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INFORME FINAL PROYECTO : Síntesis y Caracterización Estructural de O-Glicósido

Fenilazonaftólico en Medios no Acuosos y Evaluación de Actividad Enzimática. Resumen Se propuso la síntesis de O-glicósidos de colorantes fenilazonaftólicos 6 a-d y 13 a-d siguiendo la ruta propuesta en los esquemas 1 y 2 respectivamente. De las 2 rutas propuestas se encontró que la mas viable para obtener O-glicósidos de colorantes fenilazonaftólicos fue la 2, en virtud que mediante esta estrategia fue posible la obtención del glucósido 13 el cual fue caracterizado espectroscópicamente por resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas, así como evaluado como sustrato para determinar espectroscópicamente la actividad enzimática de β-glucosidasa. Introducción Las β-glicosidasas son hidrolasas de gran relevancia involucradas en el rompimiento del enlace glicosídico de una gran variedad de substratos metabólicos. La función bioquímica de estas enzimas no está del todo esclarecida, sin embargo existen evidencias que señalan su participación en una serie de procesos entre lo que podemos mencionar los de degradación se sustratos naturales como mecanismos de detoxificación, como mecanismos de defensa contra patógenos hervíboros mediante la liberación de tiocianatos, cianuro y fitohormonas, y en humanos catalizan la degradación de glucosilceramidas en el lisosima .1 Además, las hidrolasas quitinasa, y glucanasa son enzimas que degradan polisacáridos como el laminarín, y quitina presentes en hongos, levaduras e insectos como mecanismo de defensa.2 Por otra parte las celulasas degradan el polímero natural mas abundante por lo constituyen una fuente alternativa de aprovechamiento de la celulosa.3 Otra hidrolasa de gran importancia es la β-glucuronidasa las cual en animales superiores sirve para eliminar sustancias tóxicas del organismo en forma de glucurónidos, y en plantas transgénicas como marcador genético.4 Se ha reportado previamente la síntesis y evaluación histoquímica de los sustratos fenilazonaftólicos unidos a ácido glucurónico, sin embargo aunque la sensibilidad de detección ha sido exitosamente demostrada, el rendimiento reportado a traves de 2 variantes sintéticas, ha sido muy bajo lo que hasta el momento lo ha imposibilitado para ser utilizado en forma más exhaustiva. La ruta sintética que se propone se basa en un concepto sintético distinto que consiste en la formación de la sal de diazonio en medios no acuosos. Métodos y Materiales Los reactivos empleados fueron adquiridos de la compañía Aldrich Co. excepto la solución de ácido bromhídrico en ácido acético obtenida de la compañía Fluka Co. La Purificación por cromatografía en columna se llevo a cabo usando silica gel 70-230 mesh como fase estacionaria y la cromatografía en capa fina utilizando cromatofolios de la compañía Merck Co. Empleando como sistema de detección una solución de sulfato de cerio seguido por calentamiento. Los espectros de infrarrojo fueron registrados en un espectrómetro Perkin-Elmer; en tanto que los espectros de Resonancia Magnética Nuclear

2

de hidrógeno y carbono en un equipo Varian 300 MHz. Los espectros de masas y rotaciones ópticas fueron registrados en el departamento de química del Cinvestav en un equipo Hewlett-Packard 5989 y Polarímetro Perkin-Elmer 341 respectivamente. La enzima β Glycosidase de Almendras fue adquirida de la compañía Sigma Co. La síntesis de 6 a-d propuesta en el esquema 1 consiste con la preparación de los donantes glicosídicos análogos de acetobromoglucosa 1 de acuerdo a los métodos descritos en la literatura.7 El siguiente paso consistie en la condensación del donante glicosídico 1 con 2-naftol 2 bajo condiciones de Koenigs-Knorr8 para generar el O-glicósido β-naftólico 3. El paso crítico del esquema general se refiere a la formación de la sal de diazonio de las aminas 4 a-d bajo condiciones de nitrito de sodio –ácido acético en un medio prótico no acuoso como el tetrahidrofurano, y posterior reacción in situ con el intermediario 3 para formar los correspondientes O-glicósidos fenilazonaftólicos 5 a-d. Desprotección bajo condiciones de Zemplén de grupos acetato dará lugar a los O-glicósidos 6 a-d, los cuales serían evaluados como sustratos específicos para determinar actividad enzimática de β-glicosidasas.

