manual de microbiología

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INDICE

1. Preparación de material para esterilización

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2. Métodos de esterilización 83. Preparación de medios de cultivo 144. Técnicas de cultivo y cuantificación de

microorganismos20

5. Tinciones 286. Pruebas de diferenciación bioquímica 367. Crecimiento 468. Presión osmótica 509. Efecto de la temperatura, PTM y TTM 5410. Influencia del pH 6211. Morfología colonial y crecimiento de

bacterias66

12. Aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias

70

13. Aislamiento de algas 7614. Aislamiento de Hongos 8015. Aislamiento de Salmonella a partir de

Alimentos86

16. Aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de alimentos

94

17. Anexo 1 9818. Anexo 2 10019. Referencia bibliográfica 103

RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE

El laboratorio de microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde con las debidas precauciones se pueden manejar y examinar microorganismos. Cuando manejamos cualquier tipo de muestra debemos tener en cuenta la posibilidad de riesgos, estos pueden ser biológicos, del ambiente del Laboratorio o riesgos asociados como el manejo substancias químicas, eléctricos, fugas de gas.Todos los microorganismos que se manipulen deben ser manejados con precaución por su potencial patogenicidad.

REGLAS DE LABORATORIO

1. Es obligatorio el uso de bata larga de algodón, destinada exclusivamente para el Laboratorio de Microbiología. (Solo podrá retirarse para su aseo protegiéndola en una bolsa de plástico. Se recomienda lavar individualmente con jabón).

Manual de Prácticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

2. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros mochilas, etc.) en la zona especificada por el docente.

3. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos

4. Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos biológicos infecciosos que se generen en la realización de la práctica. No tirar nada en los lavabos. El material de desecho no contaminado como papeles de envoltura depositarlos en los recipientes de basura común.

5. Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de bebida o alimento dentro del laboratorio

6. Esta prohibido comer, beber y maquillarse. Cuando se manipulen microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la nariz, boca, ojos etc.

7. Por seguridad no pipetear oralmente ningún tipo de cultivo microbiano, esta actividad deberá realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación de aerosoles.

8. No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO

1. Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante deberá lavarse sus manos escrupulosamente con agua y jabón, y benzal.

2. Cada equipo se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.

3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al finalizar cada práctica el alumno realizara la desinfección de la superficie de trabajo con alcohol de 70, solución de fenol o benzal.

4. Deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos empleados (microscopio, balanza analítica, autoclave, potenciómetro, entre otros) y reportar al docente y al encargado del laboratorio cualquier irregularidad o desperfecto de los mismos.

5. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contaminantes sean colocados en recipientes y lugares específicos destinados para ello.

6. El material de desecho no contaminado como papeles de envoltura depositarlos en los recipientes de basura común.

7. Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario este será desechado.

8. En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el Laboratorio notificar inmediatamente al instructor o al personal técnico para tomar las medidas higiénicas y de seguridad apropiadas, así como su registro.

MATERIALES REQUERIDOS PARA CADA SESION

1. Bata de laboratorio limpia y con botones.

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2. El protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio.

3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos o encendedor, tijeras, cinta masking, marcador

indeleble punto fino o etiquetas pequeñas.


1

PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN

ObjetivoEl alumno preparará adecuadamente los diversos materiales e instrumental para su empleo adecuado en el laboratorio de Microbiología

Marco Teórico

En el laboratorio de Microbiología se hace uso de materiales y equipo que también son empleados en otras disciplinas, y son en general del conocimiento de los estudiantes.

Sin embargo debido a la naturaleza propia de la materia se hace necesario desarrollar ciertas habilidades que permitan un trabajo limpio, seguro y preciso. Para llevar a cabo el proceso de lavado, se empleauna solución detergente con agua caliente, posteriormentese enjuaga con agua destilada y se dejasecar a la temperatura ambiente. En este caso sedeben emplear detergentes diluidos que dejen pocoo ningún residuo.

Si se requiere limpiar material de vidrio que tiene manchas de grasa de difícil remoción, se recomienda sumergirlo en una solución de dicromato de sodio o potasio en ácido sulfúrico concentrado (mezcla sulfocrómica) durante 24 horas.Luego se enjuaga con abundante agua, y finalmente con agua destilada. Se deja secar a temperatura ambiente.Una vez que el material está limpio y seco debe ser esterilizado, para ello previamente deberá empacarse de manera que se pueda mantener estéril hasta el momento de su uso.El material que sirve de envoltura final, o que se emplea para su preparación, debe tener las características siguientes:Ser adecuado para el proceso de esterilización. Por ejemplo si va a ser utilizado para envolver un material que va a ser esterilizado por vapor a presión, debe permitir la circulación del vapor y a la vez deberá ser resistente a la humedad y la presión.

Ser resistente a pinchazos y abrasiones. Permitir envolver el material completamente. Permitir la identificación del material estéril. Permitir retirar el material estéril con facilidad. Estar libre de colorantes y sustancias tóxicas. Ser económico.

Entre los materiales que más se emplean para envolver el material antes de su esterilización, se encuentran:

Para la esterilización por calor húmedo: papel kraft. Para la esterilización por calor seco: papel kraft o papel de

aluminio.Finalmente es importante realizar controles de modo de verificar si el material de vidrio fue convenientemente sometido a limpieza y esterilización

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MATERIAL

3 Tubos de cultivo de 16 X 150 mm con tapón de baquelita

3 Tubos de cultivo de 16 X 150

3 Cajas Petri de vidrio

3 Pipetas de 1 ml.

3 Pipetas de 5 ml.

3 Matraces erlenmeyer de 250 ml.

2 Pipeteros de acero inoxidable

1 Autoclave

1 Horno de calor seco

Papel Kraft

Algodón

PROCEDIMIENTO

El docente explicará los principios generales de trabajo, enfatizando en la desinfección de áreas así como en la preparación del material necesario para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas.

PREPARACIÓN DEL MATERIAL

1. Lavar perfectamente las cajas petri, los matraces, los tubos de ensaye y las pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada por las paredes interiores auxiliándose de una piceta. Dejar escurrir el material.

TUBOS DE ENSAYE

1. Colocar a cada tubo de hemólisis un tapón de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura

2. Sobre estos colocar un capuchón de papel.3. Depositarlos en un recipiente adecuado.

PIPETAS

1. Poner en la boquilla un filtro de algodón, de tal manera que el aire pase libremente a través de él.

2. Flamear el extremo de la pipeta para quemar el exceso de algodón.3. Con tiras de papel kraft de aprox. 3 cm de ancho envolver individualmente las pipetas,

comenzando por la punta y en forma transversal, girando hacia arriba hasta el final de la pipeta.

4. Indicar el volumen de cada pipeta en la envoltura.5. Repetir los pasos 1 y 26. Introducir las pipetas con la boquilla hacia arriba en los pipeteros (si no se cuenta con

pipeteros envolver en paquetes de papel aluminio).7. Indicar en el pipetero o el paquete de aluminio el volumen de las pipetas

CAJAS DE PETRI

1. Cortar papel kraft en forma de rectángulos de un tamaño adecuado para 3 a 5 cajas petri.

2. Colocarlas con a tapa abajo.3. Toma los extremos del papel y se unen.4. Se hace un nuevo doblez recargando ligeramente en las cajas para marcarlo.5. Los extremos se doblan en forma triangular, se doblan hacia atrás y se coloca un

pequeño pedazo de cinta testigo.

MATRACES

1. Colocar a cada matraz un tapón de algodón.2. Cubrir el tapón de algodón con un capuchón de papel kraft.

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RESULTADOS Y CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el material?

2. ¿Que finalidad tiene el empacado antes de la esterilización?

3. ¿Que finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los extremos de las pipetas y de los Matraces Erlenmeyer?

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA


2

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

ObjetivoQue el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización

Marco Teórico

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico y químico.

Se han desarrollado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método físico o químico para destruir toda forma microbiana de vida de un material, incluyendo las formas altamente resistentes como las esporas, mientras que la desinfección es generalmente menos letal y es un proceso que hace referencia al uso de agentes químicos para destruir la infectividad potencial de inmaterial pero no destruye necesariamente todas las formas de vida, generalmente sola las formas vegetativas de los microorganismos.

Los procedimientos de esterilización por temperatura, calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor empleo en Microbiología.

El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación. El flameado consiste en someter el material directamente a la acción de la llama, pero esto solo consigue una esterilización momentánea ya que en el momento de enfriarse, el material vuelve a contaminarse. La esterilización en horno caliente consiste en un proceso de empleo de aire caliente, es menos eficaz que el calor húmedo, ya que el aire es peor conductor que el vapor de agua, por tal razón se eleva mayormente la temperatura y el tiempo de exposición, generalmente 150-180º durante 2 horas. Estos métodos se emplean generalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio.

El proceso con calor húmedo es uno de los más eficaces, la acción rápida del vapor depende en gran parte del calor latente del agua, la técnica mas recomendada es el empleo de la autoclave que emplea una temperatura de 121ºC a un tiempo de 15 min. con una presión de 15 libras, para asegurarse de la destrucción de endoesporas, que son las estructuras bacterianas mas resistentes al calor. Se emplea principalmente para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan.

Cuando se requieren esterilizar soluciones termolábiles, como aquellas que contienen vitaminas, aminoácidos, etc., se emplea el método de filtración en membranas estériles de 0.2 µ de diámetro. Cuando se tienen materiales plásticos es mejor el empleo de gases como el oxido de etileno o de radiaciones gamma. Las superficies o áreas de trabajo generalmente emplean radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma liquida, tales como fenol, compuestos cuaternarios de amonio, formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes.

Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas, y debe revisarse su empleo adecuado para lograr la eficacia que se requiere.

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MATERIAL

3 Tubos de cultivo de 16 X 150

3 Cajas Petri de vidrio

3 Matraces erlenmeyer de 250 ml.

2 Pipeteros de acero inoxidable con pipetas

1 Autoclave

1 Horno de calor seco

1 equipo para filtración esterilizante

4 Mecheros bunsen

1 Asa bacteriológica

Agua destilada

PROCEDIMIENTO

El docente explicará los principios generales de trabajo, para la realización de las técnicas de desinfección y esterilización que se efectuarán. También hará las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a emplearlos equipos, así como su manejo en condiciones asépticas. Desinfectar el área de trabajo con solución de benzal o alcohol

ESTERILIZACION POR CALOR SECO (INCINERACION)

1. Conectar los mecheros a la toma de gas sobre la mesa de trabajo2. Encenderlos y regular la flama3. Tomar el asa bacteriológica y someter a la flama del mechero hasta que esta se

encuentre al rojo vivo.

ESTERILIZACION POR CALOR SECO (HORNO)

1. Se conecta el Horno 2. Se introduce en el interior del horno el material a esterilizar, pipeteros o paquetes de

aluminio.3. Introducido el material, se selecciona la temperatura de esterilización (170ºC).4. El tiempo de esterilización se controla manualmente o con la ayuda de un timer.5. Finalizado el periodo de esterilización, esperar a que disminuya la temperatura.

ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO

1. Verificar el nivel del agua en el interior del autoclave (por encima de la rejilla del fondo)2. Conectar el autoclave accionando el interruptor de encendido.3. Colocar el material en la cesta dentro de la autoclave, cerrar la tapa y la llave de purga

automática.4. Seleccionar la temperatura y tiempo de esterilización.5. Trascurrido el tiempo verificar que no exista sobrepresión, abrir la tapa y sacar el

material.6. Posteriormente abrir la tapa y sacar el material.

