El género Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia heterótrofa que se caracteriza por ser

halófila estricta, consigue su equilibrio osmótico con concentraciones elevadas de cloruro potásico,

carece de mureína y por tal razón su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la

estabilidad; debido a su estilo de vida intenso Halobacterium sp, existe en extremas o altas

concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el mundo. Es una bacteria Gram-negativa, con

forma de bastón en una disposición única que es importante en su capacidad para moverse y

sobrevivir en las duras condiciones en que viven. [1] Para aislar Halobacterium Sp, se utilizó una

muestra de pescado de mar, el cual se enriqueció en agua peptonada con una concentración de

2.5M de cloruro de sodio e incubada propiciamente para luego propagarla en el medio Agar salado

manitol (A.S.M), del cual se extrajeron las colonias para realizar tinción y pruebas bioquímicas, que

nos darán indicios de la naturaleza de la bacteria aislada y de alguna manera confirmar su identidad,

procedimientos que profundizaremos más adelante.

Palabras claves: agua peptonada, bacteria, colonias, agar salado manitol.

ABSTRACT

The genus Halobacterium sp, is an archaebacterium that aerobic heterotrophic halophilic is

characterized by strict gets its osmotic balance with high concentrations of potassium chloride, no

murein and for this reason their cell wall sodium ion required to achieve stability, because his intense

lifestyle Halobacterium sp, exists in extreme or high salt concentrations and can be found worldwide. It

is a Gram-negative, rod-shaped in a unique arrangement that is important in their ability to move and

survive in the harsh conditions in which they live.[1] To isolate Halobacterium sp, we used a sample of

AISLAMIENTO DE Halobacterium Sp A PARTIR DE PESCADO DE MAR.

Janier Ariza1, Jesús Baena Negrete1, Yenis Olivera Pájaro1, Ibeth Padilla Lobo1

(1)Estudiantes de IV semestre de Ingeniería de Alimentos de la universidad de Córdoba.

sea fish, which was enriched in peptone water and incubated auspiciously and then spread it on

Mannitol Salt Agar (ASM), which were removed for staining colonies and biochemical tests, which will

give us clues to the nature of the bacteria isolated and somehow confirm their identity, deepen

procedures below.

Key words: peptone water, bacteria, colonies, mannitol salt agar

INTRODUCCIÓN

La percepción humana se ha derrochado generosamente con el espíritu de un verdadero cazador

detrás de cada posibilidad de dar con los microorganismos que circundan en nuestro medio, y no

obstante no se conforma solamente con conocerlos, observarlos, sino también aislarlos para así

saber las condiciones a las cuales estos crecen y se desarrollan. Con tal objeto se han descubierto

numerosos métodos, muchos de los cuales no han persistido porque resultaban demasiado

laboriosos o porque los resultados obtenidos no eran fáciles de interpretar. Aun en la actualidad

existe un método mucho mas práctico, económico y menos laborioso o tedioso, éste es el aislamiento

de microorganismos a nivel de laboratorio conociendo el sustrato o alimento donde estos crecen y

suministrándole los nutrientes necesarios y de igual forma, dotando al microorganismo de las

condiciones necesarias para su crecimiento.

En el estudio realizado por los autores [1], se aisló el microorganismo Halobacterium Sp, El género

Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia heterótrofa que se caracteriza por ser halófila

estricta, consigue su equilibrio osmótico con concentraciones elevadas de cloruro potásico, carece de

mureína y por tal razón su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la estabilidad;

Halobacterium sp, existe en extremas o altas concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el

mundo. Estos incluyen las instalaciones de producción de sal, de inclusiones de salmuera en los

cristales de sal en las salinas, así como lagos y lagunas naturales y en los mares.

Halobacterium Sp es una bacteria Gram negativa, Este microorganismo mesófilo es una bacteria con

forma de bastón en una disposición única que es importante en su capacidad para moverse y

sobrevivir en las duras condiciones en que viven, no tienen endosporas, por lo tanto, pueden ser

dañados por los rayos ultravioleta, gamma y la temperatura. [1].

Son aerobios obligados que crecen sobre aminoácidos. Tienen forma de coco o de bacilo, un color

rojo o púrpura y son móviles. La temperatura óptima de Halobacterium Sp es de 42 ºC y una

alcalinidad (NaCl) óptima de 4,3.

La experiencia fue realizada en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos de la Universidad de

Córdoba, y tuvo como objetivo principal el aislamiento de la bacteria Halobacterium Sp de pescado de

mar.

MATERIALES, REACTIVOS Y METODOLOGÍA

MATERIALES

Materia prima (pescado de mar)

Espátula estéril.

Balanza analítica.

Bolsa plástica para el agua peptona.

Agua peptonada (con cloruro de sodio a una concentración de 2,5M).

