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182-PPatrycja Anna Puchalska DOI: 10.3252/pso.es.seaic2015.2015

Inmunología

Se obtiene un rendimiento en la extracción del 0,73%. El perfil proteico del polen de encina muestra 7 proteínas predominantes, en un rango de 9 a 100 kDa. En el Western blot utilizando el pool de pacientes, se observan 13 proteínas que unen IgE y, al analizarlo de manera individual, 9 de ellas son reconocidas por más del 50% de los pacientes. Con el fin de identificar aquellas proteínas que eran reconocidas por la mayoría de los pacientes, se separan las proteínas del extracto en un SDS-PAGE. El perfil proteico se divide en 10 secciones con el fin de aumentar el rango dinámico del análisis, y se analizan por espectrometría de masas (LC-MS/MS). Se identifican un gran número de proteínas, muchas de las cuales han sido descritas como alérgenos en otras especies. También se realiza un análisis proteómico del extracto completo de Q. ilex (LC-MS/MS) identificándose 213 proteínas, frente a las 40 registradas en Uniprot. Finalmente, los ELISAs de competición realizados entre Q. ilex, B. verrucosa, P. pratense y O. europaea muestran una inhibición moderada indicando un posible fenómeno de reactividad cruzada (Figura 7), lo cual concuerda con los resultados proteómicos, donde se han identificado proteínas alergénicas comunes (Figura 8).

La encina (Quercus ilex) está ampliamente distribuida en la Península Ibérica (Figura 1) y constituye la especie más representativa de los bosques españoles. Pertenece al orden fagales, que incluye diferentes especies alergénicas, como Betula verrucosa, entre otras (Tabla 1) y múltiples alérgenos descritos (Tabla 2). A pesar de la abundancia del polen de encina, está poco estudiado a nivel proteico y no hay alérgenos descritos (www. allergen.org), posiblemente a su escasa alergenicidad (3.5-21% entre pacientes atópicos). Por otro lado, los pacientes con pruebas cutáneas positivas a Q. ilex suelen estar polisensibilizados, lo que dificulta su diagnóstico. Sin embargo, hay estudios que afirman que en los últimos años se ha producido un aumento del número de pacientes alérgicos a este polen. Tampoco existen datos concluyentes acerca de su reactividad cruzada con otras especies alérgicamente relevantes, como la gramínea P. pratense o árboles como Olea europaea y B. verrucosa. El objetivo de este estudio fue detectar e identificar y caracterizar los alérgenos presentes en el polen de encina Q. ilex y estudiar si está implicada en procesos de reactividad cruzada con otras especies relevantes.

Identificación y caracterización de alérgenos del polen de Quercus ilex. Estudio de reactividad cruzada

Se prepara un extracto proteico de polen de encina y se caracteriza mediante análisis de carbohidratos (Figura 2), aminoácidos (Figura 3), SDS-PAGE y Western blot (Figura 4). Además, se seleccionan 65 sueros de pacientes procedentes de Cáceres, con diagnóstico de sensibilización a Q. ilex (por ELISA) para un pool (Figura 5) y 16 de ellos para realizar inmunodetecciones individualmente (Figura 6). Se identifican mediante análisis proteómico las proteínas presentes en esta especie, así como en P. pratense, O. europaea y B. verrucosa, con el fin de caracterizar el contenido del extracto de Q. ilex e identificar proteínas comunes que pudieran estar implicadas en procesos de reactividad cruzada, para lo cual se realizan también ELISAs de competición.

1. Las proteínas del polen de encina son capaces de unir IgE.

2. En el extracto de polen de Q. ilex existen proteínas descritas como alérgenos en otras fuentes.

3. Los resultados obtenidos sugieren una reactividad cruzada moderada de Q. ilex con B. verrucosa, P. pratense y O. europaea.

