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ESTANDARIZACIÓN DEL SISTEMA DE INMERSIÓN TEMPORAL PARA LA
MICROPROPAGACIÓN IN VITRO DE Cattleya Schroederae.
DUBAN ANÍBAL AVILA DUARTE.
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y AGROPECUARIAS
BUCARAMANGA
2018
ii
ESTANDARIZACIÓN DEL SISTEMA DE INMERSIÓN TEMPORAL PARA LA
MICROPROPAGACIÓN IN VITRO DE Cattleya Schroederae.
Duban Aníbal Avila Duarte.
Trabajo de grado para optar por
El título de Microbiólogo Industrial.
Director
Ing. Christian Andrei Chacín Zambrano
MSc. en Biotecnología Microbiana.
Universidad de Santander
Facultad de ciencias exactas, físicas y agropecuarias
Bucaramanga
2018
iii
iv
Agradecimientos
La vida se encuentra llena de retos, y uno de ellos es la universidad. Tras verme dentro de ella,
me he dado cuenta que más allá de ser un reto, es una base no solo para mi entendimiento dentro
del campo profesional en el que me encuentro inmerso, sino también para lo que concierne para
la vida y mi futuro.
Agradezco a mi Docente y tutor Christian Andrei Chacín Zambrano, por haberme dado la
oportunidad de trabajar con él, por darme ese voto confianza; por acompañarme con su
conocimiento y haberme proporcionado gran parte de él durante el transcurso de estos meses,
que estoy seguro que, sin duda alguna, son y serán de gran base para mi vida profesional.
A mi equipo de trabajo compuesto por la profesional María Inés Cañas, por su tiempo, apoyo,
conocimientos y correcciones brindada durante la realización de este proyecto de investigación.
v
Dedicatoria
El presente trabajo es dedicado primero a Dios por haberme dado el libre albedrío para decidir
que este es el camino que quiero seguir en mi vida, por sostenerme cada vez que me siento caer y
por abrirme paso ante cada uno de los obstáculos que se me presentan.
A mi familia, a mis padres Campo Aníbal Avila Pérez y Luz Stella Duarte león, los cuales han
sido parte fundamental para escribir este libro, ellos son quienes me guiaron y me dieron grandes
enseñanzas, valores y me brindaron su apoyo incondicionalmente día a día, siendo ellos los
principales protagonistas de este “sueño alcanzado”.
A mi abuela por haberme enseñado que con esfuerzo, trabajo y constancia todo se logra, y que en
esta vida nadie regala nada, por sus largas pláticas cargadas de consejos.
1
Contenido
1. Introducción ........................................................................................................................... 7
2 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN .................................................................................... 10
2.1 Planteamiento del problema ............................................................................................. 10
2.2 Justificación ....................................................................................................................... 11
3. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................ 13
3.1 Cultivo in vitro de “tejidos vegetales” ............................................................................. 13
3.1.1 Métodos de regeneración de tejidos vegetales. ............................................................ 14
3.1.1.1 Embriogénesis somática......................................................................................... 14
3.1.1.2 Organogénesis. ....................................................................................................... 14
3.2 Sistema de inmersión temporal (SIT) .............................................................................. 15
3.2.1 Clases de sistema de inmersión temporal (SIT). .......................................................... 15
3.2.1.1 Biorreactores tipo RITA. ....................................................................................... 15
3.2.1.2 Biorreactores tipo BIT. .......................................................................................... 16
3.2.1.3 Biorreactores tipo BIG. .......................................................................................... 17
3.3 Orquídeas ........................................................................................................................... 18
3.3.1 Cattleya Schroederae. .................................................................................................. 18
3.3.1.1 Ecología. ................................................................................................................ 19
3.3.1.2 Distribución geográfica. ......................................................................................... 19
4. MARCO REFERENCIAL (ESTADO DE ARTE) ........................................................... 21
5. HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 25
5.1 Hipótesis nula .................................................................................................................... 25
5.2 Hipótesis alternativa ......................................................................................................... 25
6. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 26
6.1 Objetivo general ................................................................................................................ 26
6.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 26
7. METODOLOGÍA ................................................................................................................... 27
7.1 Diseño de estudio ............................................................................................................... 27
7.2 Ubicación ............................................................................................................................ 27
7.3 Población y muestra .......................................................................................................... 27
7.4 Fases de investigación ....................................................................................................... 27
2
7.4.1 Establecimiento de las condiciones operacionales de los biorreactores del sistema de
inmersión temporal. ............................................................................................................... 28
7.4.2 Evaluación de las variables para la micropropagación de Cattleya schroederae. ........ 28
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 29
8.1 Establecer las condiciones operacionales del biorreactor del sistema de inmersión
temporal ................................................................................................................................... 29
8.2 Evaluación de las variables para la micropropagación de Cattleya schroederae en el
sistema de inmersión temporal............................................................................................... 31
8.2.1 Material vegetal. ........................................................................................................... 31
8.2.2 Medición de las variables. ............................................................................................ 32
8.2.2.1 Número de brotes. .................................................................................................. 32
8.2.2.2 Número de hojas. ................................................................................................... 33
8.2.2.3 Altura. .................................................................................................................... 35
8.2.2.4 Peso. ....................................................................................................................... 36
9. CONCLUSIONES................................................................................................................... 38
10. RECOMENDACIONES ...................................................................................................... 39
11. Bibliografía ............................................................................................................................ 40
12. ANEXOS ................................................................................................................................ 42
3
Índice de figuras
Figura 1. Cultivo in vitro de tejidos vegetales. ............................................................................ 13
Figura 2. Esquema del sistema de inmersión temporal tipo RITA. ............................................ 16
Figura 3. Representación del funcionamiento del sistema de inmersión temporal BIT. ............. 17
Figura 4. Diagrama del sistema de inmersión por gravedad (BIG). ............................................ 18
Figura 5. Orquídea, Cattleya Schroederae.. ................................................................................ 19
Figura 6. Distribución geográfica (piedemonte llanero) de hábitats de orquídeas. ..................... 20
Figura 7. Prototipo de sistema de inmersión temporal construido. ............................................. 30
Figura 8. Efecto del sistema del sistema inmersión temporal sobre el número de brotes. .......... 32
Figura 9. Efecto del sistema del sistema inmersión temporal sobre el desarrollo de hojas. ........ 33
Figura 10. Explantes y hojas obtenidas en el tratamiento número uno del sistema inmersión
temporal. ....................................................................................................................................... 34
Figura 11. Efecto del sistema del sistema inmersión temporal sobre la altura. ........................... 35
Figura 12. Efecto del sistema del sistema inmersión temporal sobre el peso. ............................. 36
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RESUMEN
Título: Estandarización del sistema de inmersión temporal para la micropropagación in vitro de
Cattleya Schroederae.