Mecheros.

Agar ASM (con cloruro de sodio a una concentración de 2,5M).

Asa bacteriológica redonda.

Asa bacteriológica en punta.

Incubadora.

Portaobjetos y cubreobjetos.

Microscopio.

Aceite de inmersión.

Batería para las pruebas bioquímicas respectivas: (Nitrato, Catalasa, Motilidad y H2S,

Ureasa, KIA, Rojo de metilo y Citrato)

REACTIVOS

Reactivos para Tinción de Gram: cristal violeta, agua destilada, lugol, alcohol acetona,

safranina de Gram.

Peróxido de hidrógeno (Para prueba de Catalasa).

METODOLOGÍA (ETAPAS DEL PROCESO)

ETAPA N°1: OBTENCIÓN DE LA MATERIA PRIMA

La materia prima bajo la que se trabajó, fue pescado de mar el cual se obtuvo en el mercado público

de Ciénaga de Oro Córdoba.

ETAPA N°2: PRE-ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA.

Para esta etapa se llevó al laboratorio pescado de mar. Seguidamente, se pesaron 10g de pescado

se introdujo en una bolsa plástica con 90 ml de agua peptonada. Se agito manualmente, luego se

llevo a incubar a 37°C por 24 horas.

Fig. 1: Pre-enriquecimiento de la muestra (pescado de mar en agua peptonada)

ETAPA N°3: SIEMBRA POR MÉTODO FRANCÉS

Al segundo día luego del enriquecimiento de la muestra de pescado, se realizó la siembra por método

francés en el Agar ASM (Agar salado manitol). Se dejó transcurrir 24 horas más y se pudieron

observar los resultados del crecimiento de la bacteria.

ETAPA N°4: TINCIÓN DE GRAM

Se realizó la tinción de Gram después de pasadas 24 horas para observar el crecimiento del

microorganismo en el medio. Se tomaron muestras de colonias del cultivo de Halobacterium Sp con

respecto al crecimiento de la bacteria en cuestión, en efecto, el medio ASM, presento características

de crecimiento del Halobacterium Sp debido a que es un medio muy selectivo para este

microorganismo. Posteriormente, siguiendo el procedimiento de este método se realizó el montaje

para la tinción diferencial de Gram.

ETAPA N° 5: PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Luego de haber realizado las tinciones se procedió al desarrollo de las pruebas bioquímicas, basadas

en los siguientes principios:

KIA: Determina la capacidad de la bacteria de atacar un hidrato de carbono especifico, incorporado

en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la posible formación de

H2S.(1)

NITRATO: esta prueba bioquímica evalúa la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito

o gas nitrógeno libre. Esta reducción se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales un

organismo produce su oxigeno del nitrato(2).

CATALASA: determina la presencia de la enzima catalasa la cual elimina de manera catalítica el

anión superóxido. Esta enzima es esencial en la defensa biológica contra la toxicidad del oxigeno (3).

UREASA: Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos molécula de

amoniaco por acción de la enzima ureasa. Indicador, Rojo de fenol (4)

MOTILIDAD Y SH2: esta prueba se basa en observar la motilidad de un microorganismo, gracias a la

baja concentración de agar, lo cual nos indica la presencia de flagelos. Por otro lado se puede

determinar si se ha liberado H2S por la acción enzimático de los aminoácidos que contienen azufre,

produciendo una reacción visible de color negro, se usan como indicadores tiosulfato de sodio y

sulfato ferroso. Además también se observa en el medio la formación de indol (4).

ROJO DE METILO: Comprueba la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los

productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora

del sistema.

CITRATO: Determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono

para el metabolismo provocando alcalinidad. La utilización de ácidos orgánicos y sus sales como

fuente de carbono produce carbonatos alcalinos en nueva degradación. Indicador de pH: azul de

bromotimol.

Prueba Resultado + Resultado -

Kia / :Ferm

entación de G y

L

/ :No

hay

fermentación

Nitrato

Catalasa Burbujeo Sin burbujeo

Ureasa

Motilidad y

SH2

Móvil y SH2 No móvil y no

se produce

SH2

Rojo de

metilo

Anillo rojo en la

superficie

Amarillo en la

superficie

Citrato Azul Verde

Tabla 1.1 de coloración de las pruebas en los medios

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

1. SIEMBRA EN MEDIO A.S.M

Fig.1 crecimiento de la cepa en el medio A.S.M

La siembra realizada en el medio selectivo para el crecimiento de Halobacterium Sp. Fue satisfactoria

dado que el crecimiento se manifestó en el medio (fig.2.)

TINCIÓN DE GRAM

De acuerdo a lo observado después de haber realizado el procedimiento se puede decir que la cepa

de estudio es un bacilo Gram negativo, debido la coloración violeta que se observa en la figura 3.

