extracción dna

Licenciatura en ingeniería biológica Dr. Gabriel Vigueras

PRACTICA No. 2 EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN DE ADN Introducción El ácido desoxirribonucleico (ADN) es la biomolécula que contiene la información

genética que dirige las funciones de las células y algunos virus. El ADN esta formado

por un largo polímero de nucleótidos el cual consta de una base nitrogenada, azúcar y

un grupo fosfato. Las cuatro bases nitrogenadas esenciales del ADN son la adenina

(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Dentro de las células, dos cadenas

antiparalelas de ADN se unen por puentes de hidrógeno formando una estructura de

doble hélice. La información del ADN puede ser replicada formando copias del ADN, o

transcrita a RNA y posteriormente traducida a proteínas. En las células eucariotas

(animales, plantas y hongos) la mayoría del ADN se encuentra dentro del núcleo y una

pequeña parte en algunos orgánulos como las mitocondrias. Mientras en las células

procariotas se encuentra altamente condensado en el citoplasma.

Los avances en el conocimiento del ADN ha permitido conocer los mecanismos de

replicación y expresión de genes, incluso se conocen las secuencias completas de

diversos organismos. Actualmente existen técnicas para cuantificar la expresión de un

gen en tiempo real (RTPCR o QPCR) la cual se basa en la reacción en cadena de la

polimerasa. En la ingeniería genética, medicina, criminalistica y otras, se utiliza esta

técnica además de otras como el Southern blot y chips de ADN.

Por otro lado aprovechando las propiedades poliméricas del ADN ya se realizan

estudios en el área de los biomateriales y nanotecnología.

De ahí la importancia de conocer las propiedades físicas y químicas que permitan

establecer métodos para extraer, precipitar y purificar estas biomoléculas

Un método simple para extraer el ADN de células animales consiste utilizar un

detergente que permita solubilizar los lípidos de la membrana nuclear y celular.

Posteriormente se utilizan proteasas para liberar el ADN de las proteínas que lo

mantienen súperenrollado. Finalmente se utiliza alcohol frió y una alta concentración

de sal para precipitar el ADN.


Objetivos

• Extraer y precipitar ADN genómico de células epiteliales de la boca. • Conocer las propiedades bioquímicas y fisicoquímicas del ADN.

Materiales Por grupo

• Agua purificada • Alcohol (Isopropanol o Etanol) • Hielo • Tris • HCl • SDS • Ablandador de carne ó solución ReNu Plus • Parafilm

Por equipo

• 1 tubo con 10 mL de buffer de lisis.

• 1 tubo con 5 mL de solución proteasa+sal

• Gradilla para tubos de 15 mL • 4 vasos de plástico desechables • 4 tubos de 15 mL • 6 pipetas Pasteur

• Botellas de vidrio de 1.5 mL para almacenamiento de DNA, con tapón.

• Marcador permanente • Tijeras • Piseta con agua destilada • Baño de agua a 50°C • Termómetro

Normas de seguridad y manejo de residuos Antes de colocar el agua purificada en su boca, asegúrese que realmente sea agua purificada. Notas importantes:

• Identifique cada material con un marcador indeleble. • Colocar el alcohol en el congelador 1 hora antes de iniciar la práctica.

Soluciones.

• HCl 6N • Buffer Tris-HCl 100mM pH 7 ajustado con HCl 6N • Buffer de lisis (SDS al 1% p/v en buffer Tris-HCl 100mM pH 7.0) • Solución de proteasas+sal. Ablandador de carne al 10% (p/v) ó solución

ReNu Plus para limpieza de lentes de contacto.


Procedimiento 1. Marque un tubo falcón de 15 mL con sus iniciales. 2. Obtención de células epiteliales de la boca usando el método A o B. Método A. Enjuague con agua

• En un vaso desechable coloque 3 mL de agua purificada. • Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por al menos 30

segundos. ¡No sirve de nada sacar sangre! • Coloque el agua del vaso en su boca y enjuague por al menos 30 segundos

para obtener una abundante cantidad de células de la mucosa bucal. • Regrese el líquido al vaso y cuidadosamente viértalo al tubo de 15 mL.

