Replicación del DNA

DNA RNA proteina

transcripción traducciónreplicación

Transcripción

inversa

Dogma Central

Cromosomas Procariontes

Cromosoma lineal eucarionte

Semi-conservativa Bidireccional Semi-continua ó semi-

discontinua Alta fidelidad

Características Generales de la Replicación

Replicación semiconservativa

Replicación bidireccional

7

Replicación semidiscontinuala polimerización se llevaa cabo en dirección 5´--3´

Replicación del DNA y ciclo celular

Etapas de la Replicación

I. Inicio: es el punto en donde se regula el proceso

II. Elongación

III.Terminación

I. Inicio de la replicación

Secuencia rica en T-A

Ori C

Minicromosomas para determinar el origen mínimo

DNA cromosomal (E. coli) + Enzima de restricción

DNA plasmídico + Enzima de restricción

+

+

ligasa

origen

RR

Transformar bacterias

Medio con antibiótico

mezclado

E. coli

R

Ori-coli

X DNA

NO se replica

Se replica

Medio con antibiótico

Metodo de footprinting para determinar el sitio de origen de la replicación

Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación

1) Nucleasa + DNA Ori2) Dna A + DNA Ori3) DnaB + DNA Ori4) DnaC + DNA Ori 245

1

1 2 3 4

Secuencia del origen de Replicación bacteriano

Región de los treceámeros (tres repeticiones de 13 nucleótidos), 70% AT

5 Nonámeros o cajas DnaA

once sitios GATC en la secuencia de 245pb

Organización del OriC

DUE: DNA unwinding elementIHF: Integration host factorFIS factor

R1=R4>R2>R3=R5

DnaA

DiaA: DnaA initiator-associating proteinIHF: Integration Host factor

1) Activación 20-30DnaA

Arginina 285 es importante en la oligomerización

Proteína DnaA

• Monómero 52kDa• Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas

dnaA • Estequiometria de hasta 20-30 subunidades de DnaA por oriC• Une ATP y lo hidroliza a una velocidad muy baja• Una vez abiertos los treceámeros, DnaA reconoce las cajas

presentes en el DUE y se une a la cadena sencilla estabilizandola.

Regulación negativa del inicio de la replicación

1) Hda (RIDA: regulatory inactivation of DnaA)

2) dat locus (DnaA titulación): sitio en el cromosoma que une grandes cantidades de proteína DnaA

Aproximadamente 200-300 moléculasde DnaA pueden unirse al locus dat.El locus dat (1kb) contiene 5 cajas DnaA y un sitio para IHF

DDAH: dat dependent DnaA-ATP hydrolisis

3) Interacción de OriC con SeqA y la membrana

Regulacion de la expresión de DnaA

Regulación de DnaAPromotor de DnaA tiene cajas DnaA y secuenciasGATC.

Reactivación de DnaA-ADP a DnaA-ATP

DARS: DnaA reactivation sequence: sitios en el cromosoma que contienen cajas DnaAen orientaciones diferentes

DiaA: DnaA initiator-associating proteinIHF: Integration Host factor

1) Activación 20-30DnaA

2. Formación del pre-primosoma

HELICASA DnaB

C-terminal ATPasaSe mueve en dirección 5´---3´

DnaB• Monómeros de 60kDa que

forman un homohexámero• Actividad de helicasa• Dominios para : Unión a DNA de cadena

doble Unión a DNA cadena sencilla Interacción con DnaC y DnaA Hidrólisis de NTPs (ATP)

• Monómeros de 28 kDa• Homohexámero que

permite la llegada de DnaB• ATPasa: al hidrolizar ATP

pierde afinidad por DnaB

Dna C

Pre-primosoma y primosoma

II. Elongación

La replicación del DNA requiere un cebador catalizado por la DNA Primasa

• Dna G, Primasa, ≈ 60 kDa

• RNA polimerasa

• Sintetiza cebador de ≈ 12nt

• DNA Primasa reconoce a DnaB

Proteínas de unión a cadena sencilla: SSB

Las proteínas SSB se unen con alta afinidad al DNA de cadena sencilla y lo protegen de nucleasas y de asociaciones intracatenarias

DNA polimerasas de bacterias

Reacción de polimerización

DNA polimerasas en E. coli

Características de la DNA polimerasa I

Actividades de la DNA polimerasa I

• Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son “viables”, por lo tanto la DNA polI no es la principal enzima replicativa (pero no soportan deleciones del gen).

