mecanismos de control de los niveles de ácido araquidónico
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FACULTAD DE MEDICINA
Dpto. ANATOMÍA PATOLÓGICA, MICROBIOLOGÍA,
MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA, MEDICINA
LEGAL Y FORENSE
Mecanismos de control de los niveles de ácido
araquidónico en monocitos y macrófagos
TESIS DOCTORAL
Alma María Astudillo del Valle
Valladolid, 2011
FACULTAD DE MEDICINA
Dpto. ANATOMÍA PATOLÓGICA, MICROBIOLOGÍA,
MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA, MEDICINA
LEGAL Y FORENSE
Mecanismos de control de los niveles de ácido
araquidónico en monocitos y macrófagos
TESIS DOCTORAL
Presentada por Alma María Astudillo del Valle para optar al grado de Doctor
por la Universidad de Valladolid, bajo la dirección del Dr. Jesús Balsinde
Rodríguez y la Dra. María Ángeles Balboa García en el Instituto de Biología y
Genética Molecular (CSIC-UVa).
Valladolid, 2011
Toda la ciencia de esta tierra no me dará nada que pueda asegurarme que este mundo es mío.
Me lo describís y me enseñáis a clasificarlo. Me enumeráis sus leyes y en mi sed de saber
consiento en que sean ciertas. Desmontáis su mecanismo y mi esperanza aumenta. En último
término, me enseñáis que este universo prestigioso y abigarrado se reduce al átomo y que el
átomo mismo se reduce al electrón. Todo esto está bien y espero que continuéis. Pero me
habláis de un invisible sistema planetario en el que los electrones gravitan alrededor de un
núcleo. Me explicáis este mundo con una imagen. Reconozco entonces que habéis ido a parar a
la poesía: no conoceré nunca. Esta ciencia que debía enseñármelo todo termina en la hipótesis,
esta lucidez naufraga en la metáfora, esta incertidumbre se resuelve en obra de arte.
El mito de Sísifo, Albert Camus
(El sabio) No se da importancia, y por lo tanto llega a destacar.
No se exhibe, y por lo tanto brilla.
No se jacta, y por lo tanto se le reconoce su mérito.
No alaba sus propias hazañas y, por lo tanto, llega lejos.
Actúa sin actuar,
sirve sin preocuparse por los asuntos,
halla sabor en lo que carece de él.
Contempla lo pequeño como grande y a los pocos como muchos,
y corresponde al rencor con amabilidad.
Planea la solución de lo difícil mientras es fácil.
Actúa sobre lo grande mientras es minúsculo.
Las cosas más grandes del mundo surgen de lo minúsculo.
Así pues, el Sabio no se esfuerza hasta el final por hacer lo grande,
y el resultado es que puede realizar lo grande.
Los pocos confiarán necesariamente
en quienes se muestran de acuerdo demasiado a la ligera,
y quienes consideran muchas cosas como fáciles
acabarán necesariamente por tener muchas dificultades.
Así pues, incluso el Sabio considera las cosas como difíciles
y, por lo tanto, al final no tiene ninguna dificultad.
Tao Te Ching, Lao Tsé
Mi agradecimiento a mis directores, el Dr.
Jesús Balsinde Rodríguez y la Dra. María
Ángeles Balboa García, por brindarme la
oportunidad de realizar este trabajo, y por
su tutela durante estos años.
A todos mis compañeros de laboratorio y
amigos, por su ayuda, apoyo, ánimo y
alegría durante esta etapa.
Dedico este trabajo a mi familia, y a David.
Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de una beca de Formación de
Personal Investigador de la Comunidad de Castilla y León (Orden O.EDU/1878/2006).
El trabajo realizado durante estos años ha dado lugar a las siguentes publicaciones
científicas:
Barroso, E., Rodríguez-Calvo, R., Serrano-Marco, L., Astudillo, A. M., Balsinde, J., Palomer, X., and Vázquez-Carrera, M. 2011. The PPAR/ activator GW501516 prevents the down-regulation of AMPK caused by a high-fat diet in liver and amplifies the PGC-1-lipin 1-PPAR pathway leading to increased fatty acid oxidation. Endocrinology. 152: 1848-1859.
Astudillo, A. M., Pérez-Chacón, G., Balgoma, D., Gil-de-Gómez, L., Ruipérez, V., Guijas, C., Balboa, M. A., and Balsinde, J. 2011. Influence of cellular arachidonic acid levels on phospholipid remodeling and CoA-independent transacylase activity in human monocytes and U937 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1811: 97-103.
Balgoma, D., Astudillo, A. M., Pérez-Chacón, G., Montero, O., Balboa, M. A., and Balsinde, J. 2010. Markers of monocyte activation revealed by lipidomic profiling of arachidonic acid-containing phospholipids. J. Immunol. 184: 3857-3865.
Pérez-Chacón, G., Astudillo, A. M., Ruipérez, V., Balboa, M.A., and Balsinde, J. 2010. Signaling role for lysophosphatidylcholine acyltransferase 3 in receptor-regulated arachidonic acid reacylation reactions in human monocytes. J. Immunol. 184: 1071-1078.
Astudillo, A. M., Pérez-Chacón G., Balboa M. A., and Balsinde J. 2009. Arachidonic acid mobilization by stimuli of the innate immune response. Inmunología. 28: 182-192.
Pérez-Chacón, G., Astudillo, A. M., Balgoma, D., Balboa, M. A., and Balsinde, J. 2009. Control of free arachidonic acid levels by phospholipases A2 and lysophospholipid acyltransferases. Biochim. Biophys. Acta. 1791: 1103-1113.
Ruipérez, V., Astudillo, A. M., Balboa, M. A., and Balsinde, J. 2009. Coordinate regulation of TLR-mediated arachidonic acid mobilization in macrophages by group IVA and group V phospholipase A2s. J. Immunol. 182: 3877-3883.
Herrero, A. B., Astudillo, A. M., Balboa, M. A., Cuevas, C., Balsinde, J., and Moreno, S. 2008. Levels of SCS7/FA2H-mediated fatty acid 2-hydroxylation determine the sensitivity of cells to antitumor PM02734. Cancer Res. 68: 9779-9787.
ÍNDICE
1. ABREVIATURAS ........................................................................... 15
2. INTRODUCCIÓN .......................................................................... 21
2.1. LA RESPUESTA INMUNE INNATA .................................................. 23
2.2. METABOLISMO DE ÁCIDO ARAQUIDÓNICO ...................................... 25
2.2.1. Rutas de incorporación de AA en PL ....................................... 26
2.2.2. Enzimas de incorporación y remodelación de AA ........................ 29
2.2.3. Síntesis de eicosanoides y funciones biológicas ......................... 49
2.2.4. Estimulación celular y liberación de AA .................................. 55
2.3. CAVEOLAS Y CAVEOLINA 1 ........................................................ 56
3. OBJETIVOS ................................................................................ 59
4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................... 63
4.1. MATERIALES ......................................................................... 65
4.1.1. Material químico y biológico ................................................ 65
4.1.2. Células y animales ............................................................ 69
4.2. MÉTODOS ............................................................................ 70
4.2.1. Aislamiento de células, cultivo y ensayos in vivo ....................... 70
4.2.2. DNA y RNA ..................................................................... 73
4.2.3. Análisis de lípidos ............................................................. 76
4.2.4. Proteínas ....................................................................... 81
4.2.5. Medición de población granulocítica mediante citometría de flujo .. 84
4.2.6. Otras técnicas ................................................................. 84
4.2.7. Análisis de datos .............................................................. 85
5. RESULTADOS ............................................................................. 87
5.1. FUNCIÓN DE LPCAT3 EN LAS REACCIONES DE REACILACIÓN DE AA REGULADAS POR RECEPTOR ...................................................... 89
5.1.1. Liberación e incorporación de AA en PL de monocitos estimulados con zimosán ................................................................... 89
5.1.2. Rutas de incorporación de AA en PL durante la estimulación celular 97
5.1.3. Implicación de la cPLA2 en la incorporación de AA en PL en monocitos estimulados con zimosán ..................................... 101
5.1.4. Incremento de la actividad LPLAT en monocitos estimulados con zimosán ....................................................................... 103
5.1.5. Regulación de la LPCAT3 en células estimuladas ....................... 105
5.2. INFLUENCIA DE LOS NIVELES CELULARES DE AA EN LA REMODELACIÓN Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CoA-IT EN MONOCITOS Y U937 ................... 111
5.2.1. Caracterización de la incorporación y remodelación de AA en monocitos y U937 ............................................................ 111
5.2.2. Análisis mediante HPLC-MS de las especies de PL que incorporan [2H]AA ......................................................................... 115
5.2.3. Influencia de la diferenciación celular en la incorporación y remodelación de AA ......................................................... 117
5.2.4. Influencia del contenido endógeno de AA en su velocidad de remodelación ................................................................. 119
5.2.5. Variación de la actividad enzimática CoA-IT con el contenido endógeno de AA .............................................................. 124
5.3. EFECTO DE LA CAV-1 SOBRE EL METABOLISMO DE AA DE MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN ........................................................ 126
5.3.1. Incorporación de ácidos ..................................................... 126
5.3.2. Incorporación [2H]AA en especies de PL ................................. 130
5.3.3. Análisis de las especies endógenas de PC, PE y PI mediante HPLC-MS ....................................................................... 132
5.3.4. Incremento de la actividad CoA-IT en células sin cav-1 ............... 138
5.3.5. Análisis de ácidos grasos por GC-MS ...................................... 139
5.3.6. Análisis de AA en PL en macrófagos estimulados con zimosán mediante GC-MS ............................................................. 140
5.3.7. Infiltración de neutrófilos en peritonitis inducida con zimosán ...... 144
6. DISCUSIÓN ............................................................................... 147
6.1. FUNCIÓN DE LPCAT3 EN LAS REACCIONES DE REACILACIÓN DE AA REGULADAS POR RECEPTOR ..................................................... 149
6.2. INFLUENCIA DE LOS NIVELES CELULARES DE AA EN LA REMODELACIÓN Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CoA-IT EN MONOCITOS Y U937 ................... 153
6.3. EFECTO DE LA CAV-1 SOBRE EL METABOLISMO DE AA DE MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN ........................................................ 156
7. CONCLUSIONES .......................................................................... 161
8. REFERENCIAS ............................................................................ 165
1. ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
17
................................ Absorbancia
AA .............................. Ácido araquidónico (20:4n-6)
ACSL ............................ Acil coenzima A sintetasa de cadena larga
ACSM ........................... Acil coenzima A sintetasa de cadena media
ACSS ............................ Acil coenzima A sintetasa de cadena corta
ACSVL .......................... Acil coenzima A sintetasa de cadena muy larga
ACSBG .......................... Acil CoA sintetasa “bubblegum”
AGPAT ......................... Acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa
AMP ............................ Adenosina monofosfato
Asp ............................. Ácido aspártico
ATP ............................. Adenosina trifosfato
BEL ............................. Bromoenol lactona
BSA ............................. Albúmina de suero bovino
Cav ............................. Caveolina
cDNA ........................... Ácido desoxirribonucleico complementario
CoA ............................. Coenzima A
CoA-IT ......................... Transacilasa independiente de coenzima A
COX ............................. Ciclooxigenasa
cPLA2 ........................... Fosfolipasa A2 citosólica dependiente de Ca2+
CYP ............................. Citocromo P450
DAG ............................ Diacilglicerol
DAPI ............................ 4’, 6-diamidino-2-fenilindol
DGLA ........................... Ácido dihomo -linolénico (20:3n-6)
DHA ............................ Ácido docosahexaenoico (22:6n-3)
DHET ........................... Ácido dihidroxieicosatetraenoico
D.I. ............................. Diámetro interno
DMSO ........................... Dimetil sulfóxido
DNA ............................ Ácido desoxirribonucleico
DPPC ........................... 1,2-dipalmitoil-3-fosfocolina
DTT ............................. 1,4-Ditiotreitol
dNTPs .......................... Mezcla de deoxinucleótidos trifosfato
ECL ............................. Sistema de aumento de quimioluminiscencia
EDTA ........................... Ácido etilendiaminotetraacético
EI ............................... Impacto electrónico
ESI .............................. Ionización por electrospray
ELISA ........................... Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas
ABREVIATURAS
18
EPA ............................. Ácido eicosapentaenoico
EET .............................. Ácido epoxieicosatetraenoico
FA ............................... Ácido graso
FAM ............................. amidato de fluoresceína
6-FAM ........................... 6-carboxifluoresceína
FAME ............................ Metil éster de ácido graso
FABPpm ........................ Proteína de unión a ácido graso de la membrana
plasmática
FATP ............................ Proteína transportadora de ácidos grasos
Fc ............................... Fragmento cristalizable
FITC ............................. Isotiocianato de fluoresceína
FBS .............................. Suero fetal bovino
GAPDH .......................... gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
GC/MS .......................... Cromatografía de gases acoplada a espectrómetría de
masas
GLA ............................. Ácido -linolénico (18:3n-6)
GM-CSF ......................... Factor de estimulación de la colonia de granulocitos y
macrófagos
H2O DEPC ...................... Agua tratada con dietilpirocarbonato
HETE ............................ Ácido hidroxieicosatetranoico
His .............................. Histidina
HpETE .......................... Ácido hidroperoxieicosatetraenoico
HPLC/MS ....................... Cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a
espectrometría de masas
HX ............................... Hepoxilina
IgG .............................. Inmunoglobulina G
IL ................................ Interleuquina
iPLA2 ............................ Fosfolipasa A2 citosólica independiente de Ca2+
KM ............................... Constante de Michaelis-Menten
KO ............................... knockout (carente de gen)
LisoPA .......................... Ácido lisofosfatídico
LisoPC .......................... Lisoglicerofosfolípidos de colina
LisoPE .......................... Lisoglicerofosfolípidos de etanolamina
LisoPI ........................... Lisofosfatidilinositol
LisoPL .......................... Lisoglicerofosfolípido
LO ............................... Lipoxigenasa
ABREVIATURAS
19
LPAAT .......................... LisoPA:acil-CoA aciltransferasa
LPCAT .......................... LisoPC:acil-CoA aciltransferasa dependiente de CoA
LPEAT .......................... LisoPE:acil-CoA aciltransferasa dependiente de CoA
LPIAT ........................... LisoPI:acil-CoA aciltransferasa dependiente de CoA
LPS ............................. Lipopolisacárido
LT ............................... Leucotrieno
m/z ............................. Relación masa carga
M-CSF .......................... Factor de estimulación de colonias de macrófagos
MAPK ........................... Proteína quinasa activada por mitógenos
MBOAT ......................... Aciltransferasas unidas a membrana
MEF.............................. Fibroblastos embrionarios de ratón
MRM ............................ Monitorización de reacciones múltiples
NIST ............................ Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (USA)
Olc .............................. Ácido oleico (18:1n-9)
OxoETE ........................ Ácido oxoeicosatetraenoico
PAF ............................. Factor activador de plaquetas
PAF-AH ......................... Acetilhidrolasas del factor activador de plaquetas
Pam ............................ Ácido palmítico (16:0)
PBS ............................. Tampón fosfato salino
PC .............................. Glicerofosfolípido de colina
PCR ............................. Reacción en cadena de la polimerasa
PE ............................... Glicerofosfolípido de etanolamina
PG .............................. Prostaglandina
PI ............................... Fosfatidilinositol
Pir .............................. Pirrofenona
PL ............................... Glicerofosfolípido
PLA2 ............................ Fosfolipasas A2
pNPP ........................... Fosfato de paranitrofenilo
PMA ............................ Forbol 12-miristato-13-acetato
PMSF ........................... Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
PS ............................... Glicerofosfolípido de serina
Q-PCR .......................... PCR cuantitativa
R1 ............................... Resto hidrocarbonado en la posición sn-1 del glicerol
R2 ............................... Resto hidrocarbonado en la posición sn-2 del glicerol
RE .............................. Retículo endoplásmico
Rf ............................... Factor de retención
ABREVIATURAS
20
PAMP ........................... Patrones moleculares asociados a patógenos
PIP .............................. Fosfoinosítido
PPR ............................. Receptores de reconocimiento de patógenos
PTFBA .......................... Perfluorotributilamina
RNA ............................. Ácido ribonucleico
rpm ............................. Revoluciones por minuto
RT ............................... Transcriptasa reversa
RT-PCR ......................... PCR en tiempo real
Ser .............................. Serina
SIM .............................. Monitorización de iones seleccionados
siRNA ........................... RNA de interferencia
sPLA2 ........................... Fosfolipasa A2 secretada
Tª ................................ Temperatura
TAE ............................. Tampón para electroferesis en geles de agarosa
TAG ............................. Triacilglicerol
TLC ............................. Cromatografía en capa fina
TLR ............................. Receptor Toll-like
TX ............................... Tromboxano
u.a. ............................. Unidades arbitrarias
U ................................ Unidad
UV ............................... Luz ultravioleta
v ................................. Volumen
Vmax .............................. Velocidad máxima
Vo ................................ Velocidad inicial
WT .............................. wild type (control)
2. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
23
2.1. LA RESPUESTA INMUNE INNATA La respuesta inmune se puede dividir en dos tipos: la inmunidad adaptativa o
específica y la inmunidad innata o inespecífica. La primera es una respuesta compleja
que se basa en la formación de receptores de superficie de linfocitos, generados por
reorganización de genes sometidos a hipermutaciones somáticas cuya función es
reconocer una gran variedad de antígenos. Por el contrario, la inmunidad innata o
inespecífica está presente en la casi totalidad de organismos multicelulares y constituye
la primera línea de defensa frente a patógenos invasores.
Los mecanismos de respuesta inmune innata tienen la capacidad de reconocer
directamente una amplia variedad de patógenos a través de un gran repertorio de
receptores, denominados receptores de reconocimiento de patógenos (PPRs) [1], los
cuales se codifican en la línea germinal. Los PPRs reconocen patrones moleculares
conservados de organismos extraños, también conocidos como patrones moleculares
asociados a patógenos (PAMPs), que son capaces de activar directamente las células
inmunes, desencadenando una cascada de señalización que conlleva la expresión de una
amplia variedad de genes.
Uno de los mecanismos de defensa inespecífica más característicos frente a
patógenos es el proceso de inflamación, que representa la respuesta del tejido vivo al
daño local, ya sea traumático, infeccioso, post-isquémico, tóxico o autoinmune. La
inflamación se caracteriza clásicamente por los cuatro signos de Celso: calor, rubor,
tumor y dolor, y constituye una compleja red de interacciones entre factores solubles y
células. Los daños locales inducen una respuesta aguda e inmediata, que en esencia es
siempre la misma, independientemente del agente. Dicha respuesta se desencadena
gracias a la liberación de una gran variedad de mediadores químicos que pueden
aparecer en el tejido en cuestión de segundos, y que tienen como finalidad la
extravasación de fluido y células blancas de la sangre, principalmente leucocitos
polimorfonucleares, conduciendo a la recuperación de la infección y a la curación del
tejido [2, 3].
Dentro del sistema inmune innato las células fagocíticas desempeñan un papel
esencial, limpiando los tejidos de manera inespecífica [4]. Existen dos clases de células
fagocíticas: polimorfonucleares y mononucleares. El sistema fagocítico mononuclear
incluye los macrófagos de los tejidos y los monocitos circulantes, que derivan de los
promonocitos, los cuales a su vez derivan de los monoblastos y en último término de las
células precursoras en la médula ósea. En condiciones de estimulación, los monocitos se
adhieren a las células endoteliales vasculares, migran a tejidos y se diferencian a
macrófagos. Todo ello se lleva a cabo principalmente por el M-CSF (factor de
INTRODUCCIÓN
24
estimulación de colonias de macrófagos), GM-CSF (factor de estimulación de colonias de
granulocitos y macrófagos), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-3 (IL-3) y otras
citoquinas producidas in situ, dando lugar a diferentes tipos de macrófagos en función
de donde ocurra la diferenciación [5] (Figura 1).
Médula ósea
Sangre periférica
Células madre hematopoyéticas
Monoblastos
Monocitos
Promonocitos
Monocitos
MACRÓFAGOS
Tejido conectivo (histiocitos)
Hígado (células de Kupffer)
Pulmón (macrófagos alveolares)
Nodos linfáticos
Médula ósea
Cavidades serosas (macrófagos pleurales y peritoneales)
Hueso (osteoclastos)
Riñón (células mesangiales)
Piel (células de Langerhans)
Bazo
Otros tejidos
Tejidos
Médula ósea
Sangre periférica
Células madre hematopoyéticas
Monoblastos
Monocitos
Promonocitos
Monocitos
MACRÓFAGOS
Tejido conectivo (histiocitos)
Hígado (células de Kupffer)
Pulmón (macrófagos alveolares)
Nodos linfáticos
Médula ósea
Cavidades serosas (macrófagos pleurales y peritoneales)
Hueso (osteoclastos)
Riñón (células mesangiales)
Piel (células de Langerhans)
Bazo
Otros tejidos
Tejidos
Figura 1. El sistema fagocítico mononuclear. Las células precursoras se generan en la médula
ósea y, tras diferenciarse a monocitos, pasan al torrente sanguíneo. Posteriormente migran a
tejidos, donde se diferencian a macrófagos específicos de cada tejido.
INTRODUCCIÓN
25
Entre los mediadores químicos que desencadenan la respuesta inflamatoria
destacan los eicosanoides, compuestos de origen lipídico derivados de la oxigenación de
ácidos grasos poliinsaturados esenciales de 20 átomos de carbono, principalmente el
ácido araquidónico (AA). Debido a la gran actividad biológica de estos compuestos, es
esencial el control de los niveles de este precursor en la célula.
2.2. METABOLISMO DE ÁCIDO ARAQUIDÓNICO El ácido araquidónico (ácido 5, 8, 11, 14-eicosatetraenoico, ω-6) (AA), es un
ácido graso esencial, obtenido directamente de la dieta o indirectamente a través de la
conversión del ácido linoleico (18:2n-6) por acción consecutiva de las enzimas Δ6-
desaturasa, que forma el ácido γ-linolénico (18:3n-6 o GLA), elongasa, dando lugar al
ácido dihomo γ-linolénico (20:3n-6 o DGLA) y, finalmente, la Δ5-desaturasa.
El AA es crucial en las células de la inmunidad innata, pues es precursor de los
eicosanoides, mediadores lipídicos que actúan en los procesos de inflamación y sistema
nervioso [6, 7], aunque el AA libre puede generar también funciones fisiopatológicas por
sí mismo, como por ejemplo induciendo apoptosis [8, 9].
Debido a la gran actividad biológica del AA y, en especial, de sus derivados, es
necesario un control exhaustivo y eficaz de sus niveles como ácido graso libre. Para ello
se requiere la acción de un amplio grupo de enzimas que trabajen conjuntamente para
asegurar bajos niveles de AA libre en la célula en estado basal, evitando la síntesis de
eicosanoides y los procesos biológicos llevados a cabo por el propio ácido, así como
garantizar su disponibilidad para la producción de eicosanoides en caso de estimulación
celular [10, 11].
Así, en condiciones fisiológicas, el AA se encuentra en su mayoría esterificado en
la posición sn-2 de los fosfolípidos (PL), particularmente PL de colina (PC), etanolamina
(PE) e inositol (PI), con diferentes enlaces en la posición sn-1 (acilo, alquilo o 1-
alquenilo) [12].
La regulación de la producción de AA libre está marcada por el equilibrio entre
dos reacciones antagónicas: i) la desacilación de AA de los PL, reacción llevada a cabo
por las fosfolipasas A2 (PLA2), y ii) el proceso de reacilación, preferentemente en la
posición sn-2 de los PL, y subsiguiente transferencia de AA a varios reservorios de PL,
reacción llevada a cabo por las enzimas acil-CoA sintetasas (ACS), lisofosfolípido-
aciltransferasas dependientes de coenzima A (CoA) (LPLAT) y transacilasas
independientes de CoA (CoA-IT) [11].
Dependiendo del estado de la célula, una reacción domina sobre la otra. Así, en
células en reposo, la hidrólisis se produce en menor extensión y el AA se encuentra
INTRODUCCIÓN
26
principalmente esterificado. En estas condiciones se considera la fosfolipasa
independiente de Ca2+ (iPLA2) como una de las principales responsables de la
homeostasis de los PL de membrana [13, 14]. En células estimuladas, la reacción que
prevalece es la desacilación o hidrólisis, gracias a la activación de PLA2 dependientes de
Ca2+, lo que resulta en la liberación de grandes cantidades de AA disponible para la
síntesis de eicosanoides [15-19]. Aun así, en condiciones de activación el proceso de
reacilación sigue siendo muy significativo, lo que se manifiesta por el hecho de que sólo
una pequeña fracción del AA que se libera se utiliza para la síntesis de eicosanoides, y
el resto se reacila de nuevo a los PL por acción de las LPLAT [11]. En el apartado 2.2.2
se explican en mayor profundidad las enzimas que participan en el control de los niveles
de AA.
2.2.1. Rutas de incorporación de AA en PL
Existen dos rutas diferentes para la incorporación de AA en los PL celulares, las
cuales se han descrito en varios tipos celulares, en particular los implicados en
reacciones inflamatorias, como macrófagos y neutrófilos [11, 20].
La ruta principal de incorporación de AA en condiciones fisiológicas, cuando la
célula está expuesta a bajas concentraciones de AA, ocurre a través del ciclo de Lands
[21, 22] que es una ruta de alta afinidad pero de baja capacidad [11]. Esta ruta implica
un mecanismo de acilación/desacilación que permite la entrada de ácidos grasos
poliinsaturados en la posición sn-2 de los PL. El AA libre presente en las células,
procedente de fuentes exógenas o del metabolismo basal de fosfolípidos mediado por
acción de las PLA2, puede incorporarse en la posición sn-2 de los PL, en primer lugar a
través de la acción de ACS para formar araquidonoil-CoA (AA-CoA), y en segundo lugar
por la acción de LPLAT [10, 11, 20, 23, 24] (Figura 2). En este mecanismo de
incorporación, la disponibilidad de lisofosfolípidos (lisoPL) (que actúan como moléculas
aceptoras de AA), evento controlado por las PLA2, constituye un factor limitante [13,
19, 25-28].
La segunda ruta opera cuando la célula está expuesta a altos niveles de AA libre,
en condiciones que pueden ser patológicas, y conduce a la incorporación del ácido graso
a través de la ruta de novo o ruta de Kennedy de biosíntesis de PL. En esta ruta, las
moléculas de AA-CoA pueden esterificarse en cuaquiera de las dos posiciones del
glicerol-3-fosfato (G3P), o incluso en ambas a la vez, lo que daría lugar a PA(20:4/20:4)
mediante la acción consecutiva de glicerol-3-fosfato aciltransferasas (GPAT) y ácido
lisofosfatídico aciltransferasas (LPAAT). A partir del PA se forma bien TAG —por la
acción secuencial de las fosfatidato-fosfohidrolasas (PAP) y diacilglicerolaciltransferasas
INTRODUCCIÓN
27
(DGAT)—, o bien PL— mediante la activación con citidina difosfato (CDP) del DAG (PI) o
de la cabeza polar (PC y PE)— [29] (Figura 2). La incorporación de AA a través de esta
ruta resulta en la acumulación de AA en TG y la formación de PC(20:4/20:4). Se acepta
que esta ruta de alta capacidad pero baja afinidad funciona fundamentalmente después
de que el ciclo de Lands de acilación/desacilación se haya saturado [11, 30-33].
INTRODUCCIÓN
28
Figura 2. Rutas de incorporación de AA. El AA, una vez activado dentro de la célula como
araquidonoil-CoA, se incorpora a los lípidos celulares, bien por la ruta de alta afinidad/baja
capacidad (ciclo de Lands), cuando la célula está expuesta a concentraciones bajas del ácido, o
por la ruta de alta capacidad/baja afinidad (ruta de Kennedy) si la célula está expuesta a altas
concentraciones. ACSL: acil-CoA sintetasas de cadena larga; LPLAT: lisofosfolípido:acil CoA
aciltransferasas; PLA2; fosfolipasas A2; GPAT: glicerol-3-fosfato aciltransferasas; LPAAT: ácido
lisofosfatídico:acil-CoA aciltransferasas; PAP: fosfatidato fosfohidrolasas; DGAT: diacilglicerol
aciltransferasas; PI: fosfatildilinositol; PC: glicerofosfolípidos de colina; PE: glicerofosfolípidos de
etanolamina.
INTRODUCCIÓN
29
2.2.2. Enzimas de incorporación y remodelación de AA 2.2.2.1. Fosfolipasas A2
Las fosfolipasas son enzimas que actúan sobre los glicerofosfolípidos,
hidrolizando sus enlaces carboxiéster o fosfoéster. Las fosfolipasas A2 hidrolizan
específicamente el resto acilo de la posición sn-2 del glicerol, dando como productos un
ácido graso y el correspondiente lisofosfolípido (Figura 3). La reacción es de especial
importancia cuando el ácido graso liberado es AA, ya que es convertido a eicosanoides
por acción de posteriores enzimas. Además, si el PL sobre el que actúa la PLA2 posee
una cabeza polar de colina en la posición sn-3 y un resto alquílico en la posición sn-1, el
otro producto de la reacción es el precursor del factor activador de plaquetas (PAF),
otro compuesto de gran relevancia en procesos de inflamación [34]. El lisofosfolípido
también puede ser convertido a ácido lisofosfatídico (lisoPA), con múltiples funciones
fisiológicas [35]. Por ello, las PLA2 son enzimas cruciales que regulan la producción de
lípidos bioactivos. Además, las PLA2 participan en la remodelación de los PL de
membrana.
