CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA –UVG-

INFORME FINAL

Expresión génica en Anopheles albimanus resistentes a deltametrina

PROYECTO FODECYT No. 042-2007

NORMA PADILLA, PhD. Investigador Principal

GUATEMALA, JUNIO DEL 2012

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.

OTROS AGRADECIMIENTOS: El desarrollo técnico y profesional de la ejecución del proyecto fue realizado por la Universidad del Valle de Guatemala –UVG-, en el Centro de Estudios en Salud –CES- de la misma, en el Laboratorio de Ecología y Entomología de Enfermedades Infecciosas. Se agradece a todos aquellos quienes con su trabajo y dedicación lograron alcanzar los objetivos planteados.

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RESUMEN

La malaria es una enfermedad parasitaria causada por Plasmodium spp. y transmitida por diversas especies de mosquitos hembras del género Anopheles. En Guatemala, la malaria continúa siendo un problema de salud pública y es transmitida principalmente por Anopheles albimanus. Existen reportes que indican que este vector ha desarrollado resistencia a los insecticidas utilizados en el país en años pasados, probablemente debido al uso sostenido de estos en los programas de control de la enfermedad y en la agricultura. Esta situación presenta nuevos retos y dificultades en el control de la enfermedad, y por lo tanto es sumamente importante el análisis genético y fisiológico de las causas de resistencia a insecticidas en An. albimanus.

En este estudio se investigó la diferencia en la expresión génica entre mosquitos hembras An. albimanus susceptibles y resistentes a deltametrina, uno de los insecticidas más empleados en Guatemala para impregnar mosquiteros de larga duración y en el rociado intradomiciliar. Para la identificación de los genes asociados a resistencia a deltametrina, primero se seleccionó una cepa resistente al insecticida y seguidamente se utilizó la técnica de hibridación substractiva de supresión (SSH), la cual permite la identificación de genes expresados diferencialmente entre dos poblaciones de una manera práctica y eficiente.

Se seleccionó una cepa de An. albimanus resistente a deltametrina por 18 generaciones (F18) mosquitos hembras mediante la exposición de cada generación a la LD90 de deltametrina de la cepa susceptible (SANARATE). Para realizar el SSH, se utilizaron mosquitos hembras de la cepa SANARATE y de la F18 expuestos a la LD50 de deltametrina de la cepa SANARATE. Los genes diferencialmente expresados entre estas poblaciones fueron aislados como ADNc y clonados en células competentes Escherichia coli INVαF’. Posteriormente, se realizó la extracción del plásmido pUC19 de dichas bacterias y se secuenció la región del inserto de ADNc utilizando los iniciadores universales M13 forward y reverse. El análisis de secuenciación indicó que los genes aislados por la técnica SSH en la cepa seleccionada no correspondían a genes asociados a resistencia a deltametrina. Por lo anterior, se concluyó que el grado de resistencia obtenido no permitió identificar genes asociados a la resistencia a deltametrina y expresados diferencialmente respecto a la cepa susceptible.

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ABSTRACT Malaria is a parasitic disease caused by Plasmodium spp. and transmitted by several species of female mosquitoes of the genus Anopheles. In Guatemala, malaria remains a public health problem and is transmitted mainly by Anopheles albimanus. There are reports indicating that this vector has developed resistance to insecticides used in the country in past years, probably due to the sustained use in the control programs of this disease and agriculture. This situation presents new challenges and difficulties in controlling the disease, and therefore it is extremely important genetic and physiological analysis of the causes of insecticide resistance in An. albimanus.

In this study, we investigated the difference in gene expression between females mosquitoes An. albimanus susceptibles and resistant to deltamethrin, one of the most widely insecticide used in Guatemala for impregnate long-lasting bednets and indoor residual spraying. To identify genes associated at deltamethrin resistance, first select a strain resistant and then used the technique for suppression subtractive hybridization (SSH), which allows the identification of differentially expressed genes between two populations in a practical and efficient.

We selected a deltamethrin resistant strain of An. albimanus for 18 generations (F18) by exposing female mosquitoes of each generation at the deltamethrin LD90 of susceptible strain (SANARATE). To make the SSH, we used female mosquitoes of the SANARATE strain and F18 of strain selected exposed to deltamethrin LD50 of SANARATE strain. Genes differentially expressed between these populations were isolated by SSH as cDNA and cloned into Escherichia coli competent cells INVαF '. Subsequently, we performed the extraction of plasmid pUC19 of these bacteria’s and sequencing of the inserscion region of the cDNA using universal primer M13 forward and reverse. The sequencing analysis indicated that the genes isolated by SSH in the selected strain did not correspond to genes associated with resistance to deltamethrin. Therefore, we concluded that resistance factor did not allow identified genes associated resistance to deltamethrin and differentially expressed with respect to a susceptible strain.

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Expresión génica en Anopheles albimanus resistentes a deltametrina

PROYECTO FODECYT No. 042-2007

NORMA PADILLA, PhD. Investigador Principal

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INDICE RESUMEN ............................................................................................................................... i ABSTRACT ............................................................................................................................. ii LISTA DE FOTOGRAFIAS ................................................................................................. vii LISTA DE TABLAS ............................................................................................................ viii LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................... ix GLOSARIO ............................................................................................................................ xi PARTE I................................................................................................................................... 1 I.1 INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................... 3

I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA ......................................................................... 3

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS .............................................................................................. 5

I.3.1 Objetivos .......................................................................................................................... 5

I.3.2 Hipótesis .......................................................................................................................... 5

I.4 METODOLOGIA ............................................................................................................... 6

I.4.1 Localización ..................................................................................................................... 6

I.4.2 Las Variables ................................................................................................................... 6

I.4.3 Indicadores ....................................................................................................................... 6

I.4.4 Estrategia Metodológica .................................................................................................. 6

I.4.5 Población y Muestra ........................................................................................................ 8

I.4.6 El Método ........................................................................................................................ 8

I.4.7 La Técnica Estadística ................................................................................................... 18

I.4.8 Los Instrumentos y equipo utilizados ............................................................................ 18

PARTE II ............................................................................................................................... 19 II. 1 MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 19

II.1.1 Malaria ......................................................................................................................... 19

II.1.2 Medios de control de malaria ....................................................................................... 22

II.1.2.1 Insecticidas piretroides .............................................................................................. 23

II.1.3 Resistencia a insecticidas ............................................................................................. 23

II.1.4. Técnicas usadas para estudiar resistencia a insecticidas ............................................. 29

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PARTE III .............................................................................................................................. 33 III. RESULTADOS................................................................................................................ 33

III.2 DISCUSION DE RESULTADOS ................................................................................. 38

PARTE IV. ............................................................................................................................. 40 IV.1 CONCLUSIONES ......................................................................................................... 40

IV.2 RECOMENDACIONES ................................................................................................ 41

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 42

IV.4 ANEXOS ....................................................................................................................... 45

PARTE V ............................................................................................................................... 49 V.1 INFORME FINANCIERO ............................................................................................. 49

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LISTA DE GRAFICAS Gráfica 1. Esquema metodológico de la identificación de posibles genes relacionados a resistencia a deltametrina en Anopheles albimanus. ................................................................ 7 Gráfica 2. Ciclo de transmisión de la malaria. ....................................................................... 21 Gráfica 3. Diagrama de la estructura de transmembrana extendida de las subunidades de los canales de sodio sensibles al voltaje. ..................................................................................... 27 Gráfica 4. Relación de resistencia cruzada entre diversas familias de insecticidas, y los mecanismos que confieren dicha resistencia. ........................................................................ 29 Gráfica 5. Esquema general que describe el procedimiento de hibridación substractiva de supresión (SSH). .................................................................................................................... 31 

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LISTA DE FOTOGRAFIAS

Fotografía 1. Gel de ARN poly A para corroborar la integridad de las muestras ................ 34 Fotografía 2. Resultados del PCR de sustracción en el SSH ................................................. 35 Fotografía 3. Selección de clones con insertos producidos en el SSH .................................. 35 Fotografía 4. Productos de PCR de los insertos correspondientes a los clones obtenidos en la sustracción forward de F18 expuestos a 1.12ug/mL de deltametrina versus parental no expuesta.................................................................................................................................. 36 Fotografía 5. Preparación de solución madre de deltametrina ............................................... 45 Fotografía 6. Soluciones de deltametrina a diferentes concentraciones ............................... 45 Fotografía 7. Bioensayo para calcular la LD50 de los mosquitos de la cepa SANARATE An. albimanus ............................................................................................................................... 46 Fotografía 8. Bioensayo de selección de mosquitos por exposición a deltametrina .............. 46 Fotografía 9. Lavado de botellas impregnadas con deltametrina .......................................... 46 Fotografía 10. Cepa SANARATE An. albimanus utilizada en la selección de la cepa resistente a deltametrina ......................................................................................................... 47 Fotografía 11. Alimentación de mosquitos sobrevivientes al bioensayo de selección .......... 47 Fotografía 12. Oviposición de los mosquitos sobrevivientes del bioensayo de selección ..... 47 Fotografía 13. Mantenimiento de la cepa resistente a deltametrina en el insectario hasta el estadío de pupa en bandejas plásticas con agua ..................................................................... 48 Fotografía 14. Proceso de colecta de pupas de la cepa resistente a deltametrina .................. 48 