Esquema 1

O

OR

Br

OR

OR

OR

+

HOi

O

OR

OR

OR

OR

O

R = Ac

1 2 3

NH2

ii

O

OR

OR

OR

OR

O

N

N

4 a-dR'

R'

5 a-d R = Ac

4a = p-Me4b = p-OMe4c = p-Cl4d = p-CHO

iii6 a-d R = H

i) Ag2CO3, PhH, drierita, I2. ii) NaNO2, AcOH, THF. iii) NaOMe-MeOH. Se propone una segunda estrategia dirigida hacia la preparación de otra serie de potenciales sustratos histoquímicos 13 a-d , y consiste en la condensación del donante glicosídico 7 con p-nitrofenol 8. El glicósido resultante 9 se somete a condiciones reductivas para transformar el grupo nitro en amino 10. Este intermediario se convierte mediante la reacción de Sandmeyer en la sal de diazonio la cual se hace reaccionar in situ con β-naftol sustituidos 11 a-d para generar el O-glicósido fenilazoanftólico 12 a-d. Eliminación de los grupos acetatos bajo condiciones de Zemplén, proporciona los potenciales sustratos 13 a-d (esquema 2).

3

Esquema 2

O

OR

C(NH)CCl3

OR

OR

OR

+

OH

NO2

iO

OR

OR

OR

OR

O

NO2

R = Ac

7 8 9

iiO

OR

OR

OR

OR

O

NH2

HO

iii

10

11 a-d

R

11a = Me11b = OMe11c = Cl11d = CHO

O

OR

OR

OR

OR

O

N

HO

N

12a-d

13a-div

R = Ac

R = H

R

i) AgOTf, CH2Cl2. ii) H2/Pt EtOH. iii) NaNO2, AcOH, THF. iv) NaOMe-MeOH. Evaluación de actividad emzimática En tubos Eppendorf conteniendo 1 ml de buffer 0.1M NaHPO4 a PH 7.2 se adicionan 5 µl de la glicosidasa (Sigma Co.) y se adiciona una solución 1 mM conteniendo los potenciales substratos 6 a-d o 13 a-d. La reacción se incuba durante 30 minutos a 37oC. Se centrifugan los tubos incluyendo el testigo que contiene sustrato sin enzima, y se observará la aparición de un precipitado rojo indicativo de la prueba positiva. Resultados y Discusión La primer ruta sintética explorada en este proyecto fue la planteada en el esquema 1 y consistió en la preparación de acetobromoglucosa 1 a partir de pentaacetato de glucopiranosa la cual se hace reaccionar con ácido bromhídrico-ácido acético. El

4

intermediario 1 fue caracterizado espectroscópicamente por resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H RMN) presentando señales en: δ 2.0 ppm correspondientes a los grupos acetato, δ 4.1, 4.25, 4.8, 5.2, 5.5 y 6.6 correspondientes a 5 hidrógenos del anillo de piranosa y 2 hidrógenos diasterotópicos (espectro 1)

