ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Informes de Práctica: Hemo-Histoparástitos

ASIGNATURA :

Microbiología Clínica

DOCENTE :

Mblga. M. Teresa Silva García

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2008 - I

Lambayeque, 20 de setiembre de 2008.

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE HEMO-HISTOPARASITOSIS

PRÁCTICA Nº 08: DIAGNÓSTICO DE HEMOPARASITOS

1. OBJETIVO:

Se pretende que el estudiante adquiera destreza en la aplicación de técnicas para el diagnóstico de formas parásitos en sangre y reconozca las características morfológicas de Plasmodium y Trypanosoma.

2. MATERIAL:

Muestra: Sangre (por punción de pulpejo de dedo).

Láminas con extensiones de sangre (gota gruesa).

Láminas preparadas con montajes de diferentes estadios de Plasmodium y Tripanosoma.

Láminas portaobjeto, láminas cubreobjeto.

Metanol, alcohol.

Colorante Giemsa.

Lancetas, algodón.

3. PROCEDIMIENTO:

Tomar una muestra de sangre capilar del dedo de la mano por punción con una lanceta.

Realizar examen en fresco, frotis y gota gruesa.

Realizar observaciones microscópicas de trofozoitos, esquizontes y gametocitos de Plasmodium vivax y P. falciparum y establecer sus diferencias.

Realizar observaciones microscópicas de Trypanosoma. Esquematizar y discutir sus resultados.

TÉCNICA DE GOTA GRUESA:

Esta técnica permite concentrar parásitos.

Colocar 2 a 3 gotas de sangre capilar sobre la superficie de una lámina limpia, empleando la esquina de otra lámina extender la muestra realizando movimientos circulares y concéntricos de modo que la sangre se distribuya uniformemente (1 cm de diámetro)

Colocar la lámina en posición horizontal y dejar secar a temperatura ambiente.

Cubrir la muestra con solución de Giemsa diluida (1/10) y dejar actuar el colorante por 10 a 30 minutos.

Eliminar el exceso de colorante y lavar la lámina con un chorro de agua, cuidando de no desprender la muestra.

Dejar secar en posición vertical.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA:

Para el caso de Trypanosoma debe observarse toda la lámina al microscopio.

Para el caso de malaria una lámina se reporta como negativa sólo después de observar 100 campos sin haber encontrado parásitos.

Cuando la lámina es positiva se informa de acuerdo a la densidad parasitaria:

+/2 = De 40 a 60 parásitos en 100 campos.

+ = 1 parásito por campo en 100 campos.

++ = 3 a 20 parásitos por campo en 100 campos.

+++ =21 a 200 parásitos por campo en 100 campos.

++++ =Más de 200 parásitos por campo en 100 campos.

OTRAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE HEMOPARÁSITOS:

Técnicas Serológicas (ELISA, Inmunofluorescencia, etc.)

Microconcentración.

Hemocultivo.

Xenodiagnóstico.

Método de Concentración de Strout:

Se saca sangre sin anticoagulante.

Se deja coagular.

Se saca el coágulo.

Se centrifuga el sobrenadante.

Se hace observación microscópica del botón sanguíneo (sedimento) que queda después de la centrifugación.

4. RESULTADOS (observaciones):

Trofozoitos en forma de anillo de P. falciparum

Trofozoitos ameboide de P. vivax

Trofozoitos anular de P. vivax

Diferentes morfologías de P. falciparum

Características de invasión eritrógena de P. falciparum: Los glóbulos rojos NO están agrandados. Los anillos son delicados y puede haber más de uno por célula. Algunos anillos pueden tener dos núcleos. No es común ver formas maduras en los extendidos de sangre. Los gametocitos tienen forma característica de luna en cuarto creciente. Los

gametocitos no aparecen en sangre durante las primeras 4 semanas de infección.

Diferentes estructuras morfológicas en el ciclo biológico de Plasmodium sp.

Características diferenciales de las especies más importantes del género Plasmodium

5. REFERENCIAS:

- Láminas sobre malaria. 2007. Portales médicos. Obtenido el 17 de setiembre de 2008 en www.portalesmedicos.com/.../447/1/Paludismo.html

- Atias, A. 1996. Parasitología Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Santiago de Chile.

- Imágenes Plasmodium. 2007. obtenido el 17 de setiembre de 2008 en http://medicinaucv.blogspot.com/2008/06/parasitologa-prctica-n-10-plasmodium.html

PRACTICA N° 09: DIAGNÓSTICO DE HISTOPARASITOS

1. OBJETIVO

- Se pretende que el estudiante reconozca formas parasitas en tejidos.

2. MATERIAL

- Láminas preparadas con montajes permanentes de Leishmania, Trichomonas y otros Histoparasitos.

