U N I V E R S I D A D N A C I O N A L D E L N O R D E S T E C o m u n i c a c i o n e s C i e n t í f i c a s y T e c n o l ó g i c a s 2 0 0 3

Resumen: M-067

Injuria al microambiente hematopoyético producidos por el cadmio.

Piñeyro Buscaglia, Shirley - Juaristi, Julián A. - Aguirre, María V.

Alvarez, M. - Espada, Tracy - Quintana, Rosa N. - Brandan, Nora C. Cátedra de Bioquímica. INFIBAR - Facultad de Medicina - UNNE. Mariano Moreno 1240 - (3400) Corrientes - Argentina. Tel./Fax: +54 (03783) 435378 E-mail: nbrandan@med.unne.edu.ar ANTECEDENTES

El sistema hematopoyético es uno de los ejemplos mayor estudiados de la homeostasia celular. A partir de una célula madre totipotencial (Stem Cell, S.C), ubicado en la Medula Ósea (MO) y a través de un complejo de proliferación y diferenciación se provee diariamente a la sangre periférica 3x1011 células de 8 tipos diferentes y en proporciones estables (1). La capacidad funcional de responder adaptativa y rápidamente a los estímulos del medio (estrés, temperatura, hipoxia, o infecciones) lo hace particularmente sensible a cualquier tóxico. Metales como el cadmio, un polulante ambiental ampliamente difundido (9, 10,), pueden interferir en la regulación de la hematopoyesis, modificando la proliferación la diferenciación o la apoptosis celular. La acción del Cd es atribuible a un proceso inflamatorio agudo o crónico, mediado por moléculas como el oxido nítrico (NO) o citoquinas tales como el TNF-α IL-1 IL-6, (4, 6, 9, 12). La prolongada permanencia del Cd en los tejidos blandos es única entre los metales, provocando toxicidad hepática y renal (11, 12).Nosotros hemos demostrado que el Cd afecta la hematopoyesis tanto en MO como en bazo (BZ).en el presente estudio se investiga la injuria del Cd (1mg/kg/día i.p.), en el microambiente murino medular y esplénico, comparando imágenes de microscopia óptica (M.O.), y Microscopia Electrónica de Barrido (MEB). MATERIALES Y METODOS

Animales: Ratones isogénicos de la cepa Swiss CF1 (promedio 24.5 gr n=5/lote)

Agente genotóxico: Cloruro de Cadmio (Cd Cl2) (ICN Biochemical’s Inc. USA).

Contaje diferencial de células: Extendidos de médula ósea (MO) y esplénicos (BZ), fueron teñidos con May Grünwald Giemsa. Las células se clasificaron de acuerdo a los criterios standard, contando 500 a 1000 células nucleadas por duplicado. Los resultados se expresan en porcentajes de cada línea. Se realizó el hematocrito a las muestras por lotes/días.

Ensayos genotóxicos in vivo: Grupo control (n=3) y grupo tratados con inyectados i.p. con dosis de Cd Cl2 1mg/kg durante 3 semanas. Las muestras se tomaron a los 0, 6, 12, 21 días.

Determinación de la celularidad: Se obtuvieron muestras de células nucleadas de MO y BZ en los lotes tratados con Cl2 Cd a los días 0, 6, 12, 21días post-tratamiento. Se utilizaron lotes control (día 0). Las muestras de MO se obtuvieron por flushing del fémur, con 500 ml PBS buffer (137mM NaCl, 2,5 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4.12H2O, 1,4Mm KH2 PO4, solución de stockx10) y esplenocitos se obtuvieron a través de malla con 500 µl PBS buffer. Se determinó el recuento celular en cámara de Nebauer, y utilizando pesos y concentraciones conocidas.Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Los resultados se expresan como promedio de células nucleadas/ Femur,BZ x 106 (± SEM).