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LISTA DE TABLAS Tabla 1. Insecticidas utilizados para el rociado intradomiciliar en Guatemala para el control de la malaria. ............................................................................................................................ 4 Tabla 2. Preparación de las reacciones de ligación. ............................................................... 13 Tabla 3. Preparación de la primera hibridación .................................................................... 14 Tabla 4. Preparación del master mix del PCR primario. ...................................................... 15 Tabla 5. Preparación del master mix de PCR secundario ..................................................... 15 Tabla 6. Especies de Plasmodium que afectan humanos, y su distribución geográfica ........ 19 Tabla 7. Polimorfismo de secuencias de aminoácidos en el canal de sodio asociadas a resistencia knockdown ............................................................................................................ 28 Tabla 8. Mortalidad a los 15 minutos de hembras de la cepa RDELTA expuestas a la LD90 de deltametrina ....................................................................................................................... 33 Tabla 9. Resultados del análisis por espectrofotometría del ARN total de mosquitos ......... 34 Tabla 10. Tamaños de las secuencias de DNA producto de la sustracción forward insertadas en los clones ........................................................................................................................... 37 

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LISTA DE ABREVIATURAS ADN ácido desoxirribonucléico ADNc ácido desoxirribonucléico complementario AMV vírus de mieloblastosis aviaria ARN ácido ribonucleico ARNm ácido ribonucléico mensajero CDC centro para el control y la prevención de enfermedades CQ cloroquina DDT dicloro-difenil-tricloroetano DEPC dietil-pirocarbonato dNTP deoxirribonucleótidos trifosfato EDTA ácido etilendiaminotetracético IRS rociado domiciliar residual LD50 dosis letal 50 LD90 dosis letal 90 OD densidad óptica PCR reacción en cadena de la polimerasa QN quinina rpm revoluciones por minuto SSH hibridación substractiva de supresión

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T tetraciclina TE Tris-EDTA buffer UV ultravioleta AFR África AMR América EMR Este mediterráneo EUR Europa SEAR Sur este de Asia WPR Pacífico oriental

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GLOSARIO Absorbancia: es la cantidad de la intensidad de la luz que absorbe una muestra y que por lo

tanto permite cuantificar la densidad/concentración de esta. Anopheles: mosquito de la familia Culicidae que habita en prácticamente todo el mundo

incluyendo Europa, África, Asia, América y Oceanía, con especial intensidad en las zonas templadas, tropicales y subtropicales. Hay aproximadamente 400 especies de Anopheles, de las cuales 30 a 40 transmiten cuatro especies diferentes de parásitos del género Plasmodium, causantes de la malaria humana.

ARN poly A: ARN mensajero, que en su proceso de maduración para ser traducido, ha sido poliadenilado (se le ha agregado en el extremo 3’ una secuencia de bases nitrogenadas que son solo adeninas). Esta cola protege al ARNm frente a la degradación, aumentando su vida media en el citosol, de modo que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína.

Bioensayo: proceso experimental mediante el cual se determinan las características y la fuerza de una sustancia potencialmente tóxica o de un desecho metabolito, a través del estudio de sus efectos sobre organismos cuidadosamente escogidos y bajo condiciones específicas de laboratorio

Buffer: es un sistema constituido por un ácido débil y su base conjugada o por una base y su ácido conjugado que tiene capacidad "tamponante", es decir, que puede oponerse a grandes cambios de pH (en un margen concreto) en una disolución acuosa.

Deltametrina: (C22H19Br2NO3) es un piretroide insecticida y acaricida.

Driver: ARNm proveniente de la muestra control respecto a la que se comparará el tester.

Electroforesis: es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas

en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido, o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución.

Expresión génica: es el proceso por medio del cual todos los organismos procariotas y eucariotas transforman la información codificada en los ácidos nucleicos en las proteínas necesarias para su desarrollo y funcionamiento.

Gen: es una secuencia lineal organizada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una

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macromolécula con función celular específica, normalmente proteínas, pero también ARNm, ARNr y ARNt.

Hemozoina: Pigmento negro, formado de hematina y de proteína, derivado de la hemoglobina, que se encuentra en el citoplasma de los parásitos del paludismo (Plasmodium) intraeritrocitarios. También se halla en los hematíes y en distintos tejidos tras la destrucción del parásito.

Hibridación: la hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.

Insecticida: es un compuesto químico a base de sustancias expulsadas por animales, utilizado para matar insectos, mediante la inhibición de enzimas vitales.

Malaria: enfermedad parasitaria que se caracteriza por escalofríos, que duran de 15 minutos a una hora, comenzando cuando una nueva generación de parásitos rompe los eritrocitos huésped y escapan hacia la sangre. En este momento es común que haya náuseas, vómito y cefalea. La siguiente etapa caliente, que dura varias horas, se acompaña de fiebres en aguja que en ocasiones alcanza 40° C o más.

Piretroides: son moléculas con actividad insecticida que se aplican a cosechas, plantas de jardines, animales domésticos y también directamente a seres humanos. Los piretroides son sustancias químicas que se obtienen por síntesis y poseen una estructura muy parecida a las piretrinas. Generalmente son compuesto más tóxicos para los insectos y también para los peces.

Plasmodium spp: protistas del filo Apicomplexa, clase Aconoidasia, orden Haemosporida y familia Plasmodiidae. Este parásito siempre tiene dos huéspedes en su ciclo vital: un mosquito que actúa como vector y un huésped vertebrado. Al menos diez especies infectan al hombre y 4 provocan la malaria o paludismo.

Reacción en cadena de la polimerasa: es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Resistencia adquirida: deriva de la selección (normalmente con genes en baja frecuencia previo a la exposición y requieren el Xb para la selección).

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Tester: ARNm proveniente de la muestra prueba que se analizará en función de la diferencia en expresión génica respecto al driver (control).

Vector: agente generalmente orgánico que sirve como medio de transmisión de un organismo a otro. Los vectores biológicos pueden ser causas de enfermedades.

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PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN La malaria o paludismo continua siendo un problema de salud pública con más de 200 millones de casos y 700,000 muertes reportadas anualmente a nivel mundial (OMS, 2010). Los casos reportados para la región de América disminuyeron a 526,000 para el año 2009, los cual representa una disminución del 45% respecto al año 2000. En América, la transmisión ocurre en 23 países donde el 20% de población vive en territorio de alto riesgo (OMS, 2010). Para Guatemala se reportó una disminución aproximadamente del 88% de los casos de malaria respecto al año 2000, de 51,645 casos a 6,097 casos (OPS, 2011).

En Guatemala la malaria es transmitida por varias especies de anofelinos, siendo el de mayor distribución geográfica e importancia dentro del país es Anopheles albimanus (Wiedemann, 1820), el cual se encuentra tanto en el sur como en el norte de Guatemala. Como medidas de prevención y control de la malaria se están utilizando el tratamiento con cloroquina-primaquina y control vectorial. El control vectorial en Guatemala se basa principalmente en el uso de mosquiteros tratados con deltametrina de larga duración, control de criaderos utilizando larvicidas biológicos y en algunas áreas el rociado intradomiciliar focal. El uso intensivo de insecticidas en la agricultura y salud pública, han permitido el desarrollo de resistencia a insecticidas en diferentes insectos como los vectores de la malaria. La resistencia a insecticidas se define como la capacidad de una población de insectos de tolerar dosis altas de un insecticida que serían letales para los individuos en una población de la misma especie, la cual resulta de la selección natural y mutaciones en genes asociados a resistencia (OMS, 1975; Ranson et al, 2011). En Guatemala, se ha detectado resistencia a organofosforados y piretroides en An. albimanus (Beach y Cordón-Rosales, 1989). Resistencia a fenitrotion fue detectada en An. albimanus por medio del bioensayos de la OMS (Beach et al., 1989). Posteriormente, Brogdon et al. (1992 y 1999) reportó resistencia a organofosforados, piretroides y DTT en An. albimanus. Debido a que la aparición de resistencia a insecticidas es un hecho sumamente importante que afecta directamente la sostenibilidad, efectividad y eficiencia de las medidas de control vectorial utilizadas actualmente es necesario implementar sistemas de vigilancia. Sin embargo, aparte de detectar la resistencia también es necesario poder establecer los mecanismos involucrados en esta para poder tomar mejores decisiones para manejarla o realizar cambios en las políticas establecidas.

Existen diversos mecanismos de resistencia, los cuales son agrupados en las siguientes categorías: resistencia por comportamiento, resistencia cuticular, resistencia metabólica y resistencia por alteraciones en el sitio blanco (Hemingway et al., 2004; Ranson et al., 2011).

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La resistencia mediada por el sitio blanco y metabólica, son los principales mecanismos de resistencia a insecticidas. En la resistencia por alteraciones del sitio blanco, ocurre una disminución en la sensibilidad del sitio blanco o modificación de este lo cual no permite la unión del insecticida (Hemingway y Ranson, 2000). En el caso de la resistencia metabólica, esta es mediada por un aumento en los niveles o actividad de enzimas desintoxicantes lo cual contribuye a disminuir el efecto de la dosis efectiva de un insecticida (Ranson et al., 2002). Para An. albimanus se ha determinado que la resistencia a insecticidas esta asociada principalmente a mecanismos metabólicos según estudios previos. Uno de los primeros estudios identificó resistencia a organofosforados y piretroides mediada por esterasas (Beach y Cordón-Rosales, 1989) con métodos enzimáticos. Posteriormente, la resistencia a carbamatos por alteración del sitio blanco de la acetilcolinesterasa fue reportada por Cordón-Rosales et al. (1990). Brogdon et al. (1992 y 1999), reportó resistencia a organofosforados por insensibilidad de la acetilcolinesterasa y resistencia a piretroides y DTT mediada por esterasas y citocromo P450. El último estudio realizado en poblaciones de An. albimanus (Penilla et al., 2007), detecto una disminución de la susceptibilidad a piretroides la cual estaba mediada por una alta actividad enzimática de citocromo P450. Sin embargo, no se han establecido los genes específicos de estas familias de enzimas que confieren resistencia a los piretroides. Por lo tanto, es necesario establecer los genes específicos que confieren resistencia a piretroides y realizar una evaluación de estos genes para ser utilizados como marcadores moleculares para la vigilancia de resistencia a insecticidas en An. albimanus. Debido a esto, el objetivo principal de este estudio fue identificar los genes asociados a la resistencia a piretroides en una cepa An. albimanus resistente a deltametrina por un análisis de expresión mediante la técnica de hibridación substractiva de supresión (SSH por sus siglas en inglés)..

