Conceptos generales de Biología Molecular. Extracción de DNA y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Olga Redondo GonzálezMIR 3 Análisis ClínicosHospital Universitario de Guadalajara, 25 abril 2007

ObjetivosConceptos básicos: estructura del DNATipo de muestraObtención de la muestraCaracterísticas de la muestra: Pureza/ ConcentraciónAmplificación de fragmentos de DNA mediante “Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)”Análisis e identificación de fragmentos:

ElectroforesisEnzimas de RestricciónHibridaciónSecuenciación

1869 Miescher. Primer aislamiento del DNA

1944 Abery. El DNA y no la proteína, contiene la información genética

1953

1957 Kornberg. DNA polimerasa I

1959 Severo Ochoa. Polinucieótido-fosforilasa, síntesis de ARN

1961 Marmur y Doty. Renaturalización del DNA, especificidad e hibridación de los ácidos nucleicos

1962 Alber, Nathans y H. Smith. Nucleasas de restricción

1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana. Código genético

1967 Geller. DNA ligasa

1972-73 Boyer, Cohen, Berg. Técnicas de clonaje del DNA

1975 Southern. Hibridación y transferencia sobre gel, para la detección de secuencias específicas de DNA

1985

1975-77 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert. Métodos rápidos de secuenciación del DNA

Etapas principales del desarrollo de la tecnología del DNA recombinante

Watson y Crick. Modelo de doble hélice del DNA

Mullis y cols. PCR

Watson y Crick. Modelo de doble hélice del DNA

Mullis y cols. PCR

En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron el modelo de la doble hélice para la estructura del DNA,basados en los resultados de los rayos X de Franklin y Wilkins.

La Real Academia de las Ciencias de Suecia concede el Premio Nobel en Química 1993, a Kary B. Mullis, USA, por su invento del método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR).

Estructura del DNA

Enrollamiento de la cromatina

3.4 nm

Doble hélice y Fibra de cromatina

Núcleo de la célula eucariota

Cromosoma

2 nm

(2´-desoxi-D-rribosa)

0.34 nm

5´

5´

3´

3´

Tipo de muestraCaracterísticas de la muestra: DNA = “huella genética”

¿De dónde se obtiene la muestra? De cualquier tipo de célula nucleada:

Sangre TejidosCélulas bucalesRaíces de peloSemenVellosidades corialesLíquidos biológicos

ESTABILIDAD

MUTABILIDAD

1 mg de DNA = 150.000 células6.6 pg de DNA/célula

Evolución especies

Patologías

Precauciones

Sangre + Solución hipotónicaTejido + Homogeneizador

Fase Acuosa

Fase Orgánica

Ácidos Nucleicos

Proteínas

Lípidos,Proteínas

+ 300 µl Buffer de Extracción (SDS al10% P/V)PELLET

Extracción Fenol: CH3Cl (1:1)

Fase acuosa

Precipitación: 0.1 V AcNa 0.3M + 2.5 V Etanol

Incubar 1 h a –70ºC ó 24 h a -20ºC

Resuspender pellet en 30 µl de solución amortiguadora de TE. Agitación suave 37ºC, 2h.

Incubar 1 hora a 55ºCInactivar 10´a 98ºC

Centrifugación

SDS= dodecil sulfato de sodioTE= Tris 2 mol/L, EDTA 0.25 mol/L pH 7.5

Precauciones:Sensibilidad al cizallamiento

¡Ojo con las DNAsas!

Obtención de la muestra

+ 15 µl Proteinasa K

Características de la muestraConcentración:

Espectrofotometría

[ DNA ] = A 260 * 50µg * dilución

Fluorometría

Pureza:

1 Unidad de Absorbancia a 260 nm = 50 µg/ml de doble hebra de DNA ó 40 µg/ml de hebra sencilla de DNA o RNA.

2.2 ≥ A260/ A280 ≥ 1.8

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 1985, K. Mullis y cols.

1) Identifica el fragmento de DNA que nos interesa2) Genera “in vitro” grandes cantidades de ese fragmentoa partir de una cantidad mínima del mismo

¿Para qué sirve?:

¿En qué se fundamenta?: “mimetiza” el proceso de replicaciónque tiene lugar “in vivo”

1) Capacidad del DNA para desnaturalizarse/ renaturalizarse porcalor/frío2) Propiedad de las polimerasas de reparar el DNA que se fragmenta, añadiendo bases complementarias sobre la hebra sencilla, siempre y cuando se encuentren un fragmento de doble cadena

Doble hebra de DNA diana

Esquema de un ciclo de PCR convencional

D A S

95ºC

50-60ºC

70ºC

Programa de PCR

Anillamiento

Síntesis

Desnaturalización

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3

Tiempo

Primer ciclo

Segundo ciclo

Tercer ciclo

Tª (ºC)

100

80

60

Termociclador

2ⁿ

n=20-50 ciclos

Electroforesis

Enzimas de restricción

Hibridación

Secuenciación

Electroforesis

Electroforesis (EF)Ácidos nucleicos: moléculas polianiónicasuniformemente cargadas que pueden migrar en un campo eléctrico.Geles:

poliacrilamida fragmentos < 500 pb;agarosa (fragmentos 200 pb-50Kb). EF en gel de campo pulsante (agarosa al 1%).

Visualización: colorante bromuro de etidio, marcaje radiactivo (32P).Identificación fragmentos de DNA por tamaño:

Virus/ bacteriasDeleciones

700-800 pb

400-500 pb

-

+

Transiluminador

Marcadores de peso molecular

Aparato de electroforesis horizontal

Electroforesis

Enzimas de restricción

Hibridación

Secuenciación

Enzimas de restricción

Enzimas de restricción“In vivo”

Reconocen y cortan el DNA de doble hélice en sitios específicos (secuencias de reconocimiento) endonucleasas.Origen bacteriano: supervivencia a lisis por fagos (no existente en eucariotas).

“In vitro”Localizan secuencias mutadas dentro del genoma.

Extremos cohesivos 5´ Extremos cohesivos 3´

Extremos romos

Secuencias de reconocimiento de algunos enzimas de restricción

Secuencias de bases palindrómicas, 4-6 pb↑↓: enlaces fosfodiéster hidrolizados por el enzima de restricción (sitio de corte)N: cualquier base

M1 M2DNA normal

-ACCATG-

-TGGTAC-

DNA mutado

-ACCGTG-

-TGGCAC-El enzima de restricción no reconoce la secuencia

400 pb

100 pb 300 pb 400 pb

M1 M2WM400 pb

300 pb

100 pb

Electroforesis

Enzimas de restricción

Hibridación

Secuenciación

Hibridación

Hibridación molecularFundamento: Apareamiento de dos secuencias nucleotídicas por complementariedad de basesC-G y A-T

Utilidad:- Reconocimiento de secuencias “diana”por apareamiento con secuencias conocidas (SONDAS).

Detección:Radioactiva (32P)Fluorescente (fluorocromo)Quimioluminiscente (luminol)

Tipos: Northern, Southern y Western blot.

Electroforesis

Enzimas de restricción

Hibridación

SecuenciaciónSecuenciación

Identificación completa de la secuencia del fragmento amplificado

Electroforesis

Enzimas de restricción

Hibridación

Secuenciación

Elemental mi querido Watson, elemental!! Nos quedó como una doble hélice!!!

Lo logramos Crick!!! Cómo te

parece que nos quedóel modelo del ADN?

En 1962, Watson, Crick y Wilkins, recibieron el

Premio Nobel por su descubrimiento

¡¡Muchas gracias por

vuestra atención!!