Autores: Avila Duarte, Duban Aníbal
Palabras clave: Oxidación, hiperhidricidad, biorreactores y Cattleya schroederae.
Descripción:
El sistema de inmersión temporal, conocido por sus siglas (SIT), ha surgido como una nueva
alternativa para la micropropagación de tejidos vegetales, brindando este una alta tasa de
multiplicación y proporcionando una mayor calidad a la planta en su fase de aclimatación, por
ende, el objetivo de este estudio, se basó en la estandarización de un sistema de inmersión
temporal para la micropropagación de la orquídea Cattleya schroederae en el laboratorio de
tejidos vegetales de la Universidad de Santander.
Para ello, se establecieron las condiciones operacionales del sistema de inmersión temporal,
donde posterior a ello, se evaluaron dos variables, el tiempo y frecuencia de inmersión. Los
tiempos para el SIT-1, fue una frecuencia de inmersión de 6 horas (4 veces/día) con un tiempo
inmersión: 3 minutos, para el SIT-2, una frecuencia de inmersión de 4 horas (6 veces/día) con un
tiempo de inmersión de 8 minutos y el SIT-3, una frecuencia de inmersión de 12 horas (2
veces/día) y un tiempo de inmersión de 20 minutos.
El estudio se evaluó durante siete semanas, mostrando que la mejor respuesta en cuanto a
número de brotes, número de hojas, altura y peso, se obtuvo con el tratamiento número uno, el
5
cual estaba funcionando con una frecuencia de inmersión cada 6 horas (4 veces/día) y un tiempo
inmersión: de 3 minutos. Así mismo, no se presentó hiperhidricidad ni oxidación entre los
tratamientos. Estos resultados, permiten establecer una metodología eficiente para la
micropropagación de Cattleya schroederae mediante el uso de un sistema de biorreactores.
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ABSTRACT
Title: Standardization of the temporary immersion system for in vitro micropropagation of
Cattleya Schroederae.
Authors: Avila Duarte, Duban Anibal.
Key words: Oxidation, hyperhydricity, bioreactors and Cattleya schroederae.
The temporary immersion system, known by its acronym (SIT), has emerged as a new alternative
for the micropropagation of plant tissues, providing this high rate of multiplication and providing
a higher quality to the plant in its acclimatization phase, therefore, the objective of this study,
was based on the standardization of a temporary immersion system for the micropropagation of
the orchid Cattleya schroederae in the plant tissue laboratory of the University of Santander.
For this, the operational conditions of the temporary immersion system were established, where
after that, two variables were evaluated, the time and frequency of immersion. The times for SIT-
1, was an immersion frequency of 6 hours (4 times / day) with a dive time: 3 minutes, for SIT-2,
an immersion frequency of 4 hours (6 times / day) with an 8-minute immersion time and SIT-3,
an immersion frequency of 12 hours (2 times / day) and an immersion time of 20 minutes.
The study was evaluated over seven weeks, showing that the best response in number of shoots,
number of leaves, height and weight, was obtained with the treatment number one, which was
working with an immersion frequency every 6 hours (4 times / day) and one immersion time: 3
minutes. Likewise, there was no hyperhydricity or oxidation between the treatments. These
results allow establishing an efficient methodology for the micropropagation of Cattleya
schroederae through the use of a bioreactor system.
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1. Introducción
La deforestación de bosques en Colombia ha afectado y sigue impactando de manera negativa la
biodiversidad de nuestras regiones, viéndose expuestas gran cantidad de especies vegetales, entre
las cuales encontramos la familia Orchidaceae, un tipo de plantas muy conocido en nuestro país,
que se encuentra en un estado vulnerable por su peligro de vía extinción, siendo amenazadas por
factores tales como, recolección excesiva para fines comerciales u ornamentales dentro y fuera
del país, como también por deterioro en la calidad de su hábitat con fines para aperturas de
carreteras que hoy por hoy conectan a la región con el centro del país o simplemente para
convertir los terrenos en zonas ganaderas, agrícolas e industriales (Calderón Sáenz, 2006)
Estos factores anteriormente descritos, han influido de manera desfavorable sobre varios géneros
de orquídeas, tales como Anguloa sp, Restrepia sp, Lycaste sp, Dracula sp, Odontoglossum sp,
Masdevallia sp, Miltoniopsis sp y Cattleya sp; todos estos géneros por lo menos con el 50% de
sus especies amenazadas. Un ejemplo claro es, Cattleya schroederae, siendo esta una especie de
gran importancias en Colombia y que hoy por hoy se encuentra en un estado vulnerable, es decir
en riesgo de extinción o deterioro poblacional a mediano plazo (Calderón Sáenz, 2006).
Cattleya schroederae, también conocida con su nombre común “Lirio”, es una de las especies de
orquídea de gran importancia por sus características, dentro de las cuales encontramos, su
característico olor a vainilla que la hace ser la más fragante de las especies colombianas. Dentro
de su ecología encontramos que crecen de forma epifita, es decir que crece sobre otro vegetal,
principalmente en arboles grandes; su hábitat es principalmente en selvas húmedas estacionales
del piedemonte o ladera oriental de la cordillera oriental (Constantino, Calderon, & Julian, 2006)
8
Los esfuerzos por fomentar la conservación masiva de géneros de orquídeas ha venido
incrementando después de saber que la mayoría de sus especies se encuentran en un estado de
vulnerabilidad, por ende una de las soluciones a ello, es la conservación in situ, es decir en su
propio ambiente natural, no obstante, en todos los casos es posible realizar el rescate en el área
natural, cuando la velocidad de deterioro del hábitat por diversos factores antropogénicos es alta,
lo cual hace recurrir a otras técnicas, como lo es, la conservación ex situ (fuera de su hábitat
natural) , siendo esta última, una alternativa eficiente, por su aplicabilidad, comodidad y
modificaciones que contribuyen a mejoras, de tal manera que proporciona de esta, un método
con mejores resultados (Martinez Palacios, Chavez Avila, & Ortega, 2009)
Llevar los tejidos vegetales fuera de campo, fue un gran desafío para el hombre y una gran
hazaña que alcanzo. Esto permitió un gran avance en la biología y conservación de especies
vegetales, dando lugar a lo que actualmente se denomina cultivo in vitro a nivel de laboratorio, el
cual, bajo condiciones controladas, busca obtener plantas mejoradas, con el objeto de
incrementar su producción, resistencia a plagas y enfermedades, y la adaptación a ambientes
específicos. Facilitando también considerablemente el progreso en varios campos, tales como la
micropropagación rápida de clones, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de
embriones y combinaciones de genes por medio de hibridaciones y mutaciones (Gutiérrez,
Santacruz, Cabrera, & Rodríguez, 2003).