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA Con el transcurso de los años y el uso sostenido de insecticidas en los métodos de control de la enfermedad, los vectores han ido generando resistencia. Esto presenta nuevos retos y dificultades en el control de la enfermedad, y por lo tanto es sumamente importante el análisis genético y fisiológico de las causas de resistencia en los vectores. Por esa razón en este estudio se investigó la diferencia en la expresión génica entre mosquitos An. albimanus y susceptibles a deltametrina. Dicho insecticida se coloca en los mosquiteros utilizados como método de control en Guatemala, y por lo tanto es sumamente importante prever la aparición de resistencia. Estudiar los genes relacionados a la misma permitirá encontrar nuevos métodos efectivos para sustituirlo en caso las poblaciones silvestres se hiciesen resistentes.

A principios de 1960 el programa para la erradicación de la malaria en Guatemala empezó a encontrar tropiezos, especialmente en las costas del Pacífico, en donde como respuesta a un intenso uso de insecticidas agrícolas, An albimanus desarrolló múltiples mecanismos de resistencia, incluyendo tolerancia fisiológica a un gran rango de insecticidas y también desarrollando un comportamiento de evasión con respecto a las paredes impregnadas. En Guatemala muchos de los lugares con criaderos de mosquitos, están localizados en áreas de producción agrícola intensa, en donde el uso de insecticidas es usualmente intenso y descontrolado. Se ha propuesto que los insecticidas agrícolas favorecen una selección hacia las larvas, ya que los residuos quedan en el agua, y que los insecticidas utilizados en salud desarrollan resistencia en el adulto (Hemingway, 2000).

Después de abandonar las aplicaciones de DDT como control de la malaria, debido a las repercusiones ambientales, se empezó a usar la deltametrina, un piretroide, para el control de los vectores anofelinos (Tabla 1). Sin embargo, en 1992 se reportó resistencia para estos insecticidas en poblaciones de An. albimanus en la costa sur del país (Cordón-Rosales, 1992). Para el control de vectores en Guatemala se efectúan rociamientos en las paredes y uso de mosquiteros impregnados con deltametrina. Para detectar resistencia a insecticidas se utilizó la prueba de la OMS, pero no se le dio seguimiento a este proyecto. A pesar que se capacitó personal para realizar las pruebas OMS, hubo problema con la adquisición del equipo y de los papeles impregnados. El método del bioensayo de la botella CDC es un método mucho más práctico y económico ya que no se requiere de tanto material y no se necesitan papeles impregnados. Con este método se puede evaluar cualquier tipo de insecticida a cualquier concentración.

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Tabla 1. Insecticidas utilizados para el rociado intradomiciliar en Guatemala para el control de la malaria.

Insecticida Año Observaciones

Dieldrín 1956 Se empezó a utilizar 1957 Se suspende debido al desarrollo de

resistencia DDT 1958 Se empezó a usar 1970 Detección de resistencia con implicaciones

significativas epidemiológicas Propoxur 1971 Se empezó a utilizar 1975 Se suspende debido al desarrollo de

resistencia Fenitrotión 1978 Se empezó a utilizar Clorfoxim 1979 Se empezó a utilizar k-otrine (deltametrina)

1981 Se empezó a utilizar 1990 Detección de resistencia en poblaciones de

anofelinos de la región sur 1993 Uso restringido en la región norte del país,

hasta la fecha Fuente: Servicio Nacional de Erradicación de la Malaria, Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social,

Guatemala, 1997.

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I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General 1.3.1.1.1 Identificación de genes asociados a resistencia a deltametrina en Anopheles

albimanus. I.3.1.2 Específicos I.3.1.2.1 Selección de una cepa resistente a deltametrina de Anopheles albimanus por

medio del bioensayo de la botella CDC. I.3.1.2.2 Creación de una librería de ADNc de los genes sobre-expresados en Anopheles

albimanus resistentes a deltametrina. I.3.2 Hipótesis HO1: Existen varios genes de resistencia asociados a la resistencia a deltametrina en Anopheles albimanus.

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I.4 METODOLOGIA I.4.1 Localización

El presente estudio se realizó en el Insectario edificio M y el Laboratorio de Entomología y Ecología II1-113 del Centro de Estudios en Salud del Instituto de Investigaciones de la Universidad del Valle de Guatemala (14° 36´ 15.4´´ latitud norte, 90° 29´22.0´´ longitud oeste, 1488 msnm).

I.4.2 Las Variables

I.4.2.1 Variable dependiente Expresión de genes potencialmente relacionados a resistencia a deltametrina.

I.4.2.2 Variable Independiente Generación de mosquitos Anopheles albimanus. Exposición de mosquitos Anopheles albimanus a deltametrina. I.4.3 Indicadores Para el presente estudio, el indicador de que un gen está relacionado a la resistencia a insecticidas, es la presencia del ARNm correspondiente al mismo (lo que indica que está siendo expresado activamente) en los individuos resistentes, y la ausencia de este ARNm en los individuos susceptibles. I.4.4 Estrategia Metodológica La estrategia planteada contempló el uso del ensayo de la botella CDC para exponer a deltametrina una población de mosquitos An. albimanus susceptibles. Por medio de selección de individuos sobrevivientes a las exposiciones a sus correspondientes LD50 y el cruce de los mismos se esperaba llegar a la obtención de una cepa resistente. El análisis de la expresión génica de esta se realizó mediante el estudio de los genes transcritos a ARN posterior a la exposición a deltametrina. Para este estudio, se realizó la extracción de ARN poly A y produjo ADNc para poder realizar una selección de los genes expresados diferencialmente mediante la hibridización substractiva y el posterior PCR de supresión por medio de SSH. De manera esquemática, la estrategia metodológica ejecutada se muestra en la Gráfica 1.

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Gráfica 1. Esquema metodológico de la identificación de posibles genes relacionados a resistencia a deltametrina en Anopheles albimanus.

Fuente. FODECYT 042-2007

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I.4.5 Población y Muestra La población de mosquitos An. albimanus fue de la colonia mantenida en el insectario de la Universidad del Valle de Guatemala (28°C y 70% de humedad), obtenida de una población silvestre del municipio de Sanarate, departamento de El Progreso, Guatemala. Esta sería la población de la generación parental (F0). A partir de esta, se tomaría un grupo de mosquitos para exponer a deltametrina, y de los cuales se conservaran los individuos que sobrevivieran a la exposición. A partir de estos, se crea una nueva generación (F1, F2, F3… etc.), la cual es expuesta al mismo criterio de selección. En cada generación, se cuenta con mosquitos expuestos y no expuestos; siendo solamente de los expuestos de los que se obtiene la generación siguiente. Para los ensayos de expresión génica, se utilizarán muestras de la cepa parental expuesta (LD50) y de la última generación obtenida F18 expuesta (LD50). La muestra de mosquitos para cada bioensayo fue de 50 individuos, los cuales se almacenaron a -80°C hasta el momento en el que se pudiera realizar el análisis correspondiente. I.4.6 El Método • Cepa de An. albimanus La colonia de An. albimanus fue obtenida de una cepa silvestre de Sanarate, El Progreso, Guatemala; y mantenida en el insectario de la Universidad del Valle de Guatemala (25°C y 80% de humedad relativa y un fotoperiodo de 12 hr día/noche). Una vez liberados los zancudos adultos en las jaulas destinadas para este fin, se cuidó de limpiar las jaulas una vez por semana para eliminar individuos muertos y retirar los excrementos de los zancudos. Para la alimentación se colocó agua miel dentro de las jaulas. Esta se cambiaba cada 2 días para asegurarse de que estuviera fresca y que no se fermentara. El agua miel se elaboró mezclando 70 g de azúcar en 1000 ml de agua (7%), luego de hervir, dejar enfriar y por último colocarla en las jaulas. Esta alimentación es tanto para machos como para hembras; sin embargo, las hembras necesitan alimentarse de sangre para poder reproducirse, por lo que esta se realizaba una vez por semana (a excepción de cuando era necesario aumentar la crianza, donde la alimentación se realizaba dos veces por semana). El animal, en este caso un conejo, se colocaba en la parte superior de la jaula. Éste debía estar bien sujetado, ya que el movimiento cuando los zancudos se están alimentando podía lastimarlos. El conejo se dejaba aproximadamente unos 10-12 minutos en esta posición y para corroborar que se hubiesen alimentado, siempre se observaba que las hembras se hubiesen ensanchado. En la parte interior de la jaula, justo debajo donde se alimentaban los zancudos, se colocaba un pedazo de papel para que absorbiera lo que desechan después de comer (el plasma). Las hembras comienzan a poner huevos dos días después de haberse alimentado, por lo que estos se recolectaban al día siguiente para transferirlos a una