Metodo B. Hisopado

• Con suavidad raspe con un hisopo estéril el interior de la mejilla derecha, y el espacio situado entre la mejilla y la encía durante 1 minuto; trate de recoger la mayor cantidad de células posible.

• Coloque el hisopo con las células de la mucosa en el tubo que contiene 3 mL de agua. Agite para liberar las células del hisopo. Frote el hisopo contra el borde del tubo para transferir la mayor cantidad posible de células en el tubo.

• Usando un segundo hisopo limpio, raspe suavemente las células del interior de la mejilla izquierda, entre la mejilla y la encía, por el paladar, y debajo de la lengua durante 1 minuto; de nuevo, trate de recoger la mayor cantidad posible de material. Coloque el hisopo en el mismo tubo de antes y transfiere las células a su interior.

3. Extracción ADN

• Añada 2 mL de búfer de lisis al tubo que contiene el extracto celular. • Cierre el tubo e inviértalo suavemente para mezclar los componentes. (¡No lo

mezcle muy duro!). • Observe su tubo — ¿Ve algunos cambios? Anótelos. • Añade 5 gotas de solución de proteasas+sal a su tubo. • Cierre el tubo y voltéelo suavemente varias veces. • Coloque su tubo en un baño de agua e incube a 50°C por 10 minutos. • Lentamente añada 10 ml de alcohol frió manteniendo el tubo a un ángulo de

45°. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando una pipeta Pasteur. • Deje reposar el tubo en posición vertical en la gradilla a temperatura ambiente,

durante 5 minutos ¿Que ve? 4. Precipitación ADN

• Cierre el tubo y voltéelo de lado y de regreso en posición vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solución.


CONSIDERAR EN EL REPORTE • Dibujar o tomar fotografías de sus obsevaciones. • Analizar los resultados y compararlos con la literatura respectiva.

CUESTIONARIO

1. Escribe cómo explicarías con palabras sencillas la diferencia entre cromosomas, genes y ADN.

2. ¿Contiene una célula hepática los mismos cromosomas que una célula de la

mucosa bucal?

3. Si quisieras aislar una copia del gen que codifica una proteína encontrada en el estómago, ¿podría estar ese gen en las células de la mucosa bucal? Razona tu respuesta.

4. Busca y pega un esquema de una célula animal e indica cuales son la

membrana celular, el citoplasma, el núcleo, aparato de golgi, mitocondrias, citosol.

5. ¿En qué compartimento celular esperas encontrar tu ADN?

6. ¿Por qué es necesario un intermediario como el ARNm para pasar de la

información del ADN a la síntesis de las proteínas?

7. Una vez que las membranas se han roto, el ADN queda libre en la solución, al igual que otras moléculas celulares. Haz un listado de las moléculas que junto con el ADN esperas encontrar en la célula.

8. ¿Qué método o agente crees que se puede usar para eliminar esas moléculas

que no nos interesan?

9. ¿Qué proteínas podrían estar asociadas al ADN en la célula?

10. La proteasa utilizada en este protocolo tiene un funcionamiento óptimo a 50 ºC. ¿Crees que esta enzima se ha aislado de E. coli? Razona tu respuesta.

11. Describa en 5 líneas la función, propiedades bioquímicas y fisicoquímicas del ADN.

12. Con fundamentos fisicoquímicos y bioquímicos explique qué pasa en cada paso del protocolo (que hace el SDS, para que se usan proteasas, que es el saltig-out, por que incubar a 50°C por 10 minutos, para que alcohol frio, etc.)

13. Que métodos se aplica para purificar el ADN.

14. De dos ejemplos de aplicaciones de la tecnología del ADN

15. Cuál es la formulación del ReNu Plus. Bibliografía

extracción dna

Documents