microorganismos marcadores en alimentos
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06/12/2011
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Análisis microbiológico de alimentos
Microorganismos marcadores
María Marcela Martínez Miranda
Magister en Microbiología
Departamento de Ingeniería
Universidad de Caldas
En realidad…
• La mayoría de los
alimentos
contienen
microorganismos.
• No es posible el
análisis de todos
los patógenos y de
todos los
alterantes.Marcela Martínez M.Sc.
¿Porqué buscar
microorganismos marcadores?
1. La detección de
patógenos puede ser muy
complicada, muy lenta y/o
muy costosa.
2. La investigación de
patógenos en alimentos
no facilita un enfoque
preventivo.
3. Calidad microbiológica en
términos de
microorganismos
marcadores.Marcela Martínez M.Sc.
Microorganismos marcadores
• Son organismos (o
grupos) que advierten:
– manejo inadecuado
– presencia de
microorganismos
patógenos
• Su detección en el
laboratorio es más
sencilla, rápida y/o
económica.Marcela Martínez M.Sc.
Microorganismos marcadores
• Microorganismos cuya presencia en cantidades o niveles por encima de ciertos límites numéricos indica la posible presencia de patógenos ecológicamente relacionados.
Índices
• Microorganismos cuya presencia en cantidades determinadas indica un tratamiento o procesado de inocuidad inadecuado.
Indicadores
Marcela Martínez M.Sc.
Características de un buen índice de
contaminación en alimentos
1. Origen específico
2. Técnicas de laboratorio
fiables y rápidas
3. Resistencia a
condiciones ambientales
y al procesado tanto o
más que los patógenos a
los cuales representa.
Marcela Martínez M.Sc.
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Un microorganismo marcador dado puede funcionar a la vez como índice y
como indicador.
Por ejemplo, la presencia de cantidades importantes de E. coli en los camarones
precocinados congelados indica:
Un tratamiento de inocuidad
insuficiente cumpliendo de ese modo una función
de indicador
La presencia posible de patógenos entéricos, es decir,
una función de índice para microorganismos de
importancia para la salud pública, como por ejemplo las
shigelas, que se pudieran haber originado en la zona donde fueron tratados los
camarones.
Marcela Martínez M.Sc.
Los principales microorganismos
indicadores en alimentos son:
• Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de
proceso:
– Aerobios Mesófilos
– Psicrófilos y psicrotróficos
– Termófilos o termodúricos
– Mohos y levaduras
– Coliformes totales
• Indicadores de contaminación fecal:
– Coliformes fecales
– E. coli
– Enterococos
– Anaerobios sulfito-reductores Marcela Martínez M.Sc.
Otros microorganismos
indicadores
• Estafilococos coagulasa positiva
(Staphylococcus aureus)
• Recuento de Anaerobios Mesófilos
• Recuento de Anaerobios Esporulados
• Recuento de Virus entéricos
Marcela Martínez M.Sc.
Métodos de análisis microbiológico
• Método: cualitativo
– PRESENCIA / AUSENCIA en
25 g o mL de muestra.
• Salmonella sp.
• Vibrio cholerae
• Listeria monocytogenes
• Método: cuantitativo
– Tubos múltiples: NMP/g o mL
de muestra
– Recuento en placa: ufc/g o mL
a. Por incorporación
b. Por superficie
Marcela Martínez M.Sc.
Indicadores de condiciones de
manejo o de eficiencia de proceso
Aerobios
mesófilos
Psicrófilos y
termófilos
Mohos y
levaduras
Coliformes
totales
Marcela Martínez M.Sc.
Recuento de aerobios mesófilos
(RAM)
Se desarrollan en presencia de aire
a temperaturas medias (25-40°C).
Dan lugar a la formación de colonias
visibles después de 72 horas a 3Oº
C (ó 48 horas a 37ºC) sobre un agar
de recuento, incubado en
condiciones de aerobiosis.