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FILTRACIÓN ESTERILIZANTE

1. Esterilizar el material del sistema de filtración mediante esterilización por calor húmedo (autoclave).

2. Entre cuatro mecheros bunsen encendidos, se procede a montar el sistema de filtración.

3. Entre el embudo y el vaso superior se procederá a colocar una membrana de 0.45µm, con ayuda de unas pinzas estériles.

4. Se adiciona la solución a filtrar en el vaso y se encenderá el sistema de aspiración al vació.

5. El líquido filtrado recogido en el matraz de filtración será colocado en un material estéril, para su conservación.


CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los métodos de esterilización mas empleados en Microbiología? ¿Para que tipo de materiales se emplea cada uno?


2. ¿Qué diferencia existe entre las técnicas de esterilización y las técnicas de desinfección?

3. Explica razonadamente que técnica emplearías para esterilizar material de plástico.

4. ¿Cómo esterilizarías el área de trabajo?

5. Si tuvieras que esterilizar un recipiente con aceite de olivo. ¿Qué técnica emplearías? ¿Por qué?

6. Realiza el diagrama de la autoclave indicando sus partes y la función de cada una.

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7. Realiza el diagrama del sistema de filtración esterilizante indicando sus partes y la función de cada una.



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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

ObjetivoAdiestrar al alumno en la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los medios de cultivo.

Marco Teórico

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en:

Líquidos Semisólidos Sólidos.

Y por su uso en: Medios de cultivos básicos Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos,

diferenciales, de transporte.

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MATERIAL

5 Matraz Erlenmeyer de 250ml

1 Baño maría

1 Parrilla

Agitador

6 tubos de 16 x 150 con tapón de baquelita

1 Espátula

1 Vidrio de reloj

3 Cajas petri

Algodón

Autoclave

Papel kraft

Tubos de ensayo 16X150

Agua destilada

MEDIOS DE CULTIVOAgar plate count

Caldo nutritivo

Agar enterico de hecktoen

Agar Macconkey

Agar- Manitol- Sal- Agar

Agua destilada

PROCEDIMIENTO

El docente explicará los principios generales de trabajo, para la realización de las técnicas de preparación y esterilización de medios de cultivo, así como su manejo en condiciones asépticas. Desinfectar el área de trabajo con solución de benzal o alcohol y encender los mecheros.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

1. Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria según el volumen de medio de cultivo requerido para un volumen de 40 ml.

2. Disolver el medio en el agua destilada.3. Agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se debe tener

cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras.

4. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad.

5. Si se va a envasar en cajas petri, es necesario conservar el medio en un matraz y esterilizarlo a 121ºC durante 15 minutos.

6. Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizará el Agar directamente en ellos a 121ºC durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza, o en tubos con tapón de baquelita. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20 a 30 · sobre una varilla de vidrio.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS

1. Leer las instrucciones del fabricante y pesar la cantidad necesaria según el volumen de medio de cultivo requerido.

2. Disolver el medio en agua destilada agitando el recipiente3. Envasar el volumen necesario en matraces, tubos u otros recipientes. Procurar que el

volumen del medio no rebase la mitad de la capacidad del recipiente, pues de otra manera el medio se puede derramar.

4. Tapar el recipiente con algodón, gasa y papel estraza o con tapón de baquelita.5. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.6. Antes de usar el medio de cultivo.

VACIADO DE MEDIO SÓLIDO EN CAJA PETRI

1. Primeramente se desinfecta el área de trabajo con solución de benzal o alcohol y posteriormente se encienden los mecheros

2. Sin destapar los medios de cultivo, llevarlos a calentamiento en Baño María hasta que los medios sólidos tomen una temperatura de 42 a 45ºC.

3. No destapar las cajas petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. 4. Mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril al momento del

vaciado en las cajas petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda, sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de

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aproximadamente 15 ml. a 20 ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente

5. Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja petri de manera rápida. Se procede a tapar la caja.

6. Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar

7. Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 °C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos.

PRUEBA DE ESTERILIDAD

1. Incubar los medios a 37ºC durante 24 horas. El medio debe permanecer libre de crecimiento


CUESTIONARIO

1. ¿Que finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos?

2. ¿De donde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de medios de cultivos?


3. ¿Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona?

4. Porque es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de cultivo en las cajas de petri?

5. ¿Cómo nos podemos dar cuenta que existió crecimiento de microorganismos en un medio líquido?

6. Escribe dos ejemplos de medios selectivos encontrados en el laboratorio en donde puedan desarrollarse los microorganismos

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7. Escribe dos medios de cultivos que nos permiten determinar alguna prueba bioquímica



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TÉCNICAS DE CULTIVO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

ObjetivoQue el alumno desarrolle las técnicas comunes de inoculación en medios de cultivo y las técnicas de aislamiento.

Marco Teórico

Los microorganismos se cultivan en el laboratorio en medios de cultivo, cuyos componentes son muy variados. La elección del medio se basa en el propósito de estudio. El material que se inocula en el medio se denomina inoculo.

En la naturaleza se encuentran los microorganismos en casi cualquier lugar y rara vez se encuentra un solo tipo de organismo. Es muy frecuente que en un material dado habiten varios tipos de organismos por lo que es necesario para su estudio, separarlos y cultivarlos. A esto se le llama aislamiento.

Aunque antiguamente el procedimiento se hacia en medios de cultivo líquidos, haciendo diluciones exhaustivas, actualmente se combina la práctica de diluciones con la inoculación en medios sólidos, los que nos da la ventaja de permitir la cuantificación del contenido microbiano de las muestras en estudio, y permite el estudio de varios tipos de organismos presentes en una muestra que pueden formar colonias de características distintiva.

El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución, en medios sólidos por vertido en placa, dispersión en la superficie o estría cruzada o en medios líquidos.

La limitación principal de las técnicas de dilución, es que nos son prácticas para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se obtendrán las bacterias dominantes.

Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican métodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes especiales y/o condiciones fisicoquímicas para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés.

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MATERIAL

9 Tubos de ensayo 16X150 estériles

10 Pipetas de 1ml estériles

3 Pipetas de 1 ml estériles

1 Matraz erlenmeyer de 250 ml con 90 ml de

agua destilada estéril

3 Cajas petri estériles

3 Cajas petri con agar plate count

3 Cajas petri con agar selectivo

2 Tubos con agar diferencial

2 Varilla de vidrio acodada

1 Asa bacteriológica

Espectrofotómetro

Alcohol

Cepas

Muestra

PROCEDIMIENTO

El docente explicará los principios generales de trabajo, para la realización de las técnicas de de cultivo, así como su manejo en condiciones asépticas, proporcionara cepas para la inoculación, así como muestras problema. Desinfectar el área de trabajo con solución de benzal o alcohol y encender los mecheros.

METODO DE DILUCIONES

1. Marcar del 2 al 5 una serie de tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de agua destilada estéril.2. Agregar 10 g o 10 ml de la muestra al matraz que contiene 90 ml de agua destilada

estéril, homogenizar la suspensión y dejar sedimentar las partículas gruesas.3. Efectuar la transferencia de 1 ml solución del matraz al tubo marcado con el número

dos.4. Efectuar diluciones decimales, como se indica a continuación:

Tubo Transferencia Agua ml Dilución1 10 g 0 10 ml de muestra + 90 10-1

2 1 ml del matraz 1 + 9 10-2

3 1 ml del tubo 2 + 9 10-3

4 1 ml del tubo 3 + 9 10-4

5 1 ml del tubo 4 + 9 10-5

Notasa) Homogeneizar la suspensión en cada tubo antes de transferir el volumen al siguiente

tubo.b) Cambiar de pipeta al efectuar cada dilución.c) Introducir la pipeta usada en la envoltura original.

Muestra

10g o 10 ml1 ml

1 ml 1 ml 1 ml

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AISLAMIENTO POR EL METODO DE VERTIDO EN PLACA

1. Marcar las placas petri antes de comenzar2. Utilizando diferentes pipetas inocular 1 ml de las diluciones 10-1, 10-3, 10-5 en las cajas

petri estériles que previamente han sido rotuladas.3. Adicionar 15 a 20 ml de agar plate count fundido y mantenido a 45ºC en baño de agua.4. Homogenizar el inoculo con movimientos circulares a favor y en contra de las

manecillas del reloj, así como con movimientos hacia arriba y hacia abajo.5. Dejar solidificar.6. Incubar a 35± 2ºC durante 24 horas, con la tapa hacia abajo.7. Revisar el crecimiento.

AISLAMIENTO POR EL METODO DE DISPERSION EN LA SUPERFICIE

1. Marcar las placas petri antes de comenzar2. Utilizando diferentes pipetas inocular 0.1 ml de las diluciones 10-1, 10-3, 10-5 en la

superficie de las cajas petri con agar Plate Count, que previamente han sido rotuladas.3. Distribuir el inoculo sobre la superficie del agar con varilla de vidrio acodad estéril,

utilizando una para cada dilución. 4. Mantener las placas en su posición hasta que el inoculo sea absorbido totalmente por

el agar.5. Invertir las placas e incubar a 35± 2ºC durante 24 horas.6. Revisar el crecimiento.


10-110-2 10-3 10-4 10-5

1 ml 1 ml 1 ml

AISLAMIENTO POR EL METODO DE ESTRIA CRUZADA

1. Marcar las placas petri antes de comenzar2. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración.3. Enfriar el asa esperando unos minutos sin agitarla.4. Tomar una asada de la muestra (directa o dilución 10-1) y colocarla en el borde de la

placa petri que contiene medio selectivo, haciendo estrías continuas hacia el centro de la caja de acuerdo al esquema

5. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla6. Hacer una segunda serie de estrías tocando la porción final de la anterior.7. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla.8. Repetir los pasos 4 y 5 para continuar con la serie de estrías.9. Esterilizar el asa y enfriarla.10. Tapar la caja.11. Invertir las placas e incubar a 35± 2ºC durante 24 horas.12. Revisar el crecimiento.

INOCULACION EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO

1. Marcar los tubos con caldo antes de comenzar2. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración.3. Enfriar el asa esperando unos minutos sin agitarla.4. Tomar una asada de la muestra.5. Introducir el asa en el caldo y agítela suavemente.6. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla7. Incubar a 35± 2ºC durante 24 horas.8. Revisar el crecimiento

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INOCULACION EN TUBO CON MEDIO SOLIDÓ AGAR INCLINADO

1. Marcar los tubos con agar, antes de comenzar2. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración.3. Enfriar el asa esperando unos minutos sin agitarla.4. Tomar una asada de la muestra.5. Inocular por picadura introduciendo el asa en el centro del agar inclinado y al sacar el

asa inocular en la superficie.6. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla7. Incubar a 35± 2ºC durante 24 horas.8. Revisar el crecimiento

INOCULACION EN TUBO CON MEDIO SOLIDÓ AGAR RECTO

1. Marcar los tubos con agar, antes de comenzar2. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración.3. Enfriar el asa esperando unos minutos sin agitarla.4. Tomar una asada de la muestra.5. Inocular por picadura introduciendo el asa en el centro del agar.6. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla7. Incubar a 35± 2ºC durante 24 horas.8. Revisar el crecimiento



CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la finalidad de realizar diluciones seriadas base 10?, ¿Para que tipo de muestras se emplean?

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No.

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2. ¿Cómo se relacionan la técnica de diluciones y la de estría cruzada?

3. ¿Cuál es la finalidad de emplear la técnica de vertido en placa?

4. ¿Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos bacterianos en tubos con agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta?



5

TINCIONES

ObjetivoEl alumno aplicara

técnicas de preparación de

frotis, tinción simple y tinción diferencial para la observación

de microorganismos.

Marco Teórico

La observación de los microorganismos en el microscopio se facilita aumentando el contraste entre la luminosidad del campo y las estructuras. Esto se logra con el uso de sustancias coloridas que se unen a los componentes celulares, esas sustancias reciben el nombre de colorantes. Los procedimientos que se usan reciben el nombre de técnicas de tinción; se han desarrollado muchas para lograr e resultado deseado.