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bandeja más grande donde se pudieran desarrollar adecuadamente y proceder a una adecuada eclosión. Una vez los huevos eclosionaban, y se podían observar las larvas del primer estadío, se procedía a dividir la cantidad de larvas en más bandejas para evitar que hubieran demasiadas larvas en una sola bandeja. Luego se realizaba la alimentación de las larvas con una mezcla de 25% de levadura activa y 75% germen de trigo. La dieta conformada por levadura y germen de trigo se muele antes de dársela a los zancudos para facilitar la alimentación. Al madurar las larvas estas pasan al período de pupas y por lo tanto eran colectadas (utilizando un pedazo de maya) para identificarlas, contarlas y colocarlas en bandejas para que eclosionaran. • Insecticida Se utilizó deltametrina grado estándar de la casa comercial Chem Service ® (West Chester, PA). El insecticida fue diluido en etanol absoluto grado reactivo (Merck) a 50ug/mL. Se prepararon diluciones de 0.001ug/m, 0.005ug/mL, 0.01ug/mL, 0.05ug/mL, 0.1ug/mL, 0.2ug/mL, 0.3ug/mL, 0.4ug/mL, 0.5ug/mL, 1.0ug/mL y 4.0ug/mL para los bioensayos de la LD50 y selección. Todas estas fueron almacenadas en botellas color ámbar para evitar la exposición a la luz (o cubiertas con papel aluminio) y a 4°C. • Método de selección Mosquitos hembras de la F0 de la cepa RDELTA fueron expuestos a diferentes concentraciones de deltametrina 0.1 a 4.0ug/mL para determinar la LD50. Para esto se utilizó como matriz de exposición, una botella de vidrio de 250mL marca Wheaton. El bioensayo consistía en 4 botellas impregnadas con la dosis de insecticida a evaluar y una botella control (impregnada con etanol). La impregnación consistió en agregar un mililitro de la solución de insecticida a evaluar o etanol a cada botella. Estas inmediatamente se taparon y rodaron para cubrir todo el interior de la botella. Seguidamente, se pusieron boca abajo para permitir la impregnación de las tapaderas. Posteriormente, las botellas se destaparon y se rodaron sobre una superficie hasta que el etanol se hubiese evaporado totalmente. Estas se dejaron secar durante toda una noche protegidas de la luz (Brogdon y McAllister, 1998). Un ensayo consistía en dos botellas control y 24 botellas recubiertas. Ocho réplicas se realizaban para cada generación. 50 mosquitos, 3-6 días de edad adulta, alimentadas solamente con solución de sucrosa 10%, fueron introducidos en cada botella con un aspirador oral. Los mosquitos fueron expuestos por 15 minutos. Después de 15 minutos de exposición los mosquitos fueron liberados en una jaula libre de insecticida y 24 hrs después se colectaron los datos de mortalidad. Los sobrevivientes fueron alimentados con sangre de conejo. Los datos resultantes de dosis-respuesta fueron analizados con la función probit (SAS 9.1) para obtener la LD50 y LD90. La LD90 fue la dosis seleccionada para la selección de parentales resistente a deltametrina. Para las siguientes generaciones seleccionadas, la concentración de exposición era la LD50 de la cepa parental (Brogdon y McAllister, 1998).

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• Extracción de ARN total El tejido almacenado a -80°C fue pesado a modo de identificar el peso promedio por cantidad de individuos. Posteriormente, se realizó el macerado (utilizando instrumentos previamente tratados para eliminar RNAsas y enfriados a -20°C para el momento de su uso). Se maceró en 700 µl de buffer de macerado, y luego se homogeneizó para realizar la purificación. Para estandarizar la extracción de ARNm de mosquitos An. Albimanus, se realizó pruebas que permitieran identificar la cantidad de individuos ideal para obtener una extracción efectiva de ARNm. Para esto, se maceraron grupos con distinta cantidad de mosquitos y se realizó la purificación. Una vez identificado la cantidad de individuos necesaria para obtener el peso de tejido recomendado, se utilizó siempre esta cantidad (25 mosquitos para 50 mg) para cada una de las condiciones experimentales trabajadas. • Purificación de ARNm Para realizar la purificación de ARNm se utilizó el kit RNAqueous®, siguiendo las instrucciones del fabricante: 1. Calentar la solución de elución (la alícuota es de 100µl por preparación). Pesar los

mosquitos para ajustar 75 mg, que es aproximadamente 25 mosquitos. 2. Agregar directo a buffer de lisis y homogenizar 10-12 volúmenes de buffer de lisis

(12 µl/mg por lo que para 50 mg serían 600 µl) 3. Verificar que los filtros estén bien colocados 4. Revisar la viscosidad (equivalente a 50% glicerol) 5. Centrifugar 2-3 minutos a máxima velocidad en minicentrífuga 6. Transferir a un tubo nuevo y agregar 1 volumen de etanol 64%, mezclar por inversión

varias veces 7. Agregar 700 µl en el filtro, centrifugar 10,000-14,000 rpm de 15 segundos a 1 minuto

que corra el lisado 8. Descartar el sobrenadante en cada repetición. 9. 700 µl de solución de lavado 1 y centrifugar 1 minuto 10. 50 µl de solución de lavado 2/3 y centrifugar 1 minuto 11. En un tubo de colecta nuevo, colocar 50 µl de solución de elución a 70-80°C, cerrarlo

y dar un spin de 30 segundos 12. Hacer una segunda elución con 20 µl en el mismo tubo. Si se tenían 75 mg iniciales,

realizarlo una tercera vez 13. Medir el rendimiento y la cantidad y precipitar con LiCl si es necesario. Diluir 1:100

en TE y medir el OD 260/280 (que debe estar entre 1.8 y 2.1 para muestras de ARN de pureza aceptable)

14. LiCl = ½ vol LiCl -20, 30 min

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15. Centrifugar a máxima velocidad por 15 minutos, descartar el sobrenadante, lavar el pellet con etanol al 70% frio, centrifugar, aspirar el sobrenadante y secar al aire el pellet

• Verificación de la integridad del ARN Después de la aislación de ARN poly A+ fue necesario examinar la integridad del ARN por electroforesis en de agarosa 1% con bromuro de etidio. Para esto, todo el equipo y cristalería fue limpiado para eliminar RNAsas que pudieran degradar el ARN. El buffer de corrida y la agarosa fueron preparados con agua DEPC. Para cada set de muestras de ARN se midió la concentración por medio de la absorbancia a 260 nm y la pureza por medio del radio 260/280. En base a esta información, se calculó el volumen necesario para cargar 1 ug en el gel de agarosa 1% y determinar la integridad del mismo. Una vez se corroborara dicha integridad, se procedió a realizar la sustracción de ADNc por selección de PCR. • Primera y segunda hebra de ADNc Para cada tester, driver y control de ARN poly A+, se combinaron los siguientes componentes en un tubo de microcentrífuga de 0.5 ml estéril: 1X . ARN poly A+ (2ug) 2-4 µl Primer de síntesis de ADNc 1 ul H2O para completar 5 µl Se mezclaron los componentes y se les dio un breve spin en la microcentrífuga. Después de incubar a 70°C por dos minutos en un termociclador, se enfrió en hielo por otros 2 minutos y se centrifugó brevemente. Después se agregó la siguiente reacción: Buffer de primera hebra 5X 2 µl dNTP mix (10 mM de cada uno) 1 µl Agua estéril 1 µl Transcriptasa reversa AMV (20 U/µl) 1 µl Para realizar la síntesis de la segunda hebra de ADNc, se mezclaron los siguientes reactivos para cada reacción: H2O estéril 48.4 µl Buffer de segunda hebra 5X 16.0 µl dNTP mix (10 mM) 1.6 µl Cocktel de enzima para segunda hebra 20X 4.0 µl Estos contenidos se mezclaron y se les dio un breve spin. Para llegar a un volumen final de 80 µl. Se incubó a 16°C por 2 hr en un baño de agua o en un termociclador y se agregaron 2 µl (6 U) de T4 ADN polimerasa y se mezclaron bien los reactivos. Se volvió

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a incubar a 16°C por 30 minutos en el termociclador y se agregaron 4 µl de una mezcla 20X de EDTA/glicógeno para terminar la síntesis de la segunda hebra. Posteriormente se agregaron 100 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se mezcló vigorosamente. Para separar las fases se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente y cuidadosamente se colectó la capa acuosa superior para trasladarla a un tubo fresco de microcentrífuga de 0.5 mL. Las fases inferiores fueron descartadas apropiadamente. A la fase acuosa se le volvió a agregar 100 µl de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se volvió a realizar la separación de la fase acuosa de la misma manera que la vez anterior. A esta, se le agregaron 40 µl de NH4OAc 4 M y 300 µl de etanol al 95% para provocar la precipitación del ADNc. Se mezcló vigorosamente con vortex y se centrifugó a 14,000 rpm por 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue colectado cuidadosamente y el pellet fue cubierto con 500 µl de etanol 80%. Después de centrifugar a 14,000 rpm nuevamente (por 10 minutos), se removió el sobrenadante y el pellet se dejó secar al aire por unos 10 minutos para evaporar el etanol residual. Finalmente, el precipitado se disolvió en 50 µl de agua estéril. • Digestión con Rsa I Para cada tester, driver o control, era necesario generar fragmentos más cortos y con puntas apropiadas para realizar la sustracción y la ligación del adaptador. Para esto se agregó: Ds ADNc 43.5 µl Buffer de restricción Rsa I 10X 5.0 µl Rsa I (10 U/µl) 1.5 µl Los cuales fueron mezclados por vortex y centrifugados brevemente. La incubación realizada fue de 1.5 horas a 37°C. En este punto, se tomó 5 µl de la mezcla de digestión para analizar la eficiencia del procedimiento. Y se agregaron 2.5 µl de una mezcla EDTA/glicógeno 20X para terminar la reacción. Para purificar nuevamente se agregaron 50 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se mezcló vigorosamente. Para separar las fases se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente y cuidadosamente se colectó la capa acuosa superior para trasladarla a un tubo fresco de microcentrífuga de 0.5 mL. Las fases inferiores fueron descartadas apropiadamente. A la fase acuosa se le volvió a agregar 50 µl de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se volvió a realizar la separación de la fase acuosa de la misma manera que la vez anterior. A esta, se le agregaron 25 µl de NH4OAc 4 M y 187.5 µl de etanol al 95% para provocar la precipitación del ADNc. Se mezcló vigorosamente con vortex y se centrifugó a 14,000 rpm por 20 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue colectado cuidadosamente y el pellet fue cubierto con 200 µl de etanol 80%. Después de centrifugar a 14,000 rpm nuevamente (por 10 minutos), se removió el sobrenadante y el pellet se dejó secar al aire por unos 10 minutos para