Figura 3. Reacción de hidrólisis del resto acilo de la posición sn-2 de un PL, catalizada por las
fosfolipasas A2 (PLA2). R1: resto hidrocarbonado en la posición sn-1 del glicerol; R2: resto
hidrocarbonado en la posición sn-2 del glicerol; X: H, colina, etanolamina e inositol,
principalmente.
INTRODUCCIÓN
30
Hasta el momento presente se han clonado y caracterizado 29 enzimas con
actividad PLA2 en mamíferos. Todas estas enzimas han sido clasificadas sobre la base de
su estructura primaria [36, 37]. Siguiendo este criterio, se han establecido hasta el
momento 15 grupos de PLA2s, acorde con la revisión de Burke et al. [38], algunos de los
cuales no pertenecen a mamíferos, sino que se encuentran en fluidos extracelulares de
diferentes especies como por ejemplo veneno de insectos y reptiles. Existe además otra
PLA2 que se ha caracterizado recientemente y es específica de tejido adiposo (PdPLA2).
Debido a sus caracerísticas únicas ha sido propuesta para fomar un grupo diferente
(grupo XVI) [39, 40], y así ha sido incluida recientemente en la última revisión de PLA2
realizada por Murakami et al. [41].
Desde el punto de vista del mecanismo de catálisis, las PLA2 pueden ser
agrupadas en dos grandes familias; las de bajo peso molecular (menos de 20 kDa) que
utilizan una diada catalítica de histidina/ácido aspártico (His/Asp), y las de alto peso
molecular (más de 40 kDa), que utilizan una serina (Ser) en el centro catalítico, el cual
puede estar constituído por la triada catalítica Ser/His/Asp o por la diada Ser/Asp. La
hidrólisis se produce por dos reacciones de sustitución nucleofílica consecutivas. En el
centro catalítico que utiliza una His, ésta actúa sobre una molécula de H2O aumentando
su capacidad nucleofílica y permitiendo el ataque de su átomo de oxígeno al carbono
carboxílico del PL, proceso que se ve favorecido por la proximidad de un Asp a la His
(Figura 4). En el caso del centro catalítico con Ser es el átomo de oxígeno de la misma
el que actúa como nucleófilo sobre el carbono carboxílico, a través de un mecanismo
similar al que ocurre en las bien conocidas serín proteasas como la tripsina. En
cualquiera de los dos casos, el ataque nucleofílico genera un intermedio hemiacetal
tetraédrico con el PL, que a continuación se hidroliza liberando el lisoPL y el ácido graso
o una acil-enzima, la cual sufre otra sustitución nucleofílica con H2O [42-44].
INTRODUCCIÓN
31
Figura 4. Mecanismo de catálisis de las fosfolipasas A2 (PLA2) que utilizan una His en el centro
catalítico. La His funciona como base y desprotona una molécula de H2O, que actúa como
nucleófilo sobre el carbono carboxílico de la posición sn-2, generándose un oxoanión que se
estabiliza gracias a un ion de calcio. R1: resto hidrocarbonado en la posición sn-1 del glicerol;
R2: resto hidrocarbonado en la posición sn-2 del glicerol; X: H, colina, etanolamina e inositol,
principalmente.
INTRODUCCIÓN
32
Desde un punto de vista de regulación celular, y basándose en propiedades
bioquímicas, las PLA2 se suelen clasificar en cinco grupos: secretadas dependientes de
Ca2+ (sPLA2), citosólicas dependientes de Ca2+ (cPLA2), citosólicas independientes de Ca2+
(iPLA2), acetilhidrolasas de PAF (PAF-AH) y PLA2 lisosomales [36, 38, 41]. Las PAF-AH
hidrolizan el grupo acetilo de la posición sn-2 de PAF, conduciendo a la formación de
lisoPAF y ácido acético, aunque también hidrolizan otros grupos acilo de cadena corta
así como ácidos grasos oxidados [45, 46]. Las PLA2 lisosomales, por su parte, se localizan
en los lisosomas y desempeñan una función común en la homeostasis de surfactante
pulmonar [36, 41, 47-49]. Estos dos grupos de enzimas no están por tanto implicados en
el metabolismo de AA.
A continuación se describe en mayor profundidad aquellos grupos de PLA2 que
están implicados en el metabolismo de AA, es decir, las PLA2 secretadas, dependientes e
independientes de Ca2+ [50, 51].
2.2.2.1.1. PLA2s secretadas (sPLA2s)
En este grupo se incluyen enzimas que se secretan al medio extracelular, en
general de bajo peso molecular (14-18 kDa), excepto la sPLA2-III, con un peso de 55 kDa
(Tabla 1). Algunas de ellas se encuentran en fluidos extracelulares de distintos seres
vivos, como venenos de insectos y reptiles, además de las identificadas en mamíferos.
Todas poseen 6-8 puentes disulfuro conservados, lo que proporciona alta estabilidad en
ambientes extracelulares. Poseen una histidina catalítica, y requieren para la catálisis
concentraciones milimolares de Ca2+. No muestran selectividad por el ácido graso en la
posición sn-2 de los PL, si bien algunas de ellas muestran cierta tendencia por PL
aniónicos. Algunas de ellas (GIIA, GV y GX) desempeñan un papel importante en la
síntesis de eicosanoides, actuando conjuntamente con la cPLA2 en la liberación de AA
[50]. También se ha descrito su participación en aterosclerosis, enfermedades
neuronales y respiratorias, además de poseer propiedades anticoagulantes [43, 52].
INTRODUCCIÓN
33
Tabla 1. Fosfolipasas A2 secretadas (sPLA2). Adaptada de Burke et al. [53].
Grupo Otros nombres Origen
Masa molecular
(kDa)
Sitio catalítico
Enlaces disulfuro
I A Cobra y crótalo 13-15 His/Asp 7
B PLA2
pancreática Humano, cerdo
(páncreas) 13-15 His/Asp 7
II A PLA2 sinovial Serpiente de
cascabel, líquido sinovial humano
13-15 His/Asp 7
B Veneno de víbora de Gabón 13-15 His/Asp 6
C Rata, ratón (testículo) 15 His/Asp 8
D Humano, ratón
(páncreas, bazo) 14-15 His/Asp 7
E Humano, ratón
(cerebro, corazón, útero)
14-15 His/Asp 7
F Humano, ratón
(testículos, útero)
16-17 His/Asp 6
III Humano, ratón, lagartija, abeja
15-18 55 (h y r) His/Asp 8
V
Humano, ratón (corazón, pulmón,
macrófagos)
14 His/Asp 6
IX Conodipina-M Veneno de caracol
14 His/Asp 6
X Humano
(bazo, timo, leucocitos)
14 His/Asp 8
XI A PLA2-I Brotes verdes de
arroz 12,4 His/Asp 6
B PLA2-II Brotes verdes de
arroz 12,9 His/Asp 6
XII Humano, ratón 19 His/Asp 7
XIII Parvovirus <10 His/Asp 0
XIV Hongos y bacterias
simbióticos 13-19 His/Asp 2
r: ratón; h: humano.
INTRODUCCIÓN
34
2.2.2.1.2. PLA2s citosólicas dependientes de Ca+2 (cPLA2s)
Este grupo (G-IV) consta de 6 miembros de alto peso molecular (61-114 kDa) que
comparten una secuencia consenso GXSXS, común a lipasas, y una serina catalítica
(Tabla 2). Todas menos la de grupo IVC poseen un dominio C2 en el extremo N-
terminal, el cual une PL y Ca2+, permitiendo la traslocación e interacción con las
membranas celulares. Así pues, estas enzimas necesitan Ca2+ en el rango micromolar
para desarrollar su actividad catalítica. De todas ellas, la primera que ha sido clonada, y
la que más se ha estudiado es la del grupo IVA o cPLA2 [54], por su especificidad por
AA y su capacidad para liberarlo y desencadenar la produción de eicosanoides en
condiciones de activación celular mediada por agonista [37].
La traslocación de la cPLA2 en respuesta a un aumento de Ca2+ intracelular se produce
clásicamente hacia la envoltura nuclear, retículo endoplásmico (RE) y aparato de Golgi
[42], aunque también se han descrito otros sitios de localización como fagosoma
(durante la fagocitosis de partículas de zimosán), membrana plasmática y cuerpos
lipídicos [42, 55-60]. Una característica importante es su fosforilación en varios residuos
de serina (Ser505, Ser727, Ser515), reacción mediada por varias quinasas [61-65]. Además,
la enzima contiene agrupaciones de residuos básicos en el dominio catalítico que se
asocian con PL aniónicos, como fosfoinosítidos (PIPs), que participan en el proceso de
activación de la cPLA2 a través de la regulación de la unión de la proteína a la
membrana [42, 50]. Tabla 2. Fosfolipasas A2 citosólicas (cPLA2). Adaptada de Burke et al. [53].
Grupo Otros
nombres Origen Masa
molecular (kDa)
Sitio catalítico Características
IV A cPLA2 Humano, ratón 85 Ser/Asp Dominio C2
B cPLA2 Humano 114 Ser/Asp Dominio C2
C cPLA2 Humano 61 Ser/Asp
D cPLA2 Humano, ratón 92-93 Ser/Asp Dominio C2
E cPLA2 Ratón 100 Ser/Asp Dominio C2
F cPLA2 Ratón 96 Ser/Asp Dominio C2
INTRODUCCIÓN
35
2.2.2.1.3. PLA2s citosólicas independientes de Ca2+ (iPLA2s)
Este grupo está compuesto por 6 enzimas diferentes (A-F) (Tabla 3). Ninguna
requiere Ca2+ para su actividad catalítica, que es llevada a cabo por una Ser en el sitio
activo. Todas tienen un motivo lipasa (GXSXG), característica común con las cPLA2. La
más estudiada ha sido la grupo VIA, que contiene 5 variantes (VIA-1, VIA-2, VIA-3, VIA
anquirina-1 and VIA anquirina-2), aunque solamente las dos primeras poseen actividad
catalítica. La primera identificada y caracterizada ha sido la grupo VIA-1 [66-68],
denominada clásicamente como iPLA2, la cual contiene 8 repeticiones de anquirina. La
función de estas repeticiones de anquirina es promover la oligomerización de la enzima.
De hecho, la forma activa de la enzima de grupo VIA es un tetrámero [14, 69].
La iPLA2-VIA se expresa en todos los tejidos, y no tiene preferencia por ningún
ácido graso o cabeza de PL. Entre sus múltiples funciones, cabe destacar su papel en la
homeostasis de los PL celulares, participando en el ciclo de acilación/desacilación (ciclo
de Lands). Por ello, es una enzima clave en la distribución del AA dentro de los PL [13].
También ha sido implicada en la liberación de ácidos grasos en condiciones de estrés
oxidativo, donde el papel de la iPLA2-VIA no se basa en un incremento de su actividad
sino en una mayor susceptibilidad de la membrana a la hidrólisis como consecuncia de la
peroxidación [70]; en apoptosis, por acción del otro producto de reacción de la iPLA2, el
lisoPC [71] y otros procesos como secreción, ciclo celular, entrada de Ca2+, regulación
de expresión de genes o isquemia cardíaca, si bien algunos de ellos se han estudiado con
el inhibidor inespecífico bromoenol lactona (BEL), por lo que los resultados no se
consideran concluyentes [69].
INTRODUCCIÓN
36
Tabla 3. Fosfolipasas A2 independientes de Ca2+ (iPLA2). Adaptada de Burke et al. [53].
Grupo Otros nombres Origen Masa
molecular (kDa)
Sitio catalítico
Carcterísticas
VI A-1 iPLA2 Humano,
ratón 84-85 Ser/His/Asp 8
repeticiones anquirina
A-2 iPLA2 Humano,
ratón 88-90 Ser/His/Asp 8
repeticiones anquirina
B iPLA2 Humano,
ratón 88-91 Ser/His/Asp
C iPLA2 NTE
Humano, ratón 146 Ser/His/Asp
D iPLA2 Adiponutrina
Humano 53 Ser/His/Asp
E iPLA2 TTS-2.2
Humano 57 Ser/His/Asp
F iPLA2 Humano 28 Ser/His/Asp
VII A
PLA2 asociada a lipoproteína
(Lp-PLA2) Plasma PAF-AH
Humano, ratón,
porcino, bovino
45 Ser/His/Asp
B PAF-AH II Humano, bovino 40 Ser/His/Asp
VIII A PAF-AH Ib
(subunidad 1) Humano 26 Ser/His/Asp
B PAF-AH Ib
(subunidad 2) Humano 26 Ser/His/Asp
XV ACS, PLA2
lisosmal (LPLA2), LLPL
Humano, ratón, bovino
45 Ser/His/Asp
INTRODUCCIÓN
37
2.2.2.2. Acil-CoA sintetasas
Las ACSs catalizan la reacción de tioesterificación de los ácidos grasos con
coenzima A (CoA) a expensas de adenosina trifosfato (ATP) y Mg2+ (Figura 5). Dicha
etapa de activación de los ácidos grasos es crucial para posteriores reacciones
metabólicas de los mismos, y por tanto indispensable para la incorporación de AA en PL.
Figura 5. Activación de un ácido graso genérico mediante tioesterificación con CoA, a expensas
de ATP y Mg2+. La reacción se cataliza por acción de las acil-CoA sinetasas (ACS).
Todas las ACSs enzimáticamente activas contienen al menos dos secuencias de
aminoácidos conservados: un dominio de unión AMP (adenosina monofostato) (motivo I),
el cual consiste en 10 residuos altamente conservados de bacterias a humanos [72], y un
dominio de 36 a 37 residuos [73] (motivo II) en el que hay una secuencia considerada
esencial para la unión del sustrato [73]. Este último ha sido usado para asignar las ACS a
subfamilias. Hasta el momento se han definido 26 genes como ACS [73], 22 de ellos con
actividad enzimática bien definida. Estas enzimas se han clasificado en 5 subfamilias,
según la longitud de cadena de sus sustratos preferidos: de cadena corta o ACSS [74,
75], media o ACMS [76, 77], larga o ACSL [78], muy larga o ACSVL [79, 80] y bubblegum
o ACSBG [81-83], y otro grupo de cuatro enzimas que no pertenecen a ninguna
subfamilia (familia ACS o ACSF). Todas ellas se resumen en las Tablas 4-7. Las ACS que
muestran preferencia por AA son típicamente las de la familia ACSL, aunque la familia
ACSVL y bubblegum también pueden utilizar AA como sustrato, por ello son los grupos
que se explican en mayor detalle a continuación.
INTRODUCCIÓN
38
Tabla 4. Acil-CoA sintetasas de cadena corta y media ACSS y ACSM).
2.2.2.2.1. Acil-CoA sintetasas de cadena larga (ACSL)
Las ACSL desempeñan un papel imprescindible en la remodelación de los lípidos
de membrana, así como en la síntesis de lípidos de novo. Hasta ahora se han descrito 5
isoformas en mamíferos, denominadas ACSL1, 3, 4, 5 y 6 [84] (Tabla 5), con al menos
dos variantes de splicing de maduración del RNA mensajero por isoforma. ACSL1 ha sido
el primer gen clonado de la familia ACSL en humano [85]. Es abundante en corazón,
hígado y tejido adiposo, y usa gran variedad de ácidos grasos como sustrato, con una
ligera preferencia por 16:0, 18:1n-9 y 18:2n-6 [86]. ACSL3 se expresa abundantemente
en cerebro [87, 88]. Esta enzima posee una marcada selectividad por AA y EPA sobre
otros ácidos grasos poliinsaturados, aunque su preferencia por mirístico y láurico hace
que sea menos específica que la ACSL4 en cuanto al AA. La ACSL4 muestra alta
homología con ACSL3, compartiendo el 68% de sus aminoácidos. Se expresa sobre todo
en tejido esteroidogénico y se localiza en peroxisomas y membrana mitocondrial. Tanto
en humano como en ratón muestra alta selectividad por EPA y AA, indicando una función
crítica en el metabolismo de AA [89, 90]. La ACSL5 es la única que se localiza en la
membrana mitocondrial externa, indicativo de su participación en la -oxidación en la
mitocondria. Su expresión es abundante en intestino delgado y, en menor extensión, en
Nombre Otros nombres Tejido Localización subcelular Sustrato Selectividad
Acil-CoA sintetasas de cadena corta
ACSS1 ACAS2L, AceCS2L Corazón
Matriz mitocondrial
C(2-4)
2:0
ACSS2 ACAS2, ACS, ACSA, AceCS
Hígado Citoplasma 2:0
ACSS3 Pulmón Mitocondria 2:0
Acil-CoA sintetasas de cadena media
ACSM1 BUCS1, MACS1 Hígado, riñón Matriz mitocondrial
C(4-10)
8:0
ACSM2A ACSM2, MACS2 Hígado, riñón Matriz mitocondrial Amplio rango
ACSM2B ACSM2, HXMA Hígado Matriz
mitocondrial Amplio rango
ACSM3 SA, SAH Hígado, riñón Matriz
mitocondrial, peroxisoma
4:0
ACSM4 Matriz
mitocondrial Amplio rango
ACSM5 MACS3 Hígado, riñón,
corazón, páncreas
Matriz mitocondrial Amplio rango
INTRODUCCIÓN
39
hígado, y usa una amplia variedad de ácidos grasos saturados e insaturados [91]. Junto
con la ACSL3, la ACSL6 es la ACSL que mayoritariamente se expresa en cerebro. Tanto la
de ratón como la humana muestran clara preferencia por DHA y AA [92, 93]. Esto
sugiere una importante función en la síntesis de membranas neuronales, que
experimentan una remodelación rápida de los PL. También la ACSL6 está presente en la
membrana plasmática de eritrocitos maduros, donde activa ácidos grasos de cadena
larga para la remodelación de lípidos y acilación de proteínas [94].
Tabla 5. Acil-CoA sintetasas de cadena larga (ACSL).
Nombre Otros nombres Tejido Localización subcelular Sustrato Selectividad
CoA sintetasas de cadena larga
ACSL1 ACS1, FACL1, FACL2, LACS, LACS1, LACS2
Corazón, hígado, tejido adiposo
Membrana plasmática y mitocondrial, RE, vesícula
C(12-20)
16:0>18:1> 18:2
ACSL3 ACS3, FACL3, LACS3
Cerebro, hígado, intestino delgado
RE, cuerpos lipídicos
14:0>12:0> 20:4>20:5
ACSL4 ACS4, FACL4, LACS4
Tejido esteroidogénico,
hígado
Peroxisoma, RE, membrana mitocondrial
20:4>20:5
ACSL5 ACS2, ACS5, FACL5
Útero, bazo, intestino delgado
ER, membrana mitocondrial y
plasmática
Amplio rango saturados, C16-C18
insaturados
ACSL6 ACS2, FACL6, LACS2, LACS5
Cerebro, reticulocitos
Membrana plasmática, mitocondria
22:6>20:4
RE: retículo endoplásmico.
2.2.2.2.2. Acil CoA-sintetasas de cadena muy larga (ACSVL)
Esta familia está compuesta por 6 proteínas integrales de membrana (ACSVL1-6)
(Tabla 6) de 70-80 kDa con un dominio N-terminal extracelular/luminar y un dominio C-
terminal citosólico. Contienen un motivo propio de las enzimas dependientes de ATP
que forman intermediarios adenilados, consistente con su actividad enzimática [95-97].
Son capaces de activar ácidos grasos de cadena larga, con ramificaciones, o muy largos
conteniendo más de 22 átomos de carbono. Los miembros de esta familia también se
denominan FATP (proteínas transportadoras de ácidos grasos), pues se piensa que están
implicados en la traslocación de ácidos grasos largos y muy largos a través de la
membrana plasmática [78], bien directamente, o indirectamente a través de su
actividad acil-CoA sintetasa, capaz de atrapar los ácidos grasos en la célula [98]. Así,
INTRODUCCIÓN
40
estas proteínas pueden tener una doble función: el transporte y la esterificación de los
sustratos, si bien no queda claro si ambas funciones son dependientes o independientes
entre sí [97, 99].
Tabla 6. Acil-CoA sintetasas de cadena muy larga (ACSVL).
Nombre Otros nombres
Tejido Localización subcelular
Sustrato Selectividad
Acil-CoA sintetasas de cadena muy larga
ACSVL1
FATP-2, SLC27A2, FACVL1,
VLACS, VLCS
Hígado, riñón, intestino delgado
RE, peroxisomas
C(18-26)
16:0, 24:0, THCA, ácido
fitánico y pristánico,
ACSVL2
FATP-6, SLC27A6,
FACVL2, VLCS-H1
Corazón, placenta
Membrana celular,
mitocondrial, y de RE,
sarcolema
18:1, 20:4, 24:0
ACSVL3 FATP-3,
SLC27A3, VLCS-3
Testículo, glándula adrenal, ovario,
cerebro, pulmón, riñón
Membrana mitocondrial y
de RE
16:0, 18:1, 24:0
ACSVL4 FATP-4, SLC27A4
Intestino delgado, piel, cerebro, tejido
adiposo, músculo, corazón,
hígado, riñón
Membrana de RE
24:0, (16:0)
ACSVL5 FATP-1, SLC27A1, FATP
Corazón, tejido adiposo, músculo, cerebro
Membrana plasmática e intracelular, citoplasma
16:0, 18:1, 24:0
ACSVL6
FATP-5, SLC27A5, BAL, ACSB, BACS,
VLCS-H2
Hígado Membrana plasmática
Ácidos biliares, THCA, (24:0)
THCA: ácido trihidroxicolestanoico; RE: retículo endoplásmico.
INTRODUCCIÓN
41
2.2.2.2.3. Acil-CoA sintetasas bubblegum (ACSBG)
Se descubrieron originalmente en el mutante de Drosophila melanogaster
“bubblegum”, el cual se caracterizó por neurodegeneración y altos niveles de ácidos
grasos saturados muy largos [81]. La ACSBG1 en humanos tiene papel en la activación de
ácidos grasos largos y muy largos [72]. Recientemente, un segundo miembro (ACSBG2)
ha sido localizado en testículos de humano y de ratón, mostrando un alto grado de
homología con ACSBG1 [82] (Tabla 7).
Tabla 7. Acil-CoA sintetasas bubblegum (ACSBG) y otras.
Nombre Otros nombres Tejido Localización
subcelular Sustrato Selectividad
Acil-CoA sintetasas bubblegum
ACSBG1 BG1, BGM, lipodosina
Cerebro, glándula adrenal y testículo
Citoplasma, vesicular
citoplasmática, microsoma, RE C(14-24)
18:1>20:5= 20:4=18:0
ACSBG2 BGR, BGR-like, BRGL
Testículo adulto
Citoplasma, mitocondria 18:1=18:2
Otras acil-CoA sintetasas
ACSF1 AACS, SUR-5 Riñón,
corazón, cerebro
Citoplasma, citosol
Acetoacetato
ACSF2 ACSMW Adiposo Mitocondria 8:0
ACSF3 Mitocondria 24:0
ACSF4 AASDH, LYS2,
U26
Hígado, riñón,
páncreas, bazo,
testículo
RE: retículo endoplásmico.
INTRODUCCIÓN
42
2.2.2.2. Lisofosfolípido: acil-CoA aciltransferasas dependientes de CoA (LPLAT)
Las LPLAT son enzimas que catalizan la reacción de esterificación de un ácido
graso, activado previamente como acil-CoA, a un grupo hidroxilo de un glicerolípido,
aunque también hay enzimas que utilizan proteínas susceptibles de acilarse como
sustrato [100]. Dentro de los glicerolípidos, las aciltransferasas más relevantes, acorde
con este trabajo, son las que utilizan como sustrato lisoPL, pues participan en el
proceso de remodelación de los PL celulares, al esterificar un ácido graso en la posición
sn-2, que ha quedado vacante por acción de las PLA2 (Figura 6).
Figura 6. Reacción de acilación de un ácido graso (activado como acil-CoA) a un lisofosfolípido,
catalizada por las lisofosfolípido:acil-CoA aciltransferasa (LPLAT). R1: resto hidrocarbonado en
la posición sn-1 del glicerol; R2: resto hidrocarbonado en la posición sn-2 del glicerol; X: H,
colina, etanolamina e inositol, principalmente.
Las células mamíferas contienen un gran número de enzimas con actividad LPLAT
localizadas casi exclusivamente en el RE, las cuales exhiben distintos grados de
selectividad por los lisoPL aceptores y por los acil-CoA. Existen muchas aciltransferasas
que pueden estar implicadas en el reciclaje del AA, específicamente o como parte de
una función general en el metabolismo homeostático de PL.
Se han descrito hasta el momento dos familias de enzimas LPLAT: la familia O-
aciltransferasa unida a membrana (MBOAT), y la familia 1-acil-glicerol-3-fosfato O-
aciltransferasa (AGPAT) [101-103] (Tablas 8 y 9). Mientras que los miembros de la
familia MBOAT están implicados específicamente en la remodelación de los ácidos
grasos en el ciclo de Lands, los de la familia AGPAT actúan típicamente en la ruta de
novo, aunque algunas enzimas también participan en las reacciones de remodelación.
En cuanto a las que utilizan lisoPL como aceptores, las proteínas de la familia MBOAT
tienen varios dominios transmembrana y un residuo conservado de His en una región
hidrofóbica que se piensa puede constituir el sitio catalítico [104].
INTRODUCCIÓN
43
Los miembros de la familia de AGPAT, al considerarse en un principio que
utilizaban lisoPA específicamente como aceptor, han sido clasificados como
aciltransferasas de la ruta de novo de biosíntesis de PL. Más tarde se ha observado que
la especificidad es más amplia, pudiento usar también lisoPC y lisoPE. Presentan cuatro
dominios conservados (motivos I-IV) que son importantes para la actividad catalítica y
unión a sustrato [105, 106].
2.2.2.3.1. Ácido lisofosfatídico: acil-CoA aciltransferasas (LPAAT)
Han sido clonadas y caracterizadas tres LPAAT: LPAAT1 [107-109], LPAAT2 [109,
110] y LPAAT3 [111]. LPAAT1 y LPAAT2 usan varios acil-CoA como donores [112], y se
expresan en una amplia variedad de tejidos. LPAAT3 muestra selectividad por AA,
aunque también posee actividad LPIAT [111]. Esta última se considera que determina los
niveles de ácidos grasos poliinsaturados en células germinales [113]. Recientemente se
ha demostrado que la proteína humana CGI-58/ABHD5 muestra actividad LPAAT, con
preferencia por AA-CoA y oleil-CoA [114].
2.2.2.3.2. Lisoglicerofosfolípido de colina:acil-CoA aciltransferasas (LPCAT)
Hasta ahora se han encontrado tres enzimas en humanos que utilizan
preferentemente lisoPC como aceptor, denominadas LPCAT1, LPCAT2 y LPCAT3.
La LPCAT1 (o AGPAT9) [102, 103] fue identificada y caracterizada
independientemente por dos grupos diferentes en células alveolares de tipo II de ratón
[115, 116]. Se expresa mucho en pulmón, donde parece desempeñar una importante
función en la síntesis de fosfolípidos surfactantes, en particular PC(16:0/16:0), que es el
componente mayoritario del surfactante pulmonar. Ensayos de actividad muestran
selectividad por acil-CoA saturados de longitud media (6:0-16:0) y como aceptor lisoPC,
aunque también muestra actividad hacia lisoPA y lisoPG [116]. Es importante para la
remodelación de PC en eritrocitos [117]. Recientemente se ha descrito que esta enzima
está implicada en la síntesis de PAF en condiciones no inflamatorias e independientes de
Ca2+ [118]. La LPCAT1 humana es también abundante en pulmón, y tiene propiedades
similares a la de ratón. Otros autores han descrito también la sobreexpresión de LPCAT1
humana en adenocarcinomas de cáncer colorrectal [119].
INTRODUCCIÓN
44
LisoPAFAT/LPCAT2, clonada y caracterizada en ratón, se considera que es la
enzima implicada en la síntesis de PAF en condiciones inflamatorias [120]. Pertenece a
la familia de la AGPAT, y se expresa abundantemente en células inflamatorias,
principalmente en macrófagos residentes y neutrófilos. Muestra una marcada
preferencia por lisoPC. Usando células RAW 264.7 que sobreexpresan LPCAT2, se ha
encontrado que en condiciones basales la enzima muestra actividad con los sustratos
acetil-CoA y AA-CoA, con más afinidad por el segundo que por el primero. Sin embargo,
al estimular las células a través de receptor, la actividad acetiltransferasa aumenta
considerablemente, mientras que la de AA no [120].
LPCAT3, también conocida como MBOAT5, presenta altos niveles en tejidos de
ratón, especialmente testículos [121]. Muestra selectividad por lisoPC y, en cuanto a
ácidos grasos, usa AA y ácido linoleico con preferencia sobre otros ácidos grasos [121].
En humanos se expresa mucho en hígado, páncreas y tejido adiposo, donde además
muestra preferencia por ácido linoleico sobre AA [122, 123].