• Mutantes de DNA pol II son viables, aún con el gen deletado.• La DNApolIII es la principal enzima en la replicación del DNA.

Las mutaciones son letales.

• Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia de DNA que sirve como molde

• La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-8 a 10-10

• Procesividad # de nucleótidos que se sintetizan en un solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega miles.

Por qué no existe una DNA polimerasa 3´--5´?

DNA polimerasa III holoenzima

an asymmetric dimer

Subunidades de la DNA polimerasa III de E.coli

sub # por holoenzima

Mr Función

dnaE α 2 132,000 Subunidad catalítica

dnaQ ε 2 27,000 Proofreading

holE θ 2 10,000 Acoplador

dnaX 2 71,000 Dimerización

dnaX 1 48,000

holA δ 1 35,000

holB δ´ 1 33,000

holC χ 1 15,000

holD ψ 1 12,000

dnaN β 4 37,000 Procesividad

Pol III Núcleo 10-15 nuc/seg

Abrazadera que carga las subunidades β al DNAComplejo ó complejo

Pol III’

Pol III*

Pol III holo

1,000 bases/seg

Procesividad de la polimerasa III

La procesividad de la DNApol lII* aumenta de 50 nts a más de 50,000 nts gracias a la subunidad β

Modelo del dímero

Cuál es la participación de las DNA polimerasas en la replicación?

DNA polimerasa I ayuda a remover el cebador con su actividad de exonucleasa 5´-3´ Actividad de polimerasa reemplaza los nucleótidos eliminados ≈17

DNA ligasa cataliza la formación de enlace fosfodiéster

Maduración de los fragmentos de Okazaki

DNA ligasa

DNA topoisomerasas

Topoisomerasas en E. coli

TOPOISOMERASAS I

Topoisomerasa I

Topoisomerasa III

Topoisomerasa II (DNA Girasa)Topoisomerasa IV

IA. 5´

IB 3´

IIA.

IIB

TOPOISOMERASAS II

III. Termino de la replicación

ORIGEN DE REPLICACION EUCARIONTE

Solo uno o múltiples?Tiempo de replicación/tamaño de genomaMúltiples orígenes?/Orígenes diferenciales?Encendido durante el ciclo

Existe una secuencia única?Experimentos con plásmidosLevaduras vs eucariotes superiores

Replicación una vez por ciclo?Depende del ciclo celular?

Inicio de la replicación en eucariotes

Mas de 10 kpb

En S. cerevisiae en promedio cada 30,000. En mamíferosse encuentran entre 100,000 a250,000.La tasa de replicación es aprox. 2000bp/min.

No todos los orígenes se activan al mismo tiempo

Eucromatina se duplica primero, heterocromatina al final

Ensayos para identificar secuencias que actúen como orígenes

Inicio de la replicación en eucariontes:Saccharomyces cerevisiae

ATTTAATATTTTGGA

ARS: Autonomously replicating sequence

% of origin function

Mutaciones en A abaten la función.En B sólo se reduce

ARS

Proteínas ORC

ORC1-6

Cdc6 Cdt1

ORC1-6

Origin recognition complex (ORC)complejo que se une a A y B1

Se encuentra unido durante todoel ciclo celular

Orc 6 es estructuralmente relacionada a TFIIB

Estructura y formación de la helicasa Mcm2-7

Traslocación 3´--5´

Pre-RC

Activación:eventos de fosforilación

Iniciación

Complejo CMG: Cdc45-Mcm-GINSa través de Sld2 y Sld3

“licencia para replicar”

Psf1 GINS Psf2 Psf3 Sld5

+ Cdc45+ MCM2-7 CMG

Complejo CMG

Incrementan la actividad de la helicasa al inicio para abrir las cadenas ypermanecen a lo largo de la elongación

Control del inicio de la replicacióna lo largo del ciclo celular

Cdt1 y geminina limitan la replicación del DNA

MCM8 (primasa)

PCNA

(Helicasa)(PCNA-like)

Pol -cadena laggingPol -cadena líder

Proliferating Cell Nuclear AntigenPCNA

Proteína 29kDa

Incrementa procesividad de la DNA polimerasa

Forma un homotrímero alrededor del DNA

RFC: “ clamp loader” de PCNA

Polimerasas de eucariotes

Horquilla de la Replicación Eucarionte

Procesamiento de los fragmentos de Okazaki

Terminación en eucariontes:El dilema de los cromosomas lineales

Telomerasa

Telomerasa GGTTAG

T-loop