En general se hacen preparaciones depositando una suspensión de las células a observar en un área pequeña de un portaobjetos, de tal forma que se obtenga una película delgada. Se deja secar al aire y se fija mediante la aplicación de metanol o etanol dejando actuar por un minuto aproximadamente, o bien se fija la preparación por calentamiento suave a la flama. Una vez fija la preparación se aplica la solución del colorante deseado y se deja actuar aproximadamente un minuto, se lava con agua corriente, se deja actuar al aire y se procede a observar al microscopio. Esto constituye una tinción simple.

Las diferentes estructuras de una célula se ponen de manifiesto mediante técnicas de tinción selectivas, que requieren de ciertas manipulaciones y el uso de diversos reactivos. En otra aplicación de las técnicas de tinción se logra que unas células se tiñan con un colorante, en tanto que otras células se tiñen con otro colorante de tal modo que se distinguen unas de otras, o materiales provenientes del medio del que se han tomado. Estas técnicas son llamadas tinciones diferenciales.

Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y estructuras que facilitan la retención o eliminación de los colorantes.

Algunas de estas técnicas permiten poner de manifiesto la pared celular y clasificar a las bacterias en Gram + y Gram -, mediante la técnica de Gram, las esporas por la técnica de Shaeffer y Fulton, la capsula por la técnica de Rojo Congo o la de Duguid, entre otras.

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MATERIAL

Cepas. Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Bacillus sp, Klebsiella sp.

Frasco gotero con cristal violeta.

Frasco gotero con azul de metileno.

Frasco gotero con lugol.

Frasco gotero con alcohol – acetona.

Frasco gotero con safranina.

Tinta china

Frasco gotero con rojo congo.

Mordente de capsula.

Mordente de Knaysi

Frasco gotero con verde de malaquita.

Puente de tinción.

Pipetas Pasteur.

Piceta con agua destilada.

Microscopio

4 mecheros bunsen

PROCEDIMIENTO

El docente explicará los principios generales de trabajo, para la realización de las técnicas de de tinción, así como su manejo en condiciones asépticas, proporcionara cepas para la tinción, así como muestras problema. Desinfectar el área de trabajo con solución de benzal o alcohol y encender los mecheros.

FROTIS APARTIR DE UN CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO

1. Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados.2. Colocar con el asa bacteriológica una pequeña gota de agua en el centro del

portaobjetos.3. Tomar con el asa estéril un fragmento de la colonia y hacer una suspensión

homogénea en la gota de agua, extendiéndola para formar una película delgada de aproximadamente 1 cm. de diámetro.

4. Dejar secar al aire.5. Fijar el frotis a la flama, para lo cual se calienta la parte posterior del portaobjetos con

la flama del mechero (pasar el portaobjetos por la flama por lo menos 3 veces), a una temperatura que sea soportable en el dorso de la mano.

FROTIS APARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO LÍQUIDO.

1. Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados.2. Tomar con el asa bacteriológica estéril una gota del cultivo y colocarla en el centro del

portaobjetos (extenderla un poco para formar una película delgada y uniforme).3. Dejar secar al aire.4. Fijar al calor.

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TINCION SIMPLE.

1. Colocar los portaobjetos con los frotis sobre el puente de tinción.2. Cubrir el frotis con unas gotas de colorante y dejarlo durante un minuto.3. Tomar el portaobjetos por un extremo y escurrir el colorante.4. Lavar el exceso de colorante al chorro del agua corriente.5. Dejar secar al aire.

TINCION DE GRAM.

1. Hacer un frotis de cada una de las cepas.2. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto.3. Escurrir el colorante y lavar al chorro de agua corriente.4. Cubrir los frotis con lugol y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir y lavar al chorro

de agua corriente.5. Decolorar con alcohol –acetona (de 5 a 15 segundos), y lavar con agua corriente.6. Cubrir los frotis con safranina y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir y lavar con

agua corriente.7. Secar al aire.


Cristal Violeta 1 min Lavar al chorro del agua

Colorante 1 min Lavar al chorro del agua

Dejar secar al aire

Lugol 1 min

TINCION DE CAPSULA.

1. Poner una pequeña gota de rojo congo en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado.

2. Tomar con el asa un poco de cultivo de Klebsiella, suspenderlo en la gota de rojo congo y hacer un frotis.

3. Dejar secar al aire.4. Cubrir el frotis con unas gotas de mordente de capsula y dejarlo actuar durante un

minuto.5. Lavar el frotis con agua destilada y dejar secar al aire.

NOTA:La capsula se observa como una zona luminosa, alrededor de la bacteria de color rojo en un campo azul oscuro.

TINCION DE LA PARED CELULAR.

1. Hacer un frotis de Bacillus en la forma usual y fijarlo al calor.2. Cubrir el frotis con el mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos.3. Lavar la preparación con agua corriente.4. Colocar con el asa bacteriológica una gota de fucsina sobre la preparación.5. Poner un cubreobjetos sobre la preparación y observar al microscopio.

NOTA:La pared se observa de color rojo intenso alrededor de la bacteria, cuyo citoplasma se ve de un color rosa a rojo tenue.

Lavar al chorro del agua

Alcohol-acetona 5-15 segundos

Lavar al chorro del agua

Safranina 1 min Lavar al chorro del agua

Dejar secar al aire

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TINCION DE ESPORAS.

1. Hacer un frotis de Bacillus de la manera usual.2. Cubrir el frotis con verde de malaquita y dejarlo actuar durante 1 minuto.3. Calentar la preparación a emisión de vapores durante 5 minutos. El colorante no debe

hervir ni secarse.4. Lavar la preparación con agua corriente.5. Cubrir la preparación con safranina y dejarla actuar durante un minuto.6. Lavar la preparación con agua corriente y dejar secar al aire.

NOTA: Las esporas se observan de color verde y las bacterias de color rojo.


1. Hacer esquemas a colores de cada una de las técnicas y preparaciones observadas.


Verde de Malaquita 1 min

Calentar 5 min Lavar al chorro del agua

Safranina 1 min Lavar al chorro del agua

Dejar secar al aire

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es necesario fijar los frotis?

2. ¿Qué importancia tiene la técnica de tinción de Gram?

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No.

Prác

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3. ¿Cuál es el paso crítico de la técnica de Gram? ¿Por qué?

4. ¿Qué otros microorganismos además de las bacterias, se tiñen por la técnica de Gram?

5. ¿Por qué la capsula se observa siempre sin teñir?

6. Citar 3 ejemplos de microorganismos que tengan capsula.



6

PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA.

ObjetivoEl alumno usara algunas técnicas

para poner de manifiesto la

actividad de las enzimas producidas

por los microorganismos

sobre los carbohidratos,

ácidos orgánicos, proteínas y

aminoácidos.

Marco Teórico

El metabolismo microbiano es el conjunto de procesos por los cuales un microorganismo obtiene la energía y los nutrientes que necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en base a estas estrategias. Las características metabólicas específicas de un microorganismo constituyen el principal criterio para determinar su papel ecológico, su responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos industriales.

La identificación de estos procesos metabólicos puede realizarse en el laboratorio mediante el empleo de pruebas bioquímicas.

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

Entre estas pruebas se tienen las que ponen de manifiesto los procesos de fermentaron de azucares, empleo de ácidos orgánicos, aminoácidos, proteínas, entre otros, por ejemplo:

Fermentación de azucares: TSI, Kligler Empleo de citrato: Citrato d Simmons Empleo de proteinas: Gelosa gelatina y gelosa leche Respiración: Catalasa, Oxidasa

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b2/Api20e.jpg%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5

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MATERIAL

Cajas Petri con gelosa almidón.

Tubos de Durhame con sacarosa.glucosa y

manitol en caldo rojo de fenol.

Tubos con medio TSI.

Tubos con medio citrato de Simmons.

Tubos con caldo glucosado voges proskauer.

Tubos con caldo glucosado rojo de metilo.

Cajas Petri con gelosa leche al 5%.

Cajas Petri con gelosa gelatina al 2%.

Tubos con medio SIM.

Tubos con medio LIA.

Tubos con leche tornasolada.

Solución de lugol.

Solución de rojo de metilo.

Solución de Alfa Naftol.

Solución de KOH creatina.

Solución de Cloruro Mercúrico al 12.5%.

Reactivo de Kovac.

Papel tornasol rosa.

PROCEDIMIENTO.

El docente explicará los principios generales de trabajo, para la realización de las pruebas metabólicas, así como su manejo en condiciones asépticas, proporcionara cepas, así como muestras problema Desinfectar el área de trabajo con solución de benzal o alcohol y se enciende el mechero

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y UTILIZACION DE ACIDOS ORGANICOS.DIGESTION DE POLISACARIDOS.

1. En una placa de gelosa almidón, sembrar por estría abierta (en un cuadrante) cada una de las cepas proporcionadas.

2. Incubar a 37 º C durante 24 horas.3. Añadir unas gotas de solución de lugol alrededor del crecimiento y en una zona donde no

hay inoculado el microorganismo.4. El almidón intacto da un color azul violáceo con el lugol. Interpretación de los resultados.

Digestión de almidón positiva = aparición de un halo claro alrededor de la estría.Digestión de almidón negativa = no se forma un halo alrededor de la estría.

FERMENTACION DE AZUCARES EN TUBOS DE DURHAM.1. Inocular una serie de tubos de Durham conteniendo glucosa, sacarosa y manitol con cada

una de las cepas proporcionadas.2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Observar el resultado, indicando si hay producción de acido o acido y gas. Interpretación

de los resultados. Producción de acido = Vire del indicador rojo de fenol de rojo a amarillo.Producción de gas = Presencia de burbujas en el interior de la campana invertida.

FERMENTACION DE AZUCARES EN MEDIO TSI.1. Inocular por picadura y en la superficie de sendos tubos conteniendo medio TSI, cada una

de las cepas proporcionadas.2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Observar el resultado e interpretarlo.

Fermentación de glucosa = Vire del indicador rojo de fenol de rojo a amarillo en el fondo del tubo.

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Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, producción de gas y H2S.

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-)Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas ni de H2S. Ej. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+)Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas, si de H2S. Ej. Salmmonella typhi.

Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas y producción de ácido sulfhídrico. Ej. Salmonella spp. (la mayoría de las especies de Salmonella).

Pico ácido/fondo ácido (A/A)Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

Fermentación de lactosa = Vire del indicador rojo de fenol de rojo a amarillo en la superficie del medio de cultivo.Producción de gas = Formación de burbujas en el medio de cultivo.Producción de H2S = Presencia de un precipitado negro en el medio de cultivo.

FERMENTACIÒN DE AZUCARES PRUEBA DE ROJO DE METILO.1. Inocular cada una de las cepas proporcionadas, en los tubos con caldo glucosado RM.2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Añadir l tubo 5 gotas de la solución de rojo de metilo.4. Observar el resultado e interpretarlo.

Prueba de rojo de metilo positiva = Presencia de color rojo en todo el cultivo o cuando el reactivo permanece de ese color en la superficie del medio.

FERMENTACION DE AZUCARES PRUEBA DE VOGES PROSKAUER.1. Inocular con cada una de las cepas proporcionadas, tubos de caldo glucosado VP.2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Agregar los reactivos siguientes a cada tubo en el orden que se indican: 6 gotas de alfa

naftol y 2 gotas de solución de KOH creatina.4. Agitar cada tubo suavemente y dejarlo en reposo durante 10 a 15 minutos.5. Observar el resultado e interpretarlo.

Prueba de VP positiva = Presencia de un color rojo en la superficie del medio de cultivo.

UTILIZACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS.

1. Sembrar tubos con medio citrato se Simmons con cada una de las cepas proporcionadas.2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Observar el resultado e interpretarlo.

Prueba positiva = Crecimiento en la superficie del medio o vire del indicador azul de bromo timol de verde a azul.

METABOLISMO DE PROTEINAS Y AMINOACIDOS.

DIGESTION DE PROTEINAS.