Espectro 1. Espectro de 1H RMN de acetobromoglucopiranosa. El siguiente paso consistió en la reacción de acoplamiento de acetobromoglucosa con β-naftol 2 bajo condiciones de Koenigs-Knorr para generar 2’-(β-D-2,3,4,6-tetracetil glucopiranosiloxi) naftol (intermediario 3). La reacción de formación de la sal de diazonio de las aminas 4 a y posterior reacción de acoplamiento con del intermediario 3 no condujo a la esperada formación del O-glucósido fenilazonaftólico 5. Esto se debió aparentemente a que para la formación del colorante azóico se requiere de la formación del alcóxido aromático lo que no es posible ya que el oxígeno se encuentra unido a la glucopiranosa. Para superar este inconveniente se procedió a desarrollar la ruta sintética propuesta en el esquema 2 la cual si presupone la formación del alcóxido como se expone a continuación. El donante glicosídico 1 que es común para las 2 rutas sintéticas fue condensado en lugar del intermediario 8 debido a su estabilidad en sistemas acuosos lo que no ocurre con el imidato planteado en el esquema original con p-nitrofenol 8 bajo condiciones de NaOH acetona-agua en lugar de las condiciones de Koenigs-Knorr obteniendose el O-glicósido peracetilado 9 en rendimiento de 60%. El espectro de 1H RMN de 9 en cloroformo deuterado muestra señales en δ 2.0 ppm correspondientes a los grupos acetato, entre δ 3.9 y 5.4 ppm se localizan las señales asignables a los protones de la glucopiranosa y un sistema A2X2 en δ 7.0 y 8.2 ppm en forma de 2 señales dobles típicas de un sistema para sustitutído desplazado a campo bajo por la presencia del grupo nitro (espectro 2). El espectro d13C RMN también fue obtenido, mostrando señales consistentes con la estructura propuesta.

5

Espectro 2. Espectro de 1H RMN de β-D-2,3,4,6-tetraacetilglucopiranosiloxi-4’-nitrofenol 9. La siguiente reacción consistió en la reducción catalítica del grupo nitro al amino bajo condiciones de atmósfera de hidrógeno y paladio en carbono como catalizador generando el intermediario 10 en rendimiento cuantitativo. El espectro de 1H RMN de 10 en cloroformo deuterado mostró señales en δ 2.0 ppm correspondientes a los grupos acetato, entre δ 3.4 y 5.4 ppm las señales asignables a los protones de la glucopiranosa y un sistema A2X2 en δ 6.6 y 6.8 en forma de 2 señales dobles desplazadas a campo alto indicando la transformación del nitro a la amina.

Espectro 3. Espectro de 1H RMN de β-D-2,3,4,6-tetraacetilglucopiranosiloxi-4’-aminofenol 10. Una vez obtenido en intermediario 10 se procedió al paso crítico de la reacción consistente en la formación del colorante unido al azúcar mediante una reacción de formación de sal de diazonio y condensación con la sal de sodio del β-naftol 11 bajo condiciones débilmente ácidas con la finalidad de impedir la ruptura del enlace glicosídico. Así el intermediario 9 se hizo reaccionar con nitrito de sodio acido acético-agua a 0oC para generar la sal de

6

diazonio que se hizo reaccionar de inmediato con la sal sódica del β-naftol para generar el O-glucósido fenilazonaftólico 12. El espectro de 1H RMN de 12 en cloroformo deuterado mostró señales en δ 2.0 ppm asignables a los protones de los grupos acetato, en 3.8-5.8 las señales correspondientes a los protones intracíclicos y metilénicos de la glucopiranosa, destacando la señal doble en δ 5.8 ppm perteneciente al protón anomérico de tipo β, en δ 7.0-8.6 un patrón de señales pertenecientes a 10 protones aromáticos destacando 1 señal doble a campo bajo correspondiente al protón de la posición 8 del anillo de β-naftol (Espectro 4). El espectro de 13C RMN también fue obtenido, mostrando señales consistentes con la estructura propuesta.

Espectro 4. Espectro de 1H RMN de O-glucósido fenilazonaftólico 12.

Otra técnica instrumental importante empleada para la caracterización estructural del O-glicósido 12 fue la espectrometría de masas de impacto electrónico mostrando un ion molecular (M+) de 594 consistente con el peso molecular de la estructura propuesta y un pico base de 169 (espectro 5).

7

Espectro 5. Espectro masas del O-glucósido fenilazonaftólico 12. El siguiente paso consistió en la desprotección de los grupos acetato del intermediario 12 para lo cual se emplearon las condiciones estándar de metóxido de sodio en metanol para generar el O-glicosido 13 (espectro 6) el cual fue evaluado como sustrato para evaluar actividad enzimática de β-glucosidasa..

