fundamentos y aplicaciones analíticas y …...• 2. conocer los fundamentos de la citometría de...
TRANSCRIPT
Jorge Monserrat Sanz
Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas
de la inmunofluorescenciay la citometría de flujo
Asignatura de InmunologíaUniversidad de Alcalá
Unidad mixta
CSIC/UAH
Jorge Monserrat Sanz
Objetivos• 1. Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la
heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune.
• 2. Conocer los fundamentos de la citometría de flujo.
• 3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se realizan mediante la citometría de flujo.
• 4. Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de flujo.
• 5. Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica.
• 6. Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononuclearesmediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos.
Jorge Monserrat Sanz
• 7. Adquisición en un citometro de flujo.
• 8. Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantesdel ADN.
• 9. Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo: Comprender las etapas en el proceso de la información obtenida por citometría
• 10. Resolución de diferentes problemas clínicos reales.
• 11. Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e interpretación de intensidades medias de florescencia de célulaslinfocitarias obtenidas de distintos casos patológicos reales.
• 12. Interpretación de los resultados obtenidos.
Objetivos
Jorge Monserrat Sanz
¿Qué debe ser el alumno al terminar el curso?
• Que después del curso el alumno sea:
1. Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la citometría de flujo.
2. Eficiente preparando muestras para citometría y diseñando experimentos de citometría analítica y separativa.
3. Usuario competente y autosuficiente del citómetro de flujo analizador capaz de puesta a punto, adquisición y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones problemáticas (compensación, flujo)
4. Analizador crítico conocedor de las posibilidades de los software de análisis y exportación de datos.
Jorge Monserrat Sanz
Prácticas de Inmunología • Primer día: Seminarios Interactivos (3 horas):
1. Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo.2. Aplicaciones de la citometría de flujo.
• Segundo y tercer día:1. Dos actividades simultáneas (1.5 horas):- Realización de una separación célular de células mononucleares de sangre periférica.- Contaje de las células.
2. Citómetro de flujo: Fundamentos y utilización de un citómetro de flujo (1.5 horas).3. Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre periférica (1.5 horas):
a. Marcaje de superficie.b. Viabilidad (7add).c. Anexina V.
• Cuarto día (3 horas):– Análisis de imágenes de citometría de flujo. Problemas.
Jorge Monserrat Sanz
Relevancia
1. Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología:Conocimiento y búsqueda de información de carácter
pronóstico
2. Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía de toda la comunidad científica biomédica
Jorge Monserrat Sanz
Evolución de la citometría multiparamétrica
Evolución Temporal EE.UU
1960 1970s 1980s 1997 2001 2002 2004 2006
Nº d
e C
olor
es
0
5
10
15
20
25
NºColores
Nº Artículos trabajando en Citometría de Flujo
Evolución temporal1960 1970s 1980s 1997 2001 2002 2004 2006
NºA
rtícu
los
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
NºArticulos
Evolución Temporal Nuestro Laboratorio
1989 1990s 1996 1997-98 2004-2005
Nº d
e C
olor
es
0
2
4
6
8
10
12
14
NºColores
Nace2-3 F
4 F8 F
11 F
17 F
12 F
2 F3 F 4 F
6-12 F
Demanda: - Nuevas herramientas- Nuevas Estrategias de análisis
24 D
!!!más colores, más información!!!
!!!Análisis cada vez más complicados!!!!!
Jorge Monserrat Sanz
Heterogeneidad celular en el sistema inmune
CD19CD19
CD3CD3
CD56CD56
CD4CD4 CD8CD8
CD2CD2
CD45
CD14
CD45RACD45RA CD45RACD45RA CD45RACD45ROCD45RO CD45ROCD45RO
CD15
NeuMonoBNKT4 T8
Jorge Monserrat Sanz
Criterios de caracterización de los tipos celulares
• Celulares– Morfología al microscopio.
• Moleculares– Genotípico. (Genoma) Recombinaciones somáticas– Fenotípico (Proteoma) RNA expresado, proteínas.– Citoma: Análisis estadístico multi-celular.
- Antígenos de diferenciación linfocitariaLos antígenos de superficie pueden ser utilizados como marcadores
específicos de líneas, tipos y subtipos celulares.
Jorge Monserrat Sanz
Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias técnicas:
• 1. Con resolución a nivel de célula individual
• 2. Que caractericen la célula en función de varias características (parámetros). X, Y, Z...
• 3. Capaces de realizar medidas en números representativos de células. 100 células error ± 10%, 10.000 error ± 1%
• 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y reducir toda esa información sobre células individuales en conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares.
Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024
4C5144001 FSC-Height ->
GranulocitosCD15+
MonocitosCD14+
LinfocitosCD3+
Τ2αβΤ1γδCD4+CD8+
CD56+CD19+
CD5+CD5-
Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular
Jorge Monserrat Sanz
Fases de la citometría: 1. Pre-citometría:
1. Anticuerpos monoclonales y sondas:1. Estudio a nivel tisular2. Estudio a nivel celular
2. Técnicas de separación celular3. Técnicas en Inmunofluorescencia
2. Citómetria(Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Genética Molecular…)
3. Análisis cuantitativo4. Análisis biológico.
Jorge Monserrat Sanz
Anticuerpos como herramientas en investigación
• Ventaja• Capacidad de reconocimiento muy específica• Detección muy sensible picomolar• Inconveniente• Son invisibles
– Conjugación con moléculas “reporter”• Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 1977
• Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica
• Moléculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometría de flujo, LSC.