1. Sembrar las cepas proporcionadas por estría abierta en placas de gelosa gelatina y placas de gelosa leche.


2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Añadir unas gotas de solución de cloruro mercurico alrededor del crecimiento en la placa

de gelosa gelatina y en una zona donde no haya inoculado el microorganismo.4. Observar el resultado e interpretarlo.

Digestión de proteínas positivo = presencia de halo claro alrededor de la estría.Digestión de proteínas negativo = ausencia de halo claro alrededor de la estría.

METABOLISMO DE AMINOACIDOS.

PRODUCCION DE H2S E INDOL.

1. Sembrar por picadura tubos con medio de SIM con cada una de las cepas proporcionadas.2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Añadir 3 gotas del reactivo Kovac.4. Observar e resultado e interpretarlo.

Presencia de H2S = Presencia de un precipitado negro.Producción de indol = Presencia de un anillo de color rojo en la superficie.

ACCION SOBRE LA LISINA.

1. Inocular en la superficie y por picadura tubos conteniendo medio LIA con cada una de las sepas proporcionadas.

2. Incubar a 37 ºC durante 24 horas.3. Observar el resultado e interpretarlo.

pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilación de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis. pico rojo/fondo ácido/H2S-, desaminación de lisina positiva, descarboxilación de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis. pico alcalino/fondo ácido/H2S- descarboxilación de lisina negativa. Ej. E. colipico alcalino/fondo ácido/H2S+ descarboxilación de lisina negativa, producción de H2S. Ej. Citrobacter freundii.

Descarboxilaciòn positiva = Color púrpura en el fondo del tubo.Descarboxilacion negativa = Color amarillo en el fondo del tubo.Desaminaciòn positiva = Color rojo – anaranjado en la superficie del medio.

RESPIRACION

REDUCCION DE AZUL DE METILENO

1. Marcar una serie de 5 tubos del 1al 52. Adicionar en cada tubo las soluciones o suspensiones, siguiendo el orden de adición

de la siguiente tabla:

TUBO 1 2 3 4 5Leche esteril (ml) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5Suspensión bacteriana (ml) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0Azul de metileno (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Homogeneizar suavemente el contenido de cada tuboAceite mineral (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

3. Incubar simultáneamente todos los tubos en un baño maria a 37ºC, observar y anotar el tiempo que tarda en decolorarse el azul de metileno en cada tubo.

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REDUCCION DE NITRATOS A NITRITOS

1. Sembrar las cepas proporcionadas en tubos con caldo nitrato. Guardar un tubo sin inocular como testigo.

2. Incubar a 37ºC durante 24 hrs.3. Determinar la presencia de nitritos añadiendo a cada tubo 3 gotas de

alfanaftilamna y 3 gotas de acido sulfanilico.4. Observar el resultado e interpretarlo como sigue:

Prueba positiva = Aparicion de un color rojo en 30 segundosPrueba negativa = Sin cambio en el color del caldo

PRUEBA DE CITOCROMO OXIDASA

1. Sembrar una estria del cultivo de Pseudomonas sp y otra de Escherichia coli en una caja con gelosa simple.

2. Incubar a 37º C durante 24 hrs.3. Determinar la presencia de citocromo oxidasa cubriendo una colonia de cada

microorganismo con dos gotas del reactivo de oxidasa recién preparado o frotando una asada del cultivo en un papel filtro impregnado con el reactivo de Kovac.

4. Observar el resultado e interpretarlo como sigue:

Prueba positiva = Obscurecimiento del medio que rodea a la coloniaDel microorganismo u obscurecimiento del papel

PRODUCCION DE CATALASA

1. Sembrar las cepas proporcionadas en una caja con gelosa simple, haciendo una estria abierta.

2. Incubar a 37ºC durante 24 hrs.3. Determinar la presencia de catalasa, agregando unas gotas de H2O2 sobre el

crecimiento.4. Observar el resultado e interpretarlo como sigue:

Prueba positiva = Presencia de burbujasPrueba negativa = Ausncia de burbujas

SISTEMA DE IDENTIFICACION MULTIPRUEBAS

1. A partir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una suspensión en 5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril

2. Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene un tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos.

3. Llenar la cúpula de los pocillos CIT, VP, GEL con la suspensión de bacterias.4. Cubrir con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para

obtener anaerobiosis.5. Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente poner agua en

los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.

6. Incubar a 37°C durante 18-24 h.7. Anotar los resultados inmediatos, es decir, los que no requieren ser revelados.8. Para el revelado se tienen que tener en cuenta dos criterios:


Si la glucosa da negativo y los tests positivos son dos o menos de dos, no hay que añadir reactivos

Si la glucosa es positiva y/o tres o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos:

TDA: Añadir una gota de FeCl3 10 %. VP : Añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del

reactivo 2 (C2 H5 OH). IND : Añadir una gota de reactivo de Kovacs o de Dimetilamino-

cinamaldehido. Oxidasa: Añadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recién

preparado.9. La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada

pocillo con los de las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo.

10. Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos están separados en grupos de tres: en total 7 grupos de tres tubos o tripletes (El test 21 corresponde al test de la oxidasa).

11. Para obtener el perfil numérico de 7 cifras, a cada pocillo se le dará el valor 0, 1, 2 ó 4, de acuerdo a los siguientes criterios:

Si la reacción es negativa se pone 0. Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el

segundo, 4 si es el tercero. Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene

un código de 7 cifras. 12. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que trata.

Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo ADH Arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja

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LDC Lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja ODC Ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja

CIT Utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa

H2S Producción de H 2 S sin precipitado negro precipitado negro

URE Ureasa amarillo rojo o naranja TDA Triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo

IND Producción de indol amarillo color rosa o anillo rosa-rojo

VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer) sin color rosa-rojo

GEL Gelatinasa sin difusión difusión de pigmento GLU Fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo MAN Fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo INO Fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo SOR Fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo RHA Fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo SAC Fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo MEL Fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo AMY Fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo ARA Fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo OX Citocromo oxidasa



CUESTIONARIO

o ¿Cuáles son las rutas metabólicas de obtención de energía de las bacterias de respiración aerobia, anaerobia y fermentadora? ¿Cuál es el mas eficiente y por que?

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o ¿Explique por que los tubos de fermentación de azucares debe evaluarse a las 24 y 48 hrs.?

o ¿Explique por que se busca la presencia de precipitado de H2S en el fondo del tubo TSI y no en la superficie?

o ¿Qué enzimas son responsables de la decoloración del azul de metileno?

o ¿En que condiciones se reducen los nitratos en presencia de las bacterias?

o ¿Cite dos géneros de microorganismos que produzcan citocromo oxadasa?



7

CRECIMIENTO

ObjetivoEl alumno conocerá algunos métodos para evaluar el crecimiento de los microorganismos

Marco Teórico

El crecimiento es definido como un incremento ordenado de todos los constituyentes y estructura celular. En muchos microorganismos, este incremento continúa hasta que la célula se divide en dos nuevas células: Fisión binaria El crecimiento microbiano conlleva usualmente a un incremento en el número de células. Es importante distinguir entre el crecimiento individual de células y el crecimiento de poblaciones de células:

Crecimiento individual Es el incremento en el tamaño y peso y es usualmente un preludio a la división celular Crecimiento poblacional Es el incremento en el número de células como una consecuencia del crecimiento y división celular

Tasa de crecimiento Es el cambio del número de células o masa por unidad de tiempo

Generación Intervalo para la formación de dos células provenientes de una.

Tiempo de generación Tiempo que tarda una población en duplicarse. Se puede definir también como la cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo de división.

Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores físicos y químicos.

Factores externos Condiciones ambientales o culturales: pH, T°, Aw, O2, CO2 Condiciones nutricionales: Tasa C/N 10:1, 12:1

Factores internos Capacidad metabólica

CICLO DEL CRECIMIENTO POBLACIONAL

Si analizamos el crecimiento microbiano en el tiempo, éste describe una típica curva de crecimiento que puede ser dividida en fases distinguibles. La curva de crecimiento puede dividirse en diversas fases: fase lag, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte.

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MATERIALTubos de ensaye de 16 x 150mm con 9ml de

agua destilada estéril.

Tubos de ensaye de 16 x 150mm con 15ml de

gelosa simple fundida

Cajas de petri estériles

Pipetas de 5ml estériles

Pipetas de 1 ml estériles

Tubos con gelosa sabouraud.

Cajas de petri con gelosa sabouraud.

Matras nefelometrico con 50ml de medio

E+glucosa 0.5%.

Cepas

PROCEDIMIENTO.

El docente explicará los principios generales de trabajo y proporcionara cepas, así como muestras problema Desinfectar el área de trabajo con solución de benzal o alcohol y se enciende el mechero

METODO DE CUENTA VIABLE PARA BACTERIAS.

1. Inocular un matras nefelometrico conteniendo 50ml de medio E+glucosa con 2.5ml de una suspensión de Klebsiella pneumoniae.

2. Homogeneizar el inoculo y mantener en incubación en baño maría a 37ºC el matras antes y después de tomar una muestra.

3. Hacer una cuenta viable de las bacterias a los tiempos de incubación indicados en la tabla siguiente.

4. Efectuar diluciones decimales en serie (indicadas en la tabla anterior) para conocer el numero de bacterias viables en cada tiempo de incubación.

5. Tomar 0.1ml de la suspensión bacteriana de las 3 últimas diluciones y colocar cada una de ellas en una caja de petri esteril previamente marcada con la dilución correspondientemente.

6. Adicionar 15ml de gelosa simple fundida a 45ºC, homogeneizar por rotación y dejar solidificar.

7. Incubar a 37ºC durante 24h.8. Contar las colonias de cada placa y determinar el número de bacterias por ml

encontradas a los diferentes tiempos de incubación.9. Tabular los resultados y hacer una grafica

TIEMPO DE INCUBACION(HORAS)

DILUCIONES

0.00.51.02.0

10-1 a 10-6

3.04.05.0

10-1 a 10-7

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No.

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6.07.08.09.010.0

10-1 a 10-9

METODO NEFELOMETRICO.1. Usar el mismo matraz nefelometrico que en la curva de crecimiento por el

método de cuenta viable.2. Homogenizar la suspensión bacteriana.3. Encender el espectrofotómetro y dejar que se caliente 15 min.4. Ajustar a una longitud de onda de 520 nm.5. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia. 6. Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo, y calibrar a 100% de

transmitancia.7. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente

con papel seda y medir el valor del % de T.8. Calcular la absorbancia con la formula A= -log(%T/100).9.

CRECIMIENTO RADIAL PARA HONGOS.

1. Siembra por picadura (con el asa en ángulo recto) la cepa del hongo proporcionado en el centro de una placa de gelosa sabouraud.

2. Incubar a 28ºC durante 4 días.3. Medir y anotar el diámetro de la colonia para 24h.4. Tabular los resultados y hacer una gráfica.

CRECIMIENTO LINEAL PARA HONGOS.1. Sembrar por picadura en uno de los extremos de un tubo de ryar la sepa del

hongo proporcionado.2. Incubar a 28ºC durante 4 días.3. Medir y anotar la longitud del crecimiento obtenido en el tubo cada 24h.4. Tabular los resultados y hacer una grafica.