Espectro 6. Espectro de 13C RMN de O-glicósido desprotegido 13a. La evaluación de actividad enzimática se llevo por incubación de la muestra conteniendo 1 ml de buffer 50 mM de acetatos a pH 5.0, 1 ml de metanol, el O-glicósido fenilazonaftólico 13 (4 mg, 9.3 x 10-3 mM) y glicosidasa (Sigma Co.) (2 mg, 2.1 u/mg) a 37oC durante 3h. La reacción se detuvo por calentamiento seguido por extracción con cloroformo y evaporación a presión disminuida. La muestra y el control (O-glicósido 13 sin enzima) fueron disueltos en 2 ml de metanol y se determino su espectro de ultravioleta en el rango de 200-600 nm.

8

El espectro obtenido mostró dos bandas con máximos en 400 y 454 nm asignables al colorante liberado por efecto de la glucosidasa.

Bibliografía 1.- Esen, A., β-glucuronidase: Biochemistry and Molecular Biology, Am Chem. Soc, 1993. 2.- Brito Arias, M.A., Introducción a la Química de los Glicósidos, ed. IPN, 1999, 100. 3.- Claeyssens M., van Tilbeurgh, H., Tomme, P., Wood, T., McRae, S., Biochem, J., 1989, 819, 261. 4.- Jeffreson, R., Burgues, S.M., Hirsch, D., Proc. Nat. Acad. Sci., 1986, 8447, 83. 5.- Terryn, N., Brito-Arias, M.A., Engler, G., Tiré, C., Villarroel, N., Van Montagu, M., and Inzé, D., The Plant Cell, 1993, 5, 1761. 6.- Van der Eycken, E., Terryn, N., Goemans, J.L., Carlens, G., Nerinckx, W., Claeyssens, M., Van der Eycken, J., Van Montagu, M., Brito-Arias, M.A., Engler, G., Plant Cell Reports, 2000, 19, 966. 7.- Redemann and Niemann, Org. Synth. Coll. vol. III, 1955, 11. 8.- Igarashi, K., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1977, 243, 34. Impacto El desarrollo del presente proyecto ha permitido obtener O-glicósidos unidos a colorantes fenilazonaftólicos a través de una estrategia novedosa consistente en generar el colorante in situ a partir de un precursor glicosídico mas simple bajo condiciones débilmente ácidas que no provocan la ruptura del enlace O-glicosídico. El O-glucósido obtenido ha sido además evaluado satisfactoriamente como detector de actividad enzimática de β-glucosidasa por lo que se considera como un sustrato alternativo para detectar actividad enzimática que se puede extender a otros azúcares que le confieren la especifcidad a la enzima. De estos resultados se ha preparado el manuscrito que se anexa a continuación y sometido para su publicación en la revista especializada Journal of Carbohydrate Chemistry.

9

Synthesis of Phenylazonaphtol-β-D-O-Glucoside Under Non aqueous Diazonium Salt

Conditions. A Comparative Analysis.

M. Brito-Arias,* D. Cruz-Salazar

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologia, Instituto Politécnico Nacional

Av Acueducto s/n Barriola Laguna Ticomán 07340 México DF.

mbrito@acei.upibi.ipn.mx

Keywords: Glycoside; enzyme activity; phenylazonaphtol dye; glucosidase.

ABSTRACT

Phenylazonaphtol-β-D-O-glucoside 4 was prepared starting from p-nitrophenyl glucoside 1

which was subjected to hydrogenolysis providing the p-aminophenyl glucoside 2. Further

condensation with 2-naphtol under non aqueous diazonium salt conditions afforded

phenylazonaphtol-β-D-O-glucoside 3, which was deprotected providing the target

glucoside 4. The resulting glucoside was assayed as substrate for detection of β-glycosidase

activity and its hydrolitic activity determined through the UV absorption of the released

chromophore.

