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Jorge Monserrat Sanz

Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas

de la inmunofluorescenciay la citometría de flujo

Asignatura de InmunologíaUniversidad de Alcalá

Unidad mixta

CSIC/UAH


Objetivos• 1. Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la

heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune.

• 2. Conocer los fundamentos de la citometría de flujo.

• 3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se realizan mediante la citometría de flujo.

• 4. Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de flujo.

• 5. Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica.

• 6. Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononuclearesmediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos.


• 7. Adquisición en un citometro de flujo.

• 8. Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantesdel ADN.

• 9. Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo: Comprender las etapas en el proceso de la informaciComprender las etapas en el proceso de la informacióón obtenida por n obtenida por citometrcitometrííaa

• 10. Resolución de diferentes problemas clínicos reales.

• 11. Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e interpretación de intensidades medias de florescencia de célulaslinfocitarias obtenidas de distintos casos patológicos reales.

• 12. Interpretación de los resultados obtenidos.

Objetivos


¿Qué debe ser el alumno al terminar el curso?

• Que después del curso el alumno sea:

1. Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la citometría de flujo.

2. Eficiente preparando muestras para citometría y diseñando experimentos de citometría analítica y separativa.

3. Usuario competente y autosuficiente del citómetro de flujo analizador capaz de puesta a punto, adquisición y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones problemáticas (compensación, flujo)

4. Analizador crítico conocedor de las posibilidades de los software de análisis y exportación de datos.


Prácticas de Inmunología Clínica• Primer día: Seminarios Interactivos:

1. Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo.2. Aplicaciones de la citometría de flujo.3. Citómica: Aplicaciones clínicas

• Segundo y tercer día:1. Dos actividades simultáneas (2 horas):

- Realización de una separación célular de células mononucleares de sangre periférica.- Contaje de las células.

2. Citómetro de flujo: Fundamentos y utilización de un citómetro de flujo (2 horas).3. Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre periférica (2 horas):

a. Marcaje de superficie.b. Viabilidad (7add).c. Anexina V.

• Cuarto día (4 horas):– Análisis de imágenes de citometría de flujo. Problemas.


Relevancia

1. Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología:Conocimiento y búsqueda de información de carácter

pronóstico

2. Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía de toda la comunidad científica biomédica


Heterogeneidad celular en el sistema inmune

CD19CD19

CD3CD3

CD56CD56

CD4CD4 CD8CD8

CD2CD2

CD45

CD14

CD45RACD45RA CD45RACD45RA CD45RACD45ROCD45RO CD45ROCD45RO

CD15

NeuNeuMonoMonoBBNKNKT4T4 T8T8


Criterios de caracterizaciCriterios de caracterizacióón de los tipos celularesn de los tipos celulares

•• CelularesCelulares–– MorfologMorfologíía al microscopio.a al microscopio.

•• MolecularesMoleculares–– GenotGenotíípicopico. (Genoma) Recombinaciones som. (Genoma) Recombinaciones somááticasticas–– FenotFenotíípico (pico (ProteomaProteoma) ) RNARNA expresado, expresado, proteproteíínas.nas.–– CitomaCitoma: An: Anáálisis estadlisis estadíístico stico multimulti--celular.celular.

-- AntAntíígenos de diferenciacigenos de diferenciacióón linfocitarian linfocitariaLos antLos antíígenos de superficie pueden ser utilizados como genos de superficie pueden ser utilizados como marcadores marcadores

especespecííficosficos de lde lííneas, tipos y subtipos celulares. neas, tipos y subtipos celulares.


Para estudiar la heterogeneidad celular Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias tson necesarias téécnicas:cnicas:

•• 1. Con resoluci1. Con resolucióón a nivel de cn a nivel de céélula individual lula individual

•• 2. Que caractericen la c2. Que caractericen la céélula en funcilula en funcióón de varias n de varias caractercaracteríísticas (parsticas (paráámetros). metros). X, Y, Z...X, Y, Z...

•• 3. Capaces de realizar medidas en n3. Capaces de realizar medidas en núúmeros representativos meros representativos de cde céélulas. lulas. 100 c100 céélulas error lulas error ±± 10%,10%, 10.000 error 10.000 error ±± 1%1%

•• 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y reducir toda esa informacireducir toda esa informacióón sobre cn sobre céélulas individuales en lulas individuales en conclusiones conclusiones úútiles acerca de las poblaciones celulares.tiles acerca de las poblaciones celulares.

Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024

4C5144001 FSC-Height ->

GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+

MonocitosMonocitosCD14+CD14+

LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+

Τ2αβΤ2αβΤ1γδΤ1γδCD4+CD4+CD8+CD8+

CD56+CD56+CD19+CD19+

CD5+CD5+CD5CD5--

MorfologMorfologíía y anta y antíígenos de diferenciacigenos de diferenciacióón en el ann en el anáálisis de lisis de la heterogeneidad celularla heterogeneidad celular


Fases de la Fases de la citometríacitometría: : 1. Pre-citometría:

1. Anticuerpos monoclonales y sondas:1. Estudio a nivel tisular2. Estudio a nivel celular

2. Técnicas de separación celular3. Técnicas en Inmunofluorescencia

2. Citómetria(Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Genética Molecular…)

3. Análisis cuantitativo4. Análisis biológico.


Anticuerpos como herramientas en investigación

• Ventaja• Capacidad de reconocimiento muy específica• Detección muy sensible picomolar• Inconveniente• Son invisibles

– Conjugación con moléculas “reporter”• Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 1977

• Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica

• Moléculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometría de flujo, LSC.


Técnicas de separación celular

• Gradientes de densidad: Medios de densidad constanteGradientes continuos o discontinuos

• Elutriación centrifuga• Sorting: - Magnético

- Sorter

-- Células en tejidos:Células en tejidos:

-- Células en disolución::

1. Inmunohistoquímica2. Procesamiento mécanico3. Separación por mallas y filtros


Técnica de separación mediante Técnica de separación mediante FicollFicoll--HypaqueHypaque


DirectoDirecto IndirectoIndirecto BiotinadoBiotinado11

22

11

22

11bb

bb

bbbb bb

bb

bbbb

bb

bb bb

bb

Tipos de marcajes inmunofluorescentes


Microscopia de fluorescenciaMicroscopia de fluorescencia


FUNDAMENTOS DE LA

CITOMETRÍA DE FLUJO


¿Qué es la citometría de flujo?

FSC

90º90º2- 4º

Columna de muestra

Meeting Meeting pointpointLáserLáser

Detecto

res de lu

z

Detecto

res de lu

z

AmplificaciónAmplificacióndigitalizacióndigitalización

RepresentaciónRepresentacióny y AnalisisAnalisis

FlujoFlujo


VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJOVENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO-- Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de

células individuales (miles).células individuales (miles).

-- Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y enAumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en

la precisión de las medidas.la precisión de las medidas.

-- A menor tiempo de dedicación mayor productividad. A menor tiempo de dedicación mayor productividad.

DESVENTAJASDESVENTAJASLa citometría de flujo no aporta información sobre la distribuciLa citometría de flujo no aporta información sobre la distribución ón

espacial de las células estudiadas.espacial de las células estudiadas.


CitómetroCitómetro de de flujoflujo


¿Cómo funciona un citómetro?• Sistema de flujo• Dispersión de la luz• Fluorescencia• Separación y detección de la luz• Amplificación• Corrección de errores: solapamiento espectral y formación

de dobletes• Digitalización y almacenamiento de la información


SISTEMA DE ABSORCION DE SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRAMUESTRA

MUESTRAMUESTRA

AIREAIRE

FLUJOFLUJOMUESTRAMUESTRA


Cámarade flujo

FSC

90º90º

Fluido envolvente

Columna de muestra

Luz dispersada lateralmente Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, y luz fluorescente, α α = 90= 90º

Luz incidenteLuz incidente

Luz dispersada hacia delante, Luz dispersada hacia delante, αα==2- 4º


INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZINFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ

-- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:-- LUZ REFLEJADA O DIFRACTADALUZ REFLEJADA O DIFRACTADA

-- PROPIEDADES FLUORESCENTES:PROPIEDADES FLUORESCENTES:-- FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…) FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…)


Luz dispersada a 90 grados

Detector

Detector de 90º

Laser


DETECCION DE LUZ DISPERSADA DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD HACIA DELANTE (FORWARD

SCATTERED LIGHT, FSC)SCATTERED LIGHT, FSC)

FSCFSC

SSCSSC

El detector de FSC El detector de FSC convierteconvierte luzluz dispersadadispersada haciahaciadelantedelante en un en un pulsopulso de de voltajevoltaje proporcionalproporcional al al tamañotamaño

de la de la célula/particulacélula/particula


DETECCION DE LUZ DISPERSADA DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,

SSC)SSC)

FSCFSC

SSCSSC

El detector de SSC El detector de SSC convierteconvierte la la luzluz dispersadadispersada lateralmentelateralmenteen un en un pulsopulso de de voltajevoltaje proporcionalproporcional a l a l contenidocontenido en en

orgánulosorgánulos membranososmembranosos ((granularidadgranularidad))

Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024

4C5144001 FSC-Height ->

GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+

MonocitosMonocitosCD14+CD14+

LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+

Τ2αβΤ2αβΤ1γδΤ1γδCD4+CD4+CD8+CD8+

CD56+CD56+CD19+CD19+

CD5+CD5+CD5CD5--

MorfologMorfologíía y anta y antíígenos de diferenciacigenos de diferenciacióón en el ann en el anáálisis de lisis de la heterogeneidad celularla heterogeneidad celular


Laser

Detectores de fluorescencia

Freq

Fluorescencia

Detector

Detector de fluorescencia(PMT3, PMT4 etc.)