- Láminas portaobjeto, laminillas.

- Microscopio, Estereoscopio.

3. PROCEDIMIENTO:

- Realizar observaciones microscópicas dadas es practicas.

- Describir y diferenciar lo antes visto.

Dx de Leishmaniosis:

- Una forma de realizarla es mediante examen directo.

- Se realizará un raspado (frotis) de los bordes de la lesión.

- La muestra recogida será coloreada con Giemsa.

- También se puede realizar cultivos de las estructuras parasitarias.

- Para esto se utilizará un medio bifásico, en este caso el más usado es el medio 3N (triple N), que contiene en su formulación sangre.

- El Dx indirecto de leishmaniosis se hará a través de la intra-dermo-reacción de Montenegro, en la que se inocula al paciente sospechoso 0.1 mL de Ag Leishmania.

- Esta prueba es positiva cuando la pápula que se forme sea mayor a 5 mm.

Dx Trichomoniosis:

- La muestra a utilizar puede ser secreción vaginal (o prostática en el caso del varón) o el sedimento de orina.

- Mayormente la prueba se realizará en mujeres, ya que son en esta en donde se aprecia de manera mas notoria los síntomas.

- Se realizará centrifugación y examen directo en fresco de la muestra.

- También se puede llevar a cabo cultivos de Tricomonas, para lo cual se utilizará un medio semisólido.

- Este se incubará a 37 ºC por 24 a 48 h.

- El cultivo duplica la posibilidad de encontrar Trichomonas en la muestra.

Dx de Toxoplasmosis:

- En la actualidad el dx de Toxoplasmosis se realizá totalmente por medios serológicos.

- Se realiza de manera rutinaria una prueba de ELISA para detectar Ig G en neonatos e Ig M en infecciones agudas.

- Esta se puede llevar a cabo también de manera cuantitativa.

Dx de Paragonimiosis y Fasciolosis:

- En el caso de la Paragonimiosis se podrá realizar examen tanto de esputo como de heces.

- Se buscarán los huevos del parásito

- En el caso de la Fasciolosis se buscará sus huevos en muestras frescas de heces.

- Para ambas enfermedades parasitarias existe actualmente pruebas de diagnóstico a base de ELISA y Western Blot, mucho mas rápidas y sensibles.

Dx de Hidatidosis:

- Hace poco tiempo se utilizaba la prueba del Arco 5.

- En la actualidad se utilizan pruebas sexológicas para su detección.

4. RESULTADOS (observaciones):

Trofozoitos de Tricomonas vaginalis

Promastigote de Leishmania sp.

Amastigote de Leishmania sp.

Tripomastigote de Trypanosoma cruzi.

5. REFERENCIAS:

- Atias, A. 1996. Parasitología Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Santiago de Chile.

- Imágenes Varios: Practicas Parasitologia Medica. Universidad San Martín de Porres. Obtenido el 17 de setiembre de 2008 en http://usmp.net46.net/parasitologia.html

PRACTICA N° 10 PRUEBAS INMUNOLÓGICAS EN ELDIAGNÓSTICO DE PARASITOSIS

(Prueba de Western Blot)

1. OBJETIVO:

Se pretende que el estudiante conozca y aplique la técnica de Western Blot. En esta práctica se utilizará el kit "cistiblot" que permite detectar anticuerpos específicos de tipo IgG en suero o en líquido cefaloraquideo de personas con cisticercosis utilizando la técnica de electroinmunotransferencia o Western blot.

Los antígenos de excreción / secreción de la larva de Taenia solium (cisticercus cellulosae) obtenidos en cultivo, son separados en geles de poliacrilamina y luego transferidos a papel de nitrocelulosa.

La lámina de nitrocelulosa con las bandas antigénicas de 43,34,32,26,24,19,16,14 y 12 KDa son cortadas en tiras de 3 mm de ancho, de tal manera que cada una contenga las bandas antes mencionadas, las cuales se harán evidentes por la realización de una prueba inmunoenzimática.

2. MATERIAL

- Suero sanguíneo

- Placas de incubación

- Pipetas, micropipetas

- Componentes del kit "cistiblot"

- Tiras de nitrocelulosa con antígenos de larva T. solium.

- Solución de larvado

- Bloqueador en polvo

- Solución detergente.

- Conjugado enzimático concentrado.

- Sustrato A.

- Sustrato B.

- Buffer de Dilución.

3. PROCEDIMIENTO

- Preparar los reactivos según indicaciones.

- Colocar 0.5 ml de solución de trabajo en cada canal de la placa de incubación.

- Colocar las tiras de nitrocelulosa en la placa de incubación, agitar 3 minutos y dejar reposar por 15 minutos.