2.2.2.3.3. Lisoglicerofosfolípido de etanolamina:acil-CoA aciltransferasas
(LPEAT)
Hasta el momento se han encontrado tres tipos diferentes de LPEAT: LPEAT1 (o
MBOAT1), LPEAT2 (o AGPAT7) y MBOAT2.
LPEAT1 [121, 122, 124] ha sido caracterizada ampliamente en ratón y muestra
preferencia por oleil-CoA. También puede utilizar lisoPS como aceptor, aunque prefiere
lisoPE [121]. La enzima humana presenta propiedades similares, aunque muestra mayor
preferencia por lisoPS que lisoPE [122]. LPEAT2 ha sido identificada en tejidos humanos
por Cao et al. [124]. Se expresa altamente en cerebro y células inflamatorias. Tiene
selectividad por palmitoil-, estearoil- y oleil-CoA como donantes, así como lisoPE como
aceptor, aunque también puede usar lisoPC, lisoPG y lisoPS. Debido a que el cerebro
está enriquecido en LPEAT2, se piensa que es crucial para la remodelación de PL en este
órgano y pudiera estar implicada en desórdenes neurológicos como Alzheimer o
esclerosis múltiple.
La MBOAT2 ha sido bien caracterizada en ratón y se expresa abundantemente en
epidídimo, cerebro, testículos y ovario, tiene afinidad por oleil-CoA y puede usar lisoPE
y lisoPC como aceptores. MBOAT2 humana tiene clara selectividad por lisoPE sobre
lisoPC, y también por oleil-CoA [122]. La MBOAT de ratón se ha llamado LPCAT4 porque
muestra la misma preferencia por lisoPE que por lisoPC [121].
INTRODUCCIÓN
45
2.2.2.3.4. Lisofosfatidilinositol:acil-CoA aciltransferasas (LPIAT)
Hasta el momento se conoce una enzima que utiliza específicamente lisoPI como
sustrato: la MBOAT7, identificada en Caenorhabditis elegans [125]. Además, exhibe alta
selectividad para AA y EPA, haciendo obvio su papel en el reciclado de AA en PI a través
del ciclo de Lands. La homóloga en humanos es BB1/LENG4 y presenta la misma
especificidad por sustrato que la enzima de Caenorhabditis elegans [122]. La otra LPIAT
descrita es la LPAAT3, que, como se ha comentado, usa lisoPA y lisoPI como aceptores.
En las Tablas 8 y 9 se detallan las enzimas aciltransferasas que utilizan acil-CoA
y lípidos como sustrato (no están incluidas las de palmitoilación u octanoilación de
proteínas).
Tabla 8. Miembros de la familia MBOAT.
Familia MBOAT
Otros nombres Tejido
Sustratos y selectividad Ruta de actuación Acil-CoA Lípido aceptor
MBOAT1 LPEAT1 r: epidídimo, estómago, colon 18:1
r: LisoPE > LisoPS
h: LisoPS Lands
MBOAT2 LPCAT4* r: epididimo,
cerebro, testículo, ovario
18:1
r: LisoPC > LisoPE
h: LisoPE > LisoPA > LisoPC
Lands y de novo
MBOAT5 LPCAT3
r: todos tejidos h: hígado
(páncreas, tejido adiposo)
r: 20:4>18:2 h: 18:2>20:4
LisoPE > LisoPE, LisoPS
Lands
MBOAT7 LPIAT1/LRC4 r: todos tejidos 20:4 LisoPI Lands
ACAT1
glándulas adrenales,
macrófagos, glándulas
sebáceas, hígado, intestino
16:0, 18:0, 18:1, 18:2,
20:4
Colesterol Oxisteroles
ACAT2 Hígado, intestino Delgado
18:2, 16:0, 18:1
Colesterol Oxisteroles
DGAT1
Intestino delgado, testículo, tejido
adiposo, glándulas mamarias, timo
18:1>16:0 DAG De novo
r: ratón; h: humano; ACAT: acilcolesterol aciltransferasa; DGAT: diacilglicerol aciltransferasa.
*Sólo denominada así en ratón.
INTRODUCCIÓN
46
Tabla 9. Miembros de la familia AGPAT.
Familia AGPAT
Otros nombres Tejido
Sustratos y selectividad Ruta de actuación Acil-CoA Lípido aceptor
AGPAT1 LPAAT1, LPAAT
Todos tejidos
r: 16:0, 18:1, 20:4 h: 14:0,
16:0, 18:2
LisoPA De novo
AGPAT2 LPAAT2, LPAAT
r: hígado, intestino, corazón
h: corazón, hígado,
páncreas, adipocitos
20:4>18:0> 16:0
LisoPA De novo
AGPAT3 LPAAT3, LPAAT Testículo 20:4 LisoPA > LisoPI De novo y
Lands
AGPAT4 LPAAT
AGPAT5 LPAAT
GPAT1 r: tejido adiposo,
hígado 16:0>18:1 G3P De novo
GPAT2 xGPAT1 r: testículo 16:0, 18:1 G3P De novo
AGPAT8, AGPAT9
GPAT3, LPAAT
r: grasa epididimal,
intestino delgado h: riñón,
corazón, músculo
12:0 a 18:2 G3P De novo
AGPAT6 GPAT4, LPAAT h: todos tejidos 12:0 a 18:2 G3P De novo
LPGAT1 h: placenta,
hígado 16:0,
18:0,18:1 LisoPG Lands
AGPAT8 LCLAT1 r: corazón, hígado, riñón 18:1, 18:2 MLisoCL, DLisoCL Lands
AGPAT9 LPCAT1 r: pulmón 16:0 LisoPC > LisoPA, LisoPG
De novo y Lands
LPCAT2 LysoPAF, LPCAT2
r macrófagos neutrófilos
(inducidos por caseína)
2:0, 20:4 LisoPC Lands
LPEAT2 AGPAT7, LPAAT, LPCAT4*
h: cerebro 16:0, 18:0,
18:1 LisoPE > LisoPG, LisoPC, LisoPS Lands
r: ratón; h: humano; MLisoCL: monolisocardiolipina; DLisoCL: dilisocardiolipina; LisoPG: lisofosfatidilglicerol.
*Sólo denominada así en humano.
INTRODUCCIÓN
47
2.2.2.4. Transacilasa independiente de CoA (CoA-IT) y proceso de remodelación
El proceso de acilación/desacilación en los PL de membrana no es el único
mecanismo que controla el movimiento de AA en la célula; también, las reacciones de
transacilación entre las diferentes clases de PL son indispensables para la distribución
del mismo en los reservorios de PL, especialmente en los plasmalógenos de PE, donde
hay una cantidad considerable de AA esterificado [11, 12, 20, 126, 127]. En células
inflamatorias, la consecuencia más importante del proceso de remodelación es que, a
pesar de que PC es el aceptor inicial preferido de AA exógeno, en condiciones de
equilibrio el AA es más abundante en PE que en PC [11, 20] (Figura 7).
Figura 7. Proceso de remodelación de AA. El AA, activado como AA-CoA, se incorpora
preferentemente a acil-lisoPC mediante la acción de LPLAT. Posteriormente, por acción de la
CoA-IT, se transfiere a la posición sn-2 de lisoPE con enlace éter en la posición sn-1. Los lisoPL se
generan por acción de las PLA2. LPLAT: lisofosfolípido aciltransferasas; PLA2: fosfolipasas A2;
CoA-IT: transacilasa independiente de CoA.
La reacción de transacilación es llevada a cabo por la enzima CoA-IT, que
transfiere AA principalmente desde los glicerofosfolípidos de colina a plasmalógenos de
etanolamina, mediante una reacción de transacilación sin el uso de CoA [128-130]
(Figura 8).
INTRODUCCIÓN
48
Figura 8. Reacción de transacilación de un ácido graso de la posición sn-2 de PC con grupo acilo
en la posición sn-1 a PE con enlace éter en la posición sn-1, catalizada por la transacilasa
independiente de CoA (CoA-IT). R1: resto hidrocarbonado en la posición sn-1 del glicerol unido
mediante enlace éster; R2: resto hidrocarbonado en la posición sn-2 del glicerol unido mediante
enlace éster; R1’: resto hidrocarbonado en la posición sn-1 del glicerol unido mediante enlace
éter.
INTRODUCCIÓN
49
El proceso de remodelación de AA dentro de los PL es importante para la síntesis
de eicosanoides en condiciones de estimulación, puesto que la liberación de AA ocurre
preferentemente de PL con enlaces éter en la posición sn-1 [11, 129] y por ello es
necesario que este tipo de fosfolípidos posea los niveles apropiados de AA. Esta reacción
de remodelación es también importante para la generación de PAF [34], ya que se ha
observado que un producto típico de la acción de la CoA-IT es precisamente 1-alquil-2-
liso-GPC, lisoPAF [131-134].
Existen distintos factores que condicionan la actividad enzimática de la CoA-IT,
como por ejemplo la estimulación celular, circunstancias bajo las cuales la velocidad de
remodelación aumenta varias veces [129, 135]; también hay una notable diferencia
entre células que no proliferan, donde el proceso de remodelación puede llevar horas
[129, 136, 137], y células que proliferan, en las que la remodelación se produce en
cuestión de minutos [137-139]. De hecho, el bloqueo del proceso a través de la
inhibición de la CoA-IT provoca apoptosis celular [140-143]. Aunque la actividad de la
CoA-IT se ha estudiado en gran detalle [131-134, 144-146], aún no se ha conseguido ni
purificar la enzima ni clonar el gen, lo que dificulta la realización de estudios más
profundos sobre el papel de ésta en la remodelación de AA.
2.2.3. Síntesis de eicosanoides y funciones biológicas
Como se ha comentado anteriormente, la síntesis de eicosanoides se produce de
una manera muy controlada, teniendo su origen en la liberación de AA de los PL de
membrana, lo que constituye el paso limitante para la síntesis de los mismos en células
mamíferas. Los eicosanoides engloban un amplio grupo de compuestos que incluyen
prostaglandinas (PG), leucotrienos (LT), tromboxano (TX), hepoxilinas (HX), lipoxinas, y
ácidos hidroxitetraenoicos (HETEs), con múltiples funciones en procesos inflamatorios
[6, 147-149] (Figura 9), que actúan en las células inflamatorias a través de receptores
específicos acoplados a proteínas G. Estos metabolitos se sintetizan por acción de
ciclooxigenasas, lipoxigenasas y enzimas citocromo P450 (CYP), aunque también hay
algunos derivados que se producen por oxidaciones no enzimáticas de AA (Figura 9).
INTRODUCCIÓN
50
COX
5-LOX
Isoprostanos
Oxidaciónno enzimática
Prostaglandinas
Tromboxano
Leucotrienos
5-HpETE
5-HETE
5-oxoETE
15-LOX
12-LOX
Hepoxilinas
12-HpETE
12-HPETE
12-oxoETE
CYPepoxigenasas
EETs
DHETs
CYPhidrolasas
HETEs
15-HpETE
15-HETE
15-oxoETE
15-HpETE 15-HETE
Lipoxinas
Lipoxinas
Lipoxinas
11-HETE
AA
Figura 9. Rutas biosintéticas principales para la síntesis de eicosanoides. Distintas enzimas
actúan sobre el AA para la producción de derivados oxigenados. COX (azul): ciclooxigenasa; LOX
(rojo): lipoxigenasa; CYP (verde): enzimas citocromo P450; HpETE: ácido
hidroxiperoxieicosatetraenoico; HETE: ácido hidroxieicosatetraenoico; oxoETE: ácido
oxoeicosatetraenoico; EET: ácido epoxieicosatetraenoico; DHET: ácido dihidroxieicosatetrenoico.
En gris está la oxidación del AA no enzimática. Adaptado de Buckinsky et al. [147].
Las prostaglandinas son moléculas señalizadoras que se forman por acción de las
ciclooxigenasas (COX) sobre el AA, mediante su acción dual ciclooxigenasa y peroxidasa.
La COX incorpora O2 molecular para formar PGG2, que contiene un anillo de 5 carbonos,
un puente endoperóxido y un peróxido. El centro peroxidasa reduce el peróxido a
hidroxilo para formar PGH2, sustrato de diferentes prostaglandinas sintasas,
dependiendo de tipo celular y tejido, dando lugar a PGD2, PGE2 (dinoprostano), PGF2,
PGI2 (prostaciclina) o tromboxano A2 (TXA2) (Figura 10). Las prostaglandinas están
implicadas en vasoconstricción, dolor, fiebre o agregación plaquetaria, entre otras
funciones [147].
INTRODUCCIÓN
51
La prostaglandina PGE2 constituye la molécula señalizadora derivada de AA que
más se ha caracterizado. Participa en muchos procesos biológicos y enfermedades como
parto, broncodilatación, señalización del dolor, respuestas inmunes innatas y
adaptativas, cáncer, artritis y aterosclerosis [150, 151]. PGD2 es un isómero estructural
de la PGE2. PGF2 participa en un gran número de procesos fisiológicos y patológicos,
incluyendo ciclo endometrial, parto, vasoconstricción, inflamación aguda, daño por
deprivación de O2 y aterosclerosis [152]. La PGI2 por su parte inhibe la agregación
plaquetaria y constituye la señal fisiológicamente contraria a TXA2. TXA2 se sintetiza en
plaquetas, produce vasoconstricción y activación de la agregación plaquetaria. TXA2
contiene un enlace éter inestable que se hidroliza rápidamente in vivo bajo condiciones
acuosas para formar TXB2, biológicamente inactivo.
Las prostaglandinas ciclopentenonas se forman por la deshidratación de los
grupos hidroxilo de PGE2 y PGD2 (Figura 10) [147].
INTRODUCCIÓN
52
Figura 10. Principales prostaglandinas derivadas de AA. Las ciclooxigenasas (COX) catalizan la
ciclooxigenación y peroxidación del AA, generando PGH2, el cual es precursor de diferentes
prostaglandinas. COX: ciclooxigenasa; PG: prostaglandina.
INTRODUCCIÓN
53
Los leucotrienos participan en reacciones de defensa y condiciones
fisiopatológicas como la hipersensibilidad inmediata y la inflamación. Los leucotrienos
se sintetizan principalmente en células inflamatorias como mastocitos, basófilos,
eosinófilos, neutrófilos y macrófagos alveolares, y también en el sistema nervioso
central [149]. Se forman a partir de AA por la acción de la enzima 5-lipoxigenasa (LOX-
5), que se transloca a la envoltura nuclear durante la estimulación celular y cataliza el
primer paso enzimático en la síntesis de leucotrienos mediante la adición
estereoespecífica de O2 molecular en el AA creando el ácido 5-hidroperoxi-
eicosatetraenoico (5-HpETE) [153], el cual tiene varios destinos: puede ser secretado tal
cual en forma de peróxido, puede reducirse a ácido 5-hidroxieicosatetraenoico (5-
HETE), o puede ser utilizado por la 5-LOX para formar leucotrieno A4 (LTA4). Éste es un
intermedio epóxido inestable, que se hidroliza enzimáticamente para generar LTB4, o
forma LTC4 por adición de glutatión, el cual se metaboliza a LTD4 y LTE4 por sucesiva
eliminación de los residuos -glutamil y glicina (Figura 11). Además, el LTA4 es
precursor de las lipoxinas [147, 149].
El LTB4 provoca una potente activación autocrina sobre los leucocitos,
principalmente los polimorfonucleares, aumenta la permeabilidad vascular, produce
quimiotaxis, reclutamiento in vivo y adhesión de leucocitos al endotelio y a vénulas, con
el propósito de infiltrar células en el tejido infectado [149].
La mezcla de LTC4, LTD4 y LTE4 (cisteinil-leucotrienos) constituye la sustancia de
baja reactividad de la anafilaxis, por su baja y sostenida capacidad de contracción de
músculo liso. Tiene una función fisiopatológica en reacciones hipersensibles inmediatas.
Dichos cisteinil-leucotrienos son potentes vasoconstrictores, induciendo obstrucción de
aire, estimulan secreción mucosa, activan el músculo liso, incrementan permeabilidad
microvascular de las vías respiratorias y disminuyen la presión sanguínea porque
reducen la contractilidad de miocardio y al flujo sanguíneo coronario [149].
INTRODUCCIÓN
54
Figura 11. Síntesis de leucotrienos a partir de AA. La 5-lipooxigenasa (5-LOX) sintetiza LTA4, que
puede derivar a LTB4 o a LTC4. LOX: lipoxigenasa; LT: leucotrieno.
INTRODUCCIÓN
55
Otros productos con actividad biológica sintetizados por las LOX incluyen HETEs,
los cuales pueden reducirse a ácidos oxoeicosatetraenoicos (oxoETEs), hepoxilinas (HXA3
y HXB3), que se caracterizan por poseer un grupo epóxido, y lipoxinas, que se generan
cuando sobre el AA actúan varias LOX [147] (Figura 9).
Las enzimas citocromo P450 (CYT) catalizan la hidroxilación y epoxigenación de
AA, dando lugar a los ácidos epoxieicosatetraenoicos (EET), que pueden ser
posteriormente hidrolizados a ácidos dihidroxieicosatetraenoicos (DHET), y HETEs
hidroxilados en los carbonos (Figura 9).
2.2.4. Estimulación celular y liberación de AA
De entre los muchos estímulos que se pueden aplicar en células
inmunoinflamatorias para estudios de movilización de AA, uno de los más clásicos es el
zimosán. El zimosán es una preparación de paredes celulares de levaduras, formado de
complejos de proteínas y carbohidratos, principalmente manano y -glucano. Tiene la
capacidad de unirse a diferentes tipos de receptores en la superficie del macrófago
dependiendo de si las partículas están opsonizadas o no. El zimosán opsonizado se une
principalmente a FcR y CR3, y aunque CR3 tiene también la capacidad de unir zimosán
no opsonizado por diferentes sitios, no induce liberación de AA en macrófagos
peritoneales de ratón [154]. Por otra parte, el zimosán no opsonizado se une
preferentemente a dectina-1 y, en menor medida, a receptores Toll-like,
concretamente TLR2/TLR6. La liberación de AA y la síntesis de prostaglandinas y
leucotrienos en macrófagos peritoneales de ratón mediante estimulación con zimosán
no opsonizado se describió hace décadas [155-157], demostrándose ya entonces que una
actividad PLA2 es la responsable de promover la liberación de AA en condiciones de
estimulación con zimosán [158-160]. Con posterioridad, dicha actividad PLA2 se
adscribió a la cPLA2, que se regula por fosforilación y elevaciones de la concentración
intracelular de Ca2+ [161-163]. Además, se transloca al fagosoma durante la fagocitosis
de partículas de zimosán, proceso regulado por la activación de JNK, que fosforila
cPLA2 en Ser505 y que se lleva a cabo gracias a la agrupación catiónica
Lys488/Lys541/Lys543/Lys544 en macrófagos derivados de monocitos humanos estimulados
con zimosán opsonizado [56, 57]. En la liberación de AA también participa la sPLA2-V
[164, 165]. De manera similar, en células dendríticas derivadas de monocitos humanos
se ha descrito que el zimosán no opsonizado se une a dectina-1 y DC-SIGN, e induce
fosforilación de Syk, activación de cPLA2 y la consecuente movilización de AA y
expresión de la ciclooxigenasa 2 (COX-2) [166].
INTRODUCCIÓN
56
2.3. CAVEOLAS Y CAVEOLINA 1
Las caveolas son invaginaciones de la membrana en forma de matraz de 50 a 100
nm de diámetro. Constituyen microdominios especializados de membrana formados
como resultado de la acumulación localizada de colesterol, glicoesfingolípidos y
caveolina-1 (cav-1). Se encuentran en muchos tipos celulares, como células
endoteliales, epiteliales, células de músculo liso y estriado, adipocitos, fibroblastos o
neumocitos de tipo I. Sus funciones incluyen tráfico de vesículas, transporte de
colesterol, transducción de señal y supresión de tumor. Las caveolas también sirven
como plataformas de compartimentación y concentración de moléculas señalizadoras
[167-170].
Cav-1 es una proteína integral de membrana (21-24 kDa) que forma parte de la
familia de las caveolinas. Fue primero identificada por Glenney et al. [171-173], y
originalmente aislada de dos fuentes diferentes: de vesículas exocíticas derivadas del
aparato de Golgi trans [174], y de la caveola [175]. Cav-1 se expresa en todos los
tejidos, siendo más abundante en adipocitos (tipo de célula que más cav-1 y número de
caveolas posee), células endoteliales, células de músculo liso, mioblastos esqueléticos,
fibroblastos y una gran variedad de células epiteliales [170, 176]. Posteriormente se han
clonado la caveolina 2 (cav-2) [177] y la caveolina 3 (cav-3) [178]. Cav-2 tiene la misma
distribución y colocaliza con cav-1, hasta tal punto que es incapaz de salir del aparato
de Golgi por sí misma, y se degrada rápidamente en células que no expresan cav-1
[179], mientras que cav-3 es exclusiva de músculo esquelético, cardíaco y liso.
La cav-1 tiene tres exones y dos isoformas, y [180]. Tiene una topología
inusual, formando una horquilla embebida en la membrana con ambos extremos, amino
y carboxilo, en el citoplasma (Figura 12) [181]. Se encuentra dentro de la caveola,
principalmente, aunque según tipos celulares también puede encontrarse en citosol,
Golgi, endosomas y cuerpos lipídicos [182, 183]. Desempeña una importante función
estructural formando las invaginaciones caveolares [184], y, si la caveola se internaliza,
la proteína puede ciclar a varios compartientos celulares [185, 186]. Además, posee la
propiedad de formar oligómeros de alto peso molecular [187, 188]; es capaz de unir
colesterol, y está implicada en su incorporación y transporte [189, 190]; también puede
interaccionar directamente con proteínas señalizadoras y mantenerlas en conformación
inactiva [191]. Hace más de una década la cav-1 se definió como proteína que une
ácidos grasos, por tanto implicada en el transporte de los mismos [192-194].
INTRODUCCIÓN
57
Figura 12. Topología de la caveolina 1 en la membrana celular interna. La representación
corresponde a un dímero de cav-1; la asociación interprotomérica se mantiene a través del
dominio de oligomerización (verde claro y oscuro). La asociación con la membrana celular se
mantiene con los dominios de adhesión a membrana N-terminal y C-terminal (verde oscuro y
azul, respectivamente), el dominio transmembrana (rojo) y los tres restos palmitoil (marrón).
Membrana plasmática, gris oscuro; membranas enriquecidas en colesterol y esfingomielina, gris
claro. Figura tomada de Hnasko et al. [195].
En la actualidad existen varios tipos de ratones modificados genéticamente que
no expresan cav-1, generados en diferentes laboratorios. En este trabajo se han
utilizado dos tipos de ratones sin cav-1 o knockout (KO): el creado por Drab et al. [196],
por escisión del exón 3, que codifica el dominio transmembrana, sitios de
palmitoilación, y el dominio scaffolding de la proteína, y el creado por Razani et al.
[197], en el que se han reemplazado los exones 1 y 2 y una pequeña porción del
promotor 5’ con el casete de resistencia a neomicina (Figura 13). Existen además otros
dos tipos de ratones: por disrupción del exón 2 [198] y disrupción de los exones 1 y 2
[199].
Citosol
Medio extracelular
INTRODUCCIÓN
58
Exón 1 Exón 2 Exón 3
34216530
Neo
Neo
Exón 1 Exón 2 Exón 3
34216530
Neo
Neo
Figura 13. Formación de ratones KO de cav-1. Representación esquemática del gen de cav-1 y
de las modificaciones genéticas para la formación de ratones KO. Los exones se representan en
cajas de colores, con el número de nucleótidos de que está compuesto cada exón. La caja azul
indica el emplazamiento del casete de resistencia a neomicina (Neo). Adaptado de Le Lay et al.
[182].
Los primeros estudios mostraron que estos ratones son viables y fértiles, carecen
de caveolas así como de expresión de cav-2 (cav-1 y cav-2 forman hetero-oligómeros
[200]), muestran defectos en la endocitosis y un fenotipo hiperproliferativo, aunque no
mayor incidencia de carcinomas [196, 197].
Con el tiempo se han descrito las anomalías de ambos tipos de ratones en mayor
profundidad, muchas de las cuales están relacionadas con el metabolismo de lípidos. Las
anomalías más destacadas se detallan a continuación.
No se aprecian diferencias en el contenido lipídico de las fracciones de
membrana resistentes a detergentes ni en la apariencia de tejido adiposo
intraperitoneal; sin embargo, a medida que se hacen mayores tienden a ser más
delgados, ofrecen resistencia a desarrollar obesidad inducida por dieta, los adipocitos
son de menor diámetro, presentan elevados niveles de ácidos grasos libres y TAG,
acumulación de quilomicrones, resistencia a insulina, menor incorporación de glucosa,
alteración en la formación de cuerpos lipídicos como consecuencia de su papel en el
transporte de colesterol, aterosclerosis, alteraciones urogenitales, defectos en
angiogénsis, hipermeabilidad vascular, mayor tumorigenicidad cuando son expuestos a
carcinógenos y lactancia prematura. Por último, se ha descrito mayor grado de
mortalidad entre las 27-65 semanas, consecuencia de una progresiva fibrosis pulmonar
(provocada por la hipercelularidad y engrosamiento de la pared alveolar), hipertensión e
hipertrofia cardíaca [182, 195, 201].
Cav-1
Drab et al., 2001
Razani et al., 2001
3. OBJETIVOS
OBJETIVOS
61
El objetivo general de este trabajo es estudiar en mayor profundidad los
mecanismos de incorporación y remodelación del AA en los PL de membrana de
diferentes tipos celulares correspondientes a la línea fagocítica mononuclear, más
específicamente promonocitos, monocitos y macrófagos, y la relación de estos procesos
con diferentes condiciones celulares, como estimulación celular y contenido endógeno
de AA, o con ciertas proteínas, concretamente su relación con la caveolina 1. De forma
más específica, los objetivos perseguidos son:
1. Entender mejor los aspectos bioquímicos de la incorporación y remodelación del
AA en los PL entre las células promonocíticas humanas U937 y monocitos
humanos, la relación de los mismos con el estado de diferenciación celular y el
contenido endógeno de AA esterificado.
2. Estudiar el proceso de incorporación de AA en monocitos humanos extraídos de
sangre periférica en condiciones de estimulación con zimosán, y determinar la
enzima del metabolismo del AA responsable del aumento de incorporación
observado en situación de activación celular.
3. Estudiar el efecto de la ausencia de cav-1 en la incorporación y distribución del
AA dentro de los PL de macrófagos peritoneales de ratón, tanto en lo relativo a
la incorporación de AA exógeno, como en la reacilación del endógeno en
condiciones de estimulación, y su implicación fisiopatológica en procesos de
inflamación aguda in vivo.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
65
4.1. MATERIALES
4.1.1. Material químico y biológico
4.1.1.1. Citometría
Anti-Ly-6G-FITC (eBioscience)
IgG2 de rata (control de isotipo) (eBioscience)
Suero de cabra (Abcam)
4.1.1.2. Compuestos sólidos y otros
Albúmina de suero bovino, libre de ácidos grasos y endotoxinas (Sigma-Aldrich)
ATP (Sigma-Aldrich)
Cloruro cálcico (Scharlab)
Cloruro potásico (Scharlab)
Cloruro sódico (Scharlab)
CoA (Sigma-Aldrich)
Dihidrógeno fosfato potásico (Scharlab)
EDTA (Scharlab)
Hidrógeno fosfato sódico (Scharlab)
Hidróxido potásico (Scharlab)
Iodo (Scharlab)
Tris-(hidroximetil)-aminometano (Tris-base) (Scharlab)
Tris-HCl (Scharlab)
Placas de silicagel G 20x20 cm (Macherey-Nagel)
4.1.1.3. Cultivo celular
Estreptomicina (Gibco)
Gentamicina (Lonza)
Medio DMEM (lonza)
Medio Optimem (Lonza)
Medio RPMI 1640 con L-glutamina (Gibco)
Penicilina (Gibco)
Suero fetal bovino (Gibco)
Tripsina (170000 U/l) con EDTA (200 mg/l)
MATERIALES Y MÉTODOS
66
4.1.1.4. Detergentes
Triton X-100 (Scharlab)
4.1.1.5. Disolventes orgánicos, ácidos y bases
Para espectrometría de masas
Cloroformo (grado espectrofotométrico) (Sigma-Aldrich)
Metanol (calidad LC-MS) (Fluka)
Hexano (calidad HPLC) (Sigma-Aldrich)
Hidróxido de amonio 32% (extrapuro, Merck)
Para otros usos
Ácido acético (extrapuro, Scharlab)
Ácido clorhídrico 35% (extrapuro, Scharlab)
Butanol (extrapuro, Scharlab)
Cloroformo (grado reactivo, Scharlab)
Dietil éter (extrapuro, Scharlab)
DMSO (extrapuro, Scharlab)
Etanol (para biología molecular, Scharlab)
Hexano (extrapuro, Scharlab)
Hidróxido de amonio 28% (grado reactivo, Scharlab)
Metanol (extrapuro, Scharlab)
2-propanol (para biología molecular, Scharlab)
4.1.1.6. Estímulos
Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (Sigma-Aldrich)
Ionomicina (Sigma-Aldrich)
Zimosán (Sigma-Aldrich)
4.1.1.7. Inhibidores de fosfolipasas
Bromoenol lactona (BEL) (Cayman)
Pirrofenona (Pir): cedida amablemente por el Dr. T. Ono (Shionogi, Osaka, Japón)
Propranolol (Sigma-Aldrich)
4.1.1.8. Kits
Kit de innmunoensayo para medición de PGE2 (Kookaburra, Sapphire Biosciences)
Kit de innmunoensayo para medición de LTB4 (Kookaburra, Sapphire Biosciences)
MATERIALES Y MÉTODOS
67
4.1.1.9. Lípidos
Ácido araquidónico (Sigma-Aldrich)
Ácido linoleico (Sigma-Aldrich)
Ácido oleico (Sigma-Aldrich)
Ácido 1-oleil-sn-glicero-3-fosfato (sal de sodio) (Sigma-Aldrich)
Ácido palmítico (Sigma-Aldrich)
Ácido cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoico (Sigma-Aldrich)
1-acil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (extraído de yema de huevo, contiene
principalmente 16:0 y 18:0 en la posición sn-1) (Sigma-Aldrich)
1-acil-sn-glicero-3-fosfoinositol (extraído de soja, contiene principalmente 16:0 y 18:0
en la posición sn-1) (Sigma-Aldrich)
1,2-dinonadecanoina (rac) (Larodan)
1,2-didodecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Sigma-Aldrich)
1,2-diheptadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (Larodan)
1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (Sigma-Aldrich)
1,2-dinonadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (Larodan)
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
Mezcla de 37 ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) (Supelco)
Nonadecanoato de metilo (Sigma-Aldrich)
1-O-Octadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (LisoPAF) (Biomol)
Trinonadecanoina (Larodan)
Vaccenato o cis-11-octadecenoato de metilo (Sigma-Aldrich)
4.1.1.10. Lípidos deuterados
Acido[5,6,8,9,11,12,14,15-d8]araquidónico (Sigma-Aldrich)
4.1.1.11. Lípidos radioactivos y otros productos relacionados
Acido [5,6,8,9,11,12,14,15-3H]araquidónico, 210 Ci/mmol (GE Healthcare)
Acido [1-14C]docosahexaenoico, 55 mCi/mmol (American Radiolabeled Chemicals)
Acido [1-14C]palmítico, 60 mCi/mmol (Perkin Elmer)
Acido [1-14C]oleico, 58 mCi/mmol (Perkin Elmer)
[14C(U)] Glicerol, 137 mCi/mmol (GE Helthcare)
1-O-[3H]Octadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (lisoPAF), 185 Ci/mmol (GE Healthcare)
Líquido de centelleo (Beckman Coulter)
MATERIALES Y MÉTODOS
68
4.1.1.12. Oligonucleótidos para PCR convencional
En la Tabla 10 se detallan los oligonucleótidos utilizados de LPCAT2 y LPCAT3
para PCR convencional, de la casa comercial Eurofins MWG Operon.