INTRODUCTION

β-Glycosidases are hydrolytic enzymes involved in a number of important processes such

as defense mechanism, growth regulation (Esen; 1993), and as gene markers in transgenic

plants. (Jefferson, 1987) The most commonly used substrates for the histochemical

localization of β-glycosidases contains the 5-bromo-4-chloro-3-indolyl chomophore

attached to most of the known monosaccharides through an O-glycosidic bond (Manafi,

10

1991). After enzymatic hydrolysis, the water soluble indoxyl intermediate must undergo an

oxidative dimerisation to produce a blue precipitate. However before dimerisation occurs to

produce the indigo dye, some diffusion takes place producing false positives at some

regions in cells lacking enzymatic activity (Lodja, 1970). In order to avoid these artifacts it

has been synthetically prepared and tested in transgenic plants containing the β-

glucuronidase activity alternative substrates containing phenylazonaphtols of the Sudan

type as β-glucuronides (Terryn, 1993; Van der Eycken, 2000) By comparing the

commercially available glycosidic indoxyl substrates with the alternative phenylazonaphtol

glucuronides, it was observed a precise histochemical localization with no detectable

diffusion for the phenylazonaphtol glycoside. Despite these promising results, the

condensation of phenylazonaphtol dyes of the Sudan family with glycosyl donors under

different promoter conditions has resulted in poor yields (Van der Eycken, 2000). In this

report we describe a procedure based on the in situ formation of the phenyl azonaphtol

glucoside starting from p-nitrophenyl glucoside under non aqueous conditions. The

resulting phenyl azo naphtol glycoside 4 was tested as substrates for detection of enzymatic

activity of β-glucosidase, and its sensitivity evaluated by using UV spectroscopy.

RESULTS AND DISCUSSION

Based on the experimental evidence indicating the low yields in direct coupling reaction

between phenyazonaphtol of the sudan series with glycosyl donors under different

promoter conditions (Van der Eycken, 2000), an alternative strategy consisting in the

diazonium salts formation on the p-aminophenyl glucoside and condensation with 2-

11

naphtol under milder conditions to those employed for typical diazonium salt formation

was explored, being the standard protocol the use of .3M hydrochloric acid which is not

compatible with the stability of the glycosidic linkage (Robyt, 1998).

Thus the sequence begins with the preparation of p-nitropheny glucopyranoside tetraacetate

by coupling reaction of the p-nitrophenyl sodium salt with acetobromoglucose in water-

acetone to furnish the corresponding glucoside 1. This intermediate was treated with

palladium on carbon and then hydrogenated to produce the amino glycoside intermediate 2

in quantitative yield. Further treatment of glycoside 2 with sodium nitrite-acetic acid in

THF at 0oC produced the diazonium salts which was condensed in situ with 2-naphtol in

the sodium salt form to yield the corresponding phenylazonaphtol tetracetyl

glucopyranoside 3. Final removal of the acetate protecting groups provided the final

product 4 as a reddish solid.

We have attempted also the direct coupling reaction between the phenylazonaphtol dye 5

with acetobromoglucose, to produce glycoside 3 (Scheme). By following this procedure we

have observed the formation of the protected glycoside 3 at lower yield compared to the in

situ phenylazonaphtol formation, probably due the azo-hydrazone tautomerism that occurs

on these ring systems (Lyčka, 1993).

The deprotected glycoside 4 was tested as substrate for detection of glycosidase activity

using commercial almonds glycosidase. Thus, the hydrolytic activity will result in the

cleavage of the glycosidic linkage, releasing the phenylazonaphtol chromophore, which is

observed as intense redish color with strong absorption at 410 and 455 nm. (figure).

12

EXPERIMENTAL SECTION

General. All the reagents were purchased from Aldrich Chemical company except

HBr/acetic acid purchased from Fluka Chemical Company. Column chromatography was

performed on silica gel 70-230 mesh and thin-layer chromatography on Kieselgel, both

from Merck company, using as detection system a cerium sulfate solution followed by

heating on hot plate. IR spectra were obtained o Perkin-Elmer spectrometer; NMR spectra

were recorder on Varian 300 MHz spectrometer. MS spectra were obtained a Hewlett-

Packard 5989A. Optical rotations were measured with a Perkin-Elmer 341 polarimeter at

23oC. Enzyme Glycosidase from Almonds was purchased from Sigma Chemical Company.

p-Nitrophenyl tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (1).

p-Nitrophenol (1.69 g, 12.1 mmmol) was dissolved in sodium hydroxide solution (115 mg

,12.1 mmol of NaOH in 25 ml of water) and stirred during 10 minutes at room temperature.

