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8/18/2019 Métodos de estudio I Microscopía.pdf

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Métodos de estudio en

Biología Celular I

BIO-002 s7-s8 1_2014MICROSCOPÍA


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¿Qué es un microscopio?

Instrumento [óptico] que permite observar objetosextremadamente pequeños, generando imágenes deellos que nuestra vista puede percibir.

Todos los tipos de microscopios producen imágenes,pero los mecanismos empleados para generarlas sondiversos.

En los casos que nos ocuparán, los diferentes tipos demicroscopios se definen básicamente de acuerdo a laclase de radiación electromagnética que emplean paragenerar las imágenes.


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Tipos de microscopios que nos ocuparán:

• Microscopios de luz que operan en el espectrovisible o en sus cercanías: microscopio ordinario,microscopio de contraste de fase, microscopio defluorescencia, microscopio confocal.

• Microscopios electrónicos:

- de transmisión (MET),

• - y de barrido (MEB).


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0,1 - 0,2 mm

ESCALA


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Hígado de rata observado en dos condiciones con el microscopio ordinario


7/33Microscopio de luz Microscopio electrónico de transmisión


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Hepatocito de rata visto medianteel microscopio electrónicode transmisión, con aumentocercano a 15.000 X


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RESOLUCIÓN (poder separador) DEL MICROSCOPIO

0,6P.R. = -------------

N sen /2

1) debe ser lo más pequeño posible, extremo azul del espectro, aprox. 500 nm.

2) N debe ser lo más grande posible: objetivos de inmersión. Límite aprox. = 1,6

3) 2 debe ser lo mayor posible, pero sen 2 tiene un valor máximo

Ojo humano 0,2 mmMicroscopio de luz visible 0,2 m Aumento: 1.000 xM. electrónico de transmisión 0,2 nm Aumento: 1.000.000 x

0,6 = constante= longitud de onda (luz)

N = índice de refracción (???)

N sen /2 = A.N. (apertura numérica)

Para que el valor P.R. sea lo más PEQUEÑO posible (máxima resolución) :

La distancia más pequeña entredos puntos que con el microscopiovemos como puntos separados.

(mide distancia,espacio, y seexpresa conunidades delongitud)


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Cada una de las esferitas

(flecha roja) que parecenformar las estructurastubulares que se visualizancorresponde a una moléculade la proteína TUBULINA(masa molecular = 60 kDa)

Corte transversal por elaxonema de un cilio, MET


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Músculo esquelético al MET


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Preparación de especímenes


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Rejilla portaobjetos del MET

¿Qué problema plantea el reducido tamaño del espécimen?


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Microscopio electrónico de barrido (MEB)


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Esquema microscopio electrónico de barrido (MEB)


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Coágulo sanguíneo


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GRANOS DE POLEN Y TUBOS POLÍNICOS, (MEB)


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Piel humana,teñida conhematoxilina(colorante básicoo catiónico) yeosina (coloranteácido o aniónico).El contrastegenerado poresta doble tinciónpermite visualizarestructuras que

de otro modoseríantranslúcidas.


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Obtención de cortes

para microscopía deluz visible


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Tejido exocrino

Tejidoendocrino

Ac

Colorantes básicos o catiónicos, que se unen a los aniones; colorantes ácidos oaniónicos, que se unen a los cationes.


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La interacción entreondas fuera de fase sellama “interferencia”,

la que al crear zonasbrillantes y oscurasgenera contraste.Este contraste sellama “CONTRASTEDE FASE”.


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GFP !

Para contrastarestructuras se puedeemplear también un tipode colorantes llamados“fluorocromos”, que secaracterizan por emitirluz de un color distinto alde la luz utilizada parailuminar la preparación.

La luz usada para iluminar(excitar) debe ser delongitud de onda máscorta (más energética)

que la luz que emitiráluego el fluorocromo.La microscopía que empleafluorocromos es lallamada microscopía defluorescencia.


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Microscopio de fluorescencia (luz incidente)


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Inmunomarcación indirecta

Anticuerpos primarios Anticuerpos secundarios

Anticuerpos primarios: dirigidos contra el antígeno de interés, y no marcados

Anticuerpos secundarios: dirigidos contra los anticuerpos primarios y marcados con fluorocromo

Esquema del libro de Alberts y colaboradores


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Tubulogénesis en células gástricas de rata en cultivo

Inmunomarcaje indirecto con anticuerpos secundarios marcados con

FLUORESCEÍNA (verde).



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Anticuerpos secundarios marcados con tetrametil rodamina (rojo)


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Principio confocal

.. Todos los rayos que se originan en planosubicados por encima o por debajo del plano focalserán detenidos por la apertura confocal.

En consecuencia, la imagen se formará solo conrayos que provienen del plano focal.


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Imágenes microscopio confocal


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Non-ConfocalConfocal

Comparación de microscopía de fluorescencianormal y microscopía confocal

Non-Confocal Non-ConfocalConfocal Confocal

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