Indican:
la calidad sanitaria de un
alimento.
las condiciones de manipulación.
las condiciones higiénicas de la
materia prima.Marcela Martínez M.Sc.
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Aplicación del RAM
Alimentos
frescos,
refrigerados y
congelados.
Materias primas e
insumos.
Alimentos listos
para consumir.
Marcela Martínez M.Sc.
El RAM NO es útil para:
Alimentos fermentados.
Col acida, queso y otros
derivados lácteos.
Alimentos esterilizados
(Recuento Microscópico
Directo).
Alimentos deshidratados y
congelados (Recuento
Microscópico Directo).
Alimentos refrigerados
(Recuento de
psicrotróficas).
Marcela Martínez M.Sc.
Existen dos métodos clásicos para
el recuento de aerobios mesófilos
Marcela Martínez M.Sc.
RAM por el método de siembra a
profundidad
Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h)
Marcela Martínez M.Sc.
Un RAM elevado indica:
En alimentos estables
– Materias primas muy contaminadas.
– Tratamiento no satisfactorio.
En alimentos perecederos
– Materias primas muy contaminadas.
– Tratamiento no satisfactorio.
– Almacenamiento en condiciones de
temperatura inadecuadas.
Marcela Martínez M.Sc.
Un RAM elevado puede significar:
1. Excesiva contaminación
de la materia prima.
2. Deficiente manipulación
durante el proceso de
elaboración.
3. La posibilidad de que
existan patógenos, pues
éstos son mesófilos.
4. La inmediata alteración
del producto.
Marcela Martínez M.Sc.
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Psicrotróficos
• Por definición son
organismos que producen
crecimiento visible a 7o C
1o C dentro de 7 a 10
días, independiente de su
temperatura de crecimiento
óptima.
• Los organismos
mayormente asociados con
alimentos refrigerados y
que causan daño son
psicrotróficos y no
psicrofílicos
Marcela Martínez M.Sc.
Psicrotróficos
Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram positivos y gram negativos; aeróbos; anaerobios y anaerobios facultativos.
– Aeromonas
– Bacillus
– Clostridium
– Lactobacillus
– Escherichia
– Listeria
– Serratia, ect.
– Hongos y levaduras
Marcela Martínez M.Sc.
Psicotróficos patógenos
Patógenos
– Aeromonas hydrophila
– Bacillus cereus (algunas
cepas)
– Clostridium botulinum type E,
B y F
– Listeria monocytogenes
– Vibrio cholerae
– Yersinia enterocolítica
– Escherichia coli (algunas
cepas)
Marcela Martínez M.Sc.
Psicrotróficos
Métodos de detección
• Cultivo durante 10 días a 7oC para siembra en profundidad.
• Cultivo durante 7-8 días a 7o C para siembra en superficie
• Cultivo durante16 hr a 17O C seguido de 3 días a 7oC
Marcela Martínez M.Sc.
Termodúricos
Organismos que
pueden tolerar calor y
por consiguiente
tienen la capacidad
de sobrevivir
pausterización. Son
capaces de sobrevivir
el calentamiento de
un alimento a
temperaturas de 60 a
80OC.Marcela Martínez M.Sc.
Termodúricos
Género Alimento asociado
Actinomycetes Leche
Alcaligenes Leche
Arthrobacter Leche
Bacillus Leche/huevos
Clostridium Leche
Coryneform Huevos
Lactobacillus Leche/carne/jugos
Microbacterium Leche
Micrococcus Leche/huevos
Pseudomonas Huevos
Streptococcus/
Enterococcus
Leche/carne/huevoMarcela Martínez M.Sc.
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Coliformes
Bacilos Gram negativos
No esporulados
Aerobios o anaerobios
facultativos
Fermentan la lactosa a 35⁰Ccon producción de ácido y
gas
Viven en el ambiente y en
animales de sangra caliente
Los coliformes totales
incluyen los fecales
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Son algunas especies que
pertenecen a los géneros:
Género Fuente
EscherichiaHeces (humanas y
animales)
Klebsiella Heces, ambiente
Enterobacter Heces, ambiente
Citrobacter AmbienteMarcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Coliformes como indicadores de
contaminación fecal
• Se encuentran en el intestino del hombre y de
animales, pero también en otros ambientes
como: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.
