huella genética o “fingerprinting” original de essy levy, m.s. y julie mathern alianza para el...
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Huella Genética o “Fingerprinting”Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)
Huella genética o “Fingerprinting” de ADNTemas Cubiertos
• Digestión de las muestras de ADN con enzimas de restricción
• Introducción a la base teórica de Huella Genética o “Fingerprinting” de ADN
• Electroforesis de geles de agarosa
• Análisis e interpretaciones de los resultados
Aplicaciones al mundo real de Huella genética o “Fingerprinting”de ADN
• Escena del crimen
• Relación entre humanos
• Paternidad
• Relación entre animales
• Estudios antropológicos
• Estudios de organismos que causan enfermedades
• Identificación de alimentos
• Restos Humanos
• Monitoreo de transplantes
• La estructura de ADN
• Análisis de patrones de restricción de ADN
• Electroforesis en gel de agarosa
• Determinación de tamaño
• Simulación de “Fingerprinting” de ADN forense real
El kit de Huella genética o “Fingerprinting” de ADN Forense Puede ayudar a enseñar:
Huella GenéticaResumen de los Procedimientos
Huella Genética Procedimiento Primera Parte
Huella Genética Procedimiento Segunda Parte
Huella Genética Procedimiento Tercera Parte
Equipo de Electroforesis de AgarosaBio-Rad
• Cubetas de Electroforesis
• Fuentes de Electricidad
• Geles de agarosa preparados
PowerPac™ Junior PowerPac™ Basic
PowerPac™ HC PowerPac™ Universal PowerPac™ 3000
Mini-Sub® Cell GT Wide Mini-Sub Cell GT
Los Cromosomas están Compuestos de ADN y Proteínas llamadas Histonas.
El Estudio de CariotipoAyuda a Identificar Anormalidades Genéticas
El ADN existe enrollado apretadamente alrededor de proteínas llamadas Histonas, formando estructuras denominadas cromosomas que se encuentran en el núcleo.
Modelo del ADNEl ADN está compuesto de:fosfatos,azúcares de cinco carbonos llamadas deoxirribosas,y cuatro tipos de bases nitrogenadas(adenina, timina, citosina, guanina).
Ácido Desoxirribonucleico (ADN)
ADN Representación Esquemática
OCH2
O
P O
O
O Base
CH2
O
P
O
O
O
Base
OH
Azúcar
Azúcar
O
5’ fosfato
3’ hidróxido
Sólo se muestra una cadena de
ADN.
Los Genes consisten de exones y de intrones.
Los exones son secuencias de ADN que se expresan en la célula.
Los intrones son secuencias de ADN que no se expresan en la célula.
Los Intrones son removidos del ARN durante el proceso de Transcripción
Enzimas de Restricción - Enzimas que cortan ADN
• Evolucionadas por bacterias para protegerse contra infecciones virales.
• Son endonucleasas, cortan en el interior de las hebras del ADN.
• Se conocen más de 3,000 enzimas de restricción.
bacteria
virus
Sitio de Reconocimiento de la Enzima de Restricción
• Cada enzima digiere (corta) ADN en una secuencia específica, o sitio de restricción.
• Las enzimas reconocen de 4 a 6 pares de bases organizadas en secuencias palindrómicas(Ej. GAATTC).
Secuencia Palindrómica
Sitio de restricción
Fragmento 1 Fragmento 2
Extremos Sobresalientes5’ o 3’
• Algunas enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 5’ (cinco primo), como la mostrada aquí.
La enzima corta aquí
• Otras enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 3’ (tres primo).
Enzimas de Restricción Comunes
EcoRI– Eschericha coli– Extremos
Sobresalientes 5’
Pstl– Providencia stuartii– Extremos
Sobresalientes 3’
• EcoRI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 5’.
• PstI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 3’.
Extremos Parejos
• Existen otras enzimas de restricción que generan extremos parejos;
es decir, extremos que no tienen porciones sobresalientes.
• Ejemplos:
AluI y HaeIII
AluI– Arthrobacter luteus– Extremos Parejos
HaeIII– Haemophilus
aegyptius– Extremos Parejos
Otros Componentes en la Reacción de la Digestióndel ADN
• Búfer Restricción permite las condiciones óptimas para la reacción
• NaCI proporciona la concentración correcta de iónes
• Tris-HCI proporciona el pH correcto
• Mg2+ es un co-factor enzimático
Temperatura de la Digestióndel ADN
¿Por qué incubamos a 37°C?
• La temperatura del cuerpo es la temperatura óptima para éstas y otras enzimas.
¿Qué pasa si la temperatura de la reacción es demasiado fría o demasiado caliente?
• Muy caliente: la enzima puede ser desnaturalizada.
• Muy fría: la actividad de la enzima puede ser más lenta, requiriendo más tiempo para digerir el ADN.
Las muestras de ADN digeridas se guardarán en la nevera para ser analizadas el día siguiente.
Asegúrese de que los
pozos están en el lado del polo (-).
Electroforesisen Agarosa: aplicando las muestras
• Corriente Eléctrica La corriente mueve el ADN, que tiene una carga negativa, hacia el electrodo positivo (+, rojo).
Fuente de Poder
Búfer
Tinta
Gel de agarosa
Electroforesisen Agarosa:corriendo las muestras
• La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño.
Los fragmentos más pequeños se
mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.
Fuente de Electricidad
Corriendo la Gel
Electroforesisen Agarosa:resultados típicos
• La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño.
Los fragmentos más pequeños se
mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.
Análisis de la Gel Teñida
Determine los tamaños de los fragmentos de restricción.
• Cree una curva estándar utilizando un marcador de ADN.
• Mida la distancia (en mm) recorrida por los fragmentos de restricción.
• Determine los tamaños de lo fragmentos de ADN.
Identifique la relación entre las muestras.
Determinación del Tamaño Molecular
Tamaño (pb) Distancia (mm)
23,000 11.0 9,400 13.0
6,500 15.0
4,400 18.0
2,300 23.0
2,000 24.0
pb = pares de basesmm = milímetros
100
1,000
10,000
100,000
0 5 10 15 20 25 30
Distancia (mm)
Ta
ma
ño
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are
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)B
A
Curva Estándar de “Fingerprinting”: Semilogritmico
“Fingerprinting” de ADN Extensiones a la práctica de laboratorio
• Estudios Independientes
• Aislamiento del plásmido de (mini-preps)
• La cartografía de un plásmido utilizando las enzimas de restricción
• Análisis por “Southern blot”
• Prácticas de introducción a la electroforesis:
Kool-Aid/FastBlast
Indicador de pH en un búfer