8

ObjetivoEl alumno manejará las técnicas para observar el efecto de la presión osmótica que ejerce el Cloruro de sodio y la Sacarosa sobre el crecimiento microbiano

Marco Teórico

La osmosis es la difusión a través de una membrana semipermeable que separa a dos soluciones con distintas concentraciones de sustrato. El proceso tiende a igualar la concentración de soluto a ambos lados de la memoran. Cuando a ciertas células bacterianas se les suspende en una solución que contiene una concentración elevada de cloruro de sodio (20%), el agua pasará desde la región de menor concentración de sustancia disuelta (el interior de la célula tiene una baja concentración salina) a través de la membrana citoplasmática que es semipermeable a la solución que rodea a la célula. Así la célula se deshidrata produciéndose plasmólisis. Si las bacterias se colocan en una solución que contiene menos del 1% de cloruro de sodio, el flujo de agua se invertirá, es decir ocurrirá la difusión, ya que fluirá el agua desde la solución externa al interior de la célula y originará la plasmotipsis. Dentro de la célula se establece una presión osmótica a causa de la gran cantidad de agua que se acumula allí, esta presión hará que se hinchen e incluso las células pueden reventar. El mecanismo de inhibición microbiana es la plasmólisis: las células se deshidratan y por lo tanto Son incapaces de metabolizar o crecer, pueden morir o permanecer vivas pero en condiciones durmientes. Sin embargo también existen microorganismos que requieren altas concentraciones salinas y son denominadas halófilos, y los que requieren presiones osmóticas elevadas se les conoce como osmófilos. La mayor parte de las bacterias pueden tolerar una amplia gama de presiones osmóticas externas y fuerzas iónicas debido a su capacidad de regular la osmolaridad interna y la concentración iónica. La osmolaridad está regulada por el transporte activo de iones potasio al interior de la célulaA) En medios hipotónicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor excesiva.

B) En medios hipertónicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentración de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado genéricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos:

Bombeando iones al interior Sintetizando una molécula orgánica osmoticamente activa Bombeando sustancias osmoprotectoras

FACTORES QUE AFECTAN EL CRCIMIENTO Y VIABILIDAD DE LOS

MICROORGANISMOSPRESION OSMOTICA

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CEPASEscherichia coliStaphylococcus aureusKlebsiella pneumoniae

MATERIALTubos de ensaye de 16x150mm con caldo nutritivo + extracto de lebadura adicionado de: Cloruro de sodio al 1%, 3%,5%,7%,9% y 12%Sacarosa al 1%,2.5%,5%,7.5%,10% y 15%Nefelometro de Mac FarlandPipetas de 5ml esteriles Pipetas de 1ml esterilesMatraces erlenmeyer con 50ml de solución salina esteril Tubos de ensaye de 16x150mm esteriles

PROCEDIMIENTO.

El docente explicará los principios generales de trabajo y proporcionara cepas. Desinfectar el área de trabajo con solución de benzal o alcohol y se enciende el mechero

EFECTO DE LA PRESION OSMOTICA

PREPARACION DE SUSPENCIONES MICROOBIANAS.1. Preparar las suspensiones y ajustar su turbidez a la ampolleta 1 del nefelómetro de

Mac Farland.

EFECTO DEL CLORURO DEL SODIO.

1. Colocar en una gradilla, una serie de 6 tubos (en orden creciente de concentración) con 10 ml de caldo nutritivo y 2 ml de cloruro de sodio a diferentes concentraciones.

2. Marcar con el nombre de la cepa a inocular.3. Inocular 0.1ml de la suspensión.4. Repetir los pasos del 1 al 3 para cada cepa.5. Incubar los tubos a 37ºC durante 24 a 48 h.6. Homogeneizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a turbidez.

EFECTO DE LA SACAROSA.

1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos (en orden creciente de concentración) con 10 ml de caldo nutritivo con 2 ml de sacarosa a diferentes concentraciones.

2. Marcar cada tubo con el nombre de la cepa a inocular.3. Inocular en cada uno de los tubos 0.1ml de la suspensión.7. Repetir los pasos del 1 al 3 para cada cepa.8. Incubar los tubos a 37ºC durante 24 a 48 h.9. Homogeneizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a turbidez.

RESULTADOS Y OBSERVACIONESAnota los resultados del efecto del cloruro de sodio y de la sacarosa sobre el crecimiento, indicando el número de ampolleta del nefelómetro a que corresponda dicho crecimiento. En caso de no contar con el Nefelómetro registra a manera de cruces dicho crecimiento bacterianoHacer graficas con los resultados obtenidos

SUSPENSIONMICROBIANA

CONCENTRACION NaCl (%)1.0 3.0 5.0 7.0 9.0 12.0

SUSPENSION CONCENTRACION DE SACAROSA (%)

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Prác

tica

MICROBIANA 1.0 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0

CUESTIONARIO

1. ¿Como se define la ósmosis?

2. ¿Que es plasmólisis y cuando ocurre?

3. ¿Que sucedió con las bacterias al incrementar la concentración del NaCl y sacarosa en los distintos caldos nutritivos?

4. ¿Que nombre reciben las bacterias que soportan grandes presiones osmóticas?

5. ¿Quién es el responsable en la célula bacteriana controlar la presión en medios hipotónicos?

6. ¿Cuando se establece un medio hipotónico?

7. ¿Cuando se establece un medio hipertónico?



9

ObjetivoEl alumno aplicará un método que le permitirá conocer la temperatura y el tiempo mínimos necesarios para esterilizar una suspensión, así como el efecto que tienen diferentes diluyentes sobre dichas determinaciones.

Introducción

Diferentes especies microbianas varían ampliamente en sus fluctuaciones de temperatura óptima para su desarrollo: Las llamadas psicrófilas crecen mejor a temperaturas bajas (15 a 20·C), las formas mesófilas lo hacen mejor de 30 a 37·C, la mayor parte de la termófilas entre 50·C y 60·C.La mayor parte de los microorganismos son mesófilos, 30·C es la temperatura óptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del huésped es óptima para los simbiontes de los animales de sangre caliente.El límite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie.Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al choque por calor, una síntesis de proteínas por el calor cuando son expuestos a una elevación súbdita en la temperatura por arriba de la óptima para el crecimiento. Al parecer estas proteínas son resistentes al calor y estabilizan a las proteínas de la célula sensible al calor. Las bacterias también exhiben fenómeno denominado choque por frío, ósea la muerte de las células por un enfriamiento rápido, en oposición a uno lento. Por ejemplo, el enfriamiento rápido de la escherichia coli desde 37·C a 5·C puede matar al 90% de las células

EFECTO LETAL DEL CALOR.

Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en la membrana). ¿Cómo podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana? He aquí algunos parámetros utilizados:

tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura

tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D)

punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).


MICROORGANISMOSEFECTO DE LA TEMPERATURA

PTM Y TTM

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CEPASEscherichia coliStaphylococcus aureusKlebsiella pneumoniaeBacillus subtilisBacillus megaterium

AGARESAgar NutritivoCaldo Nutritivo

MATERIALTubos de 16 x 15º con 5 ml de caldo nutritivo, adicionado con extracto de levadura al 0.25% y glucosa al 0.5%Nefelómetro de Mac FarlandEstufa incubadora a 28, 37, 45 y 55ºCRefrigerador a 4-8ºCMatraz Erlenmeyer con 50 ml de solución salina estérilTubos de 13 X 100 estérilesTubos de ensaye de 16 X 150 estérilesPipetas de 5 ml estérilesPipetas de l ml estérilesCajas de Agar Nutritivo Baños maría a 50, 60, 70, 80 y 92ºCTubos de ensaye de 18 x 150 con 15 ml de jugo de tomate y jugo de naranjaLeche descremada al 5% estérilAgua destilada estéril

PROCEDIMIENTO.


PREPARACION DE SUSPENSIONES MICROBIANAS

1. Adicionar 3 ml de solución salina estéril a cada tubo de cultivo y resuspender y homogeneizar con la misma pipeta.

2. Transferir la solución a un tubo de ensaye de 16 x 150 previamente marcado con el nombre de la cepa.

3. Determinar la turbidez de la suspensión, comparándola con la del nefelómetro de Mac Farland.

EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACION

1. Colocar en una gradilla una serie de 5 tubos con caldo ELG2. Marcar los tubos con el nombre de la cepa que se va a inocular y a cada uno de ellos

con las siguientes temperaturas respectivamente 4, 28, 37, 45 y 55ºC.3. Inocular cada tubo con 0.1ml de la suspensión microbiana4. Incubar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 24 a 48 hrs.5. Leer el resultado comparando el crecimiento de cada cepa a las diferentes

temperaturas con la turbidez de las ampolletas del nefelómetro de Mac Farland.

DETERMINACION DEL PUNTO TERMICO MORTAL Y TIEMPO TERMICO MORTAL

PREPARACION DE SUSPENSIONES BACTERIANAS

1. Preparar la suspensión de la cepa correspondiente en agua destilada.2. Determinar la dilución necesaria para obtener la turbidez de la ampolleta del

nefelómetro.3. Diluir las cepas en los otros diluyentes en base al dato del punto anterior. Esto se

determina de esta manera para tener una concentración constante de células de cada cepa, ya que en jugo de naranja, jugo de tomate y leche no se puede comparar turbidimetricamente.

DETERMINACION DEL PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos de 13 x 1002. Marcar cada tubo con el nombre de la cepa a estudiar.3. Anotar en cada tubo las temperaturas que se indican en el esquema.4. Colocar en cada uno de los tubos 0.5 ml de la suspensión.5. Calentar las suspensiones a la temperatura indicada, en un baño Maria (el testigo no

será sometido al tratamiento termino) durante l10 min.6. Sembrar una asada de cada uno de los tubos, en tubos con caldo nutritivo.

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TEMPERATURAºC

TESTIGO 50 60 70 80 92

DETERMINACION DEL TIEMPO TERMICO MORTAL (TTM)

1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos de 13 x 1002. Marcar cada tubo con el nombre de la cepa a estudiar.3. Anotar en cada tubo las temperaturas que se indican en el esquema.4. Colocar en cada uno de los tubos 0.5 ml de la suspensión.5. Calentar las suspensiones a 70ºC , en un baño Maria (el testigo no se calienta) durante

los tiempos indicados.6. Vaciar el contenido de cada tubo en una placa petri vacía estéril y adicionar 15-20 ml

de Agar nutritivo a 40ºC y homogeneizar por rotación sobre la mesa.7. Incubar las placas a 37ºC durante 24- 48 horas..8. Observar las placas.

TIEMPO min

TESTIGO 5 10 15 20 30


Anotar los resultados del efecto de la temperatura de incubación sobre el crecimiento de las cepas. Hacer una grafica de la tabla.

CEPAS TEMPERATURA ºC4 28 37 45 55

Escherichi coli

Bacillus megaterium


Staphylococcus aureus

Klebsiella pneumoniae

Anotar los resultados sobre PTM de cada cepa con diferentes diluyentes, en la siguiente tabla

CEPAS DILUYENTE. CRECIMIENTO DESPUES DEL TRAT. TERMICO ºCT 50 60 70 80 92 PTM

Escherichia coli

Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate

Bacillus megaterium

Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate


Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate


Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate

Anota el PTM de las cepas usadas en la práctica con diferentes diluyentes, en la siguiente tabla:

CEPADILUYENTE/PTM (ºC/10 min)

AGUA JUGO DE NARANJA LECHE JUGO DE

TOMATE

Escherichia coli

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Bacillus megaterium



Anotar los resultados sobre el TTM de cada cepa con diferentes diluyentes, en la siguiente tabla.

CEPAS DILUYENTE.

CRECIMIENTO DESPUES DEL CALENAMIENTO A 70ºC DURANTE

T 5min 10 min

15 min

20 min

30 min

PTM

Escherichia coli

Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate

Bacillus megaterium

Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate

Staphylococcus aureu

Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate


Agua

Jugo de Naranja

Leche

Jugo de tomate

Anota el PTM de las cepas usadas en la práctica con diferentes diluyentes, en la siguiente tabla:

CEPADILUYENTE/TTM (MINUTOS/70ºC)

AGUA JUGO DE NARANJA LECHE JUGO DE

TOMATE


Escherichia coli

Bacillus megaterium



CONCLUIR LOS RESULTADOS

CUESTIONARIO

1. ¿Que características presentan las bacterias llamadas psicrófilas?

2. ¿A que temperatura crecen las bacterias mesófilas?