Jorge Monserrat Sanz
Técnicas de separación celular
• Gradientes de densidad: Medios de densidad constanteGradientes continuos o discontinuos
• Elutriación centrifuga• Sorting: - Magnético
- Sorter
- Células en tejidos:
- Células en disolución:
1. Inmunohistoquímica2. Procesamiento mécanico3. Separación por mallas y filtros
Jorge Monserrat Sanz
Técnica de separación mediante Ficoll-Hypaque
Jorge Monserrat Sanz
Directo Indirecto Biotinado1
2
1
2
1b
b
bb b
b
bb
b
b b
b
Tipos de marcajes inmunofluorescentes
Jorge Monserrat Sanz
Microscopia de fluorescencia
Jorge Monserrat Sanz
FUNDAMENTOS DE LA
CITOMETRÍA DE FLUJO
Jorge Monserrat Sanz
¿Qué es la citometría de flujo?
FSC
90º2- 4º
Columna de muestra
Meeting pointLáser
Detecto
res de lu
z
Amplificacióndigitalización
Representacióny Analisis
Flujo
Jorge Monserrat Sanz
VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO- Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de
células individuales (miles).
- Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en
la precisión de las medidas.
- A menor tiempo de dedicación mayor productividad.
DESVENTAJASLa citometría de flujo no aporta información sobre la distribución
espacial de las células estudiadas.
Jorge Monserrat Sanz
Jorge Monserrat Sanz
Jorge Monserrat Sanz
Jorge Monserrat Sanz
Citómetro de flujo
Jorge Monserrat Sanz
¿Cómo funciona un citómetro?• Sistema de flujo• Dispersión de la luz• Fluorescencia• Separación y detección de la luz• Amplificación• Corrección de errores: solapamiento espectral y formación
de dobletes• Digitalización y almacenamiento de la información
Jorge Monserrat Sanz
SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA
MUESTRA
AIRE
FLUJOMUESTRA
Jorge Monserrat Sanz
Cámarade flujo
FSC90º
Fluido envolvente
Columna de muestra
Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, α = 90º
Luz incidente
Luz dispersada hacia delante, α=2- 4º
Jorge Monserrat Sanz
INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ
- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:- LUZ REFLEJADA O DIFRACTADA
- PROPIEDADES FLUORESCENTES:- FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…)
Jorge Monserrat Sanz
Luz dispersada a 90 grados
Detector
Detector de 90º
Laser
Jorge Monserrat Sanz
DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD
SCATTERED LIGHT, FSC)
FSC
SSC
El detector de FSC convierte luz dispersada haciadelante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño
de la célula/particula
Jorge Monserrat Sanz
DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,
SSC)
FSC
SSC
El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmenteen un pulso de voltaje proporcional a l contenido en
orgánulos membranosos (granularidad)
Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024
4C5144001 FSC-Height ->
GranulocitosCD15+
MonocitosCD14+
LinfocitosCD3+
Τ2αβΤ1γδCD4+CD8+
CD56+CD19+
CD5+CD5-
Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular
Jorge Monserrat Sanz
Laser
Detectores de fluorescencia
Freq
Fluorescencia
Detector
Detector de fluorescencia(PMT3, PMT4 etc.)
Jorge Monserrat Sanz
Fluorescencia
FSC
FL-1
FL-2
Jorge Monserrat Sanz
Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 Percp
Jorge Monserrat Sanz
Fluorescencia• Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su
energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.• Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los
distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.
t (μs)
E
λ1<λ2
λ 1
λ 2
Jorge Monserrat Sanz
Espectros• Espectro de Absorción
– Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia.
• Espectro de Emisión– Representación de la intensidad de emisión de una sustancia
excitada con luz de una determinada longitud de onda.
λ (nm)
excitación medida
Inte
nsid
ad d
e flu
o res
cen c
ia
Jorge Monserrat Sanz
Fluoresceina (FITC)
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relat
ive I
nten
sity
Wavelength
Proteinas
Excitación Emisión300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Jorge Monserrat Sanz
Etidio
PE
Acido Parinárico
Texas Red
PE-TR Conj.
PI
FITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Laseres
comunes
Jorge Monserrat Sanz
Fluorocromos
Jorge Monserrat Sanz
Sondas
Jorge Monserrat Sanz
Proceso de señales• 1. Separación de señales luminosas
• 2. Detección de señales luminosas
• 3. Amplificación de señales eléctricas
• 4. Corrección de errores – Compensación de señales
– Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).
