Download - Halobacterium Sp
El género Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia heterótrofa que se caracteriza por ser
halófila estricta, consigue su equilibrio osmótico con concentraciones elevadas de cloruro potásico,
carece de mureína y por tal razón su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la
estabilidad; debido a su estilo de vida intenso Halobacterium sp, existe en extremas o altas
concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el mundo. Es una bacteria Gram-negativa, con
forma de bastón en una disposición única que es importante en su capacidad para moverse y
sobrevivir en las duras condiciones en que viven. [1] Para aislar Halobacterium Sp, se utilizó una
muestra de pescado de mar, el cual se enriqueció en agua peptonada con una concentración de
2.5M de cloruro de sodio e incubada propiciamente para luego propagarla en el medio Agar salado
manitol (A.S.M), del cual se extrajeron las colonias para realizar tinción y pruebas bioquímicas, que
nos darán indicios de la naturaleza de la bacteria aislada y de alguna manera confirmar su identidad,
procedimientos que profundizaremos más adelante.
Palabras claves: agua peptonada, bacteria, colonias, agar salado manitol.
ABSTRACT
The genus Halobacterium sp, is an archaebacterium that aerobic heterotrophic halophilic is
characterized by strict gets its osmotic balance with high concentrations of potassium chloride, no
murein and for this reason their cell wall sodium ion required to achieve stability, because his intense
lifestyle Halobacterium sp, exists in extreme or high salt concentrations and can be found worldwide. It
is a Gram-negative, rod-shaped in a unique arrangement that is important in their ability to move and
survive in the harsh conditions in which they live.[1] To isolate Halobacterium sp, we used a sample of
AISLAMIENTO DE Halobacterium Sp A PARTIR DE PESCADO DE MAR.
Janier Ariza1, Jesús Baena Negrete1, Yenis Olivera Pájaro1, Ibeth Padilla Lobo1
(1)Estudiantes de IV semestre de Ingeniería de Alimentos de la universidad de Córdoba.
sea fish, which was enriched in peptone water and incubated auspiciously and then spread it on
Mannitol Salt Agar (ASM), which were removed for staining colonies and biochemical tests, which will
give us clues to the nature of the bacteria isolated and somehow confirm their identity, deepen
procedures below.
Key words: peptone water, bacteria, colonies, mannitol salt agar
INTRODUCCIÓN
La percepción humana se ha derrochado generosamente con el espíritu de un verdadero cazador
detrás de cada posibilidad de dar con los microorganismos que circundan en nuestro medio, y no
obstante no se conforma solamente con conocerlos, observarlos, sino también aislarlos para así
saber las condiciones a las cuales estos crecen y se desarrollan. Con tal objeto se han descubierto
numerosos métodos, muchos de los cuales no han persistido porque resultaban demasiado
laboriosos o porque los resultados obtenidos no eran fáciles de interpretar. Aun en la actualidad
existe un método mucho mas práctico, económico y menos laborioso o tedioso, éste es el aislamiento
de microorganismos a nivel de laboratorio conociendo el sustrato o alimento donde estos crecen y
suministrándole los nutrientes necesarios y de igual forma, dotando al microorganismo de las
condiciones necesarias para su crecimiento.
En el estudio realizado por los autores [1], se aisló el microorganismo Halobacterium Sp, El género
Halobacterium sp, es una arqueobacteria aerobia heterótrofa que se caracteriza por ser halófila
estricta, consigue su equilibrio osmótico con concentraciones elevadas de cloruro potásico, carece de
mureína y por tal razón su pared celular requiere de iones de sodio para lograr la estabilidad;
Halobacterium sp, existe en extremas o altas concentraciones de sal y se puede encontrar en todo el
mundo. Estos incluyen las instalaciones de producción de sal, de inclusiones de salmuera en los
cristales de sal en las salinas, así como lagos y lagunas naturales y en los mares.
Halobacterium Sp es una bacteria Gram negativa, Este microorganismo mesófilo es una bacteria con
forma de bastón en una disposición única que es importante en su capacidad para moverse y
sobrevivir en las duras condiciones en que viven, no tienen endosporas, por lo tanto, pueden ser
dañados por los rayos ultravioleta, gamma y la temperatura. [1].
Son aerobios obligados que crecen sobre aminoácidos. Tienen forma de coco o de bacilo, un color
rojo o púrpura y son móviles. La temperatura óptima de Halobacterium Sp es de 42 ºC y una
alcalinidad (NaCl) óptima de 4,3.
La experiencia fue realizada en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos de la Universidad de
Córdoba, y tuvo como objetivo principal el aislamiento de la bacteria Halobacterium Sp de pescado de
mar.
MATERIALES, REACTIVOS Y METODOLOGÍA
MATERIALES
Materia prima (pescado de mar)
Espátula estéril.
Balanza analítica.