3. ¿Que sucede con las proteínas en la célula bacteriana cuando se aplica un cambio brusco en la temperatura?

4. ¿En que consiste el tiempo térmico letal?

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5. ¿En que consiste el punto térmico mortal?



No.

Prác

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10


MICROORGANISMOSINFLUENCIA DEL pH

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Marco Teórico

Una característica clave de un sistema vivo es la capacidad de dirigir las reacciones químicas y organizar las moléculas en estructuras específicas: crecimiento.

- Las células microbianas están constituidas de sustancias químicas de una amplia diversidad de tipos y, cuando una célula crece, todos sus constituyentes químicos aumentan en cantidad apropiada.

- Los elementos químicos básicos de una célula, viene del exterior, pero estos elementos químicos son transformados por la propia célula en los constituyentes característicos.

Los requerimientos de H+ están limitados al mundo microbiano a aquellas bacterias litótrofas que utilizan el hidrógeno como fuente de energía. La concentración de iones de hidrógeno en términos de pH tiene mucha importancia. Cada especie tiene un pH definido de crecimiento y un pH óptimo:

En general, las bacterias son consideradas neutrófilas, los hongos en ambientes ligeramente ácidos (pH 4-6). Al margen de las variaciones de pH en el medio externo, en el ambiente interno de los microorganismos el pH se mantiene cercano a la neutralidad.

Organismos acidófilos como Thiobacillus ferrooxidans que vive en ambientes de pH 2 y tiene un pH interno de 6.0. La bacteria utiliza el gradiente electroquímico creado a nivel de membrana por esta diferencia de pH, para la síntesis de ATP.

Los microorganismos que crecen a un pH óptimo por debajo de la neutralidad (7.0) son llamados acidópfilos. Aquellos que crecen mejor a un pH neutral son llamados neutrófilos y aquellos que crecen mejor bajo condiciones alcalinas son llamados alcalinófilos. Los acidófilos obligados tales como algunas especies de Thiobacillus, realmente requieren un pH bajo para su crecimiento dado que su membrana se disuelve y la célula se lisa en la neutralidad. Varios géneros de Archaea incluyendo Sulfolobus y Thermoplasma, son acidófilos obligados. Entre los eucariotas, muchos hongos son acidófilos, y el campeón del crecimiento a pH bajo es el alga Cyanidium, el cual puede crecer a un pH de 0.

ObjetivoEl alumno observara el efecto que ejerce el pH del medio de cultivo sobre el crecimiento microbiano

PROCEDIMIENTO.


EFECTO DEL pH

1. Colocar en una gradilla una serie de 5 tubos de caldo nutritivo + extracto de levadura a pH 3.5, 5.0, 7.0 y 9.0.

2. Marcar los tubos con la cepa a estudiar.3. Homogenizar la suspensión e inocular 0.1 ml en cada tubo.4. Incubar a 37ºC durante 24 hrs.5. Observar el resultado comparando el crecimiento de cada tubo con la turbidez e la

serie de ampolletas del nefelómetro de Mac Farland.


Anotar los resultados sobre el efecto de pH sobre el crecimiento de las diferentes cepas usadas, en la tabla siguiente

CEPAS pH/CRECIMIENTO*3.5 5.0 7.0 9.0

Escherichia coli

Saccharomyces cerevisiae

Pseudomonas aureoginosa

*Número de ampolleta del nefelómetro que corresponda a la turbidez del tubo con medio a diferentes pH.

Registrar el pH óptimo de crecimiento de las 3 cepas en la siguiente tabla:

CEPASEscherichia coliSaccharomyces cerevisiaePseudomonas aureoginosa

MATERIALTubos de 16 x 15º con 5 ml de caldo nutritivo, adicionado con extracto de levadura 0.5% pH 3.5, 5.0, 7.0 y 9.0Nefelómetro de Mac FarlandTubos de ensaye de 16 X 150 estérilesPipetas de l ml estériles

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CEPA pH OPTIMO DE CRECIMIENTOEscherichia coli

Saccharomyces cerevisiae

Pseudomonas aureoginosa

Hacer una grafica del efecto del pH sobre el crecimiento de las cepas.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo influye el pH en el crecimiento de los microorganismos?

2. ¿Qué es el pH óptimo?

3. ¿Qué el pH mínimo y máximo?

4. ¿Qué es un microorganismo acidófilo?

5. indique el nombre de 3 microorganismos acidófilos, neutrófilos y alcalófilos



No.

Prác

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10

MORFOLOGIA COLONIAL Y CRECIIENTO DE BACTERIAS

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Marco Teórico

El crecimiento bacteriano en una superficie sólida presenta características de cultivo llamadas: morfología colonial.

Una colonia se define como una masa visible de microorganismos, todos originados de una sólo célula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias, todas genéticamente similares.

Los siguientes adjetivos pueden usarse para describir la morfología colonial o características de cultivo:

1) Tamaño: medido en milímetros; menos de 1mm = puntiforme

2) Forma: Circula, Irregular, Filamentosa, Rhizoide y Ondulada

3) Margen: (la forma del contorno de la colonia): Entero, Ondulada, Lobada, Irregular, Concéntrica, Arrugado, Circular irradiado, Filamentoso (filiforme), Ciliado.

4) Propiedades ópticas: Opaca, Translúcida y Transparente y Brillante (mucoide).

5) Elevación: Elevada, Convexa, Plana, Gotiforme (forma de gota), Umbonada, Crateriforme.

Colonias de bajo crecimiento*

6) Textura: Suave, Granular, Tenaz, Mucoide.

7) Pigmento: Hialino a colores blanquesinos, y de amarillos a rojos.

ObjetivoEl alumno distinguirá las características de la morfología colonial de las bacterias y el crecimiento de ellas en medios líquidos.

PROCEDIMIENTO.


MORFOLOGIA COLONIAL

1. Describir la morfología colonial, anotando cada una de las características de cada colonia.

a) Tamaño: medido en milímetros; menos de 1mm = puntiforme b) Forma: Circula, Irregular, Filamentosa, Rhizoide y Ondulada c) Margen: (la forma del contorno de la colonia): Entero, Ondulada, Lobada, Irregular,

Concéntrica, Arrugado, Circular irradiado, Filamentoso (filiforme), Ciliado. d) Propiedades ópticas: Opaca, Translúcida y Transparente y Brillante (mucoide). e) Elevación: Elevada, Convexa, Plana, Gotiforme (forma de gota), Umbonada,

Crateriforme. f) Textura: Suave, Granular, Tenaz, Mucoide. g) Pigmento: Hialino a colores blanquesinos, y de amarillos a rojos.

CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO

1. Marcar correctamente un tubo con caldo nutritivo para cada una de las cepas proporcionadas.

2. Inocular con una asada cada tubo.3. Incubar a 37ºC durante 24 hrs. 4. Identificar el tipo de crecimiento de cada microorganismo, según las características que

se indican

HOMOGENEO ANILLO FLOCULENTO PELICULA MEMBRANOSO


Describir la morfología de dos colonias diferentes

CEPASEscherichia coliStaphylococcus aureusKlebsiella pneumoniae

MATERIALTubos de 16 x 150 con 5 ml de caldo nutritivoCajas petri con crecimiento de bacterias: EMB,Sal manitol, Enterico de Hecktoen

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CARACTERISTICAS COLONIA 1* COLONIA 2**

Tamaño

Forma

Margen

Propiedades ópticas

Elevación

Textura

Pigmento

Proviene del medio

*___________________________________________________

**___________________________________________________

CUESTIONARIO

1. ¿Qué significado tiene que exista más de un tipo de colonia en una placa petri?

2. ¿Qué importancia tiene la descripción de la morfología colonial?

3. ¿Es específico el estudio de la morfología colonial de cada especie o genero bacteriano? ¿Por qué?



No.

Prác

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Marco Teórico

El oxígeno es un componente universal de las células y es suministrado siempre en grandes cantidades por el agua (H2O). Sin embargo, los procariotas muestran un amplio rango de respuestas al oxígeno molecular (O2).

Aerobios obligados Requieren oxígeno para su crecimiento, ellos usan el O2 como un aceptor final de electrones en la respiración.

Anaerobios obligados, o estrictos No requiere O2, no necesitan el O2 como un nutriente. De hecho, el oxígeno es una sustancia tóxica, el cual mata o inhibe su crecimiento. Los procariotas anaerobios obligados pueden vivir por fermentación, respiración anaeróbica, fotosíntesis bacteriana, o el primitivo proceso de la metanogénesis.

Anaerobios facultativos Son organismos que pueden cambiar entre tipo de metabolismo aeróbico y anaeróbico. Bajo condiciones anaeróbicas ellos crecen por fermentación o respiración anaeróbica, pero en presencia de oxígeno ellos cambian a respiración aeróbica.

Anaerobios aerotolerantes Son bacterias con un tipo de metabolismo exclusivamente anaeróbico (fermentativo), pero ellos son insensibles a la presencia de O2. Ellos viven solamente por fermentación sin importar si el oxígeno está o no presente en su entorno.

ObjetivoEl alumno manejara las técnicas más comunes para el aislamiento y cultivo de microorganismos anaerobios

11

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS

http://www.letslab.es/jarra-para-incubacion-anaerobios-p-1053.html?osCsid=cd3e4ae3e773f6284ce47d475496f1d4%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5

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CEPASClostridium spEscherichia coliBacillus subtilis

MATERIALTubos de 16 x 150 con tapón de rosca con caldo carne picada y sello de aceite mineralTubos de 16 x 150 con tapón de rosca con caldo tioglicolatoTubos de 16 x 150 con tapón de rosca con caldo nutritivo.Tubos de 16 x 150 con tapón de rosca con 5 ml de agua destilada estéril.Pipetas Pasteur estériles.Bulbos de hule.Cajas de petri con gelosa sangreJarra de anaerobiosisPlastilina

PROCEDIMIENTO.


CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO

1. Inocular con ayuda de una pipeta pasteur esteril cada una de las cepas proporcionadas en el fondo de los siguientes medios de cultivo: caldo tioglicolato, caldo nutritivo, caldo carne picada y sello de aceite mineral.

2. Incubar a 37ºC durante 24 hrs.3. Observar el crecimiento de cada cepa sembrada en los diferentes medios de cultivo.

CULTIVO POR COMENSALISMO

1. Inocular una asada de Clostridium sp y de Bacillus subtilis en una placa de gelosa sangre como se indica en el esquema:

2. Sellar con plastilina los bordes de la caja3. Incubar a 37ºC durante 24 hrs.4. Observar el crecmiento del microorganismo anaerobio y del aerobio, hacer u frotis de

cada uno, teñir por la tecnica de Gram y observar.

CULTIVO EN JARRA DE ANAEROBIOSIS

1. Inocular una asada de Clostridium sp y de Bacillus subtilis en una placa de gelosa sangre, como se indico en el esquema

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2. Colocar las placas en la jarra de anaerobiosis conteniendo gel de sílice en el fondo.3. Introducir en la jarra un indicador de oxido-reduccion (tira de papel filtro impregnada

con azul de metileno) y un sobre generador de hidrogeno y CO2 (Gas Pak).4. Poner 10 ml de agua en el interior del sobre generador para activarlo.5. Cerrar inmediatamente la jarra.6. Incubar a 37ºC durante 24-48 hrs.7. Observar crecimiento.


CEPASMEDIO DE CULTIVO/CRECIMIENTO*

Caldo Tioglicolato

Caldo Carne Picada

Caldo Nutritivo

Clostridium sp

Bacillus subtilis

Escherichia coli

- = Ausencia de crecimiento

+= Crecimiento. Indicar además si fue en la superficie, en todo el tubo o en el fondo.

Indicar si hubo crecimiento de los microorganismos sembrados para observar comensalismo, describir morfología microscópica de ambos organismos.