Actualmente la micropropagación in vitro “convencional”, es considerada como una técnica de
laboratorio de tejido vegetales de gran utilidad y exitosa por su mecanismo para multiplicar
plantas a partir de un explante (parte vegetal que ha sido separada de la planta), además de
proporcionar beneficios adicionales en el aspecto sanitario de la planta, como generar plantas
libres de virus u otros agentes, no obstante, esta técnica presenta ciertas limitaciones en cuanto a
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su porcentaje de multiplicación, altos costos de insumos de laboratorio, escases de nutrientes que
pueden afectar su desarrollo, lo cual conlleva a buscar nuevas alternativas para la
micropropagación, que pueda satisfacer aquellas necesidades ( Cruzat G, 2009).
El encontrar nuevas tecnologías que permitan superar dichas limitaciones o bien mejorar la
eficiencia de los sistemas actuales de micropropagación, ha implicado el desarrollo de técnicas
alternativas, como lo es el sistema de inmersión temporal denominado por sus siglas (SIT) como
una opción de semi-automatización de los sistemas de propagación In vitro de plantas. Cuando
mencionamos el término semi-automatización; decimos que aunque sean los dispositivos los que
realicen la mayor parte del trabajo, para su correcto desempeño se necesita de la supervisión
humana (Aitken-Christie, Toyoki, & Smith, 1995).
En función de la necesidad existente hoy en día, de hacer conservación de especies en peligro
de vía de extinción, como lo es la familia Orchidaceae, se plantea desarrollar nuevas tecnologías
sobresalientes en cuanto a un mejor desarrollo con mejores características de plantas a nivel in
vitro, aumentando así los índices de multiplicación (IM) y disminuyendo los costos de los
medios de cultivo, por ende se pretende la semi-automatización en el laboratorio de tejidos
vegetales de la universidad de santander de un sistema inmersión temporal (BIG) para la
micropropagación de la orquídea Cattleya schroederae, evaluándose las variables tales como;
tiempo de inmersión, frecuencia de inmersión, con el fin de determinar cuáles son las mejores u
óptimas condiciones de propagación.
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2 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
2.1 Planteamiento del problema
Colombia es uno de los países más ricos en orquídeas, debido a la amplia diversidad de hábitats
que se pueden encontrar en él, siendo Santander el segundo departamento con mayor número de
especies y géneros registrados con un porcentaje del 14% de la riqueza de orquídeas reportadas
en Colombia (Martinez, Bonilla, & López, 2015). Sin embargo, se ha venido presentando
inconvenientes en cuanto a la pérdida de orquídeas por problemas como, la recolección excesiva
para fines comerciales u ornamentales, tala de árboles de tal manera que deteriora la calidad de
su hábitat, entre otras, lo cual ha llevado a una reducción de las poblaciones en los últimos 100
años, de por lo menos el 50%, según se infiere por el grado de transformación de los paisajes y
por crónicas de los colectores extranjeros (Constantino, Calderon, & Julian, 2006).
La micropropagación convencional o también denominada tradicional de tejidos vegetales, hoy
en día son y siguen siendo una alternativa exitosa, permitiendo directamente la conservación y
micropropagación in vitro de gran diversidad de plantas, consistiendo en la producción de un
gran número de plántulas a partir de pequeños fragmentos de cualquier tejido vegetal en medios
sólidos y semisólidos, no obstante presenta ciertas limitaciones, que no le permiten ir más allá, es
decir, ir avanzando e ir progresando; tales limitaciones son principalmente los altos costos de
operación ocasionados por la mano de obra, la baja eficiencia biológica, la falta de sistemas de
automatización in vitro, el bajo coeficiente de multiplicación y las dificultades en la etapa de
aclimatización ( Cruzat G, 2009)
11
Actualmente se ha venido desarrollando una nueva técnica de propagación de tejidos vegetales,
llamada sistema de inmersión temporal, denominada por sus siglas (SIT), la cual hasta el
momento no hay demasiada información o datos congruentes en cuanto a la micropropagación
masiva de algunas especies de orquídeas. Sin embargo este sistema es una herramienta que abre
la posibilidad de semiautomatizar los procesos de micropropagación de cultivo in vitro a partir
del uso de biorreactores y bajo unas condiciones asépticas y controladas, obteniendo así mejores
resultados (Béllo-Béllo & Iglesias-Andreu, 2015)
De acuerdo a lo anterior se genera la siguiente pregunta de investigación, ¿El efecto del tiempo y
frecuencia de inmersión, genera un coeficiente de multiplicación en la orquídea Cattleya
schroederae bajo el sistema de inmersión temporal?
2.2 Justificación
A partir de lo anteriormente descrito, se desarrolló este proyecto con el fin de estandarizar el
proceso de la técnica del sistema de inmersión temporal (SIT) para la micropropagación in vitro
de Cattleya schroederae, siendo esta una planta perteneciente a la familia Orchidaceae que hoy
en día se encuentra en vía de peligro de extinción, causado por la destrucción de su hábitat, venta
ilegal de estas para usos industriales, entre otras, por ende mediante la aplicación de este sistema
de inmersión temporal se quiere obtener plántulas con altos coeficientes de multiplicación, una
mejor calidad y a la misma vez hacer conservación masiva de esta especie en vía de extinción.
Con la implementación de este sistema también lograremos disminuir las manipulaciones, que
comúnmente se daban en el proceso de micropropagación convencional, ya que ésta implica
12
pérdidas del material por contaminación exógena, vitrificación u oxidación fenólica, además de
eso obtendremos una mejor eficiencia en cuanto a la asimilación o incorporación de los
nutrientes por los tejidos , ya que en este sistema se emplea un medio de cultivo líquido , un
mayor contacto entre la biomasa vegetal y el medio, mejorando así de manera directa el
coeficiente de crecimiento y mejoramiento en el porcentaje de enraizamiento y sobrevivencia de
las plantas en la etapa de aclimatación. Además de una reducción hasta de un 50% en los costos
de producción ( Cruzat G, 2009), permitiendo direccionar el laboratorio de tejidos vegetales en
una nueva fase tecnológica para nuevos estudios de investigación.