• Son útiles como indicadores de contaminación
fecal por:
– Su frecuencia en heces
– Su fácil detección en el laboratorio
– Sus características semejantes a algunos miembros
patógenos de la familia EnterobacteriaceaeMarcela Martínez M.Sc.
Aplicación del uso de Coliformes
como indicadores
1. Detección de prácticas sanitarias deficientes en el
manejo y en la fabricación de los alimentos.
2. Evaluación de la calidad microbiológica de un
producto.
3. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias
e higiénicas en el equipo.
4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de
agua utilizados en las diferentes áreas del
procesamiento de alimentos.Marcela Martínez M.Sc.
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Pruebas de determinación de
Coliformes1. Investigación y recuento en
medio líquido
• Se usa el Caldo
lactosado biliado verde
brillante (Brilliant Green
Bile Lactose: BGBL)
2. Investigación y recuento en
medio sólido
• Se utiliza el medio
selectivo agar biliado
rojo-violeta (Violet Red
Bile Agar: VRBA)
Marcela Martínez M.Sc.
Pruebas para detección y
recuento de Coliformes
1. Prueba presuntiva
– Caldo Lauril Triptosa (CLT).
– Caldo Mc. Conkey.
– Caldo lactosado bilis verde brillante.
2. Prueba confirmativa:
– Medio EC.
– Medio bilis lactosa (BLVB)
Marcela Martínez M.Sc.
Investigación y recuento en
medio sólido
Coliformes totales
en placas de agar
bilis rojo violeta,
incubadas por 24 h
a 35 ºC
UFC/g (o/mL) de
muestra.
Marcela Martínez M.Sc.
Coliformes fecales (CF)
Origen intestinal
Pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae
Bacilos Gram negativos,
anaerobios facultativos, no
esporulados.
Fermentadores de lactosa a
44.5 °C con producción de gas.
Principalmente Escherichia coli
(90%)Marcela Martínez M.Sc.
Determinación de CF
Su determinación se hace a partir de la segunda etapa
(confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo
lactosado con incubación a 44.5 °C.Marcela Martínez M.Sc.
Escherichia coli (coliformes
termotolerantes)
• Capacidad para producir
indol a partir de triptófano
• Producción de la enzima β-
glucuronidasa.
• Es el índice de
contaminación fecal más
adecuado.
• Hay grandes cantidades de
Escherichia coli en las
heces humanas y
animales.Marcela Martínez M.Sc.
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Determinación de E. coli
• Métodos basados en:
– Producción de ácido y gas a partir
de la lactosa.
– Producción de la enzima β-
glucuronidasa.
• Los procedimientos incluyen:
– Filtración con una membrana que
después se incuba en medios
selectivos a 44–45 °C.
– «número más probable»Marcela Martínez M.Sc.
Recuento de Enterobacterias
• Familia
Enterobacteriaceae
• Lactosa + y lactosa -
• Se usan como grupo
indicador en lugar del
grupo de coliformes
totales.
• Son de origen fecal y
no fecal.
Marcela Martínez M.Sc.
Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias
como indicadoras en lugar de los coliformes
1. Los coliformes son un
grupo mal definido
taxonómicamente.
2. Los coliformes solo
tienen en cuenta las
enterobacterias
lactosa positiva.
3. Las Enterobacterias
son mas resistentes
que los coliformes.
Marcela Martínez M.Sc.
Qué indica niveles altos de Enterobacteiras en
alimentos procesados?
• Tratamiento inadecuado y/o
contaminación posterior al
tratamiento; más
frecuentemente a partir de
materias primas, equipos
sucios o manejo no
higiénico
• Multiplicación microbiana
que pudiera haber permitido
el crecimiento de toda la
serie de microorganismos
patógenos y toxigénicos.