A solution of acetobromoglucose (5 g, 12.1 mmol) in 30 ml of acetone was added and the

reaction kept with stirring at room temperature during 6 h. The acetone was removed on

rotavapor at bath temperature below 30o. On standing at 0o the solid product is filtered and

recrystallized from 95% ethanol to yield 1 (2.85 g, 50%) as pale yellow solid. m.p. 172o,

[α]D -54o (c 0.95, CHCl3).; 1H NMR (CDCl3) δ 2.01-2.10 (4 s, 12 H), 3.95 (m, 1H), 4.20

(dd, 1H), 4.26 (dd, 1H), 5.15-5.34 (m, 4H), 7.07 (d, 2H, J = 9.3 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 9.3

Hz). 13C NMR (CDCl3) δ 20.78, 61.99, 68.15, 71.08, 72.57, 77.68, 98.19, 116.80, 126.02,

143.42, 161.36, 170.71.

13

p-Aminophenyl Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (2).

Compound 1 (2g, 4.2 mmol) was dissolved in 20 ml of EtOH-EtOAc (1:1) and after

addition of 150 mg of Pd-C 10%, the reaction was stirred at room temperature under

hydrogen atmosphere during 10 h. The reaction was filtered and concentrated under vacuo

to gave 2 (1.8 g, quant.) as yellow oil. m.p. 172o, [α]D -16o (c 1.1, CHCl3).; 1H NMR

(CDCl3) δ 2.01-2.10 (4 s, 12 H), 3.95 (m, 1H), 4.20 (dd, 1H), 4.26 (dd, 1H), 5.15-5.34 (m,

4H), 6.62 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 6.81 (d, 2H, J = 7.5 Hz). 13C NMR (CDCl3) δ 20.78, 61.99,

68.15, 71.08, 72.57, 77.68, 98.19, 116.13, 119.16, 142.76, 150.02, 170.71.

1-[(4-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyloxy phenyl) azo]-2-naphtol (3).

Compound 2 (0.543 g, 1.23 mmol) was dissolved in 8 ml of THF and the flask cooled at

0oC. After addition of sodium nitrite (85 mg, 1.23 mmol) and 0.3 ml of acetic acid the

reaction was kept under ice-bath temperature with stirring during 15 min. Another flask

containing 2-naphtol sodium salt dissolved in 8 ml of THF was added dropwise, and the

reaction maintained at 0oC with stirring during further 30 minutes. The solvent was

removed under vacuo, diluted with chloroform (30 ml) and washed with cold 2N NaOH

solution (3x15 ml), and water (20 ml). The organic phase was dried over anhydrous sodium

sulfate and evaporated on rotavapor. The crude was purified by column chromatography

with AcOEt:hexane (1:3) to gave an orange-red solid (325 mg, 30%). m.p. 81-83o, [α]D -

13.1o (c 0.6, CHCl3), IR (thin film) 1738 cm-1, 1H NMR (CDCl3) δ 2.09-2.12 ( 4s, 12 H),

3.85 (m, 1H-5), 4.08 (dd, 1H-6), 4.32 (dd, 1H-6’), 5.10 (t, 1H-2), 5.31 (t, 1H-4), 5.41 (t,

1H-3), 5.70 (d, 1H-1, J = 8.4 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.10 (d, 2H), 7.41 (t, 1H), 7.57

(t, 1H), 7.66 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.79 (d, 2H), 8.62 (d, 1H). 13C NMR (CDCl3) δ 20.93

(CH3-CO), 61.66 (C-5),67.90 (C-4), 68.38 (C-6), 70.39 (C-3), 72.99 (C-2), 91.90 (C-1),

14

118.3 (C-2’), 121.4 (C-8), 124.5 (C-3), 125.4 (C-6), 127.7 (C-4ª), 128.3 (C-5), 128.5 (C-7),

129.2 (C-3’), 129.7 (C-1 naphtyl), 133.3 (C-8ª), 139.6 (C-4), 144.4 (C-1’ phenyl), 157.8 (C-

4’), 171.0 (C=O), 171.6 (C-2). MS (EI) m/z 594.18 [M+], 169 (100), 264 (62).