Cabe resaltar que el laboratorio de tejidos vegetales de la universidad de Santander UDES, tiene
antecedentes en el área del cultivo in vitro, es decir, que ha trabajado con la parte de
micropropagación tradicional a partir de tejidos vegetales, tales como, especies de orquídeas o
especies que son de gran interés agrícola, que hoy por hoy se encuentran en un estado de
vulnerabilidad y también en peligro de vía de extinción.
Es importante resaltar que este proyecto de investigación es pionero, ya que es el primer estudio
realizado a nivel nacional bajo la modalidad de inmersión temporal con este tipo de especie de
orquídea, siendo de gran importancia, ya que todos los datos obtenidos, protocolos y
funcionamientos del equipo, es nuevo conocimiento y podrán usarse como base para futuras
investigación en el cuidado de la biodiversidad.
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3. MARCO TEÓRICO
3.1 Cultivo in vitro de “tejidos vegetales”
Se denomina cultivo in vitro de tejidos vegetales al cultivo de explantes como, semillas,
embriones, órganos, tejidos y células de plantas superiores en un medio nutritivo, este último
tiene todos los requerimientos necesarios para su desarrollo, bajo condiciones estériles ( Cruzat
G, 2009). La producción masiva de plantas puede realizarse mediante el uso de esta técnica in
vitro, y diferentes métodos de regeneración, tales como Embriogénesis somática y
organogénesis.
Figura 1 .Cultivo in vitro de tejidos vegetales. Fuente:
file:///C:/Users/Usuario/Desktop/TESIS%20COLOMBIA/articles-
75552_%20SIT.pdf
14
3.1.1 Métodos de regeneración de tejidos vegetales.
3.1.1.1 Embriogénesis somática.
Tipos de propagación in vitro, tales como, la embriogénesis somática, constituyen una
herramienta de trabajo para la conservación in vitro a nivel de laboratorio. La embriogénesis
somática consiste en la formación de un embrión a partir de una célula, sin necesidad de fusión
de gametos, permitiendo incrementar los coeficientes de multiplicación y disminuir los costos de
producción. El desarrollo de un sistema experimental para la regeneración de plantas vía
embriogénesis somática incluye las siguientes etapas: inducción de los embriones somáticos,
desarrollo de los embriones somáticos, proliferación, maduración, germinación y conversión.
La característica más distintiva de un embrión somático es que constituye un nuevo individuo
con estructura bipolar (raíz y brote) capaz de originar una planta completa (Seijo, 2003).
3.1.1.2 Organogénesis.
La regeneración de plantas por organogénesis, ha sido un método que ha demostrado ser
eficiente en la propagación comercial de muchas especies vegetales, el cual comprende el
desarrollo de yemas o de meristemos radicales a partir de los explantes directamente o a partir de
callos. Generalmente la regeneración por esta vía involucra 4 etapas de desarrollo: inducción y
desarrollo de yemas adventicias, alargamiento de yemas, multiplicación de brotes y
enraizamiento (OJEDA ZACARIAS, 1996)
15
3.2 Sistema de inmersión temporal (SIT)
Los problemas que presentan la micropropagación convencional pueden ser superados por
métodos alternativos, como los biorreactores cuyo principio básico es la inmersión periódica de
los explantes en el medio de cultivo, lo que permite el intercambio gaseoso dentro del recipiente.
Con este sistema los explantes son inmersos en el medio de cultivo sólo por un tiempo definido,
permitiendo la absorción de nutrientes por toda su superficie. El intercambio gaseoso se restaura
cuando el medio de cultivo es trasladado a recipiente de mantención (Damiano, Gentile, La
Starza, Frattarelli, & Monticelli, 2003).
3.2.1 Clases de sistema de inmersión temporal (SIT).
3.2.1.1 Biorreactores tipo RITA.
El sistema RITA consta de envases de un litro que comprenden dos compartimentos, uno
superior con las plantas y uno inferior con el medio. La sobrepresión aplicada en el
compartimento más bajo empuja el medio hacia el superior. Las plantas están sumergidas tanto
tiempo como la presión es aplicada. Durante el período de inmersión el aire es insuflado a través
del medio, agitando los tejidos suavemente y renovando la atmósfera dentro del frasco, con la
sobrepresión escapando a través de salidas en la parte superior del aparato (Etienne & Berthouly,
2002).
16
3.2.1.2 Biorreactores tipo BIT.
El sistema BIT es diseñado con dos recipientes transparentes de vidrio o plástico de un litro de
capacidad, uno de los cuales contiene el material vegetal de interés y el otro contiene los
nutrientes necesarios para el desarrollo de las plantas es decir el medio de cultivo líquido. Estos
dos recipientes se conectan mediante mangueras de silicona, el flujo aire pasa a través de
microfiltros de 0.2 µm. La presión que ejerce el aire permite que el medio líquido pase de un
recipiente a otro, sumergiendo totalmente las plántulas, posteriormente el flujo de aire se invierta
para devolver el medio líquido a su recipiente de origen (Oviedo-Pereira, Venutolo, & Lozano ,
2016)
Figura 2. Esquema del sistema de inmersión temporal tipo
RITA. Fuente: (Etienne & Berthouly, 2002)
17
3.2.1.3 Biorreactores tipo BIG.
El sistema de biorreactores de inmersión por gravedad, denominado con sus siglas BIG, es uno
de los prototipos de bajo costo, capacidad variable, permitiendo con ello disminuir los gastos de
inversión y electricidad del sistema neumático. Este sistema funciona de la siguiente manera,
ambos frascos estuvieron comunicados a través de mangueras de silicona, donde las condiciones
de esterilidad se lograron mediante el empleo de filtros hidrofóbicos de 0.2 m. Según el tiempo
programado, la válvula y el aire proveniente del compresor se abren para impulsar el medio de
líquido hacia la parte superior donde se encuentran los explantes a evaluar, este se mantiene allí
por un tiempo determinado y pasado este tiempo, el líquido regresa por gravedad al reservorio de
medio de cultivo (Bello, Spinoso, & Iglesias, 2014).