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evaporar el etanol residual. Finalmente, el precipitado se disolvió en 5.5 µl de agua estéril. Estos 5.5 µl de muestras de ADNc digerido con Rsa I eran los driver experimentales y el driver control. Posteriormente, estas muestras fueron ligadas con adaptadores para crear los ADNc tester para las substracciones forward, control y reversa. Para analizar la digestión con Rsa I, se realizó la electroforesis de 2.5 ul de ADNc dh no digerido y 5 ul de ADNc digerido con Rsa I en un gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio • Ligación del adaptador Debido a que la técnica usa adaptadores específicos para marcar aquellos genes expresados diferencialmente en el tester, solamente el ADNc de este será ligado a dichos adaptadores (ver figura 8). Para esto, se diluyó 1 µl de cada ADNc experimental digerido con Rsa I con 5 µl de H2O estéril. En el caso del control incluido en el kit, el control de DNA ϕX174/Hae III se diluyó a una concentración de 150 ng/ml, y se mezcló 1 µl del ADNc control con este ADN diluido. Para cada ADNc tester se preparó el siguiente master mix: H2O estéril 3 µl Buffer de ligación 5X 2 µl Ligasa de ADN T4 1 µl Así pues, para cada ADNc tester y para el control, se combinaron (en el orden indicado) los componentes indicados en la Tabla 2. Tabla 2. Preparación de las reacciones de ligación.

Componente Tester 1-1* Tester 1-2* ADNc tester diluido 2 µl 2 µl Adaptador 1 (10 uM) 2 µl - Adaptador 2R (10 uM) - 2 µl Master mix 6 µl 6 µl Volumen final 10 µl 10 µl

Fuente: PCR-Select cDNA Subtraction Kit User Manual, Clontech. Después, en un tubo de microcentrífuga fresco, se mezcló 2 µl del tester 1-1 y 2 µl del tester 1-2 y se puso a centrifugar brevemente. Esto quedó incubando durante la noche a 16°C, después de lo cual se agregó 1 µl de EDTA/glicógeno para parar la reacción de ligación. Para inactivar la ligasa se calentaron las muestras a 72°C y con esto se consideraron completas las ligaciones de los tester. De cada muestra, se tomó 1 µl de cada tester control no substraído y se diluyó en 1 mL de agua, para utilizarlo en el PCR. Todas las muestras fueron almacenadas a -20°C.

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• Primera hibridación Para cada sustracción, se combinaron los reactivos indicados en la Tabla 3, en el orden indicado. Todas las muestras se cubrieron con una gota de aceite mineral y se centrifugaron brevemente. Después fueron incubadas a 98°C por 1.5 minutos en el termociclador y finalmente se incubaron a 68°C por 8 horas en promedio. Tabla 3. Preparación de la primera hibridación.

Componente Muestra de hibridación

1 Tester 1-1

2 Tester 1-2

ADNc driver digerido con Rsa I 1.5 µl 1.5 µl Tester 1-1 ligado al adaptador 1 1.5 µl - Tester 1-2 ligado al adaptador 2R - 1.5 µl Buffer de hibridación 4X 1.0 µl 1.0 µl Volumen final 4.0 µl 4.0 µl

Fuente: PCR-Select cDNA Subtraction Kit User Manual, Clontech. • Segunda hibridación En esta fase las dos muestras de la primera hibridación son mezcladas, y el ADN driver recién desnaturalizado es añadido para enriquecer aún las secuencias expresadas diferencialmente. Entonces se forman nuevas moléculas híbridas que consisten en ADNc expresadas diferencialmente con adaptadores diferentes en cada extremo. Para esto, se mezclaron los siguientes reactivos en un tubo estéril: 1 µl de ADNc driver, 1 µl de buffer de hibridación 4X y 2 µl de agua estéril. En tubos de 0.5 mL se colocó 1 µl de esta mezcla y se cubrió con 1 gota de aceite mineral para incubarlo a 98°C por 1.5 minutos en el termociclador. Luego, con una pipeta, se recogió la mezcla de la hibridación 2, tratando de evitar acarrear mucho aceite mineral. Luego se realizó lo mismo con el driver recién desnaturalizado y la mezcla entera fue transferida a un tubo que contenía la muestra de hibridación 1. Después de mezclar por pipeteo, se dejó incubando la reacción a 68°C durante la noche. Finalmente, se agregaron 200 µl de buffer de dilución, se mezcló por pipeteo, se calentó a 68°C por 7 minutos en el termociclador y se guardó a -20°C hasta realizar la amplificación por PCR. • Amplificación por PCR Para preparar los templados del PCR se tomó una alícuota de 1 µl de ADNc y se colocó en tubos rotulados apropiadamente. Igualmente se tomó una alícuota de 1 µl del control substraído y se colocó en un tubo. Para el master mix, se mezclaron los reactivos como se indica en la Tabla 4.

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Tabla 4. Preparación del master mix del PCR primario.

Reactivo Por reacción Mix de 7 reacciones Agua estéril 19.5 µl 156.0 µl Buffer de reacción de PCR 10 X 2.5 µl 20.0 µl dNTP mix (10 mM) 0.5 µl 4.0 µl Primer 1 PCR (10 uM) 1.0 µl 8.0 µl Mix de polimerasa advantage ADNc 50X 0.5 µl 4.0 µl

Volumen total 24.0 µl 192.0 µl Fuente: PCR-Select cDNA Subtraction Kit User Manual, Clontech.

Esto se mezcló bien y se centrifugó brevemente en el tubo. Una alícuota de 24 ul del master mix fue colocado en cada uno de los tubos de reacción preparados en previamente. Esto se cubrió con 50 ul de aceite mineral y se incubó la reacción a 75°C por 5 minutos en el termociclador para extender los adaptadores. Sin retirar las muestras del termociclador, se colocó una temperatura de 94°C por 25 segundos y se comenzó con los ciclos de temperatura (27X) como siguen: 94°C 30 segundos 66°C 30 segundos 72°C 90 segundos Para observar el resultado, 8 ul de este producto fueron analizados en un gel de agarosa 2% con bromuro de etidio. Aparte, 3 ul de cada mezcla de PCR primario fueron diluidos en 27 ul de H2O y una alícuota de 1 ul de cada producto de PCR primario diluido fue colocada en un tubo rotulado. El master mix para el PCR secundario fue preparado según la Tabla 5 y se agregó a las alícuotas de producto de PCR. Tabla 5. Preparación del master mix de PCR secundario.

Reactivo Por reacción Mix de 7 reacciones Agua estéril 18.5 µl 148.0 µl Buffer de reacción de PCR 10 X 2.5 µl 20.0 µl Nested primer 1 (10 uM) 1.0 µl 8.0 µl Nested primer 2R (10 uM) 1.0 µl 8.0 µl dNTP mix (10 mM) 0.5 µl 4.0 µl Mix de polimerasa advantage ADNc 50X 0.5 µl 4.0 µl

Volumen total 24.0 µl 192.0 µl Fuente: PCR-Select cDNA Subtraction Kit User Manual, Clontech.

Antes de colocar esto en el termociclador se cubrió con una gota de aceite mineral y se comenzó inmediatamente el programa de 12 ciclos: 94°C por 30 segundos, 68°C por 30 segundos y 72°C por 60 segundos. Nuevamente, 8 ul de cada reacción fueron analizados en un gel de agarosa 2% con bromuro de etidio. Todos los productos de la reacción fueron almacenados a -20°C.

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• Ligación en plásmido 1. Centrifugar en un vial el producto del PCR 2. Determinar el volumen de la muestra de PCR a necesitar para alcanzar la cantidad

requerida de PCR. En general 0.5 a 1.0 ul de una muestra típica de PCR con un inserto de largo promedio (entre 400 y 700 bp) dará un radio apropiado de 1:1 (vector: inserto). El radio de 1.1 (vector:inserto) proporciona la mejor eficiencia de ligación. No se usa más de 2-3 ul de la muestra de PCR en la reacción de ligación ya que las sales del PCR pueden inhibir la ligasa de ADN T4.