Clostridium sp Crecimiento __________________________

Bacillus subtilis Crecimiento __________________________

Clostridium sp

Forma __________________________ Agrupación ________________________

Esporas ________________________ Gram _____________________________


Bacillus subtilis

Forma __________________________ Agrupación ________________________

Esporas ________________________ Gram _____________________________

Indicar el crecimiento de microorganismos en jarra de anaerobiosis

Clostridium sp Crecimiento __________________________

Bacillus subtilis Crecimiento __________________________

CUESTIONARIO

1. ¿Qué son las bacterias anaerobias facultativas?

2. ¿Qué necesidades de oxigenación requieren las bacterias anaerobias estrictas?

3. ¿Qué finalidad tiene emplear el caldo tioglicolato?

4. ¿Qué finalidad tiene emplear un indicador de óxido-reducción? ¿Cómo se interpreta su reacción?

5. ¿Qué función realiza la jarra de anaerobiosis?

No.

Prác

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6. Indica el nombre de 4 bacterias anaerobias



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Marco Teórico

Las algas son un filo de protoctistas unicelulares o pluricelulares cuyas células no forman tejidos, que viven en el agua y que son capaces de realizar la fotosíntesis.Otras características de las algas son los diversos colores que presentan según sea el pigmento fotosintético que posean en los denominados cromoplastos. Así, pueden ser verdes, si tienen abundante clorofila, pardas o rojas, si predominan otros pigmentos como la ficoxantina de color pardoamarillenta o la ficoeritrina de color rojo.La mayoría de las algas de agua dulce viven en lagos y lagunas (masas de aguas quietas) o en ríos y pequeñas corrientes (aguas circulantes). Si bien se distribuyen en relación al espacio y al tiempo (periodicidad estacional), la temperatura, es un factor importante porque estratifica verticalmente la masa de agua, quedando una capa fría en la parte inferior y otra caliente en la superior. Influyen además, la cantidad de oxígeno, luz y elementos nutritivos existentes en sus hábitats.En el caso de las Algas Verde-Azules su nombre científico es Cianofíceas o también Cianobacterias. Su denominación proviene del prefijo griego "cyanos" que significa azul, aludiendo al color verde oliva o ligeramente azulado que tienen debido a sus pigmentos fotosintéticos. Por eso se las llama "Algas Verde-Azules", son microscópicas y muy parecidas a las bacterias. Los mohos o musgos que crecen en las paredes o maderas húmedas, o el verdín que se observa flotando en masas de agua más o menos quietas, muchas veces no son tales, sino Cianofíceas.Estas algas invisibles y poco conocidas, tienen una gran importancia en nuestra vida diaria por sus efectos perjudiciales y beneficiosos. Mientras a veces, las algas verde-azules o Cianofíceas contaminan las aguas usadas para potabilización, como sucede en nuestro lago San Roque y otros embalses, también sirven como fertilizantes de arroz, permitiendo la alimentación de millones de seres humanos en varios países.Las algas comprenden las clases de las diatomeas, las feofíceas, las heterocontas, las carofitas, las clorofíceas y las rodofíceas.

ObjetivoEl alumno cultivara, observara e identificara algunas especies de algas microscopicas.

AISLAMIENTO DE ALGAS

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MATERIALTubos de 16 x 150 con tapón de rosca con 9 ml de medio KnopPipetas estériles de 1 ml.Muestra de agua estancadaMuestra de algasAsa bacteriologicaCubreobjetosPortaobjetosMicroscopio

PROCEDIMIENTO.


DILUCIONES

1. Hacer 5 diluciones decimales a partir de la muestra de agua estancada. 2. Sembrar 0.5 ml a 1 ml en tubos con medio Knop3. Incubar los tubos a temperatura ambiente y en presencia de luz, 3 a 4 semanas.4. Transcurrido el tiempo de incubación, hacer preparaciones en fresco y observarlas al

microscopio.


Realizar la identificación de las algas observadas y elaborar esquemas

CUESTIONARIO

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1. ¿Cuál es la composición del medio Knop?

2. ¿Por qué se incuban las algas en las condiciones mencionadas?

3. ¿Cuál es elpapel biologico de las algas?

4. ¿Cuál es la importancia de las algas en la industria alimenticia?



No.

Prác

tica

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AISLAMIENTO DE HONGOS

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Marco Teórico

Los hongos presentan básicamente dos tipos de morfologías: una multicelular denominada filamentosa y otra unicelular denominada levaduriforme. Los hongos filamentosos (miceliares o mohos), representan el crecimiento más típico de los hongos microscópicos. En medios de cultivo sólidos y también sobre cualquier superficie en la que se desarrollen, por ejemplo frutas u otros alimentos, producen colonias algodonosas o pulverulentas que son muy características. Al microscopio óptico, los hongos filamentosos presentan unas estructuras tubulares, formadas por múltiples células, que se denominan hifas. En la mayoría de los hongos filamentosos, las hifas son tabicadas y presentan septos que delimitan las diferentes células. Sin embargo, los hongos del Phylum Zygomycota presentan hifas que carecen de septos y se denominan cenocíticas o sifonadas.Las hifas de los hongos tabicados suelen tener un diámetro inferior (2-5 μm) a las de los hongos sifonados (10-15 μm).Las hifas normalmente se desarrollan a partir de esporas, aunque también pueden originarse a partir de fragmentos de otras hifas, y crecen gracias al depósito de nuevos materiales en su extremo, ramificándose con mucha frecuencia hasta producir una maraña de filamentos que constituyen el micelio.En una colonia de un hongo filamentoso se produce una diferenciación en las funciones del micelio, de tal forma que el micelio vegetativo penetra en el sustrato para obtener los nutrientes, mientras que el micelio aéreo se proyecta hacia el exterior de la colonia y produce las estructuras reproductoras.Los hongos que presentan crecimiento levaduriforme generalmente dan lugar a colonias lisas que recuerdan a las bacterianas en medios de cultivo sólidos. Dichas colonias están formadas por agregados de células individuales (3-10 x5-30 μm) denominadas levaduras. Los hongos levaduriformes se dividen por gemación o por fisión binaria.En algunos casos las células hijas no se separan de la célula madre, formándose cadenas cortas denominadas pseudohifas.Los hongos que presentan este tipo de crecimiento, denominado pseudomicelio, dan lugar a colonias similares a las que producen los hongos levaduriformes en medios sólidos.

ObjetivoEl alumno conozca y utilice las técnicas para aislamiento y cultivo de hongos, así como su morfología colonial y microscópica.

PROCEDIMIENTO.


AILAMIENTO POR DILUCIONES

1. Preparar una serie de diluciones decimales a partir de la muestra, hasta dilucion 10-5

2. Utilizar las tres últimas diluciones depositando 1 ml en cajas de petri esteriles.3. Agregar 15 a 20 ml por separado a cada juego de placas agar Sabouraud y Rosa de

bengala respectivamente.4. Homogeneizar con movimientos rotatorios.5. Incubar 28ºC durante 24 a 72 hrs.6. Observar y realizar el conteo

MORFOLOGIA COLONIAL

1. De las cepas proporcionadas sembrar por picadura en el centro de los agares proporcionados.

2. Incubar 28ºC durante 24 a 72 hrs.3. Identificar las características morfológicas de los hongos indicando:

a) Tamañob) Aspecto: algodonoso, pulverulento, aterciopelado, granulosoc) Color del micelio vegetativod) Olor del micelio aéreoe) Producción del pigmento difusible

MORFOLOGIA MICROSCOPICA

Preparaciones en fresco1. Colocar una gota de azul de algodón lactofenol en el centro de un portaobjetos

limpio.2. Colocar una pequeña porcion de una colonia seleccionada.3. Poner un cubreobjetos y examinar la preparación al microscopio a seco debil y

seco fuerte.4. Observar las caracteristicas del micelio vegetativo:a) presencia o ausencia de septosb) diámetro de las hifasc) color de las hifas

MATERIALTubos de 16 x 150 con tapón de rosca con 9 ml de agua destilada estéril.Pipetas estériles de 1 ml.Cajas de petri con agar SabouraudCajas de petri con agar Rosa de BengalaCajas petri estérilesAsa bacteriológicaCubreobjetosPortaobjetosPuente de coloraciónAzul de algodón lactofenolPreparaciones fijas: Penicillium notatum, Aspergillis sp, RhizopusMicroscopio

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5. Observar las caracteristicas del micelio reproductora) estructuras de reproducción asexualb) estructuras de reproducción sexual


Indicar el número de colonias obtenidas en las placas de agar Sabouroud y Rosa de Bengala

DILUCION MEDIO DE CULTIVO/NUMERO DE COLONIASAgar Sabouroud Agar Rosa de Bengala

10-3

10-4

10-5

Reportar el número de UFC por gramo de muestra en ambos medios

Agar Sabouroud_________________

Agar Rosa de Bengala ________________


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http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.ebrisa.com/portalc/media/media-S/images/00020396.jpg&imgrefurl=http://www.ebrisa.com/portalc/ShowArticle.do%3Bjsessionid%3D9F9DE2A2B7471A10E304989801D999E6%3FarticleId%3D85075&usg=__-eihHk6hrBdeWVKJB8i60qUVrLk=&h=369&w=550&sz=31&hl=es&start=6&tbnid=4-XFVw7kwsLrlM:&tbnh=89&tbnw=133&prev=/images%3Fq%3Dhongos%2Bmicroscopicos%26gbv%3D2%26hl%3Des%26sa%3DG%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5

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http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.elbalero.gob.mx/kids/bio/images/especies/micro/hongo8.jpg&imgrefurl=http://www.elbalero.gob.mx/kids/bio/html/especies/micro/hongo8.html&usg=__WYx_9LIY8lofglGeNefBr60RJCY=&h=273&w=210&sz=19&hl=es&start=5&tbnid=mLdL4KCErSrf-M:&tbnh=113&tbnw=87&prev=/images%3Fq%3Dhongos%2Bmicroscopicos%26gbv%3D2%26hl%3Des%26sa%3DG%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5

http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.elbalero.gob.mx/kids/bio/images/especies/micro/hongo7.jpg&imgrefurl=http://www.elbalero.gob.mx/kids/bio/html/especies/micro/hongo7.html&usg=__SZUNTaJmtrbDsbhh7dMKQAS1QCg=&h=412&w=280&sz=17&hl=es&start=2&tbnid=8N4ezE1V28F5hM:&tbnh=125&tbnw=85&prev=/images%3Fq%3Dhongos%2Bmicroscopicos%26gbv%3D2%26hl%3Des%26sa%3DG%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5

Indicar la morfología colonial

CARACTERISTICAS COLONIA1* 2** 3***

Tamaño (cm)

Aspecto

Color del micelio vegetativo

Color del micelio aereo

Pigmento difusible

Procedente del medio

* _________________________________________________

**_________________________________________________

***________________________________________________

A partir de las preparaciones en fresco y preparaciones fijas hacer esquemas e indicar los nombres de las estructuras.

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CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las diferencias entre un moho y una levadura?

2. ¿Qué función tienen las hifas y que formas presentan?

3. ¿Qué función tienen las esporas?

4. ¿Qué factores impiden el crecimiento de los hongos?

5. ¿Cuales son los inhibidores de hongos en el pan:

6. ¿Qué factores del cultivo facilitan el crecimiento de los hongos?

7. ¿Por qué son importantes los hongos en granos?

8. ¿Qué son las micotoxinas y cual es la relación con los hongos?

9. ¿Qué hongos producen micotoxinas?

10. ¿Qué levaduras son de importancia en alimentos y que se produce a partir de ellas?



No.