Figura 3. Representación del funcionamiento del sistema de
inmersión temporal BIT. Fuente:
file:///C:/Users/Usuario/Downloads/SIT_AADECA.pdf
18
3.3 Orquídeas
La orquídea es una planta Epifita de origen tropical perteneciente a la familia de las Orchidaceae,
denominada como una de las familias de plantas más numerosa que se distingue por la
complejidad de sus flores, por ende, forman parte del grupo de las plantas con flor;
Angiospermas. Las orquídeas son un grupo de plantas bastante diverso respecto a la gran
cantidad de formas y colores que poseen, y al número de especies que se conocen; de hecho, en
Colombia se han registrado 4270, lo cual ubica al país en el primer puesto en riqueza de este
tipo de plantas en el mundo (Torres & Castellanos, 2017)
3.3.1 Cattleya Schroederae.
Es esta la más fragante de las especies colombianas, con olor a vainilla y con gran importancia
en cuanto a lo ornamental. Puede crecer en agro ecosistemas arbolados y florece en los meses de
la temporada de verano, entre diciembre y marzo (Constantino, Calderon, & Julian, 2006)
Figura 4. Diagrama del sistema de inmersión por gravedad (BIG).Fuente:
file:///C:/Users/Usuario/Downloads/Vainilla_9%20(2).pdf
19
3.3.1.1 Ecología.
Crece en buenas condiciones cuando hay mucha luz solar y aire en movimiento, por ello se
ubican en las selvas húmedas estacionales del piedemonte o ladera oriental de la cordillera
Oriental, vertiente de la Orinoquia, Creciendo de manera epífita sobre árboles grandes
(Constantino, Calderon, & Julian, 2006)
3.3.1.2 Distribución geográfica.
En Colombia es exactamente en piedemonte llanero, en los departamentos de Meta, Casanare,
Arauca, Boyacá, Norte de Santander, Caquetá; desde 3° 30’ a 7° 15’ latitud norte, y desde 72° a
74° longitud Oeste; entre 500 y 1600 msnm. Exclusiva de Colombia (Constantino, Calderon, &
Julian, 2006).
Figura 5. Orquídea, Cattleya Schroederae. Tomada de:
Libro rojo de plantas de Colombia Eduardo Calderón Sáenz
editor, volumen 6 Orquídeas, primera Parte.
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Figura 6. Distribución geográfica (piedemonte llanero) de
hábitats de orquídeas. Tomada de: Libro rojo de plantas de
Colombia Eduardo Calderón Sáenz editor, volumen 6
Orquídeas, primera Parte.
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4. MARCO REFERENCIAL (ESTADO DE ARTE)
El desarrollo del sistema de inmersión temporal ha permitido avanzar en el campo de la
investigación, llevando así a ser un complemento con mejores características para técnicas
simples. Siendo esta una técnica complementaria al sistema de micropropagación in vitro
“convencional”, que traen consigo mismo una mejora en cuanto a la producción masiva tejidos
vegetales en condiciones controladas, permitiendo un mayor contacto entre la biomasa vegetal y
el medio y abriendo la posibilidad de controlar la composición del medio, así como la de la
atmósfera dentro del biorreactor (CURTIS, 2014).
Bello et al, 2014, demostraron en un estudio realizado con Vanilla planifolia (orquídea), la
eficiencia del protocolo de cultivo in vitro convencional en medio sólido con el sistema de
inmersión temporal en medio líquido en un tiempo de estudio de 30 días de cultivo. Donde se
proporcionó una tasa inducción de brotes en los dos sistemas evaluados. Sin embargo, el cultivo
en biorreactores resultó ser el más eficiente ya que permitió obtener 12 brotes por explante en
promedio, en cambio el cultivo en medio semisólido solo permitió obtener una tasa de
multiplicación de siete brotes por explante, llegando a concluir que el sistema de inmersión
temporal en biorreactores aumentó en 42% la tasa de multiplicación, comparado con el sistema
convencional.
Así mismo encontramos que Pérez, et al., para año 2011, en el Laboratorio de Biotecnología
Vegetal del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT), se ejecutó un estudio
aplicando el Sistema de Inmersión Temporal, con fines a incrementar el coeficiente de
multiplicación en el cultivo de plátano vianda, logrando demostrar un incremento notable en el
coeficiente de multiplicación y la calidad del material micro propagado a través del Sistema de
22
Inmersión Temporal con un tiempo de 10 minutos de inmersión y una frecuencia cada 3 horas (8
inmersiones al día) y un tiempo de cultivo de 18 días se garantizó el mejor comportamiento del
material.
Otra investigación realizada, con el propósito de generar una metodología que permita disminuir
los costos de producción por la exclusión del gelificante en los medios de cultivo, se evaluó el
cultivo en sistemas de inmersión temporal en la fase de multiplicación in vitro de guayabo
(Psidium guajava l). Para lo cual se comparó los sistemas de inmersión temporal de tipo BIT y
RITA y se evaluó el tiempo (1 y 2 min) y frecuencia (3 y 4 veces/día) de inmersión por un
tiempo de seis semanas de cultivo, teniéndose en cuenta las siguientes variables : número de
brotes (NB), numero de nudos (NN), longitud de brote (LB) y coeficiente de multiplicación
(CM), concluyéndose que los cultivos en el sistema de inmersión temporal (BIT Y RITA) en la
fase de multiplicación favoreció el crecimiento y la proliferación de brotes de guayabo (Vilchez
& Albany, 2014).