3. Preparar la reacción de ligación como sigue:

Producto de PCR fresco 3 ul Buffer de ligación 10X 1 ul pCR®2.1 vector (25 ng/ul) 2 ul Agua llevar a un volumen total de 9 ul Ligasa de ADN T4 1 ul Volumen final 10 ul

4. Incubar la reacción de ligación a 14°C por un mínimo de 4 horas (preferiblemente

durante toda la noche) y proceder a la transformación de células competentes. • Transformación de bacterias El vector ligado al producto de PCR obtenido fue transformado en células químico competentes E. coli INVαF’ (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Dicha cepa no expresa el represor de lac z. Por esto el producto del pCR2.1 puede ser expresando en ausencia de IPTG debido a la presencia del promotor lac z. IPTG no tiene ningún efecto en estas células. En primer lugar se equilibro un baño de agua a 42°C y se colocaba el medio S.O.C. a temperatura ambiente. Asimismo se preparó platos de agar LB con antibiótico (ampicilina) y se equilibraron a 37°C por 30 minutos. En cada plato se colocaron 40 ul de X Gal 40 mg/mL y se dejó que fuera absorbido. Para la transformación se centrifugaban los viales que contenían las reacciones de ligación y se colocaban en hielo. Para cada transformación, se colocó 50 ul de las células competentes en un vial en hielo también. Se pipeteó 2 ul de cada ligación directamente al vial de las células competentes y se mezcló con la pipeta suavemente. Estos viales fueron incubados en hielo por 30 minutos, después de lo cual recibieron un shock térmico de 30 segundos a 42°C sin agitar. Esto fue transferido inmediatamente a hielo nuevamente. A cada vial, se le agregó 250 ul de medio S.O.C. a temperatura ambiente. Esta mezcla fue incubada a 37°C por una hora a 225 rpm de agitación. De este cultivo, 100 ul fueron plaqueados en platos de agar LB conteniendo X-Gal y 100 ug/mL de ampicilina. Estos platos fueron incubados durante una noche a 37°C y después de este tiempo se colocaron a 4°C por 2.5 horas para que el color se terminara de definir. De las colonias obtenidas, se seleccionó aquellas de color blanco, y se realizaron aislados individuales para cada una

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de estas con la finalidad de verificar la presencia del inserto en el plásmido y obtener material para guardar a -80°C como stock de glicerol. • Purificación de plásmidos Para analizar los clones positivos, se realizó una purificación de los plásmidos en las células de los cultivos aislados. Para esto se utilizó el Kit de Purificación de Plásmidos PureLink HQ Mini (Invitrogen) según las indicaciones del fabricante. • Análisis de los insertos y secuenciación Para evaluar el tamaño y posible variabilidad de los clones obtenidos, se utilizaron los iniciadores M13 (Forward 5´- GTAAAACGACGGCCAGT-3´ y Reverse 5´-GCGGATAACAATTTCACACAGG-3´) para amplificar el inserto en el plásmido pUC19,

Fuente: TA Cloning Kit, Invitrogen

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El PCR fue realizado con la enzima KAPA2G Fast HotStartReadyMix (2X), con un programa rápido según las instrucciones de la enzima: 94°C 1 minuto, 35 ciclos de 94°C 10 segundos, 55°C 10 segundos y 72°C 1 segundo. Los productos de PCR fueron corridos en geles de agarosa al 1.5%, por 30 minutos, usando escaleras de 1 kb (Promega) y tinción de bromuro de etidio. • Secuenciación Se envió a secuenciar la reacción reverse y forward del plásmido de cada clon obtenido a MACROGEN utilizando los iniciadores M13. I.4.7 La Técnica Estadística No aplica I.4.8 Los Instrumentos y equipo utilizados - Centrífuga refrigerada - Congelador –80°C - Congelador -20°C - Refrigeradora 4°C - Termociclador para realizar el PCR - Transiluminador UV - Bloques calientes (heatblocks) - Autoclave - Microscopios - Estereoscopios - Balanza analítica - Espectrofotómetro - Incubadora digital - Cámaras de electroforesis - Microondas - Sistema de purificación de agua (deionización y destilación) - Estufa - Vortex - Campanas de extracción - Micropipetas - Cristalería de laboratorio - Computadora - Impresora - Cámara digital - Maceradores - Microcentrífugas - Pipeteadores eléctricos

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PARTE II II. 1 MARCO TEÓRICO II.1.1 Malaria La malaria es una enfermedad cosmopolita en áreas tropicales y subtropicales del mundo; siendo ciertas especies más comunes en algunas regiones que en otras (Tabla 6). Tabla 6. Especies de Plasmodium que afectan humanos, y su distribución geográfica.

Nombre Enfermedad Distribución Plasmodium vivax Malaria benigna Cosmopolita en áreas tropicales excepto en

partes de África tropical; las especies más comunes en áreas sub-tropicales y templadas

P. falciparum Malaria maligna Áreas tropicales y subtropicales de África y Asia; previo a la erradicación en Estados Unidos y Mediterráneo

P. malariae Malaria Principalmente en el sureste de Asia; también en África y subcontinente hindú; raro en el hemisferio occidental

P. ovale Malaria ovale África tropical en la costa oeste y en Etiopía. La importancia de la malaria difícilmente puede sobre enfatizarse. Previo a los extensos programas de control que siguieron la Segunda Guerra Mundial, al menos 300 millones de personas estaban infectadas alrededor del mundo. Cerca del 1% de estas personas murieron por la infección; lo que significa que entre 2 y 3 millones de personas morían cada año de malaria. Adicionalmente, esta aumenta grandemente la susceptibilidad a otras enfermedades (Marquardt et al., 2000). La malaria es predominantemente transmitida por Anopheles albimanus, An. darlingi, y An. vestitipennis (Ramsey et al,1994; Rodríguez y Loyola, 1990; Loyola et al., 1991¸Padilla N., 1997; Grieco et al., 2005) y en una menor medida, An. pseudopunctipennis. Todas las especies crecen preferencialmente en agua estancada que contenga plantas acuáticas o algas, y cada especie se ha adaptado a hábitats larvales únicos. Los hábitats larvales del vector principal son asociados con tres ambientes acuáticos característicos: pantanos con pocas macrofitas para An. albimanus, pantanos con macrofitas altas y densas así como aguas sombrías para An. vestitipennis y detritos flotantes o macrofitas acuáticas submersas para An. darlingi (Frederickson, 1993). Comparados con vectores africanos de malaria, estas especies de anofelinos son solamente moderadamente eficientes para transmitir la enfermedad. Cuando el mosquito se alimenta de sangre, inserta sus proboscis en la piel, buscando por un capilar; al mismo tiempo, el fluido salival originado en las glándulas en el tórax es inyectado para evitar que la sangre se coagule. Durante la inyección del fluido salivario, los esporozoitos de Plasmodium spp son llevados directamente de las glándulas salivarías hacia la piel o directamente al flujo sanguíneo. Estos esporozoitos permaneces

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circulando en la sangre solamente por unos 30 minutos. Estos esporozoitos entran las células del hígado y comienzan su desarrollo exo eritrocítico. Estos esporozoitos se transforman en merontes y se multiplican por esquizogonia. Al menos una generación asexual ocurre en las células hepáticas, y estas generaciones son llamadas metracriptozoitos. En P. vivax, el número de generaciones asexuales que toma lugar en el hígado está probablemente limitada, y una vez que los merozoitos dejan el hígado, otras generaciones de merozoitos no regresan a los hepatocitos para desarrollo (Marquardt et al., 2000). Ocho días después de la infección de esporozoitos, merozoitos derivados del ciclo extra eritrocítico comienzan a aparecer en las células rojas circulantes. Cuando el Plasmodium se ve por primera vez en los eritrocitos, solamente hay estados asexuales, y todas las fases de merogonia pueden observarse a la vez. Conforme la infección progresa durante la siguiente semana, los estados asexuales tienden a volverse sincronizados, así que las formas observadas tienden a ser de la misma etapa de merogonia. También, conforme la infección continua, una pequeña cantidad de merozoitos desarrolla etapas sexuales en las células rojas circulantes (Marquardt et al., 2000) Merogonia (esquizogonia) tiene un ciclo de 48 horas en P. vivax, que es el tiempo en el que el merozoito entra la célula roja hasta que las células hijas son producidas. Los merozoitos son de aproximadamente 2 um de largo cuando se adhieren a la superficie del eritrocito hospedero. Estos penetran cuando componentes del complejo apical y receptores específicos de la célula roja. Una vez adentro, el remozoito se rodea para formar el meronte temprano, el llamado estado de anillo. Conforme el anillo comienza a crecer, toma una forma más irregular y el meronte (trofozoito) ingiere hemoglobina por pinocitosis. La hemoglobina es digerida y la porción no digerida permanece como glánulos negros que algunas veces se ven grices debido a su cualidad refractil. El residuo de hemoglobina es hemozoina y es característica de infecciones con Plasmodium y sus parientes cercanos (Marquardt et al., 2000). La replicación nuclear toma lugar mediante separación amitótica del material nuclear. Esta etapa es usualmente llamada presegmentaria, en la cual la replicación nuclear ocurre, pero no división citoplásmica. La formación de merozoito toma lugar de tal manera que cada núcleo es envuelto en un compartimiento de citoplasma y membrana plasmática. Se alcanza la etapa segmentaria cuando los merozoitos se forman. Cuarenta y ocho oras después de que el merozoito entra las células rojas, 12 – 18 merozoitos se han formado, las células rojas se rompen, y los merozoitos son liberados para buscas nuevas células rojas hospederas. Durante la lisis del eritrocito, hemozoina, membranas de célula roja, y subproductos metabólicos son liberados al torrente sanguíneo del hospedero. Debido a la sincronía en el desarrollo, una gran cantidad de células rojas se rompen aproximadamente al mismo tiempo; los escalofríos y la fiebre característicos de la malaria son causa de esta liberación masiva de materiales tóxicos (Marquardt et al., 2000). Gametos comienzan a aparecer en las células rojas circulantes de tres a cinco días después que la infección se ha vuelto patente y no es sino hasta este momento que la infección puede ser transferida al mosquito vector. Los gametos tienen un tiempo de vida

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relativamente corto en el torrente sanguíneo; si no son tomados por un mosquito dentro de las 48 horas siguientes a su formación, mueren. Estos no pasan por ningún desarrollo más mientras permanezcan en el torrente sanguíneo del hospedero vertebrado. Cuando un mosquito no infectado toma su ingesta de sangre de la persona, tanto etapas sexuales como asexuales son ingeridas. Los merontes mueren y no participan en transferir la infección al nuevo hospedero. Los gamontes sufren cambios bastante rápido después de la ingestión por el mosquito. Como resultado de una temperatura menor y del cambio de pH, comienza una división celular y se forman microgametos y macrogametos. Cuando ocurre la fertilización, se forma un zigoto (ooquinete) y el organismo se vuelve diploide. Este se mueve del lumen del intestino a la periferia y entre las células intestinales. En los siguientes 2-3 semanas ocurre la esporogonia. La etapa de oocisto comienza y meiosis se da 2-3 días después de que este se ha formado. La esporogonia es un proceso esquizogónico en el cual hasta 10,000 esporozoitos pueden formarse de cada oocisto. Estos esporozoitos se dispersan entonces a través del heocoel del mosquito hasta entrar las glándulas salivales donde están en posición de ser inyectados a un nuevo hospedero cuando el mosquito se alimente (ciclo completo, Gráfica 2) (Marquardt et al., 2000). Gráfica 2. Ciclo de transmisión de la malaria.