Puchalska P1, Cases B1, Hernández-Arbeiza J2, García MC3, Marina ML3, Fernández-Caldas E1

1 Departamento de Investigación y Desarrollo, Inmunotek s.l., Alcalá de Henares, Madrid

2 Departamento de Alergia, San Pedro de Alcántara Hospital, Cáceres 3 Departamento de Química Analítica, Facultad de Químicas, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid

1. Cosmes Martín P, Moreno Ancillo A, Domínguez Noche C, Gutierrez Vivas A, Belmonte Soler J, Roure Nolla J. Sensitization to Castanea sativa pollen and pollinosis in northern Extremadura (spain). Allergol Immunopathol. 2005;33(03):145-150. 2. Prados M, Aragon R, Carranco MI, Martinez A, Martinez J. Assessment of sensitization to holm oak (Quercus ilex) pollen in the Mérida area (Spain). Allergy. 1995;50(5):456-459. 3. Subiza E, Subiza F, Jerez M. Palinología. SEA, E.I.C. ed. Tratado de Alergología e Inmunología Clínica. 1987;IV:211-343. 4. Rodríguez-de la Cruz D, Sánchez-Reyes E, Dávila-González I, Lorente-Toledano F, Sánchez-Sánchez J. Airborne pollen calendar of Salamanca, Spain, 2000-2007. Allergol Immunopathol (Madr). 2010 Nov-Dec;38(6):307-12

Tabla 1. Familias incluidas en el orden Fagales y los géneros que incluyen proteínas alergénicas descritas (www.uniprot.org, www.allergen.org).

ANTECEDENTES

MÉTODOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS Conflictos de interés: Inmunotek S.L produce extractos alergénicos para diagnóstico y tratamiento, con fines comerciales.

Orden Familia Género Especie

Fagales

Betulaceae

Alnus A. glutinosa Betula B. verrucosa

Carpinus C. betulus Corylus C. avellana Ostrya O. carpinifolia

Juglandaceae Carya C. illinoinensis

Juglans J.nigra, J. regia

Fagaceae Castanea C. sativa

Fagus F. sylvatica Quercus Q. alba

Nothofagaceae Myricaceae

Rhoipteleaceae Ticodendraceae Casuarinaceae

Quercus ilex

Figura 3. Análisis de aminoácidos (Biochrom 30).

Tabla 2. Alérgenos descritos en las especies del orden Fagales (www.allergen.org).

Contenido de carbohidratos: 385,46 ug/mL

Figura 2. Análisis de carbohidratos neutros del extracto de Q. ilex.

MW Q. ilex C- MW Q. ilex C- A) B)

Figura 4. SDS-PAGE (A) y Western blot (B) en condiciones reductoras del extracto de Q. ilex. (C-)- control negativo

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

2 4 8 16 32 64 128

OD

Dilución del pool de Q.ilex

Figura 5. Análisis de titulación IgE del pool de sueros de pacientes positivos a Q. ilex.

Identificados comunes en Q. ilex y P. pratense: tr|A0A078J598|A0A078J598_BRANA tr|A0A078ESL0|A0A078ESL0_BRANA tr|A0A067EBQ5|A0A067EBQ5_CITSI tr|A0A067GDN1|A0A067GDN1_CITSI tr|A0A067E3B2|A0A067E3B2_CITSI tr|D7L3Y1|D7L3Y1_ARALL tr|A2Y7R4|A2Y7R4_ORYSI tr|A0A078GG36|A0A078GG36_BRANA tr|A0A067DZE8|A0A067DZE8_CITSI tr|I1HPX4|I1HPX4_BRADI tr|A0A078J1N2|A0A078J1N2_BRANA tr|A0A087H0R1|A0A087H0R1_ARAAL tr|D7KKF5|D7KKF5_ARALL tr|A0A078GMM3|A0A078GMM3_BRANA tr|A0A087H9P9|A0A087H9P9_ARAAL tr|A0A078GLG4|A0A078GLG4_BRANA tr|A0A067DZT7|A0A067DZT7_CITSI