Bolsa plástica para el agua peptona.
Agua peptonada (con cloruro de sodio a una concentración de 2,5M).
Mecheros.
Agar ASM (con cloruro de sodio a una concentración de 2,5M).
Asa bacteriológica redonda.
Asa bacteriológica en punta.
Incubadora.
Portaobjetos y cubreobjetos.
Microscopio.
Aceite de inmersión.
Batería para las pruebas bioquímicas respectivas: (Nitrato, Catalasa, Motilidad y H2S,
Ureasa, KIA, Rojo de metilo y Citrato)
REACTIVOS
Reactivos para Tinción de Gram: cristal violeta, agua destilada, lugol, alcohol acetona,
safranina de Gram.
Peróxido de hidrógeno (Para prueba de Catalasa).
METODOLOGÍA (ETAPAS DEL PROCESO)
ETAPA N°1: OBTENCIÓN DE LA MATERIA PRIMA
La materia prima bajo la que se trabajó, fue pescado de mar el cual se obtuvo en el mercado público
de Ciénaga de Oro Córdoba.
ETAPA N°2: PRE-ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA.
Para esta etapa se llevó al laboratorio pescado de mar. Seguidamente, se pesaron 10g de pescado
se introdujo en una bolsa plástica con 90 ml de agua peptonada. Se agito manualmente, luego se
llevo a incubar a 37°C por 24 horas.
Fig. 1: Pre-enriquecimiento de la muestra (pescado de mar en agua peptonada)
ETAPA N°3: SIEMBRA POR MÉTODO FRANCÉS
Al segundo día luego del enriquecimiento de la muestra de pescado, se realizó la siembra por método
francés en el Agar ASM (Agar salado manitol). Se dejó transcurrir 24 horas más y se pudieron
observar los resultados del crecimiento de la bacteria.
ETAPA N°4: TINCIÓN DE GRAM
Se realizó la tinción de Gram después de pasadas 24 horas para observar el crecimiento del
microorganismo en el medio. Se tomaron muestras de colonias del cultivo de Halobacterium Sp con
respecto al crecimiento de la bacteria en cuestión, en efecto, el medio ASM, presento características
de crecimiento del Halobacterium Sp debido a que es un medio muy selectivo para este
microorganismo. Posteriormente, siguiendo el procedimiento de este método se realizó el montaje
para la tinción diferencial de Gram.
ETAPA N° 5: PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Luego de haber realizado las tinciones se procedió al desarrollo de las pruebas bioquímicas, basadas
en los siguientes principios:
KIA: Determina la capacidad de la bacteria de atacar un hidrato de carbono especifico, incorporado
en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la posible formación de
H2S.(1)
NITRATO: esta prueba bioquímica evalúa la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito
o gas nitrógeno libre. Esta reducción se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales un
organismo produce su oxigeno del nitrato(2).
CATALASA: determina la presencia de la enzima catalasa la cual elimina de manera catalítica el
anión superóxido. Esta enzima es esencial en la defensa biológica contra la toxicidad del oxigeno (3).
UREASA: Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos molécula de
amoniaco por acción de la enzima ureasa. Indicador, Rojo de fenol (4)
MOTILIDAD Y SH2: esta prueba se basa en observar la motilidad de un microorganismo, gracias a la
baja concentración de agar, lo cual nos indica la presencia de flagelos. Por otro lado se puede
determinar si se ha liberado H2S por la acción enzimático de los aminoácidos que contienen azufre,
produciendo una reacción visible de color negro, se usan como indicadores tiosulfato de sodio y
sulfato ferroso. Además también se observa en el medio la formación de indol (4).
ROJO DE METILO: Comprueba la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los
productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora
del sistema.
CITRATO: Determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono
para el metabolismo provocando alcalinidad. La utilización de ácidos orgánicos y sus sales como
fuente de carbono produce carbonatos alcalinos en nueva degradación. Indicador de pH: azul de
bromotimol.
Prueba Resultado + Resultado -
Kia / :Ferm
entación de G y
L
/ :No
hay
fermentación
Nitrato
Catalasa Burbujeo Sin burbujeo
Ureasa
Motilidad y
SH2
Móvil y SH2 No móvil y no
se produce
SH2
Rojo de
metilo
Anillo rojo en la
superficie
Amarillo en la
superficie
Citrato Azul Verde
Tabla 1.1 de coloración de las pruebas en los medios
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
1. SIEMBRA EN MEDIO A.S.M
Fig.1 crecimiento de la cepa en el medio A.S.M
La siembra realizada en el medio selectivo para el crecimiento de Halobacterium Sp. Fue satisfactoria
dado que el crecimiento se manifestó en el medio (fig.2.)
TINCIÓN DE GRAM
De acuerdo a lo observado después de haber realizado el procedimiento se puede decir que la cepa
de estudio es un bacilo Gram negativo, debido la coloración violeta que se observa en la figura 3.