- Eliminar el líquido de los canales.

- Colocar 0.5 ml de la dilución del control positivo en el canal 1, 0.5 ml de la dilución del control negativo en el canal 2, 0.5 ml de la dilución de cada suero problema en los canales correspondientes.

- Incubar a temperatura ambiente por 1 hora (en agitación) o agitar manualmente por periodo de 3 minutos cada 20 minutos.

- Eliminar los sueros.

- Añadir 0.5 ml de solución de trabajo en cada canal, agitar manualmente durante 3 minutos y eliminar.

- Repetir 2 veces el paso anterior.

- Colocar 0.5 ml de conjugado enzimático e incubar por 1 hora (en agitación).

- Eliminar el conjugado y lavar las tiras con 0.5 ml de solución de trabajo.

- Añadir 0.5 ml de solución de lavado a cada canal y agitar por 5 minutos.

- Repetir este procedimiento y eliminar el líquido.

- Agregar 0.5 ml de sustrato a cada canal y agitar hasta visualizar las bandas inmunorreactivas del suero control positivo.

- Detener la reacción a los 10 minutos eliminando el sustrato en un depósito con lejía y agregando 0.5 ml de agua destilada a cada canal.

- Lavar con agua destilada por 4 veces más.

- Transferir las tiras a un papel absorbente usando pinzas.

- Esperar que sequen al ambiente e interpretar los resultados

4. RESULTADOS (observaciones):

Materiles utilizados Prepararasion sol. Buffer

Procedimientos realizados parqa el corrido de los sueros

Patrón positivo para la prueba realizada

Quistes y forma adulta de Taenia solium

5. REFERENCIAS:

- Atias, A. 1996. Parasitología Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo.

Santiago de Chile.

PRACTICA N° 11: ARTROPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICAARTROPODOS PARASITOS

1. OBJETIVO:

- Se pretende que el estudiante reconozca los artrópodos de importancia médica y aplique algunas de las técnicas para su diagnóstico.

2. MATERIAL:

- Muestras de pestañas y/o forúnculos para determinación de Demodex.

- Muestras con montajes permanentes de artrópodos: Clase: Arachnida (arañas, escorpiones, acaros) Clase: Insecta: (piojos, pulgas, chinches, garrapatas moscas productoras de miasis).

- Hidróxido de potasio

- Solución salina fisiológica

- Láminas portaobjeto

- Láminas cubreobjetos

- Microscopio, Estereoscopio.

3. PROCEDIMIENTO:

- Tomar una muestra de pestaña, o forúnculo, colocarla sobre una lámina portaobjeto, con una gota de KOH y/o S.S.F., cubrirla con una laminilla y hacer una observación en fresco en busca de Demodex folliculorum.

- Observar, identificar y reconocer los caracteres morfológicos de los artrópodos presentados en la clase práctica.

- Realizar los esquemas correspondientes.

4. RESULTADOS (observaciones):

Sarcoptes hominis

Larva de Dermatobia hominis

5. REFERENCIAS:

- Atias, A. 1996. Parasitología Médica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo. Santiago de Chile.

- Salazar O., D. 2006. Ectoparásitos. Proyecto Hidroeléctrico Pirrís-ICE. Medicina Vida y Salud. Año V. Volumen 8. Setiembre 2006. pp 19 – 21. Obtenido el 10 de setiembre de 2008 en http://www.medicos.sa.cr/web/images/revista/medicina%20setiembre%202006.pdf

PRACTICA N° 12: ARTROPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA

ARTROPODOS VECTORES

1.OBJETIVO

- Se pretende que el estudiante reconozca las características morfológicas de los artrópodos vectores de importancia médica.

2. MATERIAL:

- Muestras con montajes permanentes de diferentes estadios (Huevos, larvas, pupas adultos) de artrópodos vectores

- Hidróxido de potasio

- Solución salina fisiológica

- Láminas portaobjeto

- Láminas cubreobjetos

- Microscopio, Estereoscopio.

3. PROCEDIMIENTO:

- Observar, identificar y reconocer los caracteres morfológicos de los artrópodos presentados en la clase práctica: Aedes, Anopheles, Lutzomyia, Triatoma, Panstrongylus, Rhodnius

- Realizar los esquemas correspondientes.

4. RESULTADOS (observaciones):

D E

AsB : ANOPHELES (macho, hembra)

C, D : AEDES (macho, hembra}

E, F : CULEX (macho, hembra)

Lutzomyia (adulto) Triatoma (adulto)

Pupa de Aedes

Huevo de Anopheles Hueov de Aedes

Anopheles Lutzomyia

Aedes aegypti