Procesamiento del material para la microcopia de Barrido Electrónico: Para este trabajo se procesaron muestras de tejido esplénico de medula ósea y Esplénica, previamente fijados en paraformaldehído al 8% y Buffer fosfato salino (PBS). Para el análisis de muestras al Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) en el Centro de Microscopia Electrónica de Barrido de la UNNE. Se sometió el material a los pasos de la técnica, deshidratación con acetonas crecientes (25º-50º-75º-100º).Se realizó el secado por punto crítico con secador Denton y metalización con oro paladio. Se realizó la observación en alto vacío con Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) Jeol 5800L.V. Se recogieron las imágenes en diskettes y se imprimieron las fotografías logradas en papel termo sensible. Se identificaron las células necróticas y se describieron las características estructurales del tejido esplénico y medula ósea. Se tomaron microfotografías.

Cálculos estadísticos: Los resultados fueron analizados utilizando el Software INSTAT y PRISM Versión 2.0 (GraphPad Software, San Diego, California, USA.). Se consideró significativo a un p< 0.0.

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FIGURA N°1: El número total de células nucleadas en médula ósea decrece a partir de la primer semana de exposición al genotoxico, siendo significativo a los 21 días respecto al control (22±0.8 a 15,50± 1.8 x 106) (p<.001), alcanzando una disminución del 30%.

DISCUSION DE RESULTADOS

Efecto del Cadmio sobre la celularidad medular y esplénica

Médula Osea

0.0 6.0 12.0 21.00

5

10

15

20

25

Días de tratamientocon Cd

Célu

larid

ad d

e M

Ox1

06

Bazo

0.0 6.0 12.0 21.00

100

200

300

**

**

Dias Postratamiento con Cd

Cel

ular

idad

de

Esp

leno

cito

sx1

06

Cuantificación de las diferentes líneas celulares de Médula ósea y Bazo:

0 3 6 9 12 15 18 21 240

5

10

15

20

25Linfoides(x106)Eritroides(x 106)Mieloide (x106)

Células de MO

**

**

**

Dias Pos-tratamiento

N° d

e C

elul

asx1

06

celulas de bazo

0 3 6 9 12 15 18 21 240

10

20

30

Linfoide(x 106)Eritroide(x106)Mieloide (x106)

**

Dias Pos-tratamiento Cd

N°d

e cé

lula

sx1

06

FiguraN°3: Muestra los cambios en el número absoluto de las diferentes líneas celulares (eritroideas, linfoideas y linmieloideas) en M.O El de Cadmio deprime significativamente las tres líneas hemopoyeticas durante las primeras semanas de tratamiento (p<.001).Tanto la línea eritroide como la linfoide permanecen deprimidas hasta el fin de la experiencia, mientras que la línea mieloide retorna a los valores basales al día 21. volviendo al día 21 a valores cercanos a lo normal.

La figura N°4 En las células maduras esplénicas se muestra que la línea eritroidea (p<.001) aumenta drásticamente a partir del día 6, retornando a valores normales al día 21. Tanto la línea mieloide como la linfoide decaen significativamente al sexto día

FIGURA N°2 El número total de células esplénicas evidencian una drástica caída en la primer semana de tratamiento con el toxico (222,260 vs 57± 2.90 x106), A partir de este día, la recuperación del número de células totales ascendió en forma gradual, evidenciándose que al día 21, la celularidad esplénica alcanza valores superiores a los valores basales (de 277± 33 x106().

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A B C D Bazo Normal Bz 6 días Bz 12 días Bz 21 días

Acción del Cd sobre Morfología Celular

Células de médula ósea y bazo, tratadas con cloruro de cadmio ( i.p. de 1 mg/kg/día, 0,6,12,21), teñidas con May Grunwall Giemsa y observadas con Microscopía Óptica. El estrés genotóxico puede provocar muerte celular tanto apoptótica como necrótica dependiendo de la intensidad del tratamiento. Durante la apoptosis las células muestran una contracción nuclear y citoplasmática, fragmentación de la cromatina mientras la membrana muestra bullas redondeadas pero manteniendo su integridad (figuras CyD). En contraste, la necrosis (figura B) se caracteriza por una rápida perdida de la integridad de la membrana celular.