Fluorescencia

FSCFSC

FLFL--11

FLFL--22


Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 PercpPercp


Fluorescencia• Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su

energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.• Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los

distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.

t (t (μμss))

EE

λλ11<<λλ22

λλ 11

λλ 22


Espectros• Espectro de Absorción

– Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia.

• Espectro de Emisión– Representación de la intensidad de emisión de una sustancia

excitada con luz de una determinada longitud de onda.

λ (nm)

excitaciónexcitación medidamedida

Inte

nsid

a d d

e In

ten s

ida d

de

fluor

e sce

nci a

fluor

e sce

nci a


FluoresceinaFluoresceina (FITC)(FITC)

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relat

ive I

nten

sity

Wavelength

ProteinasProteinas

ExcitaciónExcitación EmisiónEmisión300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm


EtidioEtidio

PEPE

AcidoAcido ParináricoParinárico

Texas RedTexas Red

PEPE--TR Conj.TR Conj.

PIPI

FITCFITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Laseres

comunes


FluorocromosFluorocromos


SondasSondas


Proceso de señales• 1. Separación de señales luminosas

• 2. Detección de señales luminosas

• 3. Amplificación de señales eléctricas

• 4. Corrección de errores – Compensación de señales

– Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).

•• 6. Transformaci6. Transformacióón de sen de seññales elales elééctricas analctricas analóógicas en digitalesgicas en digitales

•• 7. Almacenamiento matricial (7. Almacenamiento matricial (listlist modemode) de la informaci) de la informacióón n resultanteresultante


PMT

PMT

PMT

PMT

FiltrosDicroicos

BandpassFiltros

Optica en los citómetros de flujo

Laser

1

2

3

4

Flujo Celular


DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIATC

PerCPQR

Cy5APC

FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores

FluorocromosFluorocromos


Amplificación de señales

• Lineal• (intervalos regulares) • apropiada para:

– Señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)

– Con distribuciones con picos estrechos como el contenido en DNA.

• Logarítmica • (intervalos crecientes)

– Cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000).

1001001010 200200

100100 2002001010 10001000

101011 2020

100100 2002001010 10001000


EscalasEscalas

FSC FSC EjEj: Lineal: Lineal FLFL--1 1 EjEj: Logarítmica: Logarítmica


Compensación de señales• Fundamento Superposición de

espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un

fluorocromo es leída por el detector de otro color

• Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color

• FL-2 - %FL1

λλ

excitaciónexcitación

medidamedida

Inte

nsid

a d d

e fl u

ores

cenc

i aIn

ten s

ida d

de

fl uor

esce

nci a

FLFL--11 FLFL--22


Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos)

• Señal analógica (V)• Altura de señal (H)• Anchura de señal (W)• Área de señal (A)

• En base a la información de área y anchura se pueden detectar dobletes (dos células que pasan juntas).

WWAA

HH

tt

VV

2 2 xWxW


DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓNDE INFORMACIÓN

NN

1122334455667788......

1000010000

FSCFSC

2222334433442222......

SSCSSC

1111222211223388......

FLFL--11

1111334411112211......

FLFL--22

1122331122331122......

FLFL--33

1133334411113344......

FLFL--44

2222333355551122......

TIEMPOTIEMPO

1111111122222222......

Los Los pulsospulsos dede““VoltajeVoltaje””(se(seññalesales analanalóógicasgicas) son ) son transformadastransformadas en en seseññalesales digitalesdigitalesLas seLas seññales digitales ales digitales almacenanalmacenan en un soporte informen un soporte informáático en modo listado tico en modo listado

(almacenamiento (almacenamiento multiparammultiparaméétricotrico).).


PROCESO DE INFORMACION

HistogramasHistogramasDiagramasDiagramas biparamétricosbiparamétricos


Proceso de la información generada

• Representación de la información

• Selección de la información

• Reducción de la información

• De la célula a la población celular


RepresentaciRepresentacióón n monoparammonoparaméétricatrica de datos.de datos.Histogramas. Histogramas. Se representa en cada valor de x Se representa en cada valor de x

(intensidad de fluorescencia) el n(intensidad de fluorescencia) el núúmero de mero de ccéélulas que emiten esa intensidad.lulas que emiten esa intensidad.

