Métodos espectroscópicos para la caracterización de macromoléculas biológicas

• Interacción de radiación electromagnética con la macromolécula en estudio

• Se usa amplio rango del espectro electromagnético (desde radiofrecuencia hasta RX)

• Cada una aporta distinta información estructural

Regiones útiles en espectroscopía de biopolímeros

Técnicas espectroscópicas

• ABSORCIÖN (UV-VIS, IR)

• EMISIÓN (fluorescencia)

• DISPERSIÓN ( Raman)

• DIFRACCIÓN ( Rayos X)

• Luz polarizada (dicroismo circular)

• Resonancia (RMN, EPR)

Absorción en el uv-vis 100 - 400 nm UV transición electrónica

400 – 700 nm VISIBLE

Absorción en el infrarrojo 700 nm – 2.5 μ transición vibracional

Aplicaciones de la espectroscopía de absorción uv-vis

• Cualitativa, Identificación de cromóforos por el espectro

A vs

• Cuantitativa, medir la concentración del cromóforo

A = ε b C

Las proteínas absorben en el uv-vis?

ABSORBANCIA

max (nm)

ε (M-1 cm-1)

Triptofano 278

287

5600

4500

Tirosina 275 1400

Fenilalanina 258 200

Espectro de BSA 0.45 µM en buffer fosfato pH 7.0

Espectro de absorción uv

de una proteína, seroalbúmina bovina (BSA)

Espectro de absorción uv de seroalbúmina bovina BSA

Absorción uv-vis de Proteínas

Absorción en el uv de residuos aromáticos

Estimación del coeficiente de absortividad molar de una proteína

ε 280 (M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS)

n(Trp) = número residuos de triptofano en la secuencia

n(Tyr) = número residuos de tirosina en la secuencia

n(SS) = número de enlaces disulfuro en la proteína

Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm

Titulación espectrofotométrica de Ribonucleasa pancréatica bovina

RNasa tiene 6 residuos de tirosina

Espectro uv de la RNasa en función del pH

Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm

RNasa tiene 6 residuos de tirosina.

El resultado muestra que unas 3 tirosinas se titulan reversiblemente con un pKa = 10.2

Las otras 3 tirosinas no se titulan hasta alcanzar un pH más elevado que provoca la desnaturalzicación de la proteína

Absorción a 295 nm en función del pH

Los ácidos nucleicos, absorben en el uv-vis?

Absorción en el UV lejano de los ácidos nucleicos

Cromóforo, responsable de la absorción, las bases nitrogenadas

Diferencias en estructura secundaria, afecta el espectro de absorción uv?

Cuando tenemos más de un grupo que absorbe:

La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción

Polipéptido con estructura “ovillo estadístico”, es el espectro de una amida (―).

Polipéptido con estructura α-hélice (…) que tiene grupos amida orientados y que interaccionan unos con otros, el espectro cambia: banda a 195 nm menos intensa y hombro a 205 nm

Inserto: Espectro de absorción uv de RNasa nativa y desnaturalizada (8 M urea)

Espectro diferencial

Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv

Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv

Cambios de absorción de RNase a 286 nm y 292 nm al aumentar la temperatura

Cuando tenemos más de un grupo que absorbe:

La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción

Espectro de absorción uv de ADN de doble cadena (línea sólida), ADN cadena simple (línea de trazos) y tras hidrólisis hasta obtener nucleótidos libres (línea punteada). Todos los espectros a igual concentración de bases.

HIPOCROMISMO

Aplicación del efecto hipocrómico para seguir desnaturalización de ADN

Al perder estructura secundaria, los residuos nucleotídicos pierden rigidez, se desordenan, entonces la intensidad de absorción a 260 nm aumenta (se pierde efecto hipocrómico).

Se determina Tm (temperatura a la cual la mitad de ADN se desnaturalizó)

Cambios espectrales por perturbación del solvente

A) Triptofano (N-acetil éster)(a),Tirosina (b), Fenilalanina (c) en agua (línea sólida) o en 20%DMSO (línea punteada)

B) Espectros diferenciales

Aplicaciones espectroscopía de absorción uv-vis

• Identificación• Cuantificación• Cinética• Determinación de parámetros estructurales:

desnaturalización

ubicación de residuos

ionización de residuos

asociación con ligandos