientadas, FRET fallará.

• Incluso sin asociaciones, la superposición de espectros contribuye aporta algo de señal en los de FRET.

• Se necesitan controles positivos y negativos.