Con el fin de encontrar nuevas alternativas o herramientas para reducir los costos de producción
en el cultivo a escala, también se han desarrollado investigaciones para determinar el proceso de
propagación de inmersión temporal más eficiente para el escalamiento de la producción masiva
de Stevia rebaudiana, la cual es una planta de la región de Sudamérica, propia de Paraguay,
utilizada para fines comerciales, por ende se emplearon medios líquidos en sistemas de
inmersión temporal automatizado (RITA® y BIT) para el proceso de micropropagación,
obteniendo como resultado “ Que La mayoría de los tratamientos en los sistemas de inmersión
temporal BIT y RITA produjeron plantas vigorosas con bajos niveles de hiperhidricidad, mayor
número promedio de hojas y brotes, así como un crecimiento activo con mayor masa seca
23
promedio, lo cual saca una gran ventaja en comparación con la micropropagación convencional o
también llamada tradicional (Venutolo & Aguilar Salazar, 2015)
Otro estudio, en el cual se estableció un protocolo para la multiplicación del clon de malanga
"Viequera" justo con el mismo sistema de inmersión temporal, se evaluó el efecto de tres
tiempos de inmersión (7, 14 y 21 minutos), tres frecuencias de inmersión (2, 4 y 6 horas por día),
cuatro volúmenes de medio de cultivo (5, 10, 15 y 20 ml por brote inicial) y cuatro tiempos de
cultivo (15, 18, 21 y 25 días) en la multiplicación de los brotes de yemas axilares. Dicho lo
anterior; el mejor comportamiento del material y el coeficiente máximo de multiplicación
alcanzado, se lograron con un tiempo de 14 minutos de inmersión cada 4 horas, una densidad de
ocho brotes de yemas axilares, con un volumen de 15 ml de medio de cultivo por brote y un
tiempo de cultivo de 18 días, lo cual el protocolo propuesto aumenta la productividad del
material propagado en comparación con los desarrollados en medios de cultivo semisólidos, lo
que representa una reducción en los costos de producción al introducir la multiplicación del
cultivo en laboratorios comerciales de propagación (Santos Pino, et al., 2011)
Es importante resaltar que para el funcionamiento efectivo de un sistema de inmersión temporal
(SIT) deben existir condiciones óptimas de cultivo, además de factores ambientales como
intensidad lumínica y temperatura, se debe considerar la frecuencia y tiempo de inmersión,
densidad del cultivo, volumen del medio y composición y duración del cultivo, por consiguiente,
se deben determinar para cada especie y etapa de desarrollo. Es evidente la gran importancia que
ha tornado esta nueva alternativa de micropropagación a partir del uso de biorreactores, dando
nuevos desarrollos para conservación masiva de especies o simplemente producción a gran
escala para fines comerciales. Es por ello que todos los estudios realizados han arrojado
resultado positivo, en cuanto a la tasa de multiplicación, numero de brotes, etapa de a
24
climatización, baja hiperhidricidad en los tejidos entre otros aspectos, de diferentes géneros y
especies de plantas, como se expresó anteriormente.
25
5. HIPÓTESIS
5.1 Hipótesis nula
El efecto del tiempo y frecuencia de inmersión, no genera un coeficiente de multiplicación en la
orquídea Cattleya schroederae bajo el sistema de inmersión temporal.
5.2 Hipótesis alternativa
El efecto del tiempo y frecuencia de inmersión, genera un coeficiente de multiplicación en la
orquídea Cattleya schroederae bajo el sistema de inmersión temporal.
26
6. OBJETIVOS
6.1 Objetivo general
Estandarizar el sistema de inmersión temporal para la micropropagación de la orquídea Cattleya
schroederae.
6.2 Objetivos específicos
Establecer las condiciones operacionales del biorreactor del sistema de inmersión temporal.
Evaluar las variables para la micropropagación de Cattleya schroederae en el sistema de
inmersión temporal.
27
7. METODOLOGÍA
7.1 Diseño de estudio
Este proyecto de investigación se basó en un estudio de tipo descriptivo- experimental, ya que
evidencia la estandarización de un sistema de inmersión temporal para la micropropagación de
una especie de orquídea (Cattleya schroederae) en el laboratorio; además de experimental, ya
que se manipuló variables como tiempo y frecuencia de inmersión para determinar cuáles son las
mejores condiciones de micropropagación de Cattleya schroederae en tal sistema.
7.2 Ubicación
Se ejecutó en los laboratorios correspondientes a la universidad de Santander (UDES),
específicamente en el laboratorio de tejidos vegetales ubicado en el edificio chibcha, 1er piso.
7.3 Población y muestra
Población: Plantas de la familia Orchidaceae. Muestra: Se trabajaron con 42 explantes de
Cattleya schroederae, de 2 meses de fase de establecimiento cedidas por el laboratorio de tejidos
vegetales de la UDES.
7.4 Fases de investigación
28
7.4.1 Establecimiento de las condiciones operacionales de los biorreactores del sistema de
inmersión temporal.
El diseño del biorreactor se realizó basado en lo descrito por (Monroy Álvarez & Filgueira
Duarte, 2010) en el año 2010, en un estudio acerca de la organogénesis directa del clavel en
medio líquido, utilizando un sistema de biorreactores. Lo cual se tomó como guía para la
construcción, acondicionamiento y funcionamiento del sistema inmersión temporal (Anexo A).
7.4.2 Evaluación de las variables para la micropropagación de Cattleya schroederae.
Para esta etapa se establecieron seis (6) tratamientos con diferentes tiempos y frecuencias de
inmersión, además de la utilización del carbón activado (Tabla 1), para deducir tal eficiencia de
cada tratamiento, se realizaron las siguientes mediciones en el SIT: Oxidación, hiperhidricidad,
número de brotes, número de hojas, altura y peso.
Tabla N º1. Tiempos y frecuencias de inmersión a evaluar en los sistemas de inmersión temporal
VARIABLES
Sistema Inmersión
Temporal 1
(SIT-1).
Sistema Inmersión
Temporal 2
(SIT-2).
Sistema Inmersión
Temporal 3
(SIT-3).
Tratamiento 1
Carbón
Activado
Tratamiento 2 Tratamiento 3
Carbón
Activado
Tratamiento 4 Tratamiento 5
Carbón
Activado
Tratamiento 6
Frecuencia
De
Inmersión
6 horas
6 horas
4 horas
4 horas
12 horas
12 horas
Tiempo De
Inmersión
3 minutos
3 minutos
8 minutos
8 minutos
13 minutos
13 minutos
29
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1 Establecer las condiciones operacionales del biorreactor del sistema de inmersión
temporal
Se desarrolló un prototipo de sistema de biorreactores de inmersión temporal por gravedad semi-
automático para la micropropagación de tejidos de Cattleya schroederae, construyéndose en
total tres sistemas de inmersión temporal (anexo B), cada sistema de inmersión temporal estaba
compuesto por frascos de vidrio con capacidad de un litro, que funcionaban como biorreactores
que contenían el medio de cultivo líquido, donde la tapa de plástico de estos mismos frascos
tenían adaptado dos pasamuros de doble entrada, que funcionarían como conectores, acoplando
las mangueras neumáticas, que se encargarían de la distribución del aire, con el fin de hacer
circular el medio de cultivo liquido presente en los biorreactores de vidrio (reservorio de medio
de cultivo liquido) hacia los biorreactores de plástico de un litro de capacidad, siendo este
último un segundo biorreactor donde se encuentra depositado los explantes a evaluar (figura 7).
El aire era proporcionado por una bomba de 12 voltios adaptada al sistema.