Tabla 10. Oligonucleótidos utilizados en PCR convencional.
Gen Cebador directo Cebador inverso
LPCAT2 5’-TGGAACTCCTGGAATGAGG-3’ 5’-TGTGCAACCAGTTTTGGTGT-3’
LPCAT3 5’-ATTTGTCCCACGTGAAGAGG-3’ 5’-GGATACCTGGTCTGCTTCCA-3’
4.1.1.14. Proteínas (cuantificación)
Reactivo Bradford (Bio-Rad)
4.1.1.15. RNA, cDNA, Q-PCR y RT-PCR
Agarosa (Biotools)
Bromuro de etidio (Sigma-Aldrich)
Cebadores decámeros aleatorios (50 M) (Ambion)
Cebadores oligo (dT) (50 M) (Ambion)
Colorante para carga de DNA (Fermentas)
DNA polimerasa (1 U/l) (Biotools)
Ensayo de expression de gen TaqMan (Applied Biosystems)
H2O DEPC (Sigma-Aldrich)
Inhibidor de RNAsa (20 U/l) (Ambion)
Marcador de peso molecular de DNA 100 pb (0,5 mg/ml) (Biotools)
Mezcla de dNTPs (25 mM cada uno) (Biotools)
Mezcla para qPCR DyNAmo SYBR green (Thermo Scientific)
Transcriptasa reversa M-MLV (100 U/l) (Ambion)
Tri-Reagent (Ambion)
4.1.1.16. RNA de interferencia (siRNA)
Todos se adquirieron de la casa comercial Ambion.
LPCAT2: 5’-3’ GCA UGA AGA GAG UAC CUC A
LPCAT3: 5’-3’ CCA UUG CCU CAU UCA ACA U
Control negativo (1)
Control negativo fluorescente marcado con amidato de fluoresceína (FAM)
MATERIALES Y MÉTODOS
69
4.1.1.17. Transfección
Lipofectamina (Invitrogen Life Technologies)
4.1.1.18. Tampones, soluciones y otros
PBS 1X (lavados y preparación de otros tampones): NaCl 0,14 M, KCl 2,7 mM,
Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,7 mM
TAE 1X (corrida de geles de agarosa): Tris-base 40 mM, ácido acético glacial
0,1%, EDTA 1 mM a pH 8,8.
4.1.2. Células y animales
La línea celular U937 (promonocitos humanos) utilizada en este trabajo fue
cedida por el Dr. Patricio Aller, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid. Esta
línea celular proviene de células malignas aisladas de efusión pleural de un paciente
caucásico de 37 años con linfoma histocítico [202]. La línea celular HEK293 deriva de
células humanas embrionarias de riñón, provenientes de la casa ATCC [203]. En cuanto a
las células de cultivo primario, los monocitos humanos se extrajeron de sangre
periférica, concretamente de bolsas de leucoféresis constituidas por restos de sangre de
cinco donantes sanos, cedidas por el Centro de Hemoterapia y Hemodonación de Castilla
y León (Valladolid). Asimismo, los ratones transgénicos carentes de cav-1 o KO y el
correspondiente control o wild type (WT) fueron cedidos amablemente por los Dres.
Miguel Ángel del Pozo (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III,
Madrid) [204] y Albert Pol (Instituto de Investigación Biomédica August Pi i Sunyer,
Barcelona) [205].
Se utilizaron dos tipos de ratones deficientes en cav-1, de la cepa C57Bl6/j,
creado por Drab et al. [196], y el creado por Razani et al. [197] y comercializado por
Laboratorios Jackson, mezcla de las cepas 129/Sv, C57BL/6J y SJL. Ambos fueron
criados en homocigosis. Exceptuando la incorporación de [3H]AA a diferentes
concentraciones, que se realizó con ambos tipos de ratones KO, el resto de los
experimentos se realizaron con los ratones de Razani et al. [197].
MATERIALES Y MÉTODOS
70
4.2. MÉTODOS
4.2.1. Aislamiento de células, cultivo y ensayos in vivo 4.2.1.1. Cultivo de líneas celulares tumorales
Las líneas celulares U937 y HEK293 se mantuvieron en medio RPMI 1640 y DMEM,
respectivamente, suplementados con glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml),
estreptomicina (100 g/ml) y suero fetal bovino a una concentración de 10% (v/v), a
37 ºC en atmósfera humidificada con 5% de CO2. Las HEK293 se despegaron incubando
las células con tripsina durante 1 min.
La línea celular U937 se diferenció a monocito mediante la administración de
PMA a una concentración de 35 ng/ml durante 24 h [206].
En caso de enriquecer las células con AA, estas se incubaron durante 20 h con
AA 100 M complejado con albúmina (BSA) en una proporción 5:1.
4.2.1.2. Aislamiento de monocitos humanos
El contenido de la bolsa de leucoféresis se diluyó en una proporción 1:1 con PBS,
se vertió sobre un colchón de Ficoll, en una proporción 2:1 v/v, y se centrifugó durante
30 min a 1900 rpm (726 g). La capa de células mononucleares que se obtuvo al
centrifugar se recogió y se lavó tres veces con PBS, centrifugando en cada caso durante
10 min a 1500 rpm (453 g). Posteriormente, las células se contaron y cultivaron en
medio RPMI 1640 suplementado con glutamina 2 mM y gentamicina a 40 g/ml, a 37 ºC
en atmósfera humidificada con 5% de CO2, permitiendo la adherencia de los monocitos
durante 2 h. Después de ese tiempo los monocitos se lavaron con PBS, eliminando
linfocitos y restos celulares que quedaron en suspensión, y se dejaron durante toda la
noche en las mismas condiciones mencionadas anteriormente antes de realizar el
ensayo.
4.2.1.3. Extracción de macrófagos peritoneales de ratón
Los macrófagos peritoneales de ratón se extrajeron mediante una modificación
del protocolo descrito por Cohn y Benson [207]. Los animales se sacrificaron mediante
exposición a CO2. Posteriormente se abrió la piel abdominal y se les inyectó 5 ml de PBS
frío. Tras una agitación suave, se recogió el fluido intraperitoneal, haciendo en total dos
extracciones. El contenido intraperitoneal se centrifugó durante 10 min a 1200 rpm (290
g) y las células se cultivaron en placas de 6 pocillos con medio RPMI 1640, glutamina 2
mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 g/ml y 10% de FBS, a 37 ºC en atmósfera
MATERIALES Y MÉTODOS
71
humidificada con 5% de CO2, permitiendo la adherencia de los macrófagos durante toda
la noche antes de proceder al ensayo.
4.2.1.4. Estímulos e inhibidores 4.2.1.4.1. Estímulos
El estímulo celular utilizado en monocitos y macrófagos fue zimosán, a una
concentración de 1 mg/ml hasta 1h, tiempo y concentración a la que se alcanza el
máximo de liberación de AA [158, 208-210].
Las células HEK293 se estimularon con PMA 0,1 M junto con ionomicina 1 M [211,
212] durante 30 min.
Preparación de partículas de zimosán
El zimosán se resuspendió en PBS, se calentó durante 60 min a 100 ºC, se centrifugó
durante 30 min a 4000 rpm (3220 g), y se lavó tres veces con PBS, centrifugando en cada
caso a 4000 rpm (3220 g) durante 5 min. El precipitado final se resuspendió en PBS a
una concentración final de 20 mg/ml y se guardó a -20 ºC hasta su uso. Antes de cada
experimento, el zimosán se sonicó en un sonicador de tip (Fisher Bioblock Scientific
Vibra-Cell 75115) 2 veces durante 20 s [158, 208-210, 213].
4.2.1.4.2. Inhibidores
En este trabajo se utilizaron tres inhibidores químicos de PLA2 [15]: la
pirrofenona (Pir), inhibidor de la cPLA2, a una concentración de 1 M, la bromoenol
lactona (BEL), inhibidor de la iPLA2, a una concentración de 10 M, y el propranolol, que
inhibe la enzima fosfatidato fosfohidrolasa-1 (PAP-1), a una concentración de 200 M.
En ensayos de actividad realizados in vitro con anterioridad se demostró que, para
concentraciones usadas en este estudio, las actividades de la cPLA2 y la iPLA2 se
inhiben cuantitativamente con Pir [214-218] y BEL [28, 208, 219-223], respectivamente.
Además, a las concentraciones utilizadas la Pir no afecta a la actividad de la iPLA2, así
como tampoco para el BEL tiene efecto alguno en la actividad de la cPLA2. Asimismo, a
la concentración utilizada para propranolol la enzima PAP-1 se encuentra
completamente inhibida [224, 225]. Los inhibidores se añadieron 30 min a las células
antes del estímulo.
MATERIALES Y MÉTODOS
72
4.2.1.5. Liberación de AA en condiciones de estimulación
Para el caso de los monocitos, una vez extraídos de la sangre periférica, se
dejaron adherir a los pocillos durante 2 h aproximadamente. Después de ese tiempo, los
monocitos se lavaron con PBS dos veces, y se dejaron en medio incompleto con [3H]AA,
a una concentración de 0,25 Ci/ml. Pasadas 20 h, los monocitos se lavaron tres veces
con medio incompleto conteniendo BSA a una concentración de 0,5 mg/ml con el fin de
eliminar el exceso de ácido graso. Tras los lavados, las células se dejaron en medio
incompleto con BSA (0,5 mg/ml) y se añadió zimosán, a 1 mg/ml, incubando durante 1 h
en presencia de albúmina con el fin de evitar la reacilación del [3H]AA liberado, el cual
se compleja a la albúmina presente. Pasado ese tiempo, se recogieron los
sobrenadantes, se centrifugaron con el fin de descartar restos celulares y células no
adheridas y una fracción se recogió para medir la radioactividad, mezclándolo
previamente con 3 ml de líquido de centelleo en un contador de centelleo (modelo 6500
de Beckman Coulter LS).
4.2.1.6. Inducción de peritonitis en ratón
La peritonitis se indujo mediante una inyección intraperitoneal de 1 mg de
partículas de zimosán en un volumen de 500 l de PBS estéril. Los ratones control se
inyectaron sólo con PBS. Los ratones se mantuvieron 12 h antes de sacrificarlos en la
cámara de CO2, y el contenido intraperitoneal se extrajo tal y como se detalla en el
apartado anterior [226].
4.2.1.7. Incorporación de ácidos grasos a los lípidos celulares 4.2.1.7.1. Incorporación de ácidos grasos radiactivos
Las células, distribuidas en placas de 6 pocillos en el caso de células adherentes
(monocitos, macrófagos peritoneales y HEK293) o en tubos de 1,5 ml en el caso de
células en suspensión (U937), se mantuvieron en medio sin suero durante 1 h a una
concentración de 106 células/ml, y posteriormente se añadió [3H]AA (0,25 Ci/ml),
ácido [14C] palmítico (Pam), ácido [14C]oleico (Olc) o ácido [14C]docosahexaenoico (DHA)
(0,1 Ci/ml) a la concentración deseada. Se incubó durante el tiempo oportuno, tras el
cual se retiró el medio y las células se lisaron con 150 l de Tritón X-100 al 0,1% en agua
a 4 ºC. Posteriormente se extrajeron y separaron los lípidos celulares tal y como se
explica en el apartado 4.2.3. Las bandas de sílice correspondientes a las principales
especies de lípidos que incorporaron AA, tras ser visualizadas con vapores de yodo, se
MATERIALES Y MÉTODOS
73
rasparon y junto con líquido de centelleo se midió la radioactividad en el contador de
centelleo.
4.2.1.7.2. Incorporación de [2H]AA
Las células U937 (en tubos de 1,5 ml), los monocitos humanos o macrófagos
peritoneales (en placas de 6 pocillos), se incubaron 1 h en medio incompleto antes de la
adición de [2H]AA a una concentración de 1 o 10 M. Se incubaron las células durante
30 min y posteriormente se lisaron con agua muy fría.
4.2.2. DNA y RNA 4.2.2.1. Transfección de siRNA
Las células se dejaron en medio sin antibiótico durante 2 h antes de añadir una
mezcla de siRNA y lipofectamina 2000 (lípido catiónico que interacciona con la
membrana y permite la introducción de moléculas, como por ejemplo ácidos nucleicos),
hecha en medio Optimem y mantenida durante 20 min para permitir la formación de los
complejos, hasta una concentración final en el pocillo de 200 nM de siRNA y 2,5 g/ml
de lipofectamina, siguiendo las instrucciones del fabricante de la lipofectamina 2000.
Las células se incubaron 24 h con el complejo y, transcurrido ese tiempo, se cambió el
medio por medio propio de cada tipo celular sin suero. Las células se incubaron otras
24 h adicionales (48 h en total) con el fin de asegurar la degradación de la proteína
preexistente. Pasado ese tiempo, se extrajo el mRNA o bien se procedió a un ensayo de
incorporación de [3H]AA.
4.2.2.2. Extracción de RNA y síntesis de cDNA 4.2.2.2.1. Extracción de RNA
El RNA se extrajo de las células siguiendo el procedimiento descrito por
Chomczynski y Sacchi [227] y siguiendo las instrucciones del reactivo comercial para
aislar RNA, Tri Reagent, una disolución de isotiocianato de guanidina en fenol. Se lisaron
las células con aproximadamente 1 ml de Tri Reagent por 5-10 x 106 células durante
5 min a Tª ambiente con el fin de permitir la disociación de los complejos de
nucleoproteínas. Se añadieron 200 l de CHCl3, se agitó durante 15 s, se incubó 5 min a
Tª ambiente y se centrifugó a 12000 rpm (13400 g) durante 15 min a 4 ºC. Se recogió la
fase acuosa, donde se encuentra el RNA, que se transfirió a otro tubo junto con 500 l
de isopropanol. Se incubó durante 10 min a Tª ambiente con el fin de precipitar el RNA.
Se centrifugó a 12000 rpm (13400 g) durante 10 min a 4 ºC. Se eliminó el sobrenadante y
MATERIALES Y MÉTODOS
74
el RNA se lavó con etanol al 75% (en H2O-DEPC) y se centrifugó a 12000 rpm (13400 g)
durante 5 min a 4 ºC. El RNA se dejó secar, se disolvió en 25 l de H2O DEPC y se
cuantificó a través de medida de absorbancia (A) a 260 nm en un espectrofotómetro
UV/visible (BioPhotometer, Eppendorf) usando una cubeta TrayCell (Helma Analytics).
4.2.2.2.2. Síntesis de cDNA
Para la síntesis de DNA complementario (cDNA) se partió de 2 g de RNA y se
calentó junto con 0,1 nmol de cebadores aleatorios (2 l) y 0,1 nmol de oligo dT (2 l)
entre 70 y 85 ºC durante 3 min, y se completó con H2O DEPC hasta un volumen de
13,4 l. Las muestras se colocaron en hielo y se añadió 40 nmol de cada dNTP (1,6 l de
la mezcla comercial), 40 U de inhibidor de RNAsa (2 μl), 100 U de transcriptasa reversa
M-MLV (1 μl), junto con 2 l de su correspondiente tampón de reacción comercial
(Tris 500 mM pH 8,3, KCl 500 mM, DTT 50 mM y MgCl2 30 mM), siendo el volumen final
de la reacción de 20 μl. La mezcla de reacción se calentó a 43 ºC durante 1h, y
finalmente a 92 ºC durante 10 min. Para la Q-PCR y RT-PCR, se partió de una dilución
1:5 de la anteriormente indicada.
4.2.2.3. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) y cuantitativa (Q-PCR) 4.2.2.3.1. RT-PCR y electroforesis en geles de agarosa
Para la amplificación de DNA se utilizó cDNA como molde (20 ng), al que se
añadieron 20 nmol de cada dNTP (0,8 l de la mezcla), 20 pmol de los cebadores
directos e inversos (2 l de cada uno), 1 U DNA polimerasa termoestable de Thermus
thermophilus (1 l), junto con 5 l de su correspondiente tampón de reacción (Tris HCl
750 mM pH 9,0, MgCl2 20 mM, KCl 500 mM y (NH4)2SO4 200 mM), y se completó con H2O
DEPC hasta un volumen final de 50 l.
El programa de temperaturas usado para la amplificación del cDNA fue el
siguiente:
1. 95 ºC 10 min
2. 35 ciclos:
a. 95 ºC 30 s
b. 58 ºC 45 s
c. 72 ºC 30 s
3. 72 ºC 10 min
4. 4 ºC indefinidamente
MATERIALES Y MÉTODOS
75
La separación electroforética de fragmentos de DNA se realizó en geles de agarosa
del 2% (p/v) en TAE 1X y con bromuro de etidio (0,004% v/v) para la visualización de los
fragmentos de DNA en luz ultravioleta, en un sistema de documentación de geles
(GelDoc XR, Bio-Rad). Los geles se corrieron en tampón TAE 1X.
4.2.2.3.2. Q-PCR (PCR cuantitativa)
Cuantificación de niveles de mRNA mediante el método comparativo ΔΔCT
La Q-PCR se utilizó como técnica de cuantificación relativa, en la que se
determinó el cambio de expresión del gen bajo un tratamiento respecto a una condición
control, y normalizado todo respecto a un control endógeno (gen de referencia, cuya
expresión se mantiene constante en las muestras que se pretenden comparar). A
continuación se explica brevemente en qué se basa el método comparativo ΔΔCT [228,
229].
La ecuación que describe la amplificación exponencial de PCR para un gen dado
X en el ciclo umbral CT (punto de intersección entre la línea umbral y la fase
exponencial de la curva que representa la fluorescencia emitida en función del número
de ciclos de la reacción) se puede expresar como:
XT = X0(1 + Ex)CT,x
donde XT es el número de moléculas problema en el ciclo CT, X0 es el número inicial de
moléculas problema y Ex es la eficiencia de la amplificación de la molécula problema.
Relativizando la amplificación de la molécula problema en un determinado tratamiento
frente a la amplificación de la molécula problema en la situación control, y ambas
frente a la amplificación del gen de referencia, así como asumiendo que la eficiencia de
ambos genes es igual a 1, se llega a la expresión:
Expresión relativa = 2 –ΔΔCT
Dicha expresión se utilizó para el cálculo de cambios de expresión de ciertos
genes en relación a la situación control.
Sonda Taqman
Gene Expression Assay TaqMan consta de los cebadores correspondientes para
amplificar la secuencia de interés, a una concentración final de 900 nM cada uno, una
sonda Taqman MGB marcada con colorante 6-FAM (6-carboxifluoresceína), a una
MATERIALES Y MÉTODOS
76
concentración final de 250 nM, una DNA polimerasa y un medio de reacción. Como gen
de referencia se utilizó la -actina. Experimentalmente se siguieron las instrucciones
dadas por Applied Biosystems. En un tubo de reacción se mezclaron 1 l de la sonda
TaqMan, 9 l del cDNA de interés (1 ng) disuelto en H2O, y 10 l del medio de reacción
junto con la DNA polimerasa (Taqman Universal PCR Master Mix), siendo el volumen
final de 20 l.
La reacción se llevó a cabo en un termociclador Chromo4 Detector PTI-200 (Mj
Research), software Opticon Monitor versión 3.0, con las siguientes condiciones:
1. 50 ºC 2 min
2. 95 ºC 10 min
3. 40 ciclos de:
a. 95 ºC 15 s
b. 60 ºC 1 min
4. 4 ºC durante tiempo indefinido
4.2.3. Análisis de lípidos 4.2.3.1. Extracción de lípidos y separación en TLC
Las células se resuspendieron en H2O, se añadió el correspondiente estándar
interno, en caso de ser necesario, y se procedió a la extracción de los lípidos celulares
siguiendo el protocolo descrito por Bligh & Dyer [230]: se añadieron 3,75 volúmenes (en
relación al volumen de la fase acuosa) de cloroformo/metanol 1:2 v/v, se agitó, se
añadieron 1,25 volúmenes de H2O y 1,25 volúmenes de cloroformo, se agitó de nuevo y
se centrifugó a 3000 rpm (800 g) durante 5 minutos a 4 ºC con el fin de separar las
fases. Posteriormente se extrajo la fase orgánica, que se vertió en otro tubo. Sobre la
fase acuosa se añadieron 2 volúmenes de cloroformo, se agitó de nuevo y se centrifugó
de igual forma. Se extrajo la fase orgánica, que se juntó con la fracción anterior. La
fase orgánica extraída se concentró hasta sequedad y se procedió a la separación de los
lípidos mediante cromatografía en placa fina (TLC), en los casos necesarios. El extracto
lipídico se disolvió en 20 l de cloroformo/metanol 2:1 v/v y se pinchó en una TLC,
activada previamente mediante calor (65 ºC durante 24 h en una estufa), junto con
estándares de las correspondientes clases de lípidos. La TLC se desarrolló en el sistema
hexano/dietil éter/ácido acético (70:30:1 v/v/v) para la separación de lípidos neutros,
cloroformo/metanol/hidróxido de amonio al 28% (65/25/5 v/v/v) para la separación de
distintas clases de PL (especialmente PC, PE y PI) [209], y cloroformo/metanol/ácido
acético/H2O (50/40/8/2 v/v/v/v) para la separación de PA y lisoPA [231]. La porción de
MATERIALES Y MÉTODOS
77
TLC donde se encontraban los estándares se cortó y se expuso a vapores de yodo,
permitiendo su visualización. Los factores de retención (Rf) de los estándares se
utilizaron para localizar los lípidos de la muestra en la TLC. Dichas porciones se
cortaron, se introdujeron en tubos de 2 ml y los lípidos fueron reextraídos de la sílice
mediante 1 ml de cloroformo/metanol 1:1 v/v, seguido de 1 ml de cloroformo/metanol
2:1 v/v, centrifugando en cada caso la sílice a 12000 rpm (13400 g) durante 5 min con el
fin de recoger la fase orgánica limpia.
4.2.3.2. Análisis de ácidos grasos mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS)
4.2.3.2.1. Derivatización de ácidos grasos
La fase orgánica extraída de la TLC se concentró, se redisolvió en 50 l de
cloroformo/metanol 2:1 v/v y se introdujo en un tubo de vidrio roscado. Se añadieron
500 l de KOH 0,5 M en metanol y se calentó a 37 ºC durante 30 min en agitación,
produciéndose la transmetilación de los ácidos grasos. La reacción se neutralizó
añadiendo un volumen de HCl 0,5 M, y los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs)
se extrajeron dos veces con un volumen de hexano. Esta fase orgánica se guardó a
-80 ºC en atmósfera de N2 hasta su análisis.
4.2.3.2.2. Análisis de ésteres metílicos
El análisis de los ésteres metílicos obtenidos se realizó en un cromatógrafo de
gases (Agilent 6890N) dotado de un espectrómetro de masas como detector (Agilent
5975 MS) en modo de impacto electrónico (EI, 70 eV), equipado con un inyector
automático (Agilent 7693 autosampler) y una columna capilar (Agilent DB-23)
[(50%-cianopropil)-metilpolisiloxano] de 60 m x 250 m D.I. x 0,15 m (grosor de
película). El programa de temperatura utilizado, detallado a continuación, fue una
modificación del descrito por Abu et al. [232].
La temperatura del inlet se mantuvo a 250 ºC. La temperatura del horno se
programó a 50 ºC durante 1 min, se incrementó hasta 175 ºC a 25 ºC/min, y
posteriormente hasta 230 ºC a 2,75 ºC/min. La temperatura final se mantuvo 5 min,
siendo el tiempo total de la carrera 32,8 min. La temperatura de la línea de
transferencia del espectrómetro de masas se programó a 250 ºC, y la del cuadrupolo y la
fuente del MS a 150 ºC y 230 ºC, respectivamente.
Se utilizó He como gas portador, a una presión constante de 26,1 psi. En cada
caso se inyectó 1 l de muestra en modo splitless (sin división de la muestra).
MATERIALES Y MÉTODOS
78
La adquisición de datos se realizó en modo scan para la identificación de
compuestos, y en modo SIM (monitorización de iones seleccionados) para la
cuantificación. La identificación de compuestos se realizó usando el tiempo de
retención característico para cada FAME (éster metílico de ácido graso) así como la
librería de espectros NIST (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología). Para la
cuantificación en modo SIM se usaron los siguientes fragmentos: 74 y 87 para FAMES
saturados, 83 para monoinsaturados, 67 y 81 para diinsaturados, y 79 y 91 para
poliinsaturados [233].
La cuantificación se llevó a cabo mediante el uso de un estándar interno (lípido
análogo al lípido problema del cual se quiere conocer la composición de ácidos grasos
pero con cadenas de un número impar de átomos de carbono, que son despreciables en
la naturaleza) y mediante una curva de calibración externa para cada FAME.
El espectrómetro de masas fue calibrado usando PTFBA (perfluorotributilamina)
suministrado con el aparato y usando el protocolo del equipo.
El software utilizado fue MSD Productivity Chemstation, G1701EA, revisión
E.02.00 SP2 (G1701-64553).
4.2.3.3. Análisis de especies de fosfolípidos mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS)
4.2.3.3.1. Acoplamiento HPLC/ESI/MS
La separación cromatográfica de los PL se realizó en un sistema de HPLC
compuesto por un sistema de bombas binario con desgasificador en línea y régimen de
gradiente Hitachi LaChrom Elite L-2130 (Merck) y un inyector Hitachi Autosampler
L-2200 (Merck), acoplado a un espectrómetro de masas de trampa iónica Bruker Esquire
6000® (Bruker Daltonics). El efluente procedente del HPLC fue dividido, dejando entrar
un flujo de 0,2 ml/min a la cámara de electronebulización (ESI) del espectrómetro de
masas mediante un separador de caudal. En los casos en los que fue necesario añadir un
modificante después de la columna para favorecer la ionización, éste se añadió a través
de una jeringa Hamilton, movilizada por un pistón (Cole-Parmer) que proporciona flujo
continuo y conectada con la columna a través de una conexión en “T” antes del
separador de caudal. La presión del gas de nebulización se ajustó a 30 psi, el caudal del
gas de secado a 4 l/min y la temperatura del gas de secado a 350 ºC. La calibración de
la trampa iónica se realizó mediante el protocolo del propio equipo con la solución
Tunning Mix (Agilent).