• 6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales
• 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante
Jorge Monserrat Sanz
PMT
PMT
PMT
PMT
FiltrosDicroicos
BandpassFiltros
Optica en los citómetros de flujo
Laser
1
2
3
4
Flujo Celular
Jorge Monserrat Sanz
DETECCIÓN DE FLUORESCENCIATC
PerCPQR
Cy5APC
FL-1 FL-2 FL-3 FL-4Detectores
Fluorocromos
Jorge Monserrat Sanz
Amplificación de señales
• Lineal• (intervalos regulares) • apropiada para:
– Señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)
– Con distribuciones con picos estrechos como el contenido en DNA.
• Logarítmica • (intervalos crecientes)
– Cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000).
10010 200
100 20010 1000
101 20
100 20010 1000
Jorge Monserrat Sanz
Escalas
FSC Ej: Lineal FL-1 Ej: Logarítmica
Jorge Monserrat Sanz
Compensación de señales• Fundamento Superposición de
espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un
fluorocromo es leída por el detector de otro color
• Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color
• FL-2 - %FL1
λ
excitación
medida
Inte
nsid
ad d
e flu
ores
cen c
ia
FL-1 FL-2
Jorge Monserrat Sanz
Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos)
• Señal analógica (V)• Altura de señal (H)• Anchura de señal (W)• Área de señal (A)
• En base a la información de área y anchura se pueden detectar dobletes (dos células que pasan juntas).
WA
H
t
V
2 xW
Jorge Monserrat Sanz
DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN
N
12345678...
10000
FSC
22343422...
SSC
11221238...
FL-1
11341121...
FL-2
12312312...
FL-3
13341134...
FL-4
22335512...
TIEMPO
11112222...
Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitalesLas señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico).
Jorge Monserrat Sanz
PROCESO DE INFORMACION
HistogramasDiagramas biparamétricos
Jorge Monserrat Sanz
Proceso de la información generada
• Representación de la información
• Selección de la información
• Reducción de la información
• De la célula a la población celular
Jorge Monserrat Sanz
Representación monoparamétrica de datos.Histogramas. Se representa en cada valor de x
(intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.
M1
Jorge Monserrat Sanz
Histogramas
SSC
FSC
FL-1
FL-2
FL-3
Jorge Monserrat Sanz
Representación biparamétrica en 2D
Diagrama de puntos / dot plot
+
+--
Representación simultánea de dos parámetros X e Y.
X representa el valor de la señal de un parámetro.
Y representa el valor de la señal del otro.
++-
-FL-1
FL-2
Jorge Monserrat Sanz
Representación 3D Countour plot / Diagramas de contornos
X, Y más una tercera dimensión.
Una superficie tridimensionalLa altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros.
Jorge Monserrat Sanz
Diagrama de dot plot density
Jorge Monserrat Sanz
Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricosSitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés.
Selección de la informaciónGates (Puertas) / ventanas (windows)
M1
M2
Jorge Monserrat Sanz
Gates biparamétricos.
Se pueden utilizar puertas biparamétricas definidas en base a la combinación de los valores de dos parámetros
Se emplean para estudiar las características de subpoblaciones celulares
R1
R2
R3
R4
Jorge Monserrat Sanz
Gates lógicos / Puertas lógicasPueden combinarse distintas puertas y emplearse simultáneamente como
criterio para seleccionar las células de interés.
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
LINFOCITOSMONOCITOS
GRANULOCITOS
TAMAÑO
CO
MPL
EJI
DA
D C
EL
UL
AR
R5 and R1
T
NK
TK
Jorge Monserrat Sanz
¿Qué significa la realización de un “gate” electrónico?
N
12345678...
10000
FSC
22343422...
SSC
11221218...
FL-1
11341121...
FL-2
12312312...
FL-3
13341134...
FL-4
22335512...
TIEMPO
12345678...
Jorge Monserrat Sanz
Estadisticasmonoparamétricas
M1
M2
Histogram Statistics
Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median PeakAll 1, 9910 9917 100.00 99.17 1027.48 827.78 37.34 1113.97
M1 685, 9910 8725 87.98 87.25 1153.33 1139.97 16.01 1144.44M2 14, 685 1192 12.02 11.92 106.29 79.55 95.61 66.12
File: ap-24h.011 Log Data Units: Linear ValuesTube: Panel: Acquisition Date: 26-Apr-99 Gate: G3Gated Events: 9917 Total Events: 10000X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log)
Análisis de la información.
Jorge Monserrat Sanz
Estadisticas biparamétricas• Cuadrantes Combinación de dos
umbrales de positividad para dos
parámetros
• Número de células
• % de células
• MFI mean, geo mean
+--
++
-
+-
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Jorge Monserrat Sanz
Estadística por regiones
• Selección libre de un conjunto
de combinaciones de valores
correspondientes a dos
parámetros.R1
R2 Microbeads
Linfocitos
Jorge Monserrat Sanz
Información generada de una muestra marcada en triple color
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
Del análisis de cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12-24 nímeros
Jorge Monserrat Sanz
Estadísticas/Reducción de la información• Análisis gráfico ofrece
información numérica sobre las poblaciones estudiadas.
• Esta información numérica de una muestra se representará en una fila de una matriz de datos
• Con la matriz de datos se obtendrá información estadística y representaciones gráficas sobre poblaciones de individuos.
9x20000
célu
las
parámetros
casovariables
Población controlPoblación casos