Las fotografías muestran ambos fenómenos

A MO B 6 Días C MO 12 Días D MO 21 Días Normal (Apoptosis) (Necrosis) (Apoptosis)

Microscopia Electrónica de Barrido

Células de Bazo

Células de Medula Ósea

A B C D MO Normal MO 6 días MO 12 días MO 21 días

Figura 4: Alteración del microambiente hemopoyético por acción del Cadmio, obsérvese la modificación de la trama tisular durante el tratamiento y la pérdida de integridad de la membrana plasmática típica de la necrosis

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El Cadmio esta ubicado dentro de los polulantes medioambientales más ubicuos y tóxicos. (1). Mas conocido por sus efectos crónicos y acumulativos sobre el tejido hepático (11) y renal (12), es también un potente genotóxico (6) hemopoyético. Nuestros resultados sobre el animal in vivo muestran tras 21 días de tratamiento profundas alteraciones en la celularidad tanto medular como esplénica. Este efecto es particularmente marcado sobre el compartimento eritroideo en la primer semana de tratamiento y justifica la anemia encontrada por otros autores (Susumu Sakata et al 1988). Sus efectos pueden explicarse por producir un estado inflamatorio, con liberación de oxido nítrico (NO) y citoquinas tales como TNFα, IL1 y IL6. (10 ,12).moléculas capaces de inducir por diferentes mecanismos necrosis o apoptosis observables tanto por Microscopía óptica como por MEB CONCLUSIONES

§ El Cloruro de Cadmio induce cambios en la hematopoyesis murina tanto en MO como en BZ evidenciable por la caída de la celularidad, esto puede atribuirse a un efecto toxico inespecífico.

§ En médula ósea las tres poblaciones son afectadas por la administración subcrónica de Cadmio, y particularmente el compartimento eritroideo. En bazo hay expansión del compartimento eritroideo a los 6 días debido a la migración de progenitores eritroides desde M.O.

§ El efecto del metal sobre el microambiente muestra el daño atribuible a cualquier estrés que ponga en marcha procesos inflamatorios particularmente evidenciables en la necrosis y apoptosis observables tanto por microscopía óptica como por MEB.

REFERENCIAS

1- Ogawa M. Blood (1993). Differentiation and proliferation of hemopoietic stem cells. 81: 2844-2853.

2- Amess p, eds. General and applied toxicology. New York: Stockton Press; 93: 839-867.

3- Fuller J, Woodman DD, General and applied toxicology (1993) Haematology in toxicology studies. In: Ballantyne B, Mars T, Turner P, eds.. New York

4- International Ageny for Cancer Research IARC (1993). Monograf Eral. Carcinog. Risks Humb 1009. 58: 119-237.

5- Friberg L, Piscator M, Nordberg GF, Kjellstromt. (1974). Cadmium in the Environment, 2 nd edn, Crc Press, Cleveland, OH.

6- Friberg L, Kjellstrom T, Nordberg (1986), (eds) hand book on the Toxicology of Metals, 2nd edn, Elsevier Science Publishers BV; Amsterdam . pp 130-184.

7- Kasuya M, Teranishi H, Aoshima K, Katoh T, Horiguchi H. (1992)Water pollution by cadmium an the onser of Itai-Itai disease wai Sci Tech, 25:149-156.

8- Horiguchi H, Teranishi H, Niiya K, Ahoshima K, Kath T (1994) Long-term cadmium exposure induce anemia in rats through hypoproduction of erythropoietin in the Kidneys. Arch Toxicol. 71: 11-19.

9- Hiratsuka H, Katsuta O, Toyota N, Tsuchitani M, Unemura T, (1996) Chronic cadmium exposure- induced renal anemia in ovarictomized rats. Toxicol .Appl. Pharmacol. 137: 228-236.

10- Yamano T, De cicco L, Rikans L.E. (2000). Attenuation of cadmium-indiced liver injury in senescent male fisher 344 rats: Role of kupffer cells and inflammatory cytokines. Toxicl. Appl. Pharmacol 162:68-75.

11- Klassen Cd, Liu J (1997). Role of metallothionein in cadmium-induce hepatotoxicity and nephotoxicity .Drug Met Rev; 29: 79-102.

12- Shaikh ZA, Vu TT, Zaman, K (1999) Oxidative stress as a mechanism of chronic cadmium-induced hepatotoxicity and renal toxicity and protection by antioxidants. Toxicol. Appl. Pharmacol. 154 (3):256-263.