M1


HistogramasHistogramas

SSCSSC

FSCFSC

FLFL--11

FLFL--22

FLFL--33


Representación Representación biparamétricabiparamétrica en 2Den 2D

Diagrama de puntos / dot plot

+

+--

RepresentaciRepresentacióón simultn simultáánea nea de dos parde dos paráámetros metros XX e e YY..

XX representa el valor de la representa el valor de la seseññal de un paral de un paráámetrometro. .

YY representa el valor de la representa el valor de la seseññal del otro.al del otro.

++-

-FLFL--11

FLFL-- 22


RepresentaciRepresentacióón 3D n 3D CountourCountour plotplot / / Diagramas de contornos

X, Y mX, Y máás una tercera dimensis una tercera dimensióón.n.

Una superficie tridimensionalUna superficie tridimensionalLa altura representa el nLa altura representa el núúmero de mero de ccéélulas con una determinada lulas con una determinada combinacicombinacióón de ambos n de ambos parparáámetros.metros.


Diagrama de dot plot density


SelecciSeleccióón de subpoblaciones n de subpoblaciones definidas en diagramas definidas en diagramas monoparammonoparaméétricostricosSitSitúúan los valores lan los valores líímite superior e mite superior e inferior de un parinferior de un paráámetro que metro que definen a las cdefinen a las céélulas de interlulas de interéés.s.

SelecciSeleccióón de la informacin de la informacióónnGatesGates (Puertas) / ventanas ((Puertas) / ventanas (windowswindows))

M1

M2


GatesGates biparambiparaméétricostricos..

Se pueden utilizar puertas Se pueden utilizar puertas biparambiparaméétricastricas definidas en base a la definidas en base a la combinacicombinacióón de los valores de dos n de los valores de dos parparáámetros metros

Se emplean para estudiar las Se emplean para estudiar las caractercaracteríísticas de subpoblaciones sticas de subpoblaciones celulares celulares

R1

R2

R3

R4


GatesGates llóógicos / Puertas lgicos / Puertas lóógicasgicasPueden combinarse distintas puertas y emplearse simultPueden combinarse distintas puertas y emplearse simultááneamente como neamente como

criterio para seleccionar las ccriterio para seleccionar las céélulas de interlulas de interéés. s.

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

LINFOCITOSLINFOCITOSMONOCITOSMONOCITOS

GRANULOCITOSGRANULOCITOS

TAMAÑOTAMAÑO

CO

MPL

EJI

DA

D C

EL

UL

AR

CO

MPL

EJI

DA

D C

EL

UL

AR

R5 R5 andand R1R1

T

NK

TK


¿Qué significa la realización de un “gate” electrónico?¿Qué significa la realización de un “gate” electrónico?

N

12345678...

10000

FSC

22343422...

SSC

11221218...

FL-1

11341121...

FL-2

12312312...

FL-3

13341134...

FL-4

22335512...

TIEMPO

12345678...


Estadisticasmonoparamétricas

M1

M2

Histogram Statistics

Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median PeakAll 1, 9910 9917 100.00 99.17 1027.48 827.78 37.34 1113.97

M1 685, 9910 8725 87.98 87.25 1153.33 1139.97 16.01 1144.44M2 14, 685 1192 12.02 11.92 106.29 79.55 95.61 66.12

File: ap-24h.011 Log Data Units: Linear ValuesTube: Panel: Acquisition Date: 26-Apr-99 Gate: G3Gated Events: 9917 Total Events: 10000X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log)

Análisis de la información.Análisis de la información.


Estadisticas biparamétricas• Cuadrantes Combinación de dos

umbrales de positividad para dos

parámetros

• Número de células

• % de células

• MFI mean, geo mean

+--

++

-

+-

Quadrant Statistics

File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17

Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43


Estadística por regiones

• Selección libre de un conjunto

de combinaciones de valores

correspondientes a dos

parámetros.R1

R2 MicrobeadsMicrobeads

LinfocitosLinfocitos


Información generada de una muestra marcada en triple color

Quadrant Statistics



Quadrant Statistics



Quadrant Statistics



Del análisis de cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12Del análisis de cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12--24 24 nímerosnímeros


Estadísticas/Reducción de la información• Análisis gráfico ofrece

información numérica sobre las poblaciones estudiadas.

• Esta información numérica de una muestra se representará en una fila de una matriz de datos

• Con la matriz de datos se obtendrá información estadística y representaciones gráficas sobre poblaciones de individuos.

9x9x2000020000

célu

las

célu

las

parámetrosparámetros

casocasovariablesvariables

Población controlPoblación controlPoblación casosPoblación casos

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