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Usos de fluorescencia en bioquímica

• Localización subcelular• Cambios en la concentración • Interacciones moleculares• Cambios conformacionales• Distancias intra/intermoleculares• Difusión rotacional • Caracterización estructural• Actividad enzimática

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10-12 s

10-8 s

10-3 s

LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado

Se alcanza el estado excitado por irradiación de luz

FLUORESCENCIA estado singulete excitado, transición permitida, ns

FOSFORESCENCIA estado triplete excitado, transición prohibida, ms

QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reacción química

FLUORESCENCIA

• 1er. paso: absorción o excitaciónenergía suficiente para llegar a nivel

electrónico superior S1 o S2

λexc

• 2do. paso: emisión de luzenergía radiativa emitida menor que la absorbida, λem > λexcCorrimiento de Stokes

ESTADO EXCITADO

X X*hν

hν’

Relajación por solvente

Transferencia de energía

Quenching

Transferencia de carga

Disociación de H+

Formación de complejos

Formación de oligómerosτ (ns)

Intensidad de fluorescencia (estado estacionario) ISS

Intensidad resuelta en el tiempo (τ)

Pulso de luzIluminación continua

Parámetros a medir en fluorescencia

• Intensidad de fluorescencia (ISS)

• Espectros de excitación y emisión (IF vs λ)

• λmax(ex), λmax(em)

• Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q)

• Vida media del fluoróforo (τ)

• Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional)

• Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)

Rendimiento (Q) = fotones emitidosfotones absorbidos

= constante de velocidad de emisión

= constante de velocidad de decaimiento no radiativo

= vida media intrínseca o natural,

sin ningún proceso no radiativo

= vida media medida

Vida media del fluoróforo

La emisión es independiente de λexc

λexc = 370 nm, λem = 480 nmλexc = 340 nm

DENS = 2-Dietilamino-5-naftalensulfonato

1-hidroxipireno-3,6,8-trisulfonato pKa (exc) < pKa (basal)

A pH 1 la especie que absorbe es la protonada pero la especie que emite es otra (la aniónica)

Excepciones: - disociación de protón, especie aniónica fluorescente

Excepciones: - formación de complejo fluorescente

Se forma complejo de transferencia de carga entre antraceno excitado y la dietilamina (exciplex) que emite a mayor λ

Excepciones: - formación de oligómeros fluorescentes

Emisión estructurada igual a la absorción del pireno, a concentraciones bajas (monómero). A concentraciones altas se forman agregados excitados (excimer = excited dimer) que emiten a λmayor

ESPECTROFLUORÍMETRO

ESPECTROFLUORÍMETRO

FUENTE DE LUZ Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (laser, LED)

MONOCROMADORES excitación y emisión vs FILTROSancho de bandapolarizadores

DETECTOR tubo fotomultiplicador (PMT)

MUESTRA geometría de iluminación de la muestra

La medida de IF es relativa a la geometría del equipo

• Fuente con flujo constante de fotones a cualquier λ

•Monocromador deja pasar toda λ con = eficiencia

•PMT detectar fotones de toda λ con = eficiencia

Efecto de filtro interno -

Fluoróforo muy concentrado

Cuantificación del fluoróforomidiendo Intensidad de fluorescencia IF

IF (λex, λem) = IA Φ Z Z = factor instrumental

IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)

ε = coef. Absortividad a λexc

c = concentración del fluoróforo

Si Aλ << 1 IA = I0 (2.3 ε c l)

IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l

IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas

λexc = 280 nm

Banda Raman H2O = 311 nmDispersión de excitación

λmax (em) = 360 nm

Usar soluciones diluidas A < 0..05

Control con solo solvente

Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo

Filtrar la solución

Microscopía de fluorescencia