Prác

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AISLAMIENTO DE SALMONELLA A PARTIR DE ALIMENTOS

http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://muveterinaria.com.ar/muv/wp-content/uploads/2009/05/salmonella.jpg&imgrefurl=http://www.muveterinaria.com.ar/muv/%3Fp%3D197&usg=__h2ML_JcpxdyIgJ2HoQ65Wy0xGKw=&h=297&w=300&sz=31&hl=es&start=1&tbnid=vMM1VzlQAbSwcM:&tbnh=115&tbnw=116&prev=/images%3Fq%3Dsalmonella%26gbv%3D2%26hl%3Des%26sa%3DG%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5

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Marco Teórico

Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del método analítico utilizado para su detección.

Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clínicas y los métodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su detección en alimentos. Las modificaciones a los métodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.

Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivo selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.

ObjetivoEl alumno conozca y utilice un método general para la determinación de Salmonella en alimentos.

PROCEDIMIENTO.


PREPARACIÓN DE LOS ALIMENTOS PARA EL AISLAMIENTO DE SALMONELLA

Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se recomienda una muestra de 25 g o más.

PREENRIQUECIMIENTO

1. Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher).

2. Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado) y licuar si es necesario durante un min.

3. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.

4. Incubar 24 hrs. a 35 +/- 2 ºC.

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

1. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente.

2. Transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina.

3. Incubar de 18 a 24 h a 35 +/- 2ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo periodo


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AISLAMIENTO EN MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

1. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).

2. Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. 3. Incubar las placas 24 hrs. a 35 +/-2ºC. 4. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de

acuerdo con las siguientes características:a) Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro.

En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. b) Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio

enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. c) Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En

algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. d) Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o

negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

e) Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

IDENTIFICACION BIOQUIMICA

1. Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.

2. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo.

3. Incubar por 24 Hrs. a 35 +/-2ºC. 4. Almacenar en refrigeración de 5 a 8 ºC las placas con medios selectivos por si es

necesario retomar más colonias. 5. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para

Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: a) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de

la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.

b) Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.

6. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales

PRUEBAS BIOQUÍMICAS COMPLEMENTARIAS

1. Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.

2. Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:

Agar citrato Simmonsa) Inocular por estría el tubo. b) Incubar 24 hrs. a 35 +/- 2ºC.


Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

Medio SIMa) Inocular por punción. b) Incubar 24 h a 35 ± 2ºC.

Movilidad.Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.

Producción de ácido sulfihídrico.Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.Prueba negativa: ausencia de color negro.

Producción de indolAdicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.Prueba negativa: sin cambio de color.

Caldo RM-VPa) Inocular un tubo con el medio.b) Incubar 48 hrs. a 35 +/- 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.

Prueba de Voges-Proskauer (VP)a) Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h.b) Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol.c) Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%.d) Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).e) Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 C o 4 h a temperatura ambiente.

Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.Prueba negativa: sin cambio de color.Reincubar el resto del medio RM-VP 48 hrs. más a 35 +/- 2ºC.

Prueba de rojo de metilo (RM)a) Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de

rojo de metilo. b) Interpretar los resultados inmediatamente.

Prueba positiva: desarrollo de color rojo.Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.

Caldo malonatoa) Inocular un tubo conteniendo el medio.b) Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

Prueba positiva: desarrollo de color azul.Prueba negativa: sin cambio de color.

Caldo manitola) Inocular un tubo conteniendo el medio.b) Incubar 24 hrs a 35 +/- 2ºC.

Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.Prueba negativa: sin cambio de color.

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IDENTIFICACIÓN SEROLÓGICAENSAYO DE LOS ANTÍGENOS SOMÁTICOS DE SALMONELLA (ANTISUERO

POLIVALENTE O)

1. Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.

2. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.

3. Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.

4. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.5. Prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el

antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.6. Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe

continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.7. Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el

subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes).

8. Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.

ENSAYO DE LOS ANTÍGENOS FLAGELARES DE SALMONELLA (ANTISUERO POLIVALENTE H).

1. Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón2. Incubar de 4 a 6 h a 35 +/- 2ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el

mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 hrs a 35 +/- 2ºC (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).

3. Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 100 mm aproximadamente).

4. Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. 5. Preparar un control de solución salina mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada

con 0,5 ml del antígeno formalizado. 6. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50 ºC. Observar a intervalos de 15 min por

espacio de una hora.7. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no

en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.


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CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la importancia de determinar Salmonella en alimentos?

2. ¿Para que tipo de alimentos se efectúa el preenriquecimiento?

3. ¿Con que finalidad se efectúa el enriquecimiento selectivo?

4. Indica un metodo moderno de deteccion rapida de Salmonella



No.

Prác

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AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS A PARTIR DE ALIMENTOS

http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://swampie.files.wordpress.com/2008/02/staphylococcus-aureus.jpg&imgrefurl=http://swampie.wordpress.com/2008/02/17/&usg=__Pw8LprDYBFLqwSiRwKoTgBZxA5w=&h=400&w=400&sz=50&hl=es&start=3&um=1&tbnid=VzD3c1fHERLnlM:&tbnh=124&tbnw=124&prev=/images%3Fq%3DSTAPHYLOCOCCUS%2BAUREUS%26hl%3Des%26lr%3Dlang_es%26sa%3DN%26um%3D1%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5

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Marco Teórico

El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina que al ingerirse causa intoxicaciones alimentarias.

Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos están:

Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de una enfermedad de origen alimentario.

Determinar si un alimento o ingrediente es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico.

Demostrar la contaminación postproceso la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.

Los alimentos sujetos a contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que normalmente restringe el crecimiento del Staphylococcus aureus y la producción de enterotoxinas.

Este tipo de alimentos se vuelven más peligrosos, si además son sujetos a un inadecuado manejo o son mantenidos a temperaturas de conservación inapropiadas.

Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería y productos de leche, son los más comúnmente asociados con intoxicación estafilocóccica.

ObjetivoEl alumno conozca y utilice un método microbiológico para determinar la cuenta de Staphylococcus aureus presente en alimentos

PROCEDIMIENTO.


1. Realizar diluciones decimales hasta 10-4

2. Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilución, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las placas de agar Baird-Parker.

3. Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada dilución.

4. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar.5. Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35 +/- 2ºC.6. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus

aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al informe se debe agregar la nota de "valor estimado". Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

7. Seleccionar las colonias de acuerdo con el siguiente criterio para realizar las pruebas de coagulasa y termonucleasa:

NUMERO DE COLONIAS

SOSPECHOSAS EN PLACA POR PROBAR

Menos de 50 3

51 a 100 5

101 a 150 o más 7

8. Seleccionar el número de colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 ml de caldo de infusión cerebro-corazón.

9. Incubar a 35 +/- 2ºC durante 24 h.


VIC

EN

TE M

OR

ALE

S C

AR

BA

JAL

10. Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo.

11. Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa.

PRUEBA DE COAGULASA

1. Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con solución salina estéril.

2. Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formación de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo.

3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg.

PRUEBA DE TERMONUCLEASA

1. Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en caldo de infusión cerebro-corazón en baño de agua hirviendo.

2. Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, incluye testigo.

3. Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h.4. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la

perforación se califica como positiva.


Hacer el cálculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el número de colonias totales, el número de colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 ml).

Ejemplo:

Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000

Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan 4 positivas, el cálculo es:

80 x 4 = 64 x 1000 x 10 = 640 000

Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g

Anexo 1


Perfiles numéricos.

0104140 Shigella flexneri 0104452 Salmonella paratyphi A 0104504 Pasteurella multocida 0104521 Yersinia enterocolitica 0140004 Pasteurella multocida 0144042 Shigella boydii 0206042 Acinetobacter calcoaceticus 0210004 Achromobacter sp. 0210004 Alcaligenes faecalis 0210004 Alcaligenes sp. 0314000 Proteus mirabilis 0504512 Salmonella paratyphi A 0676001 Proteus vulgaris 0776000 Proteus mirabilis 1000004 Pasteurella sp. 1014743 Klebsiella ozaenae 1104112 Shigella sonnei 1214012 Yersinia pseudotuberculosis 1214773 Klebsiella pneumoniae 2206004 Pseudomonas aeruginosa 2504752 Salmonella spp. 3005573 Enterobacter cloacae 3246527 Aeromonas hydrophilia 4004550 Salmonella cholerasuis 4004550 Salmonella typhi 4104100 Salmonella gallinarun 4357106 Vibrio parahemolyticus 4404112 Salmonella gallinarum 4404510 Salmonella cholerasuis 4404540 Salmonella tiphy 4504010 Salmonella pullorum 4604552 Salmonella spp. 4704500 Salmonella cholerasuis 5004024 Pseudomonas cepacea 5044124 Vibrio cholerae 5046753 Serratia odorifera 5100100 Yersinia ruckeri 5104111 Hafnia alvei 5104542 Salmonella arizonae 5144572 Escherichia coli 5207323 Serratia rubidae 5255573 Klebsiella oxytoca 5346761 Serratia marcescens 5314173 Enterobacter gergoviae 5317761 Serratia marcescens

VIC

EN

TE M

OR

ALE

S C

AR

BA

JAL

5704412 Salmonella arizonae 5704552 Salmonella arizonae 6004540 Salmonella typhi 6144204 Plesiomonas shigelloides 6404112 Salmonella spp. 6504750 Salmonella spp. 6604512 Salmonella spp. 6704342 Salmonella spp. 6704532 Salmonella spp 6704752 Salmonella gallinarum 7244126 Aeromonas hydrophila 7305773 Enterobacter cloacae 7704752 Salmonella arizonae 7704752 Salmonella spp.

ANEXO 2


VIC

EN

TE M

OR

ALE

S C

AR

BA

JAL


VIC

EN

TE M

OR

ALE

S C

AR

BA

JAL

NORMAS

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-110-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS.

BIBLIOGRAFIA

Jay, J. M., Microbiologia Moderna de los Alimentos , Tercera Edición, Editorial Acribia, España.

Pelczar, Michael, et.al, Elementos de Microbiología, McGraw-Hill, México

Prescot, L.M., Harley, J.P., Microbiología , Cuarta Edición, McGraw-Hill, México

Zinsser, Joklik Willett Amos, Microbiología , Editorial médica panamericana, 18º edición, México.

Koheman Elmer w., et.al. Diagnóstico Microbiológico, Panamericana, quinta edición, México.

MANUALES

Q.F.B. Alcaraz Murguía Mónica, Manual de Practicas de Microbiología, Universidad Autónoma de Colima. 2005

M.C Gaitán Hinojosa Mario Alberto, Manual de prácticas de Bacteriología General, Facultad e Ciencias Químicas, Universidad de Colima.

Dr Martínez Ramos, Manual de Prácticas de Microbiología General, Centro de Graduados e investigación, Instituto Tecnológico de Veracruz, l993.

Olivas E Evangelina, Luis Roberto Alarcón, Manual de prácticas de Microbiología básica y Microbiología de alimentos, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Editor UACJ, 2004


M.C. Ruiz Puente Juvencio, Manual de Prácticas de Microbiología General, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN, México, D.F., 2000

PAGINAS WEB

Manual de Laboratorio Manual de prácticas de Microbiología . Cualquiera de estas prácticas se puede hacer perfectamente en un laboratorio de institutohttp://www.joseacortes.com/practicas/ Última modificación: 17-03-2005 © 2001 por José A. Cortés

Practicas de Microbiología AlimentaríaSEGUNDO CURSO DE LA DIPLOMATURA DE NUTRICIÓN HUMANA Y DIETÉTICAhttp://www.uv.es/~castillg/practicasnutricion.doc

IMÁGENES

Mediateca.educa.madrid.orghttp://mediateca.educa.madrid.org/imagen/ver.php?

id_imagen=w1yoyatkhnvb2ybn&id_disciplina=49&pag=5

http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

http://mediateca.educa.madrid.org/imagen/ver.php?id_imagen=w1yoyatkhnvb2ybn&id_disciplina=49&pag=5

http://mediateca.educa.madrid.org/imagen/ver.php?id_imagen=w1yoyatkhnvb2ybn&id_disciplina=49&pag=5

http://www.uv.es/~castillg/practicasnutricion.doc

manual de microbiología

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