MATERIALES Y MÉTODOS
79
4.2.3.3.2. Análisis de especies moleculares de PC, PE y PI
Los lípidos totales se extrajeron de diferente cantidad de células de acuerdo al
procedimiento de Bligh Dyer, añadiendo previamente los estándares internos
apropiados. Se evaporó el disolvente y las muestras se redisolvieron en metanol/agua
(9:1 v/v) y se guardaron bajo atmósfera de N2 a -80 ºC hasta su análisis. Para la
separación cromatográfica se usó la columna Supelcosil LC-18 de 5 m de tamaño de
partícula, 250 x 2,1 mm (Sigma-Aldrich) protegida con una precolumna Supelguard
LC-18 de 20 x 2,1 mm (Sigma-Aldrich). Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron
las descritas por Igbavboa et al. [234] con algunas modificaciones. La fase móvil que se
utilizó fue un gradiente del eluyente A (metanol/agua/hexano/hidróxido de amonio al
30%, 87,5:10,5:1,5:0,5 v/v/v/v), eluyente B (metanol/hexano/hidróxido de amonio al
30%, 87,5:12:0,5 v/v/v/), y eluyente C (metanol/agua, 9:1 v/v). El gradiente utilizado
se detalla en la Tabla 11.
MATERIALES Y MÉTODOS
80
Tabla 11. Gradiente de eluyentes utilizado en la separación cromatográfica de PC, PE y PI.
Tiempo (min) Eluyente A Eluyente B Eluyente C
0 100 0 0
17,5 50 50 0
30 0 100 0
35 0 100 0
38 0 0 100
47 0 0 100
50 0 100 0
La velocidad de flujo fue 0,5 ml/min y el volumen de inyección 80 l. Las
especies de PI y PE se detectaron en modo negativo como [M-H]- con corriente de
capilar +3500 V a lo largo de los primeros 21 min. Las especies de PC se detectaron
como [M+H]+ desde el minuto 21 al 35 con corriente de capilar -4000 V. La identificación
de las especies de PC se realizó en modo negativo mediante la adición de ácido acético
después de la columna con un flujo de 100 μl/h, condiciones en las que se produce el
aducto [M+CH3CO2]-. El rango de m/z rastreado para los experimentos de identificación
fue m/z 150-1000 y para los experimentos de detección 450-1000. Se usó la base de
datos de Lipid Maps (www.lipidmaps.org) para la identificación de cada especie, y
sucesivas fragmentaciones en modo MRM para su caracterización, concretamente los
fragmentos correspondientes a las cadenas R1 y R2 de los PL, y del fragmento
correspondiente a la pérdida neutra de R2. Como estándares internos así como para
curvas de calibrado se usó 1, 2-diheptadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina, m/z = 762,5
para especies de PC, 1, 2-didodecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina para especies de
PE, m/z = 578,5 y 1, 2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoinositol para especies de PI,
m/z = 809,5.
En los experimentos de incorporación de [2H]AA a los fosfolípidos celulares, la
identificación de las especies que contenían [2H]AA se realizó mediante la visualización
de una forma acampanada característica de las señales m/z, debido a la distribución
isotópica del [2H]AA, siendo la m/z 8 unidades mayor que su análogo natural como
consecuencia de los 8 deuterios, así como por los fragmentos generados en MS/MS,
especialmente 311, correspondiente al ion [M-H]- de [2H]AA [235].
MATERIALES Y MÉTODOS
81
4.2.4. Proteínas 4.2.4.1. Cuantificación de proteína
La proteína se cuantificó usando el método de Bradford [236]. Es un método
colorimétrico que se basa en el cambio del máximo de A que sufre el azul de Coomassie
G-250 cuando en medio ácido interacciona de forma no covalente con las proteínas, de
465 a 595 nm. Con la absorbancia medida, se determina la concentración de proteínas
utilizando la Ley de Lambert-Beer. Para dicho cálculo se realizó una curva patrón con
distintas cantidades de BSA, disueltas en H2O MilliQ, cubriendo un rango de 1 a 10
g/ml.
4.2.4.2. Actividad enzimática 4.2.4.2.1. Preparación de homogeneizados
Las células se lavaron una vez con PBS, se centrifugaron a 1300 rpm (340 g)
durante 5 min, se resuspendieron en el tampón en el que se llevó a cabo el ensayo
enzimático, y se sonicaron tres veces en el sonicador de tip en tres intervalos de 20 s en
hielo. Posteriormente se centrifugó a 12000 rpm (13400 g) 10 min a 4 ºC para eliminar
los núcleos y se recogió el sobrenadante. Se midió la proteína de los homogeneizados
mediante el método de Bradford.
4.2.4.2.2. Preparación de sustratos
Todos los ensayos de actividad enzimática se realizaron con el sustrato en forma
de vesículas. Éstas se formaron evaporando el disolvente orgánico en el que se
encuentra disuelto el sustrato y sonicando en hielo en un sonicador de tip, en tres
intervalos de 20 s en la propia disolución tampón del ensayo de actividad.
4.2.4.2.3. Ensayos de actividad enzimática
Araquidonoil-CoA sintetasa
Se siguió el protocolo utilizado por Wilson et al. [237]. Para realizar la curva de
velocidad de reacción frente a concentración de sustrato, se mezcló MgCl2 20 mM, ATP
10 mM, CoA 1 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, [3H]AA en un rango de concentraciones de
25-150 M, y extracto celular correspondiente a 50 g de proteína en Tris-HCl (pH 8)
100 mM hasta un volumen final de 150 l. La mezcla de reacción se incubó a 37 ºC
durante 10 min en un baño con agitación. Posteriormente, la reacción se paró
añadiendo 2,25 ml de 2-propanol/heptano/H2SO4 2 M (40:10:1 v/v/v). Después de la
MATERIALES Y MÉTODOS
82
agitación se añadió 1,5 ml de heptano y 1 ml de H2O. La mezcla se agitó y se centrifugó
durante 5 min a 3000 rpm (800 g). Se recogió la fase acuosa que se lavó dos veces con 2
ml de heptano conteniendo 4 mg/ml de ácido linoleico, con el fin de extraer el sustrato
que no ha reaccionado. En la fase acuosa se encuentra el producto de reacción, AA-CoA.
Una porción de la fase acuosa se recogió, se mezcló con líquido de centelleo y se midió
la radioactividad.
Lisofosfolípido:araquidonoil-CoA aciltransferasa
Se realizó siguiendo una modificación del protocolo descrito por Lands et al.
[22]. Para realizar la curva de velocidad de reacción frente a concentración de sustrato,
se mezcló MgCl2 20 mM, ATP 10 mM, CoA 1 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, [3H]AA 50 M y
lisofosfolípido (LisoPA, LisoPC, LisoPI, o lisoPE) en un rango de concentraciones de
5-50 M y extracto celular correspondiente a 50 g de proteína en Tris-HCl (pH 8)
100 mM, hasta un volumen final de 150 l. La mezcla de reacción se incubó a 37 ºC
durante 20 min en un baño con agitación. Posteriormente, la reacción se paró
añadiendo cloroformo, y tanto los productos de reacción como el resto de los lípidos se
extrajeron mediante el método de Bligh & Dyer. La separación de los productos de
reacción (PC, PE, PI o PA) se realizó mediante TLC como se explica en el apartado
4.2.3.1. Los puntos correspondientes a las especies lipídicas de interés se visualizaron
exponiendo la TLC a vapores de I2, se rasparon y se mezclaron con líquido de centelleo
para la medida de la radioactividad.
Transacilasa independiente de CoA
El ensayo se realizó siguiendo el procedimiento descrito originalmente por
Venable et al. [238] y modificado por Balsinde et al. [239]. La mezcla del ensayo se
componía de NaCl 120 mM, EGTA 2 mM, homogeneizado celular correspondiente a
100 g de proteína (el PL que cede el ácido graso lo proporciona el homogeneizado) y
varias concentraciones (1,25 a 30 M de 1-O-[3H]octadecil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina
(lisoPAF, lisofosfolípido aceptor) en Tris HCl 100 mM (pH 7,5) en un volumen final de
200 l. La mezcla de reacción se incubó a 37 ºC durante 5 min. Posteriormente, la
reacción se paró con 0,75 ml de una mezcla de cloroformo/metanol (1:2 v/v),
extrayendo la porción lipídica según el procedimiento de Bligh Dyer. La fase orgánica
se concentró y lisoPC y PC se separaron mediante TLC utilizando el sistema de
cloroformo/metanol/ácido acético/agua (50:25:8:4 v/v/v/v) o cloroformo/metanol/
amoníaco 28% (65:25:5 v/v/v). La porción de sílice correspondiente a lisoPC y PC se
raspó, tras ser visualizada con vapores de yodo, y se midió la radioactividad
mezclándolo con líquido de centelleo.
MATERIALES Y MÉTODOS
83
Determinación de KM y Vmax
La estimación de la Vmax y KM de algunas de las actividades enzimáticas descritas
anteriormente se realizó mediante la ecuación de Lineweaver-Burk, cuyo principio
teórico se detalla brevemente a continuación.
La dependencia de la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima
(V0) con la concentración de sustrato ([S]), se expresa algebraicamente mediante la
ecuación de Michaelis-Menten, es decir:
donde Vmax es la velocidad inicial máxima que puede alcanzar la reacción catalizada por
dicha enzima, y KM es una constante, denominada constante de Michaelis-Menten, que
indica la concentración de sustrato para la cual la velocidad de la reacción es igual a la
mitad de Vmax (Figura 14).
[S]
Vo
KM
1/2 Vmax
Vmax
Figura 14. Representación de la velocidad de una reacción catalizada por enzima (Vo) en función
de la concentración de sustrato ([S]), y los parámetros característicos KM, Vmax y ½ Vmax.
[S]K
[S]VV
Mo max
MATERIALES Y MÉTODOS
84
La ecuación de Michaelis-Menten se puede transformar algebraicamente en otra
ecuación más útil para representar datos experimentales, la denominada ecuación de
Lineweaver-Burk, en la que simplemente se obtiene la inversa a ambos lados de la
ecuación de Michaelis-Menten, como se muestra a continuación. Esta ecuación permite
un fácil y preciso cálculo de KM y Vmax.
maxmax
1
][
1
VSV
K
VM
o
donde KM es un indicativo de la afinidad de la enzima por su sustrato, mientras que el
valor de Vmax da una idea de la cantidad de enzima presente en la célula.
4.2.5. Medición de población granulocítica mediante citometría de
flujo
Las células extraídas de la región intraperitoneal se centrifugaron a 1200 rpm
(290 g) durante 10 min y se resuspendieron en PBS estéril, cultivando 0,5 x 106 células
en 100 l de PBS por condición. A continuación se bloquearon los receptores Fc con
50 l de suero de cabra inactivado (calentado 20 min a 65 ºC) durante 45 min a 4 ºC.
Posteriormente se añadió el anticuerpo a una concentración de 5 g/ml (dilución 1:100
del anticuerpo comercial), y se incubó durante 30 min a 4 ºC en oscuridad. Las células
se centrifugaron a 1200 rpm (290 g) durante 10 min, se lavaron una vez con PBS estéril y
se resuspendieron en 500 l finales de PBS en un tubo de citómetro. Las células se
analizaron en el citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter) con el software Gallios y
los datos se analizaron en el canal FL1 con el software Kaluza 1.1.
4.2.6. Otras técnicas 4.2.6.1. Medición de PGE2 y LTB4 mediante ELISA
La cuantificación de ambos eicosanoides se realizó mediante ensayo ELISA,
siguiendo las instrucciones de la casa comercial.
MATERIALES Y MÉTODOS
85
4.2.7. Análisis de datos
Todos los experimentos se realizaron por duplicado o triplicado. Salvo que se
indique otra cosa, las figuras mostradas corresponden a un experimento representativo,
y cada dato se muestra como la media ± error estándar (SE). En el caso de comparar
estadísticamente datos, se realizó el test de Student t y las diferencias se consideraron
significativas cuando p < 0,05.
5. RESULTADOS
RESULTADOS
89
5.1. FUNCIÓN DE LPCAT3 EN LAS REACCIONES DE REACILACIÓN DE AA REGULADAS POR RECEPTOR
5.1.1. Liberación e incorporación de AA en PL de monocitos estimulados con zimosán
En estudios preliminares realizados por espectrometría de masas se analizaron
las especies endógenas de PL que contienen AA en monocitos humanos en situación
basal, así como la variación en los niveles de estas especies cuando las células se
estimulan con zimosán [12], situación en la que se produce la liberación de gran
cantidad de AA así como de metabolitos derivados de éste al medio extracelular [240,
241].
Del total de especies con AA endógenas detectadas en condiciones basales, las
mayoritarias son PC(18:0/20:4), PC(18:1/20:4), PC(O-16:0/20:4), PC(O-18:1/20:4),
PI(18:0/20:4), PE(P-16:0/20:4), PE(P-18:0/20:4) y PE(18:0/20:4) (Tabla 12).
RESULTADOS
90
Tabla 12. Especies de PL endógenas que contienen AA en monocitos humanos. Se extrajeron los lípidos de 2x106 células, y a continuación se analizaron las especies endógenas de PC, PI y PE conteniendo AA mediante HPLC/MS, mostrándose los resultados en % respecto a la masa de cada clase de PL. PC: 562,4 ± 61,9 pmol/106 células; PE: 760,0 ± 72,2 pmol/106 células; PI: 273,6 ± 32,8 pmol/106 células.
Especies de PC m/z [M+H]+ AA en PC (%)
P-16:0/20:4 766 8,1
O-16:0/20:4 768 17,1
O-18:1/20:4 794 14,4
O-18:0/20:4 796 6,7
18:2/20:4a 806
18:1/20:4 808 19,6
18:0/20:4 810 28,5
20:4/20:4 830 5,4
Especies de PI m/z [M+H]- AA en PI (%)
16:0/20:4 857 6,1
18:2/20:4a 881
18:1/20:4 883 9,2
18:0/20:4 885 83,6
20:4/20:4 905 1,1
Especies de PE m/z [M+H]- AA en PE (%)
P-16:0/20:4 722 33,7
P-17:0/20:4a 736
16:0/20:4 738 2,7
P-18:2/20:4a 746
P-18:1/20:4a 748
P-18:0/20:4 750 33,6
18:1/20:4 764 2,8
18:0/20:4 766 27,1 a Especie de PL detectada a niveles inferiores al límite de cuantificación.
RESULTADOS
91
Al estimular los monocitos con zimosán a una concentración de 1 mg/ml [12] se
observan cambios en los niveles de las especies de PL con AA endógenas, como
consecuencia de pérdida o ganancia de AA. En la Figura 15 se representan las especies
de PL detectadas y, mediante el uso de un color, su variación en condiciones de
estimulación con zimosán respecto a las células sin tratar. Como se puede observar,
todas las especies mayoritarias de PC que contienen AA disminuyen en condiciones de
estimulación (recuadros azules), excepto la especie minoritaria PC(20:4/20:4), que
aumenta (rojo). En el caso de las especies de PI conteniendo AA, la única que disminuye
es PI(18:0/20:4), la especie de PI mayoritaria en monocitos [12], mientras que las
especies PI(16:0/20:4) y PI(18:1/20:4) permanecen sin cambios (verde), y PI(20:4/20:4)
aumenta (rojo). En cuanto a las especies de PE, a excepción de PE(16:1/20:4), que
aumenta, el resto de las especies permanecen constantes, sin cambios (verde). Resulta
llamativo que en el caso de las especies de PE, fuentes de liberación de AA en
condiciones de estimulación [131, 220, 242-244], no haya variación, lo que indica que a
la vez que el AA es liberado también ocurre una fuerte reacilación, de tal manera que
los niveles de especies de PE conteniendo AA permanecen constantes. Esta reacilación
de AA provendría probablemente de especies de PC a través de reacciones de
transacilación, lo que ha sido descrito con anterioridad en neutrófilos humanos y
mastocitos de ratón [129, 131], y conduce a pensar que en condiciones de estimulación
no sólo la liberación, sino también la reacilación, están activadas.
Estos experimentos previos justifican pues un estudio a nivel molecular del
proceso de reacilación durante la activación de monocitos con zimosán.
RESULTADOS
92
PC(P-16:0/20:4)
PC(O-16:0/20:4)
PC(O-18:1/20:4)
PC(O-18:0/20:4)
PC(18:1/20:4)
PC(18:0/20:4)
PC(20:4/20:4)
PI(16:0/20:4)
PI(18:1/20:4)
PI(18:0/20:4)
PI(20:4/20:4)
PE(P-16:0/20:4)
PE(16:1/20:4)
PE(16:0/20:4)
PE(P-18:0/20:4)
PE(18:1/20:4)
PE(18:0/20:4)
Figura 15. Variación de los niveles de PL conteniendo AA en monocitos humanos después de la
estimulación celular. Las células se incubaron con zimosán (1 mg/ml) durante 60 min. A
continuación se extrajeron los lípidos y se midieron las especies de PL mediante HPLC-MS. La
celda en color indica si la cantidad de cada especie disminuye (azul), aumenta (rojo) o se
mantiene constante (verde) respecto a las mismas especies medidas en extractos de células sin
tratar.
RESULTADOS
93
Ya que la movilización de AA en respuesta a estímulos representa un balance
entre lo que se hidroliza de los PL, acción llevada a cabo por las PLA2, y lo que se
esterifica de nuevo en PL a través de las LPLAT [11], se procedió a estudiar las dos
ramas de la respuesta en monocitos estimulados con zimosán. En primer lugar se
procedió a estudiar la liberación de AA [240, 241, 245], marcando las células
previamente con [3H]AA y midiendo la radioactividad en el medio extracelular después
de ser estimulados con zimosán a 1 mg/ml durante 60 min (Figura 16). Los monocitos
liberaron gran cantidad de AA al medio extracelular, respuesta que se inhibió casi por
completo cuando se preincubaron las células con pirrofenona (inhibidor de la cPLA2) a
una concentración de 1 M, pero no así al usar BEL (inhibidor de la iPLA2), a una
concentración de 10 M, lo que demuestra que la fosfolipasa responsable de la
liberación de AA mediada por receptor es la cPLA2, y no la iPLA2, lo que está en
concordancia con trabajos anteriores [15-19].
RESULTADOS
94
Control BEL Pir
[3 H]A
A li
bera
do (
dpm
x 1
0-4)
0
1
2
3
4
5
Figura 16. Liberación de [3H]AA en monocitos humanos estimulados con zimosán. Los monocitos,
marcados con [3H]AA durante 20 h a una concentración de 0,25 Ci/ml, se lavaron con medio
conteniendo BSA (0,5 mg/ml) y se trataron con BEL a una concentración de 10 M, pirrofenona
(Pir) a 1 M, o nada (Control) durante 30 min. Después, las células se dejaron sin tratar (barras
blancas), o se trataron con zimosán a una concentración de 1 mg/ml (barras de rayas) durante 60
min. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes, una fracción de los cuales se
utilizó para medir la radioactividad.
Una vez confirmado que los monocitos humanos estimulados con zimosán liberan
AA, y que esta liberación es dependiente de la cPLA2, se prosiguió midiendo la
cantidad de AA re-incorporado en los PL celulares en condiciones de estimulación. Para
ello, los monocitos se estimularon con zimosán en presencia de [3H]AA a una
concentración de 1 nM (0,25 Ci/ml) y, a distintos tiempos, se midió la radioactividad
incorporada en PL totales, así como por clases de PL (PI, PC y PE). Dichos perfiles de
incorporación se representan en la Figura 17. El tratamiento de los monocitos con
zimosán produjo una rápida estimulación de la incorporación de [3H]AA en PL y,
midiendo la radioactividad en las distintas especies de PL, se observó que el [3H]AA se
RESULTADOS
95
incorpora principalmente en PC y, en menor medida, en PE y PI. También se
encontraron cantidades significativas de [3H]AA en TAG (15% del total de AA en PL).
Es importante recalcar que, a esta concentración tan baja, el [3H]AA no ejerce
efectos estimulantes por sí mismo, por lo que los efectos observados se deben
únicamente a la interacción del zimosán con el/los correspondiente/s receptor/es de la
membrana plasmática.
RESULTADOS
96
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60[3 H]A
A in
corp
orad
o (f
mol
/106 c
élul
as)
0
20
40
60
80
B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60[3 H]A
A in
corp
orad
o (f
mol
/10
6 cél
ulas
)
0
50
100
150 A
Figura 17. Incorporación de [3H]AA en PL de monocitos humanos estimulados con zimosán. Los
monocitos en estado basal (azul) o tratados con zimosán a una concentración de 1 mg/ml (rojo)
se expusieron a [3H]AA 1 nM (0,25 Ci/ml) durante 0, 5, 15, 30 y 60 min. A continuación se
extrajeron los lípidos, y se midió la radioactividad en PL totales (A) o en distintas clases de PL
(B), PI (, ), PC (, ) y PE (, ).
RESULTADOS
97
5.1.2. Rutas de incorporación de AA en PL durante la estimulación celular
Una vez observado que durante la estimulación celular los monocitos incorporan
más AA que las células en reposo, se procedió a definir cuál es la ruta de incorporación
en estas condiciones, bien el ciclo de acilación/desacilación (o también llamado ciclo
de Lands), y/o la ruta que implica la biosíntesis de novo de los PL, o ruta de Kennedy
[11]. Para ello, las células se marcaron radioactivamente con [3H]AA y con [14C]glicerol.
Este último permite detectar de forma selectiva los lípidos sintetizados a través de la
ruta de novo. Se observó que, en células activadas, el [14C]glicerol se acumulaba de
forma lineal con el tiempo tanto en en PL como en TAG (Figura 18A), lo que demuestra
la activación de la ruta de biosíntesis de lípidos de novo. El [3H]AA se acumuló en PL,
pero también en TAG (Figura 18B). Este resultado sugiere la posibilidad de que el AA
pueda incorporarse a través de la ruta de novo de forma significativa en condiciones de
activación. Sin embargo, la proporción entre la radioactividad incorporada en PL y la
incorporada en TAG (PL/TAG) para ambos isótopos fue de un factor de 2 para 14C y un
factor de 6 para 3H. Esta diferencia sugiere que la mayor parte de la radioactividad
derivada de 3H que se acumula en PL proviene de una ruta distinta a la de la ruta de
novo (que es a través de la cual se incorpora la radioactividad derivada de 14C).
RESULTADOS
98
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60
[14C
]Glic
erol
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
2
4
6
8
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60[3 H]A
A in
corp
orad
o (f
mol
/106 c
élul
as)
0
50
100
150
200
A
B
Figura 18. Efecto del tiempo de incubación con zimosán en la incorporación de [14C]glicerol (A)
o [3H]AA (B) en los lípidos de monocitos humanos. Las células se dejaron sin tratar (azul) o se
trataron (rojo) con 1 mg/ml de zimosán en presencia de [3H]AA 1 nM (0,25 Ci/ml) o [14C]glicerol
0,7 M (0,1 Ci/ml) durante 0, 5, 15, 30 y 60 min. Después se extrajeron los lípidos y se midió la
incorporación de [14C]glicerol (A) y [3H]AA (B) en PL totales (, ) y TAG (, ).
RESULTADOS
99
Con el fin de obtener evidencias más directas, los experimentos de incorporación
de [3H]AA se llevaron a cabo en presencia del inhibidor de la fosfatidato fosfohidrolasa-1
(PAP-1) propranolol a una concentración de 200 M, el cual bloquea la incorporación del
ácido graso a través de la ruta de novo pero no las reacciones de acilación/desacilación
[30, 224, 225, 246, 247]. En estudios previos se ha determinado que a esta
concentración la incorporación de AA por la ruta de novo está fuertemente disminuida
[225].
Al realizar el experimento en presencia de dicho compuesto se observó una
marcada inhibición de la incorporación de [3H]AA en TAG en monocitos estimulados con
zimosán (Figura 19A). Por el contrario, la incorporación de [3H]AA en PL no se veía
afectada en estas condiciones (Figura 19B). En estado basal, la incorporación en TAG
fue despreciable y, en el caso de PL, no hubo tampoco variación en la incorporación con
el tratamiento con propranolol, un resultado esperable. Estos datos confirman que,
aunque en células estimuladas la ruta de novo para la biosíntesis de PL está activada, su
contribución en la incorporación de [3H]AA en PL es menor.
RESULTADOS
100
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60[3H
]AA
inco
rpor
ado
(fm
ol/1
06 c
élul
as)
0
50
100
150
200
250
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60[3H
]AA
inco
rpor
ado
(fm
ol/1
06 c
élul
as)
0
20
40
60 A
B
Figura 19. Inhibición de la incorporación de [3H]AA en TAG mediante el uso de propranolol,
inhibidor de la enzima PAP-1. Los monocitos humanos se trataron (rosa) o no (azul) con
propranolol 200 M durante 30 min. Después, las células fueron expuestas a [3H]AA 1 nM (0,25
Ci/ml) en ausencia (, ) o presencia (, ) de zimosán 1 mg/ml durante 0, 5, 15, 30 y 60
min. Los lípidos se extrajeron y se midió incorporación de [3H]AA en TAG (A) o PL totales (B).
RESULTADOS
101
5.1.3. Implicación de la cPLA2 en la incorporación de AA en PL en monocitos estimulados con zimosán
Dado que la estimulación de monocitos con zimosán da lugar a la activación de la
cPLA2 (Figura 16), el incremento de la reacilación de AA observado en estas
condiciones puede ser debido a la creciente disponibilidad de lisoPL aceptores que se
producen en células activadas como consecuencia de la acción de dicha PLA2. Con el fin
de investigar esta posibilidad, se llevaron a cabo experimentos de incorporación de
[3H]AA en presencia de pirrofenona a una concentración de 1 M. Tal y como se observa
en la Figura 20A, el aumento en la incorporación de [3H]AA en PL en condiciones de
estimulación con zimosán no se vio alterado por la presencia de pirrofenona. Estos
resultados sugieren que el aumento de la incorporación de [3H]AA en estas condiciones
no es consecuencia del aumento de lisoPL generados por acción de la cPLA2, lo que a
su vez implica que el nivel de lisoPL ya existente en las células en estado basal debe ser
suficiente para afrontar la reacilación de AA en PL que se produce en condiciones de
estimulación con zimosán. Este resultado condujo a centrarse en la iPLA2, enzima cuyo
papel se considera crucial en el mantenimiento de los niveles de lisoPL en células
fagocíticas en estado basal [25, 27, 239, 248]. En estudios anteriores se ha demostrado
que la inhibición de la iPLA2 resulta en la reducción de los niveles de lisoPL aceptores en
condiciones basales, lo que conduce a un descenso en la incorporación de AA en PL [25,
27, 28, 239]. Por ello, se evaluó el efecto del zimosán sobre la incorporación de [3H]AA
en monocitos tratados con BEL, inhibidor que en condiciones basales disminuye la
cantidad de lisoPL disponibles [235]. Los resultados muestran una ligera reducción en la
respuesta (Figura 20B). No obstante, la reducción en la incorporación de [3H]AA es
similar en células sin estimular y, por ello, la proporción entre el [3H]AA incorporado en
PL de células estimuladas y el incorporado en células sin estimular en células tratadas
con BEL es igual a la observada en células no deficientes en actividad iPLA2, es decir, no
cultivadas en presencia de BEL (Figura 20B). Así pues, el incremento en la
incorporación de [3H]AA en PL de células estimuladas con zimosán no depende de los
niveles de lisoPL, y sugiere que, de alguna manera, el proceso de reacilación de AA en
condiciones de estimulación está regulado a través de receptor, en un nivel previo a la
acción de las PLA2.
RESULTADOS
102
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60[3H
]AA
inco
rpor
ado
(fm
ol/1
06 cél
ulas
)
0
50
100
150
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50 60[3 H]A
A in
corp
orad
o (f
mol
/10
6 c
élul
as)
0
50
100
150
200
B
A
Figura 20. Efecto de los inhibidores de PLA2 sobre la incorporación de [3H]AA en monocitos
humanos estimulados con zimosán. Los monocitos se preincubaron sin (, ) o con (, )
pirrofenona 1M (A), o bien sin (, ) o con (, ) BEL 10 M (B) durante 30 min. Después las
células se dejaron sin tratar (azul) o se trataron (rojo) con zimosán 1 mg/ml en presencia de
[3H]AA 1 nM (0,25 Ci/ml) durante 0, 5, 15, 30 y 60 min. Se extrajeron los lípidos y se midió
incorporación de [3H]AA en PL totales.
RESULTADOS
103
5.1.4. Incremento de la actividad LPLAT en monocitos estimulados con zimosán
A partir de los resultados anteriores sugiriendo que ni la iPLA2 ni la cPLA2
estarían implicadas directamente en el incremento de incorporación de AA en los
monocitos estimulados, se consideró la posibilidad de que algunas de las enzimas de la
ruta de reacilación del AA pudieran estar reguladas por receptor y, por tanto, que sus
actividades se incrementaran en células activadas. Con el propósito de estudiar esto, se
llevaron a cabo ensayos de actividad in vitro utilizando homogeneizados de células en
estado basal así como de células estimuladas con zimosán durante 30 min. Se midieron
las actividades ACS, LPCAT, LPEAT, LPIAT y LPAAT. De todas ellas, sólo la actividad
LPCAT se halló aumentada en homogeneizados procedentes de células estimuladas con
zimosán en comparación con homogeneizados de células sin tratar (Figuras 21 y 22).
Estos datos sugieren que la actividad LPCAT está regulada durante la estimulación con
zimosán y puede ser la causante del incremento en la incorporación de AA en PL de
células estimuladas.