30
Por otro lado, la parte automática del prototipo de sistema inmersión temporal, generaba las
señales (ON y OFF) por tiempos determinados de la siguiente manera: este comienza desde la
toma de corriente 110 v y va alimentado con un adaptador de 12 Vdc, de ese voltaje de 12 Vdc
se extrae un cableado que pasa por el relee y alimenta el motor, el otro cableado, entra al
A
B
C
D
E
F
Figura 7. Prototipo de sistema de inmersión temporal. Constituido por
frascos de vidrio, lo cuales funcionaban como biorreactores que contenía el
medio de cultivo líquido (A). Bomba de aire de 12 voltios, que alimenta al
sistema con aire (B). Pasamuros, que funcionan como acople para las
mangueras neumáticas presentes en el sistema (C). Mangueras (D).
Biorreactores de plástico, donde se encontraban los explantes a evaluar (E).
Caja de control de configuración de tiempos.
31
convertidor dc-dc para tener una salida de entre 7 y 7.5 Vdc que va a alimentar al arduino, a su
vez el arduino alimenta con 5V los demás componentes. La conexión del arduino al teclado va
con Jumpers macho-macho, y la conexión al módulo relee y display va con Jumpers macho--
hembra, por aparte se implementa un pequeño circuito alimentado con 5 v con un potenciómetro
de 10 K, este circuito es para controla el brillo del display con el potenciómetro (anexo C).
8.2 Evaluación de las variables para la micropropagación de Cattleya schroederae en el
sistema de inmersión temporal
8.2.1 Material vegetal.
Para el inicio de este estudio, se trabajaron siete (7) explantes de Cattleya schroederae por
tratamiento (anexo D), los cuales tenían dos meses de establecimiento. Además de realizarse un
proceso de desinfección con solución jabonosa (tiempo: 20 Minutos), alcohol (tiempo: 15
minutos) y glutaraldehído (tiempo: 15 minutos), con lavados intermedios utilizando agua estéril
(Procedimiento tomado del laboratorio de tejidos vegetales de la universidad de Santander
UDES).
El medio de cultivo líquido utilizado en el presente estudio, fue un medio de cultivo
estandarizado por el laboratorio de tejidos vegetales (anexo E), la cantidad de medio agregado al
sistema de biorreactores de inmersión temporal fue de 250 mL. Luego los explantes a evaluar
fueron inoculados en los sistemas, de manera aséptica y controlada, mediante el uso de la cabina
de flujo laminar, con fines a mantener la esterilidad del sistema y de los explantes previamente
desinfectados, finalmente fue llevado al área de incubación ubicado en el laboratorio de tejidos
32
vegetales de la universidad de Santander, el cual tenía las siguientes condiciones de temperatura
18 °C y humedad relativa 55%.
8.2.2 Medición de las variables.
Después de realizado el estudio se generaron los siguientes resultados:
8.2.2.1 Número de brotes.
De acuerdo a la Figura número 8, se observa que hay diferencias significativas p>0,05 (anexo F)
Por consiguiente se puede inferir que el tratamiento número uno (T1), tuvo el mejor desarrollo en
cuanto a un número de brotes, obteniendo una media de 3,39 brotes/explante, a diferencia del
tratamiento dos (T2) con una media de 2,13. Así mismo, el tratamiento que presentó menor
coeficiente de multiplicación de brotes/explante fue el tratamiento cuatro (T4) con una media de
1,30 brotes/explante. Lo anterior se explica posiblemente, a la presencia del carbón activado en
Figura 8. Efecto del sistema del sistema inmersión temporal
sobre el número de brotes.
33
el tratamiento número uno ( La concentración de carbón activado trabajada fue de 4.5% ), ya que
este compuesto ejerce un efecto positivo en el crecimiento, como lo explica (Pedroza Manrique,
2009) donde indica que el carbón activado es una sustancia que al ser adicionada al medio de
cultivo, incide de manera positiva sobre la tasa de desarrollo de los protocormos de una especie
de orquídeas, bajo condiciones de cultivo in vitro. Por ende, el carbón activado administrado en
bajas concentraciones a los medios de cultivo, dosis que pueden variar desde los 0,5 a 5,0 g.L-1,
estimula los procesos de desarrollo morfo genético en diferentes orquídeas.
Por otra parte, se resalta que ninguno de los tratamientos evaluados generó ningún tipo de
oxidación, esto es debido a la presencia de los agentes antioxidantes presentes en el medio de
cultivo líquido, tales como ácido ascórbico y ácido cítrico los cuales ejercen un control al cambio
en la coloración del tejido vegetal en el cultivo in vitro.
8.2.2.2 Número de hojas.
Figura 9. Efecto del sistema del sistema inmersión
temporal sobre el desarrollo de hojas.
34
De acuerdo a la figura número 9, se logró observar que el tratamiento número uno (T1) presentó
diferencias significativas con respecto a los demás tratamientos p< 0.05 (anexo G), ya que se
evidencia que el tratamiento uno, presentó mejor desarrollo de hojas con respecto al tratamiento
número seis, con valores de 3 hojas/ explante y 2.43 hojas/explante, respectivamente. Las hojas
obtenidas en el tratamiento número uno presentó una muy buena pigmentación verde además de
presentar hojas con características vigorosas, es decir fueres, robustas y con buena apariencia
saludable (libre de contaminación u otros factores) además de no presentar hiperhidricidad
(figura 10), el cual se define como un desorden morfológico y fisiológico asociado a una
excesiva hidratación. Lo dicho anteriormente se debe posiblemente al uso de biorreactores y
tiempos adecuados, lo cual es afirmado por (Venutolo & Aguilar Salazar, 2015) en donde
asevera que el uso de sistemas de inmersión temporal aumentan el número promedio de
regeneración de hojas y aseguran que el tiempo de inmersión y frecuencia de inmersión son
variables muy importante, ya que determina la tasa de absorción de nutrientes y controla la
hiperhidricidad.
Figura 10. Explantes y hojas obtenidas en el
tratamiento número uno del sistema inmersión
temporal.
35
8.2.2.3 Altura.
En cuanto a la altura, se observó una diferencia significativa de p>0,05 (anexo H) entre los
tratamientos, donde nuevamente el tratamiento número uno (T1), presentó plántulas con un
promedio de altura de 2,91, valor que está por encima de los demás tratamientos (figura 11). Lo
dicho anteriormente se debe a que el tiempo y frecuencia de inmersión en el sistema de
inmersión temporal es un factor trascendental que influye de forma significativa en el desarrollo
de los explantes en criterios tales como la altura, esto es contrastado por (Perez, et al., 2013), en
un estudio para la micropropagación del cultivar del plátano vianda, en el que explica que al
utilizar frecuencias de inmersión de 6 horas y tiempos de inmersión cercanos a 10 minutos en el
sistema de inmersión, va a facilitar una mayor eficiencia en la asimilación de nutrientes por los
explantes y este influirá de manera significativa en la altura de los explantes.