Identificados comunes en Q. ilex y O. europaea: tr|D7M0R1|D7M0R1_ARALL tr|E4MXU5|E4MXU5_THEHA tr|C7EXG9|C7EXG9_MORAL tr|A0A078IDX6|A0A078IDX6_BRANA tr|D7LFI7|D7LFI7_ARALL tr|P93135|P93135_FRAAN tr|H9ME29|H9ME29_PINRA tr|K7P491|K7P491_ABIAL tr|H9ME30|H9ME30_PINRA tr|A5HLY2|A5HLY2_ALOVR tr|D5JWS8|D5JWS8_TRAPR tr|F8SVM5|F8SVM5_VANPL tr|D3JW72|D3JW72_WOLAR tr|S4WDN9|S4WDN9_9ASPA tr|S4WIS9|S4WIS9_9ASPA tr|S4WCH9|S4WCH9_9ASPA tr|D5LGD6|D5LGD6_9ASTR tr|I2AWM7|I2AWM7_SESIN tr|Q9M5X0|Q9M5X0_EUPES tr|D7KM49|D7KM49_ARALL tr|D7M2I4|D7M2I4_ARALL tr|D7KRF5|D7KRF5_ARALL

Identificados comunes en Q. ilex y B. verrucosa: tr|A0A067GPS1|A0A067GPS1_CITSI tr|A0A087GRD5|A0A087GRD5_ARAAL tr|A0A087H058|A0A087H058_ARAAL

Figura 8. Diagrama de Venn de las proteínas comunes identificados en los extractos de Q. ilex, B. verrucosa, P. pratense y O. europaea.

A)

B)

Figura 1. Distribución de la encina en España (http://gurb-gurb.blogspot.com.es) y periodo de polinización en Cáceres de la encina, olivo, gramíneas y abedul (www.polenes.org ).

Alérgeno Nombre MW (SDS-PAGE) Alnus glutinosa (Aliso)

Aln g 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1 18 kDa Aln g 4 Polcalcina 6-7 kDa

Betula verrucosa (Betula pendula) (Abedul)

Bet v 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1 17 kDa Bet v 2 Profilina 15 kDa Bet v 3 Polcalcin-like protein (4 EF-hand) 24 kDa Bet v 4 Polcalcina 7-8 kDa Bet v 6 Isoflavona reductasa 35 kDa Bet v 7 Ciclofilina 18 kDa

Carpinus betulus (Carpe) Car b 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1 17 kDa

Carya illinoinensis (Pecan) Car i 1 Albúmina 2S 16 kDa

Car i 4 Legumina Subunidad de proteína hexamérica: 55,4 kDa

Castanea sativa (Castaño) Cas s 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1 22 kDa Cas s 5 Quitinasa Cas s 8 nsLTP1 12-13 kDa (no red)

Cas s 9 Pequeña proteína de choque térmico de clase I, citosólica 17 kDa

Corylus avellana (Avellano) Cor a 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1 17 kDa Cor a 2 Profilina 14 kDa Cor a 6 Isoflavona reductasa (homólogo) 35 kDa Cor a 8 nsLTP1 9 kDa Cor a 9 Globulina 11S (tipo legumina) 40 kDa

Cor a 10 Luminal binding protein 70 kDa Cor a 11 Globulina 7S (tipo vicilina) 48 kDa Cor a 12 17 kDa oelosina 17 kDa Cor a 13 14-16 kDa oleosina 14-16 kDa Cor a 14 Albúmina 2S 15-16 kDa

Fagus sylvatica (Haya) Fag s 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1

Juglans nigra (Nogal negro americano) Jug n 1 Albúmina 2S Jug n 2 Vicilina

Juglans regia (Nogal) Jug r 1 Albúmina 2S 15-16 kDa Jug r 2 Vicilina 44 kDa Jug r 3 nsLTP1 9 kDa Jug r 4 Globulina 11S

Ostrya carpinifolia (Carpe negro, falso carpe) Ost c 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1

Quercus alba (Roble blanco) Que a 1 PR-10, miembro de familia Bet v 1 17 kDa

Figura 6. A) Western blot de Q. ilex utilizando sueros individuales de 16 pacientes sensibilizados. B) Análisis de presencia/ausencia de bandas reconocidas por los sueros individuales.

Figura 7. ELISAS de competición utilizando como fase sólida e inhibidores los extractos de Q. ilex, B. verrucosa, P. pratense y O. europaea.

FS: Q. ilex FS: P. pratense

FS: B. verrucosa FS: O. europaea