Fuente: Tomado de Marquardt et al., 2000.

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El mosquito vector (1) inyecta el esporozoito al torrente sanguíneo al momento de alimentarse, (2) estos llegan al hígado y (3) estos se tornan en merozoitos en las células del hígado, hasta que (4) se da la ruptura celular y estos son liberados nuevamente al torrente sanguíneo, donde (5) llegan a las células rojas y (6) ocurre la diferenciación en los gametocitos femenino y masculino. (7) dichas formas son ingeridas por el mosquito cuando se alimenta, y (8) son maduradas a ooquinete y posteriormente oocisto; los cuales (9) llegan a las glándulas salivales como esporozoitos, donde comienza nuevamente el ciclo. II.1.2 Medios de control de malaria El control de la malaria dirige sus esfuerzos en tres principales componentes: (1) protección personal, (2) el vector y (3) el parásito. Técnicamente, el más simple de estos esfuerzos es la protección personal, el cual incluye el uso malla en los hogares y de mosquiteros para dormir, el uso de repelentes de insectos, y evitar la exposición a mosquitos evitando actividades a campo abierto. En los trópicos, muchas casas no están construidas para la fácil instalación de mallas, o estas pueden ser demasiado caras. Por razones prácticas, los repelentes son los más útiles a corto plazo, si alguien va a exponerse a un área donde los mosquitos son abundantes. Los mosquiteros pueden ser altamente efectivos en la prevención de la malaria y otras enfermedades transmitidas por insectos voladores. Es una práctica común impregnar el mosquitero con una piretrina sintética, que repelerá y matará los mosquitos. Estos mosquiteros deben ser re-impregnados periódicamente (Marquardt et al., 2000). Los mosquiteros impregnados de insecticida fueron probados en Gambia, África oriental. La mortalidad infantil fue reducida en 40% en la mayoría de villas donde fueron usados. Sin embargo, el costo de la impregnación continúa siendo un problema. Para los mosquiteros, el costo de impregnación es aproximadamente de $2.41 (US), pero en muchos casos los pobladores de áreas endémicas no pueden costearlo y el costo total también se encuentra fuera de la capacidad financiera de los gobiernos. Por esto, estrategias para controlar el vector también deben ser realizadas. Los esfuerzos dirigidos contra el mosquito pueden ser dirigidos contra la larva o el adulto. Diferentes métodos son necesarios en cada caso. Debido a que las distintas especies de mosquitos tienen distintos rangos de vuelo y diferentes sitios de crecimiento, el tipo de control está determinado por la especie de mosquito que se desee controlar (Marquardt et al., 2000). Para el control de larvas se puede colocar insecticida en el agua. El material más usado son insecticidas de segunda o tercera generación. Los insecticidas organoclorados han sido desplazados en la mayoría de países y se utilizan organofosforados y carbamatos. Entre los insecticidas de tercera generación miméticos de hormonas juveniles pueden ser usados en aguas donde el agua no se consume por humanos. Estos últimos tienen la ventaja de no causar contaminación ambiental y que son específicos para insectos. Los insecticidas de segunda generación pueden afectar peces, aves y mamíferos en adición a sus organismos blanco. Para el control de adultos se pueden usar insecticidas de acción directa o de acción residual. En la acción directa el insecticida es rociado en el aire y mata a los mosquitos que estén presentes. Entre estos se encuentran

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carbamatos, organofosforados y piretrinas. En la acción residual, el insecticida es rociado en una superficie o liberado en un dispensador en un espacio cerrado. Los insecticidas organoclorados usualmente tienen una acción residual larga cuando son rociados en las superficies de casas, pero por su daño ambiental han sido prohibidos en la mayoría de lugares. II.1.2.1 Insecticidas piretroides Este grupo de insecticidas surgió como un intento por parte del hombre de emular los efectos insecticidas de las piretrinas naturales obtenidas del crisantemo, que se venían usando desde 1850. La obtención de piretrinas sintéticas (denominadas piretroides, es decir, “semejantes a piretrinas”), se remonta a la fabricación de la aletrina en 1949. Desde ese entonces su uso se ha ido ampliando en la medida en que los demás pesticidas van dejando de ser útiles, o se descubre que tienen efectos de alta residualidad, bioacumulación y carcinogénesis (organoclorados), así como un alto efecto tóxico en organismos no plaga y en mamíferos (carbamatos y organofosforados). Los piretroides, en cambio, no poseen estas desventajas y debido a las bajas cantidades de producto necesarias para combatir las plagas, su costo operativo es más que conveniente. Debido a las ventajas antes señaladas, los piretroides son actualmente una de las principales armas elegidas por los productores agropecuarios y la más importante herramienta en el combate de mosquitos transmisores de enfermedades, tal como la malaria. Sus cualidades en este último campo, son su alta toxicidad para los mosquitos y a la vez su baja acción en el hombre. Su acción, como casi todos los insecticidas, es a nivel sistema nervioso, generando una alteración de la transmisión del impulso nervioso. Aletrina, cipermetrina, permetrina, resmetrina, tetrametrina, etc., son algunos de los piretroides que han salido al mercado (Marquardt et al., 2000) II.1.3 Resistencia a insecticidas

Los insecticidas juegan un papel central en el control de las enfermedades transmitidas por vectores como mosquitos, moscas, piojos, moscas tsetse, e insectos triatominos. En 1955 la asamblea de la Organización Mundial de la Salud (OMS) propuso la erradicación global de la enfermedad humana más prevalente producida por vector, la malaria, por medio de rociados domiciliares de DDT residual. Sin embargo, la euforia de insecticida terminó rápido y en 1976 la OMS revirtió oficialmente la erradicación de la malaria al control de la misma. Muchos problemas han salido de este cambio, pero la mayor causa del cambio de política fue la aparición de resistencia a DDT en un amplio rango de mosquitos vectores. En 1975 la OMS reportó 256 millones de personas viviendo en áreas donde la resistencia a DDT y/o BHC estaba arruinando los esfuerzos de control de malaria (esto no incluyó la región africana, donde el 90% de la malaria ocurre y donde la resistencia a DDT ha sido notada en Anopheles gambiae, el mayor vector de malaria) (Hemingway y Ranson, 2000). La resistencia a insecticidas ha aparecido en todos géneros los mayores insectos vectores. Desde los mosquitos que transmiten la malaria, el dengue, dengue

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hemorrágico, fiebre amarilla, filaríais, etc.; garrapatas que transmiten la enfermedad de Lyme; moscas y piojos que transmiten Bartonella, y moscas, piojos y garrapatas que transmiten varias rickettsiosis. Desde 1992, la lista de especies de vectores resistentes a insecticidas incluía 56 anofelinos, 39 mosquitos culicinos, piojos, triatominos, ocho especies de moscas, y nueve especies de garrapatas. También otros insectos de importancia en la salud pública, como ciertas moscas y cucarachas, muestran resistencia en todos los géneros (Brogdon y McAllister, 1998). Se ha desarrollado resistencia a cada clase de químico insecticida, incluyendo las drogas microbianas y los reguladores de crecimiento de insectos. A pesar de décadas de esfuerzos internacionales, una descripción práctica detallada de resistencia a insecticidas que permita ajustar las estrategias de control a las necesidades específicas, permanece siendo la excepción más que la regla (Brogdon y McAllister, 1998). Se espera que la resistencia a insecticidas afecte directa y profundamente la reemergencia de las enfermedades vectoriales, y donde la resistencia no haya contribuido a la emergencia de la enfermedad, se espera que amenace el control de la enfermedad. Sin embargo, un escrutinio cuidadoso de la información actual sobre la resistencia de vectores muestra que el total efecto de la resistencia en los esfuerzos de control todavía no se conoce en su totalidad (Hemingway, 2000) Los mecanismos de resistencia a insecticidas (opuesto a los comportamientos de evasión al insecticida que son importantes en el control de los vectores de la malaria) tiene una base bioquímica (Gráfica 5). Las dos grandes formas de resistencia bioquímica son de resistencia del sitio blanco, la cual ocurre cuando el insecticida ya no se une a su blanco, y la resistencia basada en enzimas de detoxificación, que ocurre cuando se da un aumento en los niveles o en las actividades de las esterasas, oxidasas, o glutatión-S-transferasas (GST) para prevenir que el insecticida alcance su sitio de acción (Brogdon y McAllister, 1998). II.1.3.1 Mecanismos de sitio blanco Alteraciones en los aminoácidos responsables de la unión del insecticida a su sitio de acción causan que el insecticida sea menos efectivo e incluso inefectivo. El blanco de los insecticidas organofosforados (OPs) y carbamatos es la acetilcolinesterasa en las sinapsis nerviosas, y el blanco de los organoclorados (DDT) y piretroides sintéticos son los canales de sodio. La resistencia a DDT y piretroides puede ser producida por un solo cambio de aminoácidos en el canal de sodio del sitio de unión del insecticida (Brogdon y McAllister, 1998). II.1.3.2 Mecanismos de detoxificación Las enzimas responsables por la detoxificación de xenobióticos en organismos vivientes son transcritas por miembros de grandes familias multigénicas de esterasas, oxidasas y GST. Talvez los mecanismos de resistencia más comunes en insectos sean niveles o actividades modificadas de enzimas de detoxificación esterasas que metabolizan