1-[(4-β-D-glucopyranosyloxy phenyl) azo]-2-naphtol (4).

To protected phenylazonaphtol glycoside 3 (0.3 g, 0.504 mmol) were added 5 ml of 10 %

NaOMe in MeOH and stirred a room temperature during 2 h. The solvent was removed

under vacuo and diluted with CH2Cl2 (15 ml), and washed once with water (15 ml). The

organic phase was dried over Na2SO4 and concentrated to give 0.193 g, 90% of a red solid.

m.p. 177-178o, [α]D -23.4o (c 0.9, MeOH), 1H NMR (DMSO d-6) δ 2.94 (dd, 1H-2), 3.14

(t, 1H-4), 3.17 (t, 1H-3), 3.27 (m, 1H-5), 3.45 (dd, 1H-6), 3.64 (dd, 1H-6’), 4.99 (d, 1H-1, J

= 7.5 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.10 (d, 2H), 7.41 (t, 1H), 7.57 (t, 1H), 7.66 (d, 1H),

7.78 (d, 2H), 8.62 (d, 1H) 13C NMR (CDCl3) δ 20.93 (CH3-CO), 61.66 (C-5),67.90 (C-4),

68.38 (C-6), 70.39 (C-3), 72.99 (C-2), 91.90 (C-1), 118.3 (C-2’), 121.4 (C-8), 124.5 (C-3),

125.4 (C-6), 127.7 (C-4ª), 128.3 (C-5), 128.5 (C-7), 129.2 (C-3’), 129.7 (C-1 naphtyl),

133.3 (C-8ª), 139.6 (C-4), 144.4 (C-1’ phenyl), 157.8 (C-4’) 171.6 (C-2).

Anal. Calcd for C22H22N2O7 : C, 30.98; H, 2.60; N, 3.28. Found: C, 30.74, H, 2.41; N, 3.20.

Enzyme reaction.- β-glucosidase (2 mg; 2.1 u/mg) was incubated with glycoside 4 (4 mg;

9.3 x 10-3 mM) in a mixture of 50 mM acetate buffer pH 5.0 (0.5 ml) and methanol (0.5 ml)

at 37oC during 3 hours. The reaction was stopped by heating followed by addition of CHCl3

and evaporation under diminushed pressure. The absorption spectra of the released

phenylazonaphtol dye was obtained in 2 ml of methanol.

15

ACKNOWLEDGEMENTS

We wish to thank COFAA-IPN for scholarship and CGPI-IPN for final support. We also

want to thank Dr. Carlos Cerda Garcia-Rojas for MS and optical rotation determinations.

REFERENCES

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sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 1987, 6, 3901-3907.

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16

Scheme

O

OR

RORO

OR

O

NO2

O

OR

RORO

OR

O

NH2

i

ONa

ii

1; R = Ac 2; R = Ac

3; R = Ac4; R = Hiii

ONa

N

NO

iv

5O

OAc

AcOAcO

OAcBr

H

O

OR

RORO

OR

O

N

NO

H

i) H2, Pd-C 10%, EtOH. ii) NaNO2-AcOH,THF. iii) NaOMe-MeOH. iv) Acetona-H2O

17

Figure 1. Absorption spectra: (1) Substrate 4 incubated without enzyme. (2) Substrate 4

incubated with glycosidase.

(1) (2)

(1) Substrate 4 incubated without enzyme. (2) Substrate 4 incubated with almonds β-

glycosidase.