[AA] (M)
0 50 100 150 200
Act
ivid
ad A
A-C
oA s
inte
tasa
(nm
ol m
g-1m
in-1
)
0
2
4
6
8
10
Figura 21. Actividad ACS en homogeneizados de monocitos humanos. Se prepararon
homogeneizados de células sin tratar (símbolos blancos) o tratados (símbolos negros) con zimosán
a 1 mg/ml durante 30 min, y posteriormente se midió la actividad acil-CoA sintetasa, utilizando
[3H]AA como sustrato a diferentes concentraciones.
RESULTADOS
104
[LisoPA] (M)
0 10 20 30 40 50
Act
ivid
ad li
sofo
sfol
ípid
o: a
cil-
CoA
aci
ltran
sfer
asa
(pm
ol m
g-1
min
-1)
0
200
400
600
800
1000
[LisoPI] (M)
0 10 20 30 40 50
0
200
400
600
800
1000
1200
[LisoPC] (M)
0 10 20 30 40 50
0
200
400
600
800
[LisoPE] (M)
0 10 20 30 40
0
50
100
150
200
250
300
A
DC
B
Figura 22. Actividad LPLAT en homogeneizados de monocitos humanos. Se prepararon
homogeneizados de células sin tratar (símbolos blancos) o tratados (símbolos negros) con
1 mg/ml de zimosán durante 30 min, y se midió la actividad aciltransferasa usando lisoPA (A),
lisoPI (B), lisoPE (C) o lisoPC (D) como aceptores a diferentes concentraciones, y [3H]AA como
ácido graso.
RESULTADOS
105
5.1.5. Regulación de la LPCAT3 en células estimuladas
Al observar que la única actividad enzimática que aumenta en monocitos
estimulados con zimosán es LPCAT y, por tanto, ser ésta la hipotética causante del
incremento de la incorporación de [3H]AA en estas condiciones, se pasó a estudiar más a
fondo las enzimas que poseen esta actividad. Actualmente existen cuatro isoformas en
mamíferos con actividad LPCAT [102, 115, 116, 121, 123, 124, 249], pero sólo dos de
ellas, LPCAT2 y LPCAT3, han sido documentadas como enzimas con actividad LPCAT que
participen en las reacciones de reacilación de AA [120, 121, 123, 249, 250]. Para definir
el papel de estas enzimas en la incorporación de AA en células estimuladas, se llevaron
a cabo experimentos de bloqueo de la expresión de la proteína mediante el uso de
siRNA en tres modelos celulares diferentes. En primer lugar se realizó en monocitos,
modelo celular de este estudio; sin embargo, debido a la baja eficiencia de
transfección, también se diseñaron experimentos similares en la línea promonocítica
U937 y en la línea HEK293, célula que, a pesar de que dista de ser un modelo de
inmunidad innata, es apropiada para experimentos de silenciamiento debido a su alta
eficiencia de transfección, por lo que complementa los resultados que se muestran a
continuación.
En primer lugar se comprobó, mediante PCR convencional, que los mRNA de
ambas enzimas se expresan en los tres tipos de células, lo que se muestra en la
Figura 23.
Figura 23. Expresión de mRNA de LPCAT2 y LPCAT3 en monocitos, U937 y HEK293. Tras
sintetizar cDNA a partir de mRNA de los tres tipos de células, éste se amplificó mediante
PCR convencional con cebadores específicos de cada gen, y los fragmentos generados se
separaron en geles de agarosa.
A continuación se realizaron experimentos de silenciamiento con siRNA en
monocitos y en células U937, tras los cuales se midió la incorporación de [3H]AA en PC.
A pesar de que la eficiencia de transfección es muy baja, cuando se transfectaron las
células con siRNA específico para LPCAT2 y la LPCAT3 se observó una ligera disminución
LPCAT2 LPCAT3 LPCAT2 LPCAT3 LPCAT2 LPCAT3
Monocitos U937 HEK293
RESULTADOS
106
en la incorporación de [3H]AA en PC en respuesta a zimosán para el caso de células
deficientes en LPCAT3, pero no así para las deficientes en LPCAT2 (Figura 24A). Se
llevaron a cabo estudios similares en la línea promonocítica humana U937, donde la
eficiencia de transfección es mayor, y los resultados muestran de igual manera que la
inhibición de la expresión proteica de LPCAT3, pero no de LPCAT2, bloquea la
incorporación de AA en células estimuladas con zimosán (Figura 24B).
RESULTADOS
107
Control LPCAT2 LPCAT3[3 H]A
A In
corp
orad
o (f
mol
/106
cél
ulas
)
0
2
4
6
8
10
12
Control LPCAT2 LPCAT3[3 H]A
A In
corp
orad
o (f
mol
/106
cél
ulas
)
0
2
4
6
A
B
*
*
Figura 24. La inhibición de la expresión de LPCAT3 mediante siRNA bloquea la incorporación de
[3H]AA en PC, en monocitos y U937. Monocitos (A) o células U937 (B) se trataron con siRNA
negativo (Control), siRNA para LPCAT2 o para LPCAT3 durante 48 h. Transcurrido ese tiempo las
células se estimularon con 1 mg/ml de zimosán en presencia de 1 nM de [3H]AA (0,25 Ci/ml)
durante 30 min. Se extrajeron los lípidos y se midió la incorporción de [3H]AA en PC. *p < 0,05.
RESULTADOS
108
La inhibición de la expresión de la LPCAT2 y la LPCAT3 en HEK293 con siRNA fue
más eficiente que en los casos anteriores, alcanzándose bajadas del mRNA del 60-70%
(Figura 25A). Dicha bajada también se manifestó en una fuerte disminución de la
incorporación de [3H]AA en PC en células tratadas con el siRNA de la LPCAT3, cuando se
estimularon con PMA e ionomicina. Dicha disminución alcanzó hasta el 80% con respecto
a la incorporación de las células tratadas con el siRNA negativo. Sin embargo, la
contribución de LPCAT2 a la incorporación de [3H]AA en estas condiciones fue mucho
menor, aproximadamente del 20% (Figura 25B).
RESULTADOS
109
Control LPCAT2 LPCAT3
Exp
resi
ón r
elat
iva
de m
RN
A (
u.a.
)
Control LPCAT2 LPCAT3
[3 H]A
A in
corp
orad
o (d
pm x
10-3
)
A
B
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
3,5
2,5
3,0
Figura 25. La inhibición mediante siRNA de la LPCAT3 bloquea la incorporación de [3H]AA en PC
en HEK293. Las células se trataron con siRNA negativo, siRNA para LPCAT2 o para LPCAT3 durante
48 h. Después de este tiempo parte de las células se apartaron para extracción de mRNA y
evaluación de los niveles del mismo mediante Q-PCR (A), y el resto se estimularon con PMA 0,1
M junto con ionomicina 1 M en presencia de 1 nM de [3H]AA (0,25 Ci/ml) durante 30 min,
tiempo tras el cual se extraían los lípidos y se medía la incorporación de [3H]AA en PC (B).
RESULTADOS
110
Estos resultados demuestran que el aumento de la incorporación de AA en
células estimuladas se produce mayoritariamente a través del ciclo de
acilación/desacilación, y es debido a la regulación de la actividad LPCAT,
concretamente de la LPCAT3.
RESULTADOS
111
5.2. INFLUENCIA DE LOS NIVELES CELULARES DE AA EN LA REMODELACIÓN Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CoA-IT EN MONOCITOS Y U937
5.2.1. Caracterización de la incorporación y remodelación de AA
en monocitos y U937
Las células promonocíticas U937 se cultivaron en presencia de [3H]AA a una
concentración de 1 M, analizándose posteriormente su incorporación en los lípidos
celulares. Se observó que el ácido graso se incorpora de forma muy rápida en PL,
mientras que la incorporación en TAG es insignificante (Figura 26A). Al analizar la
distribución de [3H]AA entre las distintas especies de PL, se observó que las especies
mayoritarias que incorporan [3H]AA son PC y PE en concordancia con estudios realizados
en neutrófilos o macrófagos peritoneales [33, 128, 130] y que, sólo después de unos
pocos minutos, la cantidad de [3H]AA en PC disminuía de forma significativa y paralela a
un incremento de [3H]AA en PE (Figura 26B). Este efecto pone de manifiesto,
previsiblemente, la acción de la CoA-IT en la remodelación de [3H]AA entre las especies
de PL. De estos datos se puede deducir que, a un tiempo aproximado de 15 min, la
cantidad de [3H]AA en PE es igual a la cantidad de [3H]AA en PC, es decir, que a ese
tiempo se alcanza un punto de equimolaridad de [3H]AA entre las especies de PC y PE.
Con el fin de poder hacer comparaciones directas entre las diferentes condiciones, el
tiempo en el que la cantidad de [3H]AA es igual en PC que en PE se ha definido como
“tiempo de remodelación”. Por otro lado, los niveles de [3H]AA en PI permanecen
prácticamente constantes a lo largo del tiempo.
RESULTADOS
112
Tiempo (h)
0 1 2 3 4 5
[3H
]AA
en
PL
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
BPE
PI
PC
Tiempo (h)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0[3H
]AA
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
50
100
150
200
250
TAG
PLA
Figura 26. Incorporación y remodelación de [3H]AA en células U937. Las células se incubaron con
[3H]AA 1 M (0,25 Ci/ml) durante los tiempos indicados. Después, se extrajeron los lípidos
celulares y se midió la incorporación de [3H]AA en PL () y TAG () (A), o la remodelación en PI
(), PC (), y PE () (B).
RESULTADOS
113
Con el fin de comparar este comportamiento con el de células primarias en un
estado de maduración más avanzado que la línea celular U937, se realizaron
experimentos de incorporación de [3H]AA en monocitos humanos de sangre periférica en
condiciones idénticas a los representados en la Figura 26. Aunque el perfil de
incorporación de [3H]AA exógeno en monocitos es similar al de las U937 (Figura 27A), se
apreció una notable diferencia en la distribución de [3H]AA en las distintas clases de PL
(Figura 27B). En los monocitos, el tiempo de remodelación es mucho mayor que en las
U937, siendo aproximadamente de 15 h.
Resulta muy destacable la extrema rapidez de la remodelación de [3H]AA en la
línea celular promonocítica U937 comparada con los monocitos, a pesar de que el
proceso ocurre bajo unas condiciones donde ambos tipos de células incorporan
cantidades similares de [3H]AA exógeno en PL.
RESULTADOS
114
Tiempo (h)
0 5 10 15 20
[3 H]A
A e
n P
L (%
)
0
20
40
60
80
B
PE
PC
PI
Tiempo (h)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0[3H
]AA
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
20
40
60
80
100
120
140
160A PL
TAG
Figura 27. Incorporación y remodelación de [3H]AA en monocitos humanos. Las células se
incubaron con [3H]AA 1 M (0,25 Ci/ml) durante los tiempos indicados (A), o con [3H]AA 1 M
durante 30 min, se lavaron con medio conteniendo BSA (0,5 mg/ml) y se incubaron en medio
nuevo sin suero durante los tiempos indicados (B). Después se extrajeron los lípidos celulares y se
midió la incorporación de [3H]AA en PL () y TAG () (A), o la remodelación en PI (), PC () y
PE () (B).
RESULTADOS
115
5.2.2. Análisis mediante HPLC-MS de las especies de PL que incorporan [2H]AA
A pesar de que el uso de radioactividad es el método más sensible para medir
incorporación de AA o cualquier otro ácido graso en distintas clases de lípidos, no
permite distinguir, en este caso, las especies de PL donde se incorpora el AA exógeno
inicialmente. Para profundizar de los resultados anteriores, se llevaron a cabo
experimentos de incorporación de [2H]AA —no [3H]AA— y se utilizó la técnica de
HPLC/MS de trampa iónica para medir aquellas especies que incorporaron el [2H]AA
poco tiempo después de la adición del ácido graso. La detección de las especies de
interés se obtuvo de forma inequívoca gracias a la forma acampanada característica de
la señal de m/z de iones deuterados consecuencia de la distribución isotópica del AA
conteniendo 8 deuterios (ver “Materiales y Métodos”). En la Figura 28 se recogen las
especies de PI, PC y PE que incorporan [2H]AA a 30 min de su adición, tanto en células
U937 como en monocitos.
En el caso de las células U937, se detectaron cuatro especies de PI que
incorporan [2H]AA; PI(16:0/[2H]AA), PI(18:1/[2H]AA), PI(18:0/[2H]AA) y
PI([2H]AA/[2H]AA).
Del mismo modo, se detectaron cuatro especies de PE con [2H]AA en las células
U937: PE(P-16:0/[2H]AA), PE(P-18:1/[2H]AA), PE(P-18:0/[2H]AA) y PE(18:1/[2H]AA),
siendo mayoritarias PE(P-16:0/[2H]AA) y PE(18:0/[2H]AA).
En cuanto a especies de PC, sólo se detectaron dos: PC(18:1/[2H]AA) y
PC(18:0/[2H]AA).
En el caso de los monocitos, se detectaron las mismas especies de PI con [2H]AA,
ninguna especie de PE y hasta cuatro de PC: PC(16:0/[2H]AA), PC(18:2/[2H]AA),
PC(18:1/[2H]AA) y PC([2H]AA/[2H]AA).
La aparición de todas estas especies moleculares está en concordancia con los
resultados de las Figuras 26 y 27. Así, en las células U937 se detectan varias especies
deuteradas de PE y sólo dos de PC a los 30 min, mientras que otras especies de Pc tales
como PC(16:0/[2H]AA) y PC(18:2/[2H]AA) no se detectan, lo que sugiere que estas
especies probablemente incorporan [2H]AA en el estadio inicial y pierden el ácido graso
de forma rápida, que se transfiere a varias especies moleculares de PE (Figura 26 y
28). En monocitos, sin embargo, se detectan varias especies de PC y ninguna de PE a los
30 min, puesto que este tiempo no es suficiente para permitir una transferencia
significativa de [2H]AA desde especies de PC a especies de PE, ya que el proceso de
remodelación es mucho más lento (Figura 27 y 28). Así pues, parece probable que
PC(16:0/[2H]AA) y PC(18:2/[2H]AA) sean dos especies que preferentemente ceden
RESULTADOS
116
[2H]AA a especies de PE, puesto que ambas están presentes en monocitos humanos a los
30 min pero no en células U937.
Por otro lado, la especie PC(18:0/20:4), que constituye la mayor reserva de AA
endógeno dentro de las especies de PC en condiciones de equilibrio (Tabla 12) [12] está
presente en U937 pero no en monocitos a los 30 min, lo que sugiere que en monocitos
aún no se ha llegado a un estado de equilibrio, mientras que las células U937 sí.
Respecto a las especies de PI no se aprecia diferencia entre U937 y monocitos, en
concordancia con los datos de las Figuras 26 y 27, en donde se produce una
incorporación inicial de AA en especies de PI (20-30%) que se mantiene constante a lo
largo del tiempo.
U937 Mon. PI(16:0/[2H]AA)
PI(18:1/[2H]AA)
PI(18:0/[2H]AA)
PI([2H]AA/[2H]AA)
PE(P-16:0/[2H]AA)
PE(P-18:1/[2H]AA)
PE(P-18:0/[2H]AA)
PE(18:1/[2H]AA)
PC(16:0/[2H]AA)
PC(18:2/[2H]AA)
PC(18:1/[2H]AA)
PC(18:0/[2H]AA)
PC([2H]AA/[2H]AA)
Figura 28. Análisis de las especies de PL que contienen [2H]AA en células U937 y monocitos
humanos. Las células se incubaron con [2H]AA 1 M durante 30 min. Posteriormente se extrajeron
los lípidos y se detectaron (recuadros azules) o no (recuadros amarillos) las especies de PL
conteniendo [2H]AA mediante HPLC/MS. Mon: monocitos.
RESULTADOS
117
5.2.3. Influencia de la diferenciación celular en la incorporación y remodelación de AA
Al observar la diferencia tan acentuada en el proceso de remodelación de AA en
los PL celulares entre las células promonocíticas U937 y los monocitos, es posible pensar
que este proceso pueda estar condicionado por el grado de diferenciación celular. Con
el fin de estudiar esta posible relación, las células U937 se diferenciaron a monocitos
usando como agente PMA [206]. Posteriormente se incubaron las células con [3H]AA y se
estudió su incorporación en los lípidos celulares así como el movimiento del ácido graso
entre los PL a diferentes tiempos. Los datos, mostrados en la Figura 29, indican que,
aunque la incorporación de AA en PL es un poco menor en las células diferenciadas con
PMA comparada con las células sin diferenciar, la remodelación del [3H]AA en las células
U937 diferenciadas es prácticamente idéntica a la de las células U937 sin tratar
(Figuras 26 y 29). Estos datos indican que la remodelación de [3H]AA en células U937 es
independiente del grado de maduración de las células. Las células U937 remodelan el
[3H]AA muy rápidamente tanto en estado de promonocito como de monocito.
RESULTADOS
118
Tiempo (h)
0 1 2 3 4 5
[3H
]AA
en
PL
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
B PE
PC
PI
Tiempo (h)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0[3H
]AA
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
20
40
60
80
100
120
140 A PL
TAG
Figura 29. Incorporación y remodelación de [3H]AA en células U937 diferenciadas a monocitos.
Las células se incubaron con PMA (35 ng/ml) durante 24 h. Posteriormente se retiró el medio y se
incubó con [3H]AA 1 M (0,25 Ci/ml) durante los tiempos indicados. A continuación se
extrajeron los lípidos celulares y se midió la incorporación de [3H]AA en PL () y TAG () (A), o
la remodelación en PI (), PC () y PE () (B).
RESULTADOS
119
5.2.4. Influencia del contenido endógeno de AA en su velocidad de remodelación
Una importante diferencia entre las células U937 y los monocitos es que las
primeras, siendo células que se mantienen en cultivo, son típicamente deficientes en
AA. Por ello, se planteó la posibilidad de que la rápida remodelación de [3H]AA dentro
de los PL celulares en las U937 pudiera estar de alguna manera relacionada con el bajo
contenido endógeno de AA de las mismas. Por ello, se incubaron las células U937 con AA
exógeno a una concentración de 100 M (complejado con BSA en una proporción 5:1)
durante 20 h, con el fin de aumentar los niveles intracelulares de AA hasta valores
similares a los encontrados en los monocitos maduros humanos de sangre periférica. En
la Figura 30 se representan los datos del contenido total de AA, analizado mediante
GC/MS, de monocitos, células U937 y células U937 enriquecidas con AA, expresado en
nmol/mg y % respecto al total de ácido graso. El contenido de AA de los monocitos fue
del 20% aproximadamente, mientras que el de las células U937 apenas llegó al 3%,
alcanzando algo más del 30% respecto al total al enriquecerlas con AA.
Monocitos U937 U937 + AA
Con
teni
do c
elul
ar d
e A
A (
nmol
/mg)
0
50
100
150
200
Con
teni
do c
elul
ar d
e A
A (
%)
0
10
20
30
40
50
Figura 30. Contenido total de AA en monocitos humanos, células U937, y células U937
enriquecidas con AA. Se extrajeron los lípidos totales y se transmetilaron con KOH 0,5 M en MeOH
durante 30 min a 37 ºC. Posteriormente se extrajeron los ésteres metílicos procedentes de los
ácidos grasos con hexano y se analizaron por GC/MS. Se representa la masa total de AA
relativizado a mg de proteína (barras blancas) o el % de AA respecto al total de ácido graso
medido (barras grises).
RESULTADOS
120
Después de incubar las células U937 con AA durante 20 h, éstas se marcaron con
[3H]AA 1 μM y se estudió tanto la incorporación como el movimiento del ácido graso
entre los PL a diferentes tiempos (Figura 31). La cantidad de [3H]AA incorporado en PL
en este caso fue 200 ± 20 pmol por 106 células a las 2 h, valor similar al encontrado en
células U937 sin ser enriquecidas con AA. Cabe destacar que la incorporación en TAG,
aunque baja, es significativa, alcanzando niveles similares a los encontrados en
monocitos (Figuras 27 y 31), lo que sugiere que la entrada de AA a PL está saturada y
el AA está siendo dirigido a TAG a través de la ruta de novo [30, 32]. Por el contrario, la
remodelación de [3H]AA entre los PL ocurrió de forma mucho más lenta que en el caso
de las células U937 no enriquecidas con AA, de manera similar al de los monocitos. Así,
el tiempo de remodelación en estas condiciones es de unas 15 h (Figura 31).
RESULTADOS
121
Tiempo (h)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0[3H
]AA
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
50
100
150
200
250
A PL
TAG
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25 30
[3H
]AA
en
PL
(%)
0
10
20
30
40
50
60 B
PI
PC
PE
Figura 31. Incorporación y remodelación de [3H]AA en células U937 enriquecidas con AA. Las
células se incubaron en medio conteniendo AA 100 M complejado con BSA (relación 5:1) durante
20 h. Posteriormente se lavaron y se incubaron con [3H]AA 1 M (0,25 Ci/ml) durante los
tiempos indicados (A), o se incubaron con [3H]AA 1 M durante 30 min, después se lavaron con
medio conteniendo BSA (0,5 mg/ml) y se incubaron en nuevo medio sin suero durante los tiempos
indicados (B). A continuación se extrajeron los lípidos celulares y se midió la incorporación de
[3H]AA en PL () y TAG () (A), o la remodelación en PI (), PC (), y PE () (B).
RESULTADOS
122
Del mismo modo, se realizaron experimentos de incorporación y remodelación en
los que se utilizaron células U937 diferenciadas con PMA y enriquecidas con AA, y, en
este caso, la remodelación de este ácido graso, aunque algo más lenta, fue
esencialmente la misma que la de las U937 sin diferenciar y enriquecidas con AA
(Figura 32), lo que proporciona una evidencia adicional de que este proceso no está
influenciado por el grado de maduración del fagocito.
RESULTADOS
123
Tiempo (h)
0 5 10 15 20 25
[3H
]AA
en
PL
(%)
0
20
40
60
80 B
PC
PE
PI
Tiempo (h)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0[3H
]AA
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
20
40
60
80
100
120
140 A PL
TAG
Figura 32. Incorporación y remodelación de [3H]AA en células U937 diferenciadas y enriquecidas
con AA. Las células se diferenciaron con PMA (35 ng/ml) durante 24 h, se retiró el medio y se
incubaron durante otras 20 h en medio conteniendo AA 100 M complejado con BSA (relación
5:1). Después se lavaron y se incubaron con [3H]AA 1 M (0,25 Ci/ml) durante los tiempos
indicados (A), o se incubaron con [3H]AA 1 M durante 30 min, posteriormente se lavaron con
medio conteniendo BSA (0,5 mg/ml) y se incubaron en nuevo medio sin suero durante los tiempos
indicados (B). A continuación se extrajeron los lípidos celulares y se midió la incorporación de
[3H]AA en PL () y TAG () (A) o la remodelación en PI (), PC (), y PE () (B).
RESULTADOS
124
5.2.5. Variación de la actividad enzimática CoA-IT con el contenido endógeno de AA
De todos los datos anteriores se puede deducir que las células U937 remodelan el
AA a mucha mayor velocidad que los monocitos, y que este fenómeno está relacionado
con el bajo contenido endógeno de AA de las células. Existen muchos estudios en los
que se define la enzima CoA-IT como la responsable de la remodelación de AA de
especies de PC a especies de PE en células mamíferas [132, 133, 144-146, 238], por lo
que, con el fin de analizar más en profundidad la relación entre la velocidad de
remodelación del AA y el contenido endógeno de AA en células fagocíticas humanas, se
centró la atención en esta enzima. Debido a que la secuencia de nucleótidos del gen
que codifica la CoA-IT permanece desconocida, el único modo de estudiarla es midiendo
su actividad enzimática en un ensayo in vitro. El ensayo se realizó con homogeneizados
de células U937 sin tratar o tratados con AA exógeno durante 20 h, usando como
sustrato radiactivo [3H]lisoPAF a diferentes concentraciones. Los resultados, que se
muestran en la Figura 33, indican que la actividad CoA-IT de homogeneizados
procedentes de células enriquecidas con AA es, de forma significativa, inferior a la de
las células sin tratar (Figura 33A). Posteriormente se hicieron los cálculos de la KM y de
la Vmax a partir de las representaciones de Lineweaver-Burk de los datos de actividad
(Figura 33B), lo que resulta en una KM aparente de 6,14 ± 0,05 μM y Vmax de 263 ± 24
pmol·min-1·mg-1 para la actividad enzimática de homogeneizados de las células sin
tratar, y de una KM aparente y Vmax de 6,25 ± 0,07 μM y 182 ± 18 pmol·min-1·mg-1,
respectivamente, en el caso de homogeneizados de células enriquecidas con AA. De
estos resultados se puede concluir que al incubar las células U937 con AA exógeno con
el fin de enriquecer los PL intracelulares con este ácido graso (Figura 30), la actividad
de la CoA-IT del homogeneizado correspondiente disminuye; sin embargo, se preserva la
afinidad por el sustrato, en comparación con los homogeneizados de U937 sin tratar.
RESULTADOS
125
[LisoPAF] (µM)
0 5 10 15 20 25 30
Act
ivid
ad C
oA-I
T (
pmol
min
-1 m
g-1)
0
50
100
150
200
250
(1/[LisoPAF]) (M-1)
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2(1/A
ctiv
idad
CoA
-IT
) (m
g m
in p
mol
-1)
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
A
B
Figura 33. Disminución de la actividad CoA-IT en homogeneizados de células U937 enriquecidas
con AA. Se prepararon homogeneizados de células sin tratar () o de células incubadas durante
20 h en medio conteniendo AA 100 M complejado con BSA (proporción 5:1) (). El ensayo de
actividad se realizó tal y como se detalla en el apartado 4.2.4.2 de “Materiales y Métodos”.
RESULTADOS
126
5.3. EFECTO DE LA CAV-1 SOBRE EL METABOLISMO DE AA DE MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN
5.3.1. Incorporación de ácidos grasos
La cav-1 es una proteína capaz de unir ácidos grasos y, por tanto, de facilitar su
transporte al interior de la célula [192-194]. En ratones deficientes en cav-1 se ha
descrito una mayor cantidad de ácidos grasos y TAG circulantes en sangre como
consecuencia de este efecto [182, 195, 201]. Con el fin de determinar si la deficiencia
de cav-1 modifica la incorporación de AA en macrófagos de ratón, se incubaron los
macrófagos peritoneales de ratones KO de Drab et al. [196] con [3H]AA a distintas
concentraciones durante 30 min, desde 1 nM hasta 10 M, y se midió su incorporación
en PL y TAG. Los resultados se muestran en la Tabla 13. Los macrófagos incorporaron
más [3H]AA en PL que en TAG independientemente de la concentración utilizada, lo que
indica que la ruta de acilación/desacilación es la ruta que actúa principalmente en
condiciones basales. Sin embargo, la proporción de AA incorporado en PL y en TAG
disminuye con la concentración, lo que indica que, a medida que aumenta la
concentración de AA, la participación de la ruta de novo aumenta, debido a que la
capacidad de esterificación de la ruta de acilación/desacilación en este breve periodo
de tiempo es limitada [11]. El dato más destacado que se extrae de estos resultados es
que hay una mayor incorporación de [3H]AA en los macrófagos de ratones KO para
cualquier concentración. Este resultado es, en principio, muy sorprendente puesto que,
si la cav-1 actúa como transportador de ácidos grasos, no es esperable un aumento de la
concentración en su ausencia.
RESULTADOS
127
Tabla 13. Incorporación de [3H]AA en macrófagos peritoneales de ratones WT y KO de cav-1
de Drab et al. [196]. Los macrófagos peritoneales se incubaron durante 30 min con [3H]AA
0,001, 0,1, 1 y 10 M (0,25 Ci/ml). Después de extraer los lípidos se midió la incorporación
de [3H]AA en PL y TAG. Los datos se expresan como pmol/106 células. *p < 0,05.
[3H]AA (M)
PL TAG
WT KO WT KO
0,001 (16,20 ± 0,03)·10-3 (18,40 ± 1,90)·10-3 (1,30 ± 0,07)·10-3 *(1,60 ± 0,01)·10-3
0,1 1,30 ± 0,04 *2,60 ± 0,13 0,10 ± 0,01 *0,20 ± 0,01
1 11,30 ± 0,10 14,20 ± 0,93 1,70 ± 0,17 *2,60 ± 0,02
10 69,20 ± 0,82 *100,40 ± 4,88 23,50 ± 2,08 *36,20 ± 1,88
Con el propósito de comprobar si este efecto no era debido a las características
genéticas de este ratón, se realizó el mismo experimento con otro tipo de ratón KO, el
creado por Razani et al. [197], cuyo resultado se muestra en la Tabla 14. El
comportamiento fue exactamente igual al observado para la otra cepa, con un
incremento muy significativo en la incorporación en los macrófagos de los ratones KO
con respecto a los WT. Además, la masa de AA incorporada por las células de ambas
cepas está en el mismo rango para cada concentración, aunque es algo inferior en las de
Razani et al. Puesto que el comportamiento respecto a la incorporación de ácidos grasos
era similar para ambos tipos de ratones, los sucesivos experimentos se realizaron con
una cepa exclusivamente, la de Razani et al. [197]
Tabla 14. Incorporación de [3H]AA en macrófagos peritoneales de ratones WT y KO de cav-1
de Razani et al. [197]. Los macrófagos peritoneales se incubaron durante 30 min con [3H]AA
0,001, 0,1, 1 y 10 M (0,25 Ci/ml). Después de extraer los lípidos se midió la incorporación
de [3H]AA en PL y TAG. Los datos se expresan como pmol/106 células. *p < 0,05.