Marcela Martínez M.Sc.
Métodos para el recuento de
Enterobacterias
• Método de
recuento
– Recuento en
placa
– Recuento en
medio líquido
• Método de
ausencia
presencia
VRBG Agar
Confirmación con
prueba de oxidasa
Marcela Martínez M.Sc.
Estreptococos fecales
Enterococcus• Se encuentran en las heces
de los humanos y animales
de sangre caliente.
• Animales de producción:
vaca, cerdo, oveja, caballo,
gallina y pato.
• Son importantes en
situaciones donde se sabe
que hay contaminación
fecal y no se detectan
coliformes.
Marcela Martínez M.Sc.
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Uso de Enterococcus como
indicadores en alimentos
• Aunque se encuentran
en cantidades menores
que E. coli, son mas
resistentes.
• Se consideran
indicadores en alimentos
procesados, como
lácteos y cárnicos, en
los cuales E. coli no
puede sobrevivir.
Marcela Martínez M.Sc.
Especies de Enterococcus
Grupo Especies Hábitat
Grupo 1
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus durans
están normalmente
presentes en las heces de
humanos y animales
Grupo 2
Streptococcus bovis
Streptococcus equinus
Enterococcus avium
no se encuentran
comúnmente en las heces
humanas
Marcela Martínez M.Sc.
Clostridium sulfito reductores
• Bacterias Grampositivas,
esporuladas, anerobias,
reductoras de sulfitos.
• Se utilizan como
indicadores de
contaminación fecal
antigua.
• Clostridium perfringens es
de origen fecal y también se
encuentra ampliamente
distribuida en la naturaleza.
Marcela Martínez M.Sc.
Recuento de esporas de Clostridium
sulfito reductores
Se pesan 10g o ml y se homogenizan
con 90ml de peptona 0.1%
Se realizan diluciones seriadas en
9ml peptona 0.1%
Marcela Martínez M.Sc.
Choque térmico para formación de
esporas
Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10
minutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas.
Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.Marcela Martínez M.Sc.
Siembra en fondo en agar SPS
Se siembra 1ml en fondo de la dilución
que ha sido sometida a choque térmico
y se agrega el medio SPS caliente.Marcela Martínez M.Sc.
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Incubación en anaerobiosisSe llevan a incubar las cajas en cámara
de anaerobiosis por 72 horas a 37 C,
con sobre generador de anaerobiosis e
indicador atmosférico.
Marcela Martínez M.Sc.
Mohos y levaduras
• Crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que
conservan humedad.
• Las levaduras crecen mas rápidamente que los mohos, pero con frecuencia
junto a ellos.
• Mohos son aerobios estrictos.
• Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentación).
hongos filamentososUnicelulares
Marcela Martínez M.Sc.
Mohos y levaduras en alimentos
Importantes en alimentos
ácidos y en los de baja
actividad de agua:
– Frutas frescas
– Jugos
– Vegetales
– Quesos
– Cereales
– Alimentos salazonados
– Encurtidos
– Alimentos congelados y
deshidratados Marcela Martínez M.Sc.
Recuento de mohos y levaduras
• Se desarrollan en
condiciones de aerobiosis.
• A temperaturas que varían
entre 20 y 30⁰C.
• Crecen más lentamente
que las bacterias.
• Los medios de cultivo
deben favorecer su
desarrollo pero no el de las
bacterias.
Marcela Martínez M.Sc.
Medios de cultivo para mohos
Agar de Sabouraud
Agar papa dextrosa
Agar extracto de malta
Agar Czapek-Dox
Agar Micosel o micobiótico
BHI + antibióticos
BHIMarcela Martínez M.Sc.
Recuento de mohos y levaduras
Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC – 100 UFC
Se reportan indistintamente mohos y levaduras
Marcela Martínez M.Sc.
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“La misión de la vida es descubrir la vocación y luego entregarse a ella con todo el corazón”
BudaMarcela Martínez M.Sc.