Figura 11. Efecto del sistema del sistema
inmersión temporal sobre la altura.
36
8.2.2.4 Peso.
Finalmente encontramos que el peso obtenido, pasadas las siete semanas de evaluación, fue
mayor en el tratamiento número uno, presentando diferencias significativas P<0.05 en
comparación a los demás tratamientos (anexo I) presentando una media, específicamente de 0,13
gr/explante (figura 12). lo cual comparado con un estudio realizado por ( Quiala, et al., 2014)
obtuvieron los mejores resultados para el peso fresco al utilizar frecuencia de inmersión de 6
horas y 4 horas en sistemas de inmersión temporal de un litro de capacidad, alcanzando
significativamente más biomasa en los brotes sumergidos. Esto debido al uso de biorreactores
junto con el uso de medios de cultivo liquidos y variables adecuadas u optimas, aceleran de
manera satisfactoria el desarrollo de los explantes (Perez, et al., 2013), permitiendo una mayor
absorción de nutrientes, lo que mejora la parte morfo genética y el crecimiento del material
vegetal.
Figura 12. Efecto del sistema del sistema inmersión
temporal sobre el peso.
37
También se logra ratificar la posibilidad de que el carbón activado junto con tiempo y frecuencia
de inmersión apropiada, influye sobre el desarrollo de los explantes, ya que los tratamientos
número uno, tres y cinco, los cuales contenían carbón activado, fueron aquellos que presentaron
mejor desarrollo en cuanto a los demás tratamientos (figura 12).
A manera importante, el mecanismo del carbón activado en una planta actúa funcionando al
combinarse con el hidrógeno y con el oxígeno y en esta combinación polar, también se combina
con sí mismo. En múltiples de sus inter-combinaciones el carbón, suministra la base de un
sinnúmero de sustancias orgánicas halladas en la naturaleza, que sirven de base para en la
construcción de sustancias corporales de los organismos vivos; una de estas sustancias son los
carbohidratos. En la construcción de ellos claramente se aprecia la doble función del carbón,
alternando en los estados de construcción de almidones y azúcares (Mendez, 2017). Siendo estos
compuestos de gran importancia para el desarrollo de las plantas con muy buenas características
en el criterio morfo genético de los tejidos vegetales.
38
9. CONCLUSIONES
Se logró la construcción y estandarización de un prototipo del sistema de inmersión temporal
(SIT) de tipo BIG en el laboratorio de tejidos vegetales de la universidad de Santander.
Se evidenció que la micropropagación de explantes de Cattleya schroederae a partir del uso de
biorreactores, mediante la aplicación de sistemas de inmersión temporal (SIT), ES VIABLE, ya
que se obtienen explantes con muy buenas características, sin alteraciones o cambios fisiológicos
en su desarrollo, tales como, oxidación e hiperhidricidad, además de presentar resultados
significativos en cuanto al número brotes, número de hojas, altura y peso.
Se estableció que frecuencia de inmersión (F.I) de cada 6 Horas (4 veces/día) y un tiempo de
inmersión de 3 minutos, presentan un efecto positivo en el desarrollo y micropropagación de
tejidos vegetales de Cattleya schroederae.
Se deduce el efecto positivo que tiene el carbón activado al ser suministrado en bajas
concentraciones a los medios de cultivo, ya que al adicionarse tal sustancia mejora la tasa de
desarrollo y crecimiento.
39
10. RECOMENDACIONES
Generar nuevas mediciones de variables al prototipo con el fin de mejorar aún más el
proceso in vitro de los explantes, no solo de orquídeas sino de otros géneros de plantas.
Optimizar el diseño de los biorreactores del prototipo de sistema inmersión temporal para
fortalecer nuevos estudios en el ámbito in vitro.
40
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42
12. ANEXOS
ANEXO A. Materiales utilizados para el proceso de construcción de los biorreactores del
sistema de inmersión temporal.
Nombre Descripción Cantidad Unidad
Frascos de vidrio Con capacidad de 1000 mL 2 Unidades
Manguera azul neumática
Grosor 8 mm 1 Metros
Tarros de plástico Con capacidad de 1000 mL 2 Unidades
Pasamuros De doble entrada de 8 mm 2 Unidades
Racores Entrada sencilla 8 mm 2 Unidades
O-rings 6 Unidades
43
ANEXO B. Sistemas de inmersión temporal (SIT-1, SIT-2) construidos y adaptados al
laboratorio de tejidos vegetales de la universidad de Santander (UDES).
44
ANEXO C. Diagrama de la programación realizada para que los sistemas de inmersión temporal
(SIT-1, SIT-2, SIT-3), encendieran y apagaran de manera automática por tiempos específicos.
45
ANEXO D. Explantes con los que se inició el estudio (Tenían dos meses de establecimiento,
tomados del laboratorio de tejidos vegetales, universidad de Santander UDES), los cuales se
introdujeron en los tres sistemas de inmersión temporal.
46
ANEXO E. Medio de cultivo líquido utilizado en el presente estudio, medio de cultivo
estandarizado por el laboratorio de tejidos vegetales.
47
ANEXO F. Cuadro de análisis de varianza y diferencias significativas en cuanto al
número de brotes de los seis tratamientos (T1, T2, T3, T4, T5, T6) correspondientes a
los tres sistemas de inmersión temporal (SIT-1, SIT-2, SIT-3).
48
ANEXO G. Cuadro de análisis de varianza y diferencias significativas en cuanto al
número de Hojas de los seis tratamientos (T1, T2, T3, T4, T5, T6) correspondientes a
los tres sistemas de inmersión temporal (SIT-1, SIT-2, SIT-3).
49
ANEXO H. Cuadro de análisis de varianza y diferencias significativas en cuanto a la
altura de los seis tratamientos (T1, T2, T3, T4, T5, T6) correspondientes a los tres
sistemas de inmersión temporal (SIT-1, SIT-2, SIT-3).
50
ANEXO I. Cuadro de análisis de varianza y diferencias significativas en cuanto a su
peso de los seis tratamientos (T1, T2, T3, T4, T5, T6) correspondientes a los tres
sistemas de inmersión temporal (SIT-1, SIT-2, SIT-3).