Aunque cabe resaltar que también se observaron bacilos Gram positivos.
Fig.3 Coloración de Gram
2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS:
KIA
Fig. 4 prueba KIA
Prueba KIA gas ac/ac coloración amarilla en toda la línea de siembra, con presencia de gas en el pico
de flauta. (fig.4)
NITRATO:
Fig. 5 prueba nitrato
Prueba nitrato positiva, con viraje de color rojo. (fig.5)
CATALASA
Fig. 6 prueba catalasa
Prueba de catalasa positiva, formación de burbujas en la superficie del portaobjeto que contenía la
muestra (fig. 6)
UREASA
Fig. 7 prueba ureasa
Prueba de ureasa negativa, coloración piel de ante (fig.7).
MOTILIDAD Y SH2
Fig. 8 prueba Motilidad y SH2
La prueba de Motilidad y SH2 dio un resultado positivo debido a que los microorganismos móviles
migran de la línea de siembra y se difunden en el medio, ennegrecimiento del medio para el H2S.
ROJO DE METILO
Fig. 9 prueba rojo de metilo
Prueba rojo de metilo positiva, anillo rojo en la superficie.
CITRATO
Fig. 10 prueba de citrato
Prueba negativa debido a que no cambio de color el medio se mantuvo de color verde.
Prueba Resultado
KIA (+) Ac gas/Ac.
Nitrato (+) Viraje de color
rojo en la superficie.
Catalasa (+)Formación de
burbujas.
Ureasa (-) no se produce
cambio de color (piel
de ante).
Motilidad y SH2 (+) hubo
crecimiento y
hubo presencia
de sulfuro.
Rojo de metilo (+) Medio l icuado
Citrato (-) coloración verde.
Tinción de Gram (-)coloración fucsia
de las células
Tabla 2. Resultado de pruebas experimentales
De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas, tinción de Gram, y teoría
consultada sobre la cepa de estudio (Halobacterium Sp), se podría decir que la cepa aislada podría
ser la buscada debido que todas las características obtenidas por pruebas de laboratorio (realizados
por nosotros) fueron las encontradas en la teoría, cabe resaltar que no puede afirmar que la especie
encontrada corresponde a la del análisis dado que para esto se necesita una confirmación con
pruebas de antibiótico las cuales no pudieron ser ejecutadas por falta de recursos.
CONCLUSIÓN
En este articulo podemos concluir que se pudo llevar a cabo de manera exitosa el objetivo del
trabajo el cual consistía primordialmente en aislar la bacteria Halobacterium Sp a partir de pescado
de mar, se puede decir que para tener una certeza razonable de que el microorganismo aislado era
el mencionado anteriormente se realizaron un conjunto de pruebas bioquímicas las cuales
produjeron unos resultado exitoso concordando con la teoría consultada al igual que la tinción
efectuada; para finalizar podemos decir que a pesar que todas las pruebas bioquímicas dieron
resultados satisfactorios no podemos afirmar en un 100% que las colonias obtenidas en el cultivo
correspondían a Halobacterium Sp dado que para tener una seguridad absoluta de que la bacteria
asilada correspondía a Halobacterium Sp se debían realizar pruebas más rigurosas como lo serian
exámenes genéticos y pruebas antibióticas.
RECOMENDACIONES
Como recomendaciones tenemos las siguientes, las cuales son muy importantes a la hora de aislar
dicho microorganismo:
Antes de realizar el procedimiento del aislamiento se deben consultar todos los pasos con el
estado del arte de dicho microorganismo que se vaya a aislar.
Mantener el área de trabajo desinfectada y en buenas condiciones, para evitar la
contaminación de diversos microorganismos.
Se debe utilizar los medios de cultivos adecuados para así poder evidenciar si existe o no
crecimiento de bacterias.
Trabajar cuidadosamente para así evitar riegos de accidentes con dichas bacterias.
Utilizar adecuadamente todos los implementos necesarios para la realización de la práctica y así
evitar la contaminación de los mismos.
BIBLIOGRAFÍA
1. GRUPO NORIEGA. EDITORES/Escrito por Agustín López, Mariano García Garibay,
Rodolfo Quintero Ramírez, Agustín López-Munguía Canales
2. BEUCHAT, Thomas J. DOYLE, Michael P. R. Larry. Microbiología de los alimentos,
fundamentos y fronteras editorial Acribia S.A.
3. KONEMAN, Elmer; STEPEN D. Allen. Diagnostico, Microbiológico. Texto y atlas.5a edición.
Editorial medica. Panamericana.
4. MACFADDIN, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. 3ra Edicion Argentina (2003), 526-527.
5. RAMON PARES. Bioquímica de los microorganismos. Reverte. Barcelona España. Pág.
118.