[3H]AA (M)
PL TAG
WT KO WT KO
0,001 (11,40 ± 0,05)·10-3 *(21,90 ± 0,36)·10-3 (0,80 ± 0,08)·10-3 (0,90 ± 0,05)·10-3
0,10 1,10 ± 0,06 *1,70 ± 0,12 0,10 ± 0,01 0,10 ± 0,10
1 9,10 ± 0,90 *16,30 ± 1,49 1,10 ± 0,05 1,50 ± 0,15
10 57,80 ± 2,86 *106,70 ± 2,61 10,10 ± 1,34 *17,00 ± 0,29
RESULTADOS
128
Posteriormente se procedió a estudiar si este comportamiento es específico para
el AA. Para ello, se incubaron las células durante 30 min con [3H]AA, [14C]Pam (16:0,
ácido graso saturado), [14C]Olc (18:1n-9, ácido graso monoinsaturado) o [14C]DHA (22:6n-
3, ácido graso poliinsaturado ω-3) a 10 M. En los sucesivos experimentos de
incorporación se eligió la concentración de 10 M debido a que esta concentración
permite ver las diferencias de forma más reproducible. Los resultados, representados en
la Figura 34, ponen de manifiesto que todos los ácidos grasos, no sólo AA, se incorporan
en mayor cantidad en los macrófagos peritoneales de ratones KO respecto a los WT, es
decir, que el comportamiento no es específico para el AA.
Estos resultados ponen de manifiesto que en macrófagos peritoneales carentes de
cav-1 el proceso de acilación de ácidos grasos está más activado.
RESULTADOS
129
FA
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06
célu
las)
0
100
200
300
400
500
FA
inco
rpor
ado
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
20
40
60
80
100
20:4n-6 16:0 18:1n-9 22:6n-3
A
B
20:4n-6 16:0 18:1n-9 22:6n-3
*
*
*
*
*
Figura 34. Incorporación de [3H]AA en macrófagos peritoneales de ratones WT y KO de cav-1.
Los macrófagos peritoneales se incubaron durante 30 min con [3H]AA 10 M (0,25 Ci/ml).
Después de extraer los lípidos se midió la incorporación de [3H]AA en PL (A) y TAG (B) en ratones
WT (barras blancas) y KO (barras negras). *p < 0,05.
RESULTADOS
130
5.3.2. Incorporación de [2H]AA en especies de PL
Dada la diferencia observada en la incorporación de ácidos grasos entre ratones
WT y KO se procedió al análisis lipidómico de las especies de PL (PC, PE y PI) que
incorporan AA en los macrófagos peritoneales de ratones WT y KO, y la determinación
de las especies que específicamente albergan el exceso de AA incorporado en el caso de
los macrófagos de ratones KO comparado con los WT. Para ello se llevó a cabo el mismo
experimento de incorporación de AA que en el apartado 5.3.1, pero en lugar de usar
[3H]AA se utilizó [2H]AA 10 M, y se midieron las especies conteniendo [2H]AA a 30 min.
Las especies de PC, PE y PI detectadas que contienen [2H]AA se muestran en la Figura
35. Se detectaron 5 especies de PC conteniendo [2H]AA. La especie que más AA
incorpora es PC(16:0/[2H]AA), siendo significativamente más abundante en las células
de ratones KO que en las de WT. Las dos siguientes especies que más AA incorporan son
PC(18:0/[2H]AA) y PC(18:1/[2H]AA), que lo hicieron de forma similar tanto en células de
ratones KO como WT. Otras dos especies, PC(O-18:1/[2H]AA) y PC(16:1/[2H]AA), se
detectaron en ratones KO pero no en los WT.
En las especies de PE y PI que incorporan [2H]AA la diferencia es mucho más
acusada. De PE sólo se detectó una especie, PE(P-16:0/[2H]AA), en el caso de los KO,
indetectable en el caso de los WT. En cuanto a las especies de PI que incorporan [2H]AA,
las cuatro especies detectadas incorporaron más [2H]AA en los ratones KO que en los
WT, siendo éstas PI(18:0/[2H]AA), PI(18:1/[2H]AA), PI(16:0/[2H]AA) y PI([2H]AA/[2H]AA).
Estos resultados muestran que la mayor incorporación de AA que ocurre en ratones KO
respecto a WT ocurre en especies de PC, concretamente en la especie PC(16:0/[2H]AA),
aunque proporcionalmente el aumento es mayor en especies de PE y PI. Sabiendo que
las especies de PC son las que preferentemente incorporan AA exógeno [11], es factible
pensar que los macrófagos de ratones KO no sólo presentan una activación de la
reacilación, sino que el proceso de remodelación es mucho más rápido, de manera que
a los 30 min, parte del AA incorporado en exceso en los macrófagos de ratones KO con
respecto a los WT, presumiblemente en especies de PC, es rápidamente transferido a
especies de PE.
RESULTADOS
131
Esp
ecie
s de
PC
con
[2 H]A
A
(p
mo
l/106
cé
lula
s)
0
10
20
30
40
50
60
*
16:
1/[2
H]A
A
16:0
/[2H
]AA
O-1
8:1/
[2H
]AA
18:1
/[2H
]AA
18:0
/[2H
]AA
A
Esp
ecie
s de
PI c
on
[2H
]AA
(p
mol
/106
cél
ula
s)
0
5
10
15
20
*
*
*
*
16:0
/[2H
]AA
18:1
/[2H
]AA
18:0
/[2H
]AA
[2H
]AA
/[2H
]AA
C
P-16:0/[2H]AA
Esp
ecie
s de
PE
con
[2H
]AA
(p
mol
/106
cél
ulas
)
0
1
2
3
4
5
B
Figura 35. Incorporación de [2H]AA en macrófagos peritoneales de ratones WT y KO de cav-1
mediante HPLC-MS. Los macrófagos peritoneales correspondientes a 5 ratones (de cada tipo) se
incubaron durante 30 min con [2H]AA 10 M. Después se extrajeron los lípidos y se analizaron las
especies de PC (A), PE (B) y PI (C) que incorporaron [2H]AA tanto en ratones WT (barras blancas)
como KO (barras negras) mediante HPLC-MS. *p < 0,05.
RESULTADOS
132
5.3.3. Análisis de las especies endógenas de PC, PE y PI mediante HPLC-MS
Con el objeto de observar alguna diferencia en el contenido lipídico,
especialmente la distribución del AA dentro de las especies de PL, y obtener más
información sobre la razón por la que hay una mayor incorporación de AA en macrófagos
peritoneales de ratones KO, se procedió al análisis lipidómico de las especies endógenas
de PC, PE y PI del extracto lipídico de macrófagos peritoneales de ratones KO y WT
mediante HPLC-MS. Las especies endógenas de PC, PE y PI conteniendo AA se
representan en las Figuras 36 (PC), 37 (PE) y 38 (PI), bien en masa (Figuras 36A, 37A
y 38A), o en % respecto al total de PL (Figuras 36B, 37B y 38B). Dichas especies se
identificaron y caracterizan por comparación con las bases de datos y por los
fragmentos generados en MS/MS: el fragmento característico de AA [M-H]- = m/z 303, y
el correpondiente a la pérdida neutra de la cadena lateral en la posición sn-2.
En la Figura 36 se representan las especies de PC que contienen AA. Se
identificaron hasta 7 especies diferentes. La especie PC(20:4/20:4) también se detectó,
pero al estar por debajo del límite de cuantificación no se representa en la figura. De
estas especies, las más abundantes son PC(18:0/20:4) y PC(16:0/20:4), seguidas de
PC(18:1/20:4) (estas tres son las que mayoritariamente incorporan [2H]AA, apartado
5.3.2.), a continuación PC(O-18:1/20:4), PC(O-16:0/20:4) y, por último,
PC(P-16:0/20:4). En todos los casos, dichas especies fueron significativamente menos
abundantes en los macrófagos peritoneales de ratones KO que en WT, es decir, los
ratones KO presentan una deficiencia de AA en especies de PC respecto a los WT.
En el caso de las especies de PE, se detectaron igualmente 7 especies
conteniendo AA (Figura 37). De ellas, PE(P-16:0/20:4) (especie también observada en
los experimentos con [2H]AA), PE(P-18:1/20:4), PE(P-18:0/20:4) y PE(18:0/20:4) son las
mayoritarias, seguidas de PE(P-18:2/20:4), PE(16:0/20:4) y PE(18:1/20:4). Salvo las
especies PE(P-16:0/20:4), PE(P-18:2/20:4) y PE(P-18:0/20:4), que son similares en
ambos tipos de ratones, el resto resultan ser más abundantes en los macrófagos de
ratones KO respecto a los WT.
Por último, el análisis de las especies de PI (Figura 38) muestra 4 especies con
AA, siendo la mayoritaria PI(18:0/20:4), seguida de PI(18:1/20:4), PI(16:0/20:4) (las tres
de las 4 especies que incorporan [2H]AA, apartado 5.3.2.) y PI(18:2/20:4), junto con
PI(20:4/20:4), que por estar en tan baja cantidad no ha sido posible su cuantificación.
En este caso, todas las especies son mucho más abundantes en las células de ratones KO
respecto a los WT, contrariamente a lo que ocurría con las especies de PC, y similar a lo
que ocurre en especies de PE, aunque de forma mucho más acusada.
RESULTADOS
133
Esp
ecie
s de
PC
(pm
ol/1
06 c
élul
as)
0
100
200
300
P-1
6:0/
20:4
O-1
6:0/
20:4
16:
0/20
:4
O-1
8:1/
20:4
18:
1/20
:4
18:
0/20
:4
A
* *
*
**
*
Esp
ecie
s de
PC
(%
res
pect
o P
L to
tale
s)
0
2
4
6
8
10
P-1
6:0/
20:4
O-1
6:0/
20:4
16:0
/20:
4
O-1
8:1/
20:4
18:1
/20:
4
18:
0/20
:4
B
* *
*
**
*
Figura 36. Análisis de especies endógenas de PC en ratones WT y KO mediante HPLC-MS. Se
extrajeron los lípidos de macrófagos peritoneales correspondiente a 5 ratones (de cada tipo), y
se analizó el perfil de especies de PC que contenían AA en masa (A) o % respecto a PL totales (B)
de ratones WT (barras blancas) y KO (barras negras). *p < 0,05.
RESULTADOS
134
Esp
ecie
s de
PE
(pm
ol/1
06
célu
las)
0
100
200
300
400
500
600
P-1
6:0/
20:4
16:0
/20:
4
P-1
8:2/
20:4
P-1
8:1/
20:4
P-1
8:0/
20:4
18:1
/20:
4
18:0
/20:
4
A
*
*
*
Esp
ecie
s de
PE
(%
res
pect
o P
L to
tale
s)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
P-1
6:0/
20:4
16:0
/20:
4
P-1
8:2/
20:4
P-1
8:1/
20:4
P-1
8:0/
20:4
18:1
/20:
4
18:0
/20:
4
B
*
*
*
Figura 37. Análisis de especies endógenas de PE en ratones WT y KO mediante HPLC-MS. Se
extrajeron los lípidos de macrófagos peritoneales correspondiente a 5 ratones (de cada tipo) y se
analizó el perfil de especies de PE que contenían AA en masa (A) o % respecto a PL totales (B) de
ratones WT (barras blancas) y KO (barras negras). *p < 0,05.
RESULTADOS
135
Esp
ecie
s de
PI (
pmol
/10
6 cé
lula
s)
0
200
400
600
16:0
/20:
4
18:2
/20:
4
18:1
/20:
4
18:0
/20:
4
A
* *
*
*E
spec
ies
de P
I (%
re
spec
to P
L to
tale
s)
0
5
10
15
20 *
*
*
*
16:0
/20:
4
18:2
/20:
4
18:1
/20:
4
18:0
/20:
4
B
Figura 38. Análisis de especies endógenas de PI con AA en ratones WT y KO mediante HPLC-MS.
Se extrajeron los lípidos de macrófagos peritoneales correspondiente a 5 ratones (de cada tipo) y
se analizó el perfil de especies de PI que contenían AA en masa (A) o % respecto a PL totales (B),
para células WT (barras blancas) y KO (barras negras). *p < 0,05.
RESULTADOS
136
En la Figura 39 se muestran las especies de PC, PE y PI que no contienen AA,
identificadas por comparación con las bases de datos, o aquella cuyos espectros de
fragmentación constituían una mezcla de iones correspondientes a distintos isómeros y
no podían asignarse inequívocamente a una especie con AA. En estos casos las especies
moleculares se han dejado en forma abreviada, indicando únicamente el tipo de especie
(PC, PE o PI), número de carbonos totales que suman las dos cadenas laterales del
fosfolípido, número total de insaturaciones totales entre las dos cadenas, y si se trata
de un plasmanilo (O-) o plasmenilo (P-).
En cuanto a las especies detectadas de PC, 16 en total (Figura 39A), cabe
destacar la diferencia observada en la especie PC(32:0) —con mucha probabilidad
PC(16:0/16:0)—, que es significativamente inferior en los KO. Dicha especie, junto con
PC(34:1) y PC(34:2) —posiblemente formadas por una cadena de 16 carbonos y otra de
18—, y PC(36:2) —muy probablemente formada por dos cadenas de 18 átomos de
carbono—, son las mayoritarias, alcanzando niveles similares a los de las especies
mayoritarias conteniendo AA. Del resto de especies, hay dos minoritarias, PC(O-38:6/P-
38:5) y PC(38:0/O-40:7/P-40:6), que también se encuentran en menores cantidades en
los KO. En el resto de especies detectadas no se observaron diferencias apreciables.
En referencia a las especies de PE (Figura 39B), 13 en total, la mayoría se hallan
en mayores cantidades en las células de ratones KO. Cabe destacar las mayoritarias
dentro de éstas, especialmente PE(40:4), PE(40:6) y PE(40:5), que corresponden a las
especies PE(18:0/22:4), PE(18:0/22:6) y PE(18:0/22:5), respectivamente, de acuerdo
con los estudios preliminares de fragmentación realizados, aunque de forma muy
minoritaria también se observaron fragmentos correspondientes a otros isómeros.
También hay gran diferencia entre células de ratones WT y de KO en las especies PE(O-
34:2/P-34:1), PE(34:1) y PE(36:2), compuestas probablemente por cadenas de 16 y 18
átomos de carbono, con 0, 1 ó 2 insaturaciones.
Con respecto a las especies de PI, se detectaron tres, PI(36:0), probablemente
PI(18:0/18:0) y PI(36:3), formado probablemente por cadenas de 18 átomos de carbono.
Por último, la especie PI(40:4), cuyos fragmentos corresponden a la especie
PI(18:0/22:4), aparece en ratones KO pero no en los WT. El 22:4 o ácido adrénico es el
homólogo superior del AA (Figura 39C).
RESULTADOS
137
Esp
eci
es d
e P
I (p
mo
l/106
cél
ula
s)
0
50
100
150
200
P
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:3)
PI(
36
:0)
PI(
40
:4)
C
Esp
ecie
s de
PC
(pm
ol/1
06
cél
ula
s)0
50
100
150
200
250
300
350
PC
(40:
4)
PC
(36:
5)
PC
(36:
3)
PC
(36:
2)
P
C(O
-38
:6/P
-38:
5)
PC
(36:
1)
PC
(38:
6)
PC
(38:
3)
PC
(40:
6)
PC
(40:
5)
PC
(32
:0)
PC
(32:
1)
P
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8:0
/O-4
0:7
/P-4
0:6
)
P
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-34
:1/P
-34:
0)
PC
(34:
2)
PC
(34:
1)
A
*
* *E
spe
cie
s d
e P
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pm
ol/1
06
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lula
s)
0
50
100
150
200
250
PE
(40
:4)
PE
(O-4
0:6
/P-4
0:5
)
PE
(40
:7)
PE
(40
:6)
PE
(40:
5)
PE
(38:
0/O
-40:
7/P
-40:
6)
PE
(38:
6)
PE
(38:
1)
PE
(36
:2)
PE
(36
:1)
PE
(O-3
4:2/
P-3
4:1)
PE
(34:
1)
P
E(O
-36
:4/P
-36:
3)
B *
*
*
**
Figura 39. Análisis de especies endógenas de PC, PE y PI sin AA en ratones WT y KO mediante
HPLC-MS. Se extrajeron los lípidos de macrófagos peritoneales correspondiente a 5 ratones (de
cada tipo) y se analizó el perfil de especies de PC (A), PE (B) y PI (C) para células WT (barras
blancas) y KO (barras negras). *p < 0,05.
RESULTADOS
138
En resumen, el perfil de las especies endógenas de PL muestra que las especies
de PI y PE que contienen AA son más abundantes en células de ratones KO. Sin embargo,
para especies de PC ocurre lo contrario, aquellas especies de PC que contienen AA son
menos abundantes en células de ratones KO. Esta diferencia entre especies de PC y PE
sugiere, a primera vista, una mayor velocidad de remodelación del AA en los PL de los
ratones KO que en los WT.
5.3.4. Incremento de la actividad CoA-IT en células sin cav-1
Una manera directa de comprobar si el proceso de remodelación en los
macrófagos de ratones KO está activado, en vista de los resultados mostrados en el
apartado 5.3.3., es midiendo la actividad CoA-IT en homogeneizados de ambos tipos de
células, pues es la enzima encargada de la remodelación de AA entre PC y PE. Los
resultados, que se muestran en la Figura 40, indican un evidente incremento de la
actividad CoA-IT en homogeneizados de macrófagos peritoneales KO en comparación
con homogeneizados de células WT (de hasta un 70%).
Act
ivid
ad C
oA-I
T (
pmol
min
-1m
g-1)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
WT KO
*
Figura 40. Actividad CoA-IT en homogeneizados de macrófagos peritoneales de ratones KO. Se
prepararon homogeneizados de macrófagos peritoneales de ratones WT y KO, y se realizó un
ensayo de actividad enzimáticaCoA-IT, utilizando lisoPAF como sustrato a una concentración de 5
M. *p < 0,05.
RESULTADOS
139
5.3.5. Análisis de ácidos grasos por GC-MS
Ya que previamente se había observado un incremento en la incorporación de
ácidos grasos en las células de ratones KO, se procedió al análisis del perfil de ácidos
grasos esterificados en PL de macrófagos peritoneales KO y WT mediante GC/MS, con el
fin de determinar si de forma natural hay alguna diferencia debida a la carencia de
cav-1. Estos datos están representados como % respecto al total en la Tabla 15. Los
datos muestran hasta 19 ácidos grasos detectados, de los cuales 8 estaban por debajo
del límite de cuantificación. No existe ninguna diferencia significativa entre los niveles
de ningún ácido graso esterificado en PL entre ratones WT y KO.
Tabla 15. Perfil de ácidos grasos en PL de macrófagos peritoneales de ratones WT y KO. El
contenido se muestra en nmol/106 células.
Ácido graso Nombre común WT KO
12:0 Ácido láurico nc* nc
14:0 Ácido mirístico 0,24 ± 0,01 0,31 ± 0,05
15:0 Ácido pentadecanoico nc nc
16:0 Ácido palmítico 5,35 ± 0,52 5,05 ± 0,61
16:1n-7 Ácido palmitoleico nc nc
18:0 Ácido esteárico 3,62 ± 0,49 3,45 ± 0,20
18:1n-9 Ácido oleico 2,21 ± 0,29 1,61 ± 0,06
18:1n-7 Ácido vaccénico 0,59 ± 0,20 0,56 ± 0,02
18:2n-6 Ácido linoleico 1,22 ± 0,16 1,53 ± 0,18
18:3n-6 Ácido -linolénico nc nc
20:0 Ácido araquídico 0,14 ± 0,02 0,09 ± 0,04
20:1n-9 Ácido gondoico nc nc
20:2n-6 Ácido 11, 14-eicosadienoico 0,47 ± 0,25 0,49 ± 0,02
20:3n-6 Ácido dihomo-γ-linolénico 0,74 ± 0,33 0,80 ± 0,02
20:4n-6 AA 3,59 ± 0,27 3,56 ± 0,11
20:5n-3 EPA nc nc
22:4n-6 Ácido adrénico nc nc
22:5n-3 Ácido docosapentaenoico nc nc
22:6n-3 DHA 1,88 ± 0,28 1,77 ± 0,71
*nc: no cuantificable.
RESULTADOS
140
5.3.6. Análisis de AA en PL en macrófagos estimulados con zimosán mediante GC-MS
El siguiente paso fue examinar si la mayor capacidad de acilación de AA de las
células KO se traduce en alguna diferencia en la liberación de AA en condiciones de
estimulación con zimosán, puesto que la liberación neta de AA es un balance entre lo
que es hidrolizado de los PL por acción de PLA2 y lo que es reacilado de nuevo por
acción de las ACSL y LPLAT [11, 50]. Del mismo modo, la diferente distribución de AA en
las especies de PL en las células de ratones KO pudiera afectar el proceso de liberación
del mismo. Así pues, los macrófagos se estimularon durante 1 h con zimosán (1 mg/ml),
y posteriormente se analizó el contenido en AA. Los resultados de la Figura 41 ponen
de manifiesto que, tras la estimulación, hay mayor cantidad de AA en las células KO en
comparación con las WT, es decir, una menor liberación de AA (17,9 ± 0,6%), lo que es
congruente con el hecho de que el proceso de reacilación en ausencia de cav-1 esté
activado, y de que el AA susceptible de ser liberado en condiciones de estimulación en
las células KO no esté en los reservorios de PL adecuados.
RESULTADOS
141
WT KO
WT KO
nmol
AA
en
PL/
106
célu
las
0
1
2
3
4
5
AA
en
PL
(% r
espe
cto
a co
ntro
l)
0
20
40
60
80
100
120
140
A
B
*
*
Figura 41. Contenido de AA en macrófagos peritoneales de ratones KO al estimular con zimosán.
Los macrófagos peritoneales, tanto de ratones WT como de KO, se incubaron en ausencia (barras
blancas) o en presencia de 1 mg/ml de zimosán (barras grises), durante 1 h. Posteriormente se
extrajeron los lípidos celulares y se analizó el contenido de AA en PL mediante GC/MS, que se
expresa como nmol/106 células (A) o % respecto al contenido de AA en células sin tratar (B). *p <
0,05.
RESULTADOS
142
Con el propósito de comprobar si la disminución en la liberación de AA en
condiciones de estimulación con zimosán tiene como consecuencia una disminución en la
síntesis de metabolitos derivados del AA, característicos en una respuesta inflamatoria,
se midió la cantidad de PGE2 y LTB4 liberado al medio extracelular tras estimular las
células en las mismas condiciones. Estas medidas se realizaron mediante un ensayo
ELISA. Tal y como se puede observar en la Figuras 42A y 42B, hay menos producción de
ambos eicosanoides en los macrófagos de ratones KO estimulados con zimosán. Es
importante recalcar que en las células sin estimular también hay una marcada
disminución en la cantidad de PGE2 y de LTB4 en las células de ratones KO, lo que pone
de manifiesto, presumiblemente, que los macrófagos de los ratones KO, al tener una
mayor capacidad de reacilación de AA producen menos PGE2 y LTB4, tanto a nivel basal
como, más notoriamente, en condiciones de estimulación.
RESULTADOS
143
PG
E2
(ng/
106
célu
las)
0
50
100
150
200
250
*
#A
WT KO
LTB
4 (ng
/10
6 cé
lula
s)
0
1
2
3 *
#B
WT KO Figura 42. Producción de PGE2 y LTB4 de macrófagos peritoneales de ratones WT y KO. Los
macrófagos peritoneales de ratones WT y KO se incubaron en ausencia (barras blancas) o
presencia de zimosán 1 mg/ml (barras negras) durante 1 h. Posteriormente se recogieron los
sobrenadantes y se cuantificó PGE2 (A) o LTB4 (B) presente en el medio extracelular mediante
ensayo ELISA. *p < 0,05; #p < 0,05; n = 17 para PGE2 y n = 10 para LTB4.
RESULTADOS
144
5.3.7. Infiltración de neutrófilos en peritonitis inducida por con zimosán
Para estudiar si la diferencia de producción de PGE2 y LTB4 en los ratones KO,
tanto en condiciones basales como, especialmente, en condiciones de estimulación,
tiene consecuencias fisiopatológicas, se indujo en los ratones KO y WT una infección
aguda en el peritoneo, para así poder estudiar posibles diferencias en la infiltración de
granulocitos en la zona de infección. Para ello se inoculó 1 mg de partículas de zimosán
(suspendidas en PBS estéril) intraperitonealmente, y el mismo volumen de PBS sólo a
ratones control. Se usaron 4-5 ratones por condición y se mantuvieron 12 h antes de
sacrificarlos (tiempo en el que la respuesta proinflamatoria llega al máximo [226]). Las
células del peritoneo se extrajeron tal y como se detalla en “Materiales y Métodos”, se
marcaron con un anticuerpo específico para granulocitos (Ly-6G o GR-1) marcado con
FITC y se analizaron en un citómetro de flujo. En la Figura 43 (A.1 y A.2) se muestran
diagramas representativos de los resultados analizados para cada condición, esto es,
ratones WT y KO tratados o no con zimosán. En la Figura 43 se muestra el número de
granulocitos encontrados en el peritoneo, con y sin infección. Se observa una clara
disminución en la infiltración de granulocitos en el peritoneo de los ratones KO tratados
con zimosán. Esta diferencia, que podría atribuirse a la menor cantidad de eicosanoides
como consecuencia de una menor liberación de AA, manifiesta una deficiencia en la
respuesta proinflamatoria en ratones carentes de cav-1.
RESULTADOS
145
nº d
e cé
lula
s (x
10-6
)
0
2
4
6
8
10
12
14
*
log (FL1)
Con
teo
Control Zimosán
A.1
log (FL1)
Con
teo
A.2
B
Figura 43. Infiltración de granulocitos en el peritoneo de ratones KO y WT en peritonitis. Se
inyectó 1 mg de zimosán en 500 l de PBS (zimosán) o sólo PBS (control) en el peritoneo de
ratones WT y KO. Tras 12 h, los ratones se sacrificaron y se extrajo el contenido peritoneal de
cada ratón, las células se marcaron con anti-Ly-6G FITC y se analizaron por citometría de flujo.
(A) Diagramas representativos de la población granulocítica de peritoneo de ratones WT (rosa) y
KO (azul) infectados con zimosán, con los correspondientes controles de isotipo, gris y negro,
respectivamente, en situación control (A.1) y con tratamiento con zimosán (A.2). (B) Media de 5
ratones WT (barras rosas) y KO (barras azules) en situación control o inyectados con zimosán.
*p < 0,05, n = 5.
6. DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
149
6.1. FUNCIÓN DE LPCAT3 EN LAS REACCIONES DE REACILACIÓN DE AA REGULADAS POR RECEPTOR
El control de los niveles de AA en la célula se realiza a través de varias
reacciones bioquímicas en equilibrio. En un primer lugar, el AA tiene que ser
incorporado en los PL celulares. Este proceso de incorporación, común para los ácidos
grasos poliinsaturados, se produce principalmente a través del ciclo de Lands,
mecanismo por el que los PL de membrana sufren reacciones de acilación/desacilación
en la posición sn-2 [11, 20, 23], aunque alternativamente el AA puede incorporarse a
través de la ruta de novo, si la célula está expuesta a altas concentraciones de AA [11].
En estado basal el proceso de incorporación de AA en PL está muy bien caracterizado;
sin embargo, se conoce muy poco de su regulación en condiciones de estimulación,
donde la activación sostenida de las PLA2 —en particular la cPLA2— produce la
liberación de AA a una velocidad mayor que la de reacilación en los PL, que culmina en
la acumulación de gran cantidad de AA libre, el cual sirve de sustrato para numerosas
enzimas que lo oxidan para dar lugar finalmente a una gran variedad de eicosanoides. A
este respecto, varios estudios han demostrado que la velocidad de incorporación de AA
en PL celulares se incrementa ligeramente después de la estimulación celular en
mastocitos de ratón, neutrófilos humanos y macrófagos peritoneales de ratón con la
utilización de diferentes estímulos, como PAF, ionóforo o zimosán [129, 131, 158, 251,
252]. Se cree que este incremento es importante para el reabastecimiento de las
reservas intracelulares de AA, las cuales se han agotado después de la estimulación
[11]. Sin embargo, el aumento del influjo de AA exógeno en PL puede también ocurrir
bajo condiciones donde no hay liberación de AA endógeno [137, 209], lo que da indicios
de que este proceso puede ser realmente independiente.
Tradicionalmente se ha asumido que la incorporación de AA en PL en condiciones
de estimulación celular es un proceso subsiguiente a la etapa de hidrólisis llevado a
cabo por las PLA2, debido a que el AA se incorpora preferentemente en la posición sn-2
de los PL. Así pues, para que ocurriera un incremento en la incorporación de AA, las
PLA2 tendrían que generar lisoPL a partir de PL. Por otro lado, se ha descrito que las
actividades de las enzimas que participan en las reacciones de reacilación, es decir, la
actividad acil-CoA sintetasa y la lisofosfolípido:acil-CoA aciltransferasa son varias veces
superiores a las de las PLA2 tanto en homogeneizados de células en estado basal como
en homogeneizados de células estimuladas, lo que sería concordante con que la
reacción de hidrólisis de las PLA2 sobre los PL para generar lisofosfolípidos constituyera
el paso limitante en el proceso de reacilación en condiciones de activación celular.