Aunque cabe resaltar que también se observaron bacilos Gram positivos.

Fig.3 Coloración de Gram

2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS:

KIA

Fig. 4 prueba KIA

Prueba KIA gas ac/ac coloración amarilla en toda la línea de siembra, con presencia de gas en el pico

de flauta. (fig.4)

NITRATO:

Fig. 5 prueba nitrato

Prueba nitrato positiva, con viraje de color rojo. (fig.5)

CATALASA

Fig. 6 prueba catalasa

Prueba de catalasa positiva, formación de burbujas en la superficie del portaobjeto que contenía la

muestra (fig. 6)

UREASA

Fig. 7 prueba ureasa

Prueba de ureasa negativa, coloración piel de ante (fig.7).

MOTILIDAD Y SH2

Fig. 8 prueba Motilidad y SH2

La prueba de Motilidad y SH2 dio un resultado positivo debido a que los microorganismos móviles

migran de la línea de siembra y se difunden en el medio, ennegrecimiento del medio para el H2S.

ROJO DE METILO

Fig. 9 prueba rojo de metilo

Prueba rojo de metilo positiva, anillo rojo en la superficie.

CITRATO

Fig. 10 prueba de citrato

Prueba negativa debido a que no cambio de color el medio se mantuvo de color verde.

Prueba Resultado

KIA (+) Ac gas/Ac.

Nitrato (+) Viraje de color

rojo en la superficie.

Catalasa (+)Formación de

burbujas.

Ureasa (-) no se produce

cambio de color (piel

de ante).

Motilidad y SH2 (+) hubo

crecimiento y

hubo presencia

de sulfuro.

Rojo de metilo (+) Medio l icuado

Citrato (-) coloración verde.

Tinción de Gram (-)coloración fucsia

de las células

Tabla 2. Resultado de pruebas experimentales

De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas, tinción de Gram, y teoría

consultada sobre la cepa de estudio (Halobacterium Sp), se podría decir que la cepa aislada podría

ser la buscada debido que todas las características obtenidas por pruebas de laboratorio (realizados

por nosotros) fueron las encontradas en la teoría, cabe resaltar que no puede afirmar que la especie

encontrada corresponde a la del análisis dado que para esto se necesita una confirmación con

pruebas de antibiótico las cuales no pudieron ser ejecutadas por falta de recursos.

CONCLUSIÓN

En este articulo podemos concluir que se pudo llevar a cabo de manera exitosa el objetivo del

trabajo el cual consistía primordialmente en aislar la bacteria Halobacterium Sp a partir de pescado

de mar, se puede decir que para tener una certeza razonable de que el microorganismo aislado era

el mencionado anteriormente se realizaron un conjunto de pruebas bioquímicas las cuales

produjeron unos resultado exitoso concordando con la teoría consultada al igual que la tinción

efectuada; para finalizar podemos decir que a pesar que todas las pruebas bioquímicas dieron

resultados satisfactorios no podemos afirmar en un 100% que las colonias obtenidas en el cultivo

correspondían a Halobacterium Sp dado que para tener una seguridad absoluta de que la bacteria

asilada correspondía a Halobacterium Sp se debían realizar pruebas más rigurosas como lo serian

exámenes genéticos y pruebas antibióticas.

RECOMENDACIONES

Como recomendaciones tenemos las siguientes, las cuales son muy importantes a la hora de aislar

dicho microorganismo:

Antes de realizar el procedimiento del aislamiento se deben consultar todos los pasos con el

estado del arte de dicho microorganismo que se vaya a aislar.

Mantener el área de trabajo desinfectada y en buenas condiciones, para evitar la

contaminación de diversos microorganismos.

Se debe utilizar los medios de cultivos adecuados para así poder evidenciar si existe o no

crecimiento de bacterias.

Trabajar cuidadosamente para así evitar riegos de accidentes con dichas bacterias.

Utilizar adecuadamente todos los implementos necesarios para la realización de la práctica y así

evitar la contaminación de los mismos.

BIBLIOGRAFÍA

1. GRUPO NORIEGA. EDITORES/Escrito por Agustín López, Mariano García Garibay,

Rodolfo Quintero Ramírez, Agustín López-Munguía Canales

2. BEUCHAT, Thomas J. DOYLE, Michael P. R. Larry. Microbiología de los alimentos,

fundamentos y fronteras editorial Acribia S.A.

3. KONEMAN, Elmer; STEPEN D. Allen. Diagnostico, Microbiológico. Texto y atlas.5a edición.

Editorial medica. Panamericana.

4. MACFADDIN, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia

clínica. 3ra Edicion Argentina (2003), 526-527.

5. RAMON PARES. Bioquímica de los microorganismos. Reverte. Barcelona España. Pág.

118.