DISCUSIÓN
150
En este estudio se demuestra que la estimulación de monocitos con zimosán
promueve la liberación de AA y que el proceso es dependiente de la activación de la
cPLA2, pues al hacer ensayos de liberación de AA con pirrofenona, inhibidor de esta
enzima, se inhibe completamente la respuesta, un comportamiento descrito con
anterioridad en distintos tipos celulares como promonocitos humanos o macrófagos de
ratón [253-255]. Sin embargo con el uso de BEL, inhibidor de la iPLA2, la liberación se
mantiene inalterada. También se ha observado que las células estimuladas con zimosán
presentan un incremento en la incorporación de AA en todas las clases mayoritarias de
PL (PI, PC y PE), el cual se produce principalmente a través del ciclo de
acilación/desacilación, pues, aunque se demuestra que en estas condiciones la ruta de
novo también se activa, su contribución a la incorporación de AA en PL es menor, en
vista de los resultados obtenidos con propranolol, inhibidor de PAP-1, enzima que actúa
en la ruta de novo.
Un resultado llamativo de estos estudios es que la incorporación de AA es
insensible a pirrofenona, lo que pone de manifiesto que el incremento en la
incorporación de AA en los PL no está determinado únicamente por el incremento en la
cantidad de lisoPL producidos por la activación (mediada por receptor) de la cPLA2. El
inhibidor BEL sí produce inhibición en la incorporación de AA, si bien esta disminución
es la misma en condiciones de estimulación que en condiciones basales. Se ha descrito
que la iPLA2 tiene una importante función homeostática, manteniendo los niveles de
lisoPL en condiciones basales en macrófagos P388D1 y U937, importante para la
incorporación y movilización de AA, o en el control de la disponibilidad de lisoPC,
indispensable en señales de apoptosis [25, 27, 28, 239, 248]. Así pues, si se inhibe la
enzima bajan los niveles de lisoPL presentes en la célula y como consecuencia el
proceso de acilación de AA se ve reducido. Lo que es nuevo e importante de estos
resultados es que la iPLA2 también participa en la incorporación de AA en condiciones
de estimulación. Sin embargo, es necesario recalcar que esta contribución parcial es
igual en ambos casos, tanto en estado basal como en estimulación, lo que quiere decir
que incluso en ausencia de esta enzima hay un aumento neto en la incorporación de AA
en condiciones de activación en relación con el estado basal, o, lo que es lo mismo, el
efecto provocado por la iPLA2 no condiciona el proceso de incorporación en células
activadas.
Así, el proceso de incorporación de AA en estas condiciones no está limitado por
la cantidad de lisoPL presentes, y parece constituir en sí mismo un proceso regulado por
receptor con entidad propia. Si las PLA2 no regulan directamente esta ruta de
incorporación de AA, parece lógico pensar que sí lo hagan las otras enzimas implicadas
DISCUSIÓN
151
en la ruta de reacilación, ya sea las acil-CoA sintetasas o las lisofosfolípido:acil-CoA
aciltransferasas. Para verificarlo de manera sencilla y directa se han medido las
actividades enzimáticas de estos dos grupos de enzimas en homogeneizados de células
estimuladas con zimosán.
Hasta este momento se han caracterizado cinco formas diferentes de acil-CoA
sintetasa de cadena larga: ACSL1, ACSL3, ACSL4, ACSL5 y ACSL6 [88, 92, 256]. De todas
ellas, la ACSL4 y ACSL6, presentan cierta selectividad por AA, y la ACSL6 también por
DHA en células sin tratar [90, 93]. Sin embargo, en este trabajo no se ha detectado
ningún incremento en la actividad acil-CoA sintetasa en homogeneizados de células
tratadas con zimosán utilizando AA como sustrato, lo que sugiere que esta actividad no
se regula por señales extracelulares.
En cuanto a la actividad enzimática LPLAT, ésta se midió para distintas clases de
lisoPL como aceptores; lisoPC, lisoPE, lisoPI y lisoPA. Los tres primeros lisoPL toman
parte en el ciclo de Lands, y el último es un aceptor de la biosíntesis de novo de PL. Los
resultados muestran que en condiciones de estimulación con zimosán solamente la
actividad LPCAT aumenta, lo que demuestra que la ruta de reacilación está regulada a
nivel de las aciltransferasas. Por el contrario, utilizando el resto de los lisofosfolípidos
no se detectaron cambios en la actividad. El que la actividad LPLAT correspondiente al
uso de lisoPA como aceptor se mantenga inalterada es esperable, puesto que los datos
han demostrado que la incorporación de AA en PL inducida por zimosán no se produce
por la ruta de novo de biosíntesis de PL. Que no haya incremento en la actividad
enzimática usando como aceptores lisoPI o lisoPE es más difícil de explicar, puesto que
sí se observa un incremento en la incorporación de AA en PE y PI en células estimuladas
con zimosán. Además, se han descrito enzimas aciltransferasas con clara preferencia
por lisoPE y por lisoPI como aceptores [122, 124, 125]. Es posible que una porción
significativa del AA reincorporado en estos PL en células activadas, particularmente en
PE, proceda de PC a través de reacciones de transacilación, ya que es bien conocido que
dicha ruta contribuye sustancialmente a la remodelación de los ácidos grasos de PL en
neutrófilos humanos [131].
En cuanto a las LPCAT, se han descrito hasta el momento cuatro enzimas en
humanos con esta actividad. Tres de ellas, LPCAT1, LPCAT2 y LPCAT4, pertenecen a la
familia de AGPAT, y la cuarta, LPCAT3, que forma parte de la familia MBOAT. En ratón
se ha descrito que tanto la LPCAT2 como la LPCAT3 muestran preferencia por AA [120,
121], aunque también por ácido linoleico [120, 123, 250]. Shindou et al. [120] ha
descrito aumento de la actividad lisoPAF:acetil-CoA aciltransferasa en RAW 264.7
transfectadas con el gen de ratón LPAF-AT/LPCAT2 y estimuladas con agonistas de TLR.
DISCUSIÓN
152
Sin embargo, en ese trabajo no se describió nada relacionado con la actividad LPCAT, lo
que sugiere que el principal papel de esta enzima se encuentra más relacionado con el
metabolismo de PAF que con el proceso de remodelación general de los PL. De hecho,
recientemente se ha descrito que la enzima se fosforila en Ser34 por la acción de la
MAPKAP quinasa 2 o MK2, (MAPK-activated protein kinase 2) en macrófagos de ratón, y
que la actividad enzimática, utilizando acetil-CoA y araquidonoil-CoA como sustratos,
aumenta significativamente en macrófagos transfectados con la enzima y estimulados
con LPS, si bien el aumento de la actividad lisoPAF-AT es mucho más acusado que el de
LPCAT [257]. Por otro lado, se ha encontrado actividad LPCAT endógena en macrófagos
peritoneales de ratón que aumenta en respuesta a LPS bacteriano, aunque la expresión
basal de LisoPAF/LPCAT2 fue casi indetectable, lo que sugiere que esta actividad LPCAT
basal que se midió podía deberse a otras isoformas [120]. En este sentido, esta tesis
demuestra, utilizando siRNA específico, que la LPCAT implicada en la reacilación de AA
en condiciones de estimulación es la LPCAT3 y que la LPCAT2 juega un papel
minoritario. Este comportamiento se ha observado en monocitos, promonocitos U937 y
también en la línea celular HEK293, poniendo de manifiesto que el comportamiento no
se circunscribe a un solo tipo celular, si bien es cierto que la activación de HEK293 no es
mediada por receptor, y se aleja del modelo fisiológico de estimulación con zimosán a
través de receptor en células fagocíticas.
DISCUSIÓN
153
6.2. INFLUENCIA DE LOS NIVELES CELULARES DE AA EN LA REMODELACIÓN Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CoA-IT EN MONOCITOS Y U937
En este estudio se ha comparado la incorporación y remodelación de AA en los PL
de membrana de células promonocíticas humanas (U937) y monocitos humanos extraídos
de sangre periférica. La remodelación de AA entre los PL celulares es esencial para
lograr la distribución apropiada del ácido graso en los reservorios específicos sobre los
que actúan las PLA2 para iniciar la síntesis de eicosanoides [11, 50]. En el proceso de
remodelación de AA en los PL participan secuencialmente las lisofosfolípido:acil-CoA
aciltransferasas y la transacilasa independiente de CoA [11, 50]. Así, las aciltransferasas
dependientes de CoA median la incorporación inicial de AA en PL, y después, gracias a
la acción de CoA-IT, el AA se redistribuye entre las clases de PL. Está descrito que tanto
la inhibición del proceso de incorporación como el de remodelación de AA altera la
homeostasis celular y induce apoptosis [27, 140, 142].
En este trabajo se ha demostrado que las células U937 manifiestan una gran
capacidad para incorporar AA en PL, que es cualitativamente similar a la de los
monocitos humanos y, en ambos tipos de células, la incorporación en lípidos neutros
(TAG) es menor, lo que indica que el AA se incorpora a los PL a través del ciclo de
Lands. En ambas células (U937 y monocitos), el AA se incorpora en PC y PI inicialmente,
seguido de la transferencia de AA a PE a expensas de PC. Aunque esta remodelación de
AA es, en términos cualitativos, similar al descrito en otros sistemas celulares como
macrófagos alveolares, peritoneales, neutrófilos o linfocitos [11, 128, 130, 137, 209], lo
que la hace notoria en las células U937 es que es extremadamente rápida comparado
con los monocitos.
Con el fin de comprobar si el estado de diferenciación celular influye en esta
diferencia en la velocidad de remodelación, se indujo la diferenciación de las células
U937 hacia monocitos maduros exponiéndolas a PMA, un éster de forbol que provoca el
cese de la división celular, adherencia, formación de agregados y expresión de
propiedades fenotípicas propias de monocitos maduros, como la expresión de antígenos
de superficie, tales como glicoproteínas [258] y el receptor de -microglobulina [259],
así como mayor liberación de AA y síntesis de eicosanoides [206, 260]. Cabe destacar
que la incorporación en ambos casos es similar, así como también la velocidad de
remodelación es similar entre las U937 sin diferenciar y diferenciadas con PMA. En un
principio se puede pensar que el cese de la división de las células al diferenciarse
provoca una inevitable disminución en la síntesis de PL puesto que no se requiere la
DISCUSIÓN
154
fabricación de nuevas membranas, y por tanto el proceso de la distribución de AA en los
mismos pueda verse afectado. Sin embargo estos resultados muestran que el
movimiento de AA en PL es independiente de los cambios en el metabolismo de lípidos
asociado a la diferenciación, pues la velocidad de remodelación sigue siendo
extraordinariamente rápida. Así pues, estos resultados dan indicios de que la regulación
de estos eventos es independiente. De hecho, otros autores han descrito con
anterioridad que la actividad CoA-IT, enzima responsable de la remodelación de AA, se
mantiene inalterada con la diferenciación de las células U937 inducida por DMSO [261],
aunque sí se han descrito cambios en incorporación y liberación de AA o en síntesis de
eicosanoides, como consecuencia de aumento de la actividad PLA2 en la diferenciación
de células U937 con distintos agentes como DMSO, ésteres de forbol o IFN [262-266].
Como se muestra en esta tesis, la cantidad de AA presente en monocitos de
sangre periférica representa aproximadamente el 20% del total de los ácidos grasos
celulares esterificados. Sin embargo, en las células U937, el AA supone un escaso 3%.
Ello lleva a pensar en la posibilidad de que la gran capacidad de las células U937 para
remodelar AA en los PL pueda estar relacionada con su “deficiencia” en AA endógeno
comparada con monocitos de sangre normales. Con el fin de investigar esta hipótesis, se
prepararon células U937 enriquecidas en AA, cultivándolas con AA complejado con BSA,
con el fin de que la cantidad endógena de AA fuese similar a la encontrada en los
monocitos. Cuando se exponen de nuevo a AA, las células U937 enriquecidas
previamente con AA incorporan el ácido graso de una manera tanto cualitativa como
cuantitativamente similar a las células U937 sin enriquecer y a los monocitos. Sin
embargo, los resultados demuestran que en las células enriquecidas con AA, el proceso
de remodelación de AA en los PL es mucho más lento que en el de las células sin tratar,
llegando a ser parecido al de los monocitos (el tiempo de remodelación para las células
U937 enriquecidas con AA y los monocitos es aproximadamente de 15 h). En las células
U937 diferenciadas con PMA, enriquecidas con AA y expuestas a AA por segunda vez
ocurre lo mismo; las células remodelan el AA mucho más despacio, pasando de minutos
en células sin tratar a varias horas en el caso de células enriquecidas con AA. Estos
resultados indican que el contenido celular de AA modifica la velocidad del proceso de
remodelación.
Ya que la secuencia de la CoA-IT aún no ha sido descrita, no es posible manipular
sus niveles en células mediante las técnicas habituales de sobreexpresión o
silenciamiento. Por ello, la única manera de estudiar la regulación celular de la CoA-IT
es a través de la medida de la actividad enzimática. Mediante este tipo de
experimentos se ha observado que los niveles intracelulares de AA producen una
DISCUSIÓN
155
disminución en la actividad CoA-IT. Así, en homogeneizados de células enriquecidas en
AA, la actividad de la CoA-IT es significativamente más baja que en homogeneizados de
células sin tratar (deficientes en AA). Después de enriquecer las células con AA, la
actividad de la CoA-IT de homogeneizados de estas células presenta una Vmax menor que
la de los homogeneizados de células sin tratar con AA; sin embargo, la KM no sufre
variación significativa. Winkler et al. ha demostrado que la actividad CoA-IT no se
inhibe directamente por sustratos o productos de origen fosfolipídico en células U937,
particularmente ácido araquidónico y 1-alquil-2-araquidonoil-PC [261]. Así, una
explicación plausible de estos datos podría ser que enriquecer las células con AA lleva a
la reducción de la cantidad de masa de CoA-IT, lo que reduce su actividad en
homogeneizados. Ello lleva a especular con la posibilidad de que un PL conteniendo AA
—o un ácido graso sintetizado a partir de éste, por ejemplo ácido adrénico (22:4n-6),
producto de la elongación de AA [267]—, que estuviera presente en las células
enriquecidas pero no en las que no están tratadas, pueda regular los niveles de
expresión de la CoA-IT. En este sentido, estudios lipidómicos recientes de nuestro
laboratorio en monocitos humanos y células U937 han puesto de manifiesto la existencia
de un rápido recambio de ciertas especies con AA dependiendo del estado de activación
de la célula [12]. Igualmente, existen estudios que han mostrado que ciertas especies
moleculares de PL pueden producir efectos notables en la expresión de genes por
interacción directa con factores de transcripción. Por ejemplo, la activación de PPAR
mediada por ligando induce la expresión de genes implicados en el metabolismo de
ácidos grasos, y Chakravarthy et al. han mostrado recientemente que la especie
PC(16:0/18:1) es un ligando endógeno de PPAR en hígado de ratón, dependiente de la
ácido graso sintasa (FAS) [268].
DISCUSIÓN
156
6.3. EFECTO DE LA CAV-1 EN EL METABOLISMO DE AA DE MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATÓN
La cav-1 se expresa en todos los tejidos, si bien es más abundante en adipocitos,
fibroblastos, células endoteliales y epiteliales [170]. Por otro lado, aunque ha habido
discrepancias sobre la expresión de cav-1 en líneas celulares macrofágicas [269], existen
evidencias de que la caveola y/o caveolina están presentes en todos los tipos de células
inmunes, aunque su nivel de expresión y distribución puede depender de la activación o
grado de maduración de la célula [270]. Cav-1 ha sido identificada en macrófagos y
mastocitos de ratón [271-275], así como en neutrófilos y células dendríticas humanas
[276, 277].
En cuanto a lípidos se refiere, la cav-1 ha sido implicada tradicionalmente en la
unión y transporte de colesterol [190, 278]. Además, hace más de diez años se describió
que la cav-1 (ambas isoformas, y ) es capaz de unir ácidos grasos, al tratar proteínas
purificadas de membrana plasmática de adipocitos 3T3-L1 con ácido
11-DAPI[11-3H]undecanoico, un ácido graso fotorreactivo que marca la cav-1 de modo
saturable [192-194]. Por otro lado, está implicada en la formación y lipólisis de cuerpos
lipídicos, según los ensayos realizados en fibroblastos procedentes de ratones KO de
cav-1 [279]. Conociendo la implicación de esta proteína en el metabolismo de lípidos, se
propuso valorar el efecto de su ausencia en el metabolismo de AA en macrófagos
peritoneales de ratón y, de existir alguna diferencia, investigar qué consecuencias
tendría en la respuesta inflamatoria. Al hacer ensayos de incorporación con [3H]AA en
macrófagos peritoneales procedentes de dos tipos de ratones KO [196, 197], se observó
que el AA se incorpora principalmente en PL para todas las concentraciones utilizadas,
comportamiento típico de macrófagos peritoneales de ratón [30], aunque en ese caso a
concentraciones de 5 M la ruta de PL ya estaba saturada, mientras que en los
resultados que aquí se muestran, incluso a una concentración de 10 M el AA se
incorpora principalmente en PL. Lo más llamativo ha resultado ser que los macrófagos
sin cav-1 incorporan más AA tanto en PL como en TAG, en comparación con los WT,
comportamiento que se mantiene en un intervalo de concentraciones de cuatro órdenes
de magnitud. Este efecto no es específico de AA, sino que se observa también para DHA
y otros ácidos grasos comunes como ácido oleico (típico ácido graso monoinsaturado) y
palmítico (típico ácido graso saturado), lo que sugiere que la función que la cav-1
ejerce sobre los ácidos grasos no es selectiva, ni en cuanto a longitud ni en número de
insaturaciones. El hecho de que los macrófagos de ratones KO incorporen más AA que
los WT, o lo que es lo mismo, que en estas condiciones y para este tipo de células la
cav-1 actúe de regulador negativo de la incorporación de ácidos grasos, contrasta con lo
DISCUSIÓN
157
observado en la bibliografía. El fenotipo de los ratones sin cav-1 muestra alteración de
los lípidos plasmáticos y perfil de lipoproteínas en plasma, en particular altos niveles de
colesterol y ceramidas [280]; además, presentan alto contenido en ácidos grasos y TAG
circulantes, efecto que se agudiza en el estado postpandrial, y presentan resistencia a
desarrollar obesidad [182, 195, 201]. Todos estos efectos, aunque en parte han sido
atribuidos a un defecto en lipogénesis mediado por insulina al faltar el receptor de
insulina en estos ratones [195], son congruentes con el papel que desempeña la cav-1 en
el transporte de lípidos.
Por otro lado, Pohl et al. ha descrito cómo se reduce la incorporación de ácido
[3H]oleico, a una concentración de 173 M y complejado con BSA, en células de
hepatoma humano HepG2 [281] deficientes en cav-1 por tratamiento con
oligonucleótidos antisentido. Adicionalmente se corroboraron estos resultados al inhibir
la expresión de filipina III y ciclodextrina, otras dos proteínas indispensables en la
formación de la caveola. Asimismo, en MEF (fibroblastos embrionarios de ratón)
derivados de ratones KO de la cepa de Drab et al. [196] se observa una disminución en
la incorporación de ácido oleico (173 M con BSA 1:1) [282] junto con la pérdida la
expresión de FAT/CD36 en la membrana plasmática, proteína transportadora de ácidos
grasos cuya deficiencia está asociada a una disminución en la incorporación de los
mismos [283]. Según estos estudios, la pérdida de la caveola que acompaña la ausencia
de expresión de cav-1 es determinante para la disminución en la incorporación de ácido
graso.
La razón por la cual existe esta diferencia con la bibliografía no es fácil de
responder aunque es muy probable que se deba a diferencias derivadas del tipo celular
en consideración. En este trabajo se han utilizado macrófagos peritoneales de ratón,
células clave de la inmunidad con funciones completamente diferentes a las de las
células utilizadas en los trabajos presentes en bibliografía. La mayoría de los estudios
están realizados en fibroblastos o adipocitos, células especializadas para el almacenaje
de lípidos, donde la caveolina juega papel en lipogénesis y lipólisis [284]. Wu et al. ha
descrito cómo en ratones KO de FATP1 la incorporación de moléculas derivadas de
lípidos en tejido adiposo y músculo disminuye, mientras la incorporación en hígado y
corazón aumenta, indicando una redistribución de los ácidos grasos a tejidos donde la
FATP1 está ausente o no se requiere para la incorporación de ácido graso [285]. Esto
podría llevar a pensar que algo similar puede ocurrir en los ratones KO de cav-1.
Uno de los aspectos importantes a tener en cuenta es el perfil endógeno, tanto
de ácidos grasos como de especies de PL. En cuanto al perfil de ácidos grasos, no se han
DISCUSIÓN
158
encontrado diferencias al hacer al análisis mediante GC/MS de los ácidos grasos
esterificados en PL, ni en AA ni en ningún otro ácido graso.
Analizando mediante experimentos de metabolipidómica las especies de PL
donde se incorpora inicialmente el AA exógeno, se ha observado que en ratones KO este
ácido graso se incorpora en mayor medida en PC, PE y PI. Si bien la mayor incorporación
se produce en PC, aceptor inicial mayoritario de AA [11, 209, 286], el incremento
respecto a la incorporación en los WT es mucho más acusado en PE y PI. De hecho sólo
se ha detectado una especie de PE con [2H]AA que fue indetectable en los WT, lo que
hace pensar que el proceso de remodelación en las células KO es más rápido que en los
WT [11], aunque está descrito que en células primarias lleva horas en alcanzar la misma
cantidad de AA en PC que en PE [129, 137, 209]. Esta diferencia en la velocidad de
remodelación se corroboró midiendo la actividad CoA-IT y comprobando que hay más
actividad, aunque no se sabe si el aumento implica cambio en la proteína de afinidad
por el sustrato o aumento en su expresión. El aumento en la velocidad de remodelación
favorece a su vez el proceso de incorporación en PC, ya que la transferencia de AA de
PC a PE genera lisoPC disponibles para reacilar nuevas moléculas de AA.
En cuanto al perfil endógeno de especies de PL, las especies mayoritarias
conteniendo AA son similares a las de otros estudios [12, 287, 288]. Sin embargo,
merece ser destacado que en los ratones KO hay menos AA en PC y más en PE y PI en
comparación con los WT, lo que es nuevamente consistente con la presencia de una
mayor actividad CoA-IT en los macrófagos de ratones KO. La falta de cav-1 provoca en
definitiva una redistribución de AA entre las distintas clases de PL, si bien es importante
destacar que los niveles de AA en el equilibrio son idénticos, lo que sugiere que los
mecanismos homeostáticos globales de utilización de AA no están alterados.
En cuanto a especies sin AA, quizás la más destacada sea PC(16:0/16:0), que es
menos abundante en los KO. Esta especie (DPPC) constituye el principal componente del
surfactante pulmonar. Los ratones KO de cav-1 desarrollan fibrosis pulmonar y
presentan fatiga cuando son expuestos a ejercicio físico y, aunque ello se ha
relacionado con un tejido alveolar más engrosado como consecuencia del fenotipo
hiperproliferativo [197] ya que la expresión de cav-1 se considera supresora de tumor
[289] sería interesante medir la especie en tejido pulmonar, por si sus niveles
pudieran estar asociados a los problemas respiratorios.
Cuando las células procedentes de ratones KO se estimulan con zimosán se
aprecia menor liberación de AA que en ratones WT (un 20% menos). Esto podría ser
simplemente un reflejo de la mayor capacidad de acilación y remodelación de ácidos
grasos de estas células, también en condiciones de activación, aunque también podría
DISCUSIÓN
159
ser consecuencia de la distribución anormal de AA en los PL en las células sin cav-1, o a
un defecto en los mecanismos de activación de las enzimas que catalizan la liberación
del AA, esto es, las PLA2. En este sentido, se sabe que cav-1 interacciona con proteínas
y modifica su actividad; un ejemplo muy claro es su capacidad de inhibir eNOS [197].
Hay estudios que describen co-localización de cav-2 con sPLA2-V [290], y otros que
muestran que la cav-1 colocaliza con cPLA2 e interacciona con ella positiva o
negativamente según el tipo celular en cuestión [291-293]. Además, se ha descrito
también su co-localización con COX2 en fibroblastos [294]. En futuras direcciones del
trabajo será necesario evaluar si la falta de cav-1 afecta a la acción de las PLA2 en
condiciones de estimulación, y por tanto a la liberación de AA, o a otras enzimas de las
reacciones subsiguientes.
Como consecuencia de la menor liberación de AA se ha medido la producción de
PGE2 y de LTB4 (dos mediadores típicos en la respuesta proinflamatoria aguda). Se ha
observado menor producción de ambos, tanto en situación basal como en estimulación,
lo que sugiere que la maquinaria de síntesis de eicosanoides está intacta, y lo que falta
es sustrato, es decir, AA, como consecuencia de una mayor reacilación. Esta
disminución produce efectos in vivo, de tal manera que los ratones KO exhiben menor
infiltración de PMN al inducir peritonitis en los ratones. Así, la cav-1 desempeña un
papel proinflamatorio, lo que es remarcable, ya que no existen muchas evidencias
implicando a la cav-1 en las reacciones de inmunidad. Los trabajos de cav-1 en
macrófagos involucran a esta proteína en metabolismo de lípidos, especialmente en el
transporte de colesterol, y también se considera importante su papel en aterosclerosis y
formación de células espumosas [269], aparte de su función en apoptosis [295]. Por otro
lado, se ha visto que la expresión de cav-1 está afectada por el tratamiento de LPS in
vitro en macrófagos peritoneales, si bien aumenta (en macrófagos peritoneales
extraídos con tioglicolato) o disminuye (en la línea celular RAW 264.7), lo que sugiere
que la cav-1 puede ser una proteína reguladora que contribuye a la señalización celular
producida por LPS [275, 296].
Además, la caveola parece jugar un papel importante en la internalización de
patógenos, de tal manera que ciertos ligandos y moléculas extracelulares, como toxinas
de cólera y tétanos, son transportados a través de la caveola [270, 278]. Wang et al.
[297] han demostrado que en ausencia de cav-1 se incrementa la producción de
citoquinas proinflamatorias (TNF e IL-6) y disminuye la citoquina antiinflamatoria IL-10
en macrófagos alveolares de ratones KO estimulados con LPS, lo que sugiere que la
cav-1 modula la respuesta inmune inflamatoria, aunque en este mismo trabajo los
macrófagos peritoneales no muestran ninguna modulación de la producción de
DISCUSIÓN
160
citoquinas. Por otro lado, Medina et al. [298] han demostrado que los ratones KO
infectados con Salmonella enterica Serovar Typhimurium, así como sus macrófagos
peritoneales, desarrollan una mayor respuesta inflamatoria a juzgar por la mayor
producción de citoquinas, quimoquinas y óxido nítrico, menor supervivencia y mayor
infiltración de bacterias en tejidos. Sin embargo, en un trabajo similar donde se
infectaron ratones KO con el parásito Trypanosoma cruzi se observa el efecto contrario,
basado en la reducción de parasitemia y de la producción de mediadores inflamatorios
como INF, TNF y otras quimoquinas y citoquinas [299], es decir, una reducción de la
respuesta inflamatoria, en consonancia con los datos que se muestran ene este trabajo.
En resumen, estos estudios demuestran que la falta de cav-1 en macrófagos
peritoneales de ratón incrementa la reacilación de AA así como el proceso de
remodelación a través de la activación de la CoA-IT. La mayor consecuencia es una
disminución en la liberación de AA en condiciones de estimulación, con efectos en la
repuesta proinflamatoria in vivo.
7. CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
163
1. Los monocitos estimulados con zimosán presentan un aumento en la
incorporación de AA en PI, PC y PE, a través del ciclo de Lands
mayoritariamente, y no a través de la ruta de novo.
2. El aumento de la incorporación de AA en monocitos estimulados con zimosán no
es consecuencia de la activación de PLA2 y subsiguiente aumento de la
disponibilidad de lisofosfolípidos aceptores, sino de la activación de la actividad
LPCAT, concretamente a la activación de la enzima LPCAT3.
3. La diferencia en la velocidad de remodelación del AA en monocitos humanos y
promonocitos U937 no es debida a la diferencia en el estado de diferenciación,
sino al contenido endógeno de AA, que provoca la disminución en la Vmax de la
actividad CoA-IT.
4. La ausencia de cav-1 provoca mayor reacilación de AA, a juzgar por el aumento
en la incorporación de AA de macrófagos peritoneales de ratón, aunque el efecto
no es específico para este ácido graso.
5. El exceso de AA que se incorpora en macrófagos peritoneales de ratones KO lo
hace principalmente en PI y PE, consecuencia, en parte, de una mayor velocidad
de remodelación como resultado del aumento de de la actividad CoA-IT.
6. La mayor reacilación provoca menor liberación de AA en condiciones de
estimulación, y en consecuencia menor síntesis de PGE2 y LTB4, provocando una
deficiencia de la respuesta proinflamatoria in vivo. La cav-1 favorece la
respuesta proinflamatoria.
8. REFERENCIAS
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