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un amplio rango de insecticidas. Estas esterasas comprenden seis familias de proteínas pertenecientes a la familia α/β hidrolasa (Brogdon y McAllister, 1998). Existen tres grupos mayores de enzimas que son responsables de la resistencia metabólica a los organoclorados, organofosforados (OPs), carbamatos y piretroides. La DDT-dehidroclorinasa es una glutatión-S-transferasa (GTS), es una enzima que está involucrada en la resistencia metabólica hacia el DDT. Las esterasas están involucradas en la resistencia de organofosforados, carbamatos y piretroides. Las monooxigenasas tienen un rol en el metabolismo de piretroides, carbamatos y en la activación y/o detoxificación de organofosforados (Hemingway, 2000). Resistencia basada en esterasas: el mecanismo de resistencia basado en las esterasas se ha estudiado intensamente en los mosquitos del género Culex y en el áfido Myzus persicae. La resistencia hacia los organofosforados de amplio espectro es conferida por el aumento de esterasas, las cuales actúan rápidamente uniéndose y desactivando el insecticida. Por ejemplo, en el caso de Culex, dos loci comunes de esterasas, estα2 y estβ2, están involucradas en la resistencia por esterasas. La superioridad que confiere a los insectos, el hecho que las enzimas se unan y neutralicen al insecticida, sugiere que ha habido una presión de selección positiva que favorece el mantenimiento de altos niveles de esterasas. Por el contrario a Culex, especies de Anopheles tienen un mecanismo que les confiere resistencia a malatión que no está basado en la elevación de las esterasas (Hemingway, 2000). Resistencia basada en la Glutatión-S-transferasa: las glutatión-S-transferasas o GTS son enzimas multifuncionales que detoxifican una gran cantidad de xenobióticos. En los insectos se ha reportado por lo menos tres familias de GST que tienen un rol en la resistencia a insecticidas. En Ae. aegypti por lo menos dos están muy elevadas en especímenes resistentes a DDT. En An. gambiae las GST están sobre-expresadas en todos los órganos, a excepción de los ovarios, en insectos resistentes (Hemingway, 2000). Resistencia basada en monooxigenasas: las monooxigenasas son una familia compleja de enzimas involucradas en el metabolismo de xenobióticos. Las monooxigenasas están involucradas virtualmente en el metabolismo de todos los insecticidas, teniendo un efecto detoxificante. La actividad elevada de las monooxigenasas está asociada a la resistencia por piretroides en An. stephensi, An. gambiae y Cx. quinquefasciatus. II.1.3.3 Biología molecular de la resistencia a piretroides Se asume que la resistencia a insecticidas es un fenómeno pre-adaptativo, en el que previo a la exposición al insecticida, raros individuos ya existen con un genoma alterado que resulta en uno o más posibles mecanismos (genes) que les permiten sobrevivir la presión de selección evolutiva de los insecticidas. La sobre-expresión, amplificación y mutaciones estructurales de genes han sido frecuentemente ligadas a la resistencia a insecticidas y un gran número de estudios han sido dedicados a los múltiples mecanismos de resistencia o genes involucrados en la resistencia a insecticidas de especies de individuales de insectos. La sobre-expresión transcripcional de genes en insectos

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resistentes parece ser un evento determinante común en la evolución del desarrollo de resistencia en insectos (Liu et al., 2007).

Selección por resistencia en poblaciones de pestes es la amenaza principal a la eficacia continuada de insecticidas piretroides para el control de pestes agrícolas y vectores de enfermedades humanas y animales. “Resistencia knockdown” es un término genérico que es aplicado a uno de los dos mayores tipos de resistencia a piretroides. A diferencia de la resistencia por detoxificación metabólica incrementada, la resistencia knockdown no es afectada por sinergismos que inhiben las esterasas de insectos y monooxigenasas. En vez de esto, la resistencia knockdown es causada por una reducción en la sensibilidad del sistema nervioso del insecto a los piretroides. Debido a que la resistencia knockdown limita usualmente la efectividad de todos los piretroides, se presenta como un mecanismo en el campo que tiene consecuencias severas para el uso mantenido de piretroides en el control de insectos. La detección temprana y caracterización de la resistencia son por lo tanto críticos en el desarrollo de estrategias para el manejo de esta (Soderlund y Knipple, 2003). Hasta hace poco, la mayoría de investigaciones con resistencia knockdown utilizaba la mosca doméstica (Musca domestica L.) como sistema modelo. El rasgo de resistencia knockdown (designado kdr) de la mosca doméstica fue descrito y aislado genéticamente a principios de los años 1950’s. Estudios subsecuentes mapearon el kdr al cromosoma 3 y documentaron la sensibilidad reducida de elementos del sistema nervioso de insectos a piretroides. El gen kdr confiere resistencia tanto a las acciones paralíticas como letales de todos los piretroides conocidos, así como piretrinas y DDT, pero no disminuye la eficacia de insecticidas de otras clases. Mecanismos de resistencia similares al kdr han sido inferidas en gran número de pestes agrícolas y vectores de enfermedades con bases en los patrones de resistencia cruzada y la ausencia de sinergismo por compuestos que se sabe inhiben las actividades de esterasas y monooxigenasas involucradas en el metabolismo de piretroides (Soderlund y Knipple, 2003).

Los piretroides son conocidos por sus efectos al alterar la función de los canales de sodio sensitivos a voltaje en las membranas nerviosas. Por esto, los esfuerzos para identificar los mecanismos detrás de la resistencia knockdown se han concentrado principalmente en alteraciones en la expresión o farmacología de los canales de sodio sensibles a voltaje. Investigaciones de la relación entre la resistencia knockdown y las mutaciones en los genes del canal de sodio del insecto avanzaron grandemente con la identificación del producto del para gene de Drosophila melanogaster como una subunidad α del gen del canal de sodio importante fisiológicamente en esta especie. Conocer la para secuencia facilitó el diseño de sondas moleculares para aislar segmentos del gene del canal de sodio para-ortólogo de otras especies de artrópodos. Estas pruebas consecuentemente permitieron el diseño de experimentos para probar la hipótesis que la resistencia knockdown está ligada genéticamente a los genes para-ortólogos de los canales de sodio de otras especies de insectos (Soderlund y Knipple, 2003).

Evidencia genética implicando el gen Vssc1 de la mosca doméstica como sitio de mutaciones de resistencia knockdown dio un gran ímpetu para la determinación de la

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codificación completa de la secuencia de este gen. La comparación de secuencias parciales y completas de secuencias de 15 cepas de mosca doméstica representando múltiples ejemplos de fenotipos susceptible, kdr, y super-kdr identificaron consistente-mente mutaciones de dos puntos que estaban asociados con fenotipos de resistencia (Gráfica 3): mutación de leucina a fenilalanina en el residuo aminoácido 1014 (designado L1014F) en todas las cepas kdr y super-kdr, y la mutación adicional de metionina a treonina en el residuo 918 (designado M918T) solo en las cepas super-kdr. La asociación de las mutaciones L1014F y M918T en la resistencia knockdown en la mosca doméstica estimuló la búsqueda para las mutaciones correspondientes en los genes de canal de sodio en otras especies muy importantes como Anopheles gambiae, entre otros. La búsqueda de mutaciones en genes del canal de sodio asociadas a resistencia knockdown también ha identificado numerosas mutaciones nuevas (Tabla 7) (Soderlund y Knipple, 2003). Gráfica 3. Diagrama de la estructura de transmembrana extendida de las subunidades de los canales de sodio sensibles al voltaje.

Fuente: Tomada de Soderlund y Knipple, 2003.

En la Gráfica 3, se indican los cuatro dominios internos homólogos (marcados I-IV), cada uno tiene seis hélices transmembranales (marcadas S1-S6 en cada dominio homólogo), y las identidades y localización de las mutaciones asociadas a resistencia knockdown. Los símbolos usados para identificar las mutaciones indican su impacto funcional según fuera determinado en la expresión de ensayos con oocitos X. laevis.

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Tabla 7. Polimorfismo de secuencias de aminoácidos en el canal de sodio asociadas a resistencia knockdown.

Fuente: Tomada de Soderlund y Knipple, 2003.

II.1.3.4 Resistencia cruzada Los mecanismos de resistencia que puede llegar a desarrollar una población de anofelinos varían según el insecticida al que se encuentren expuestos. Por ejemplo, poblaciones de An. gambiae y Cx. Quinquefasciatus expuestas a DDT desarrollan un mecanismo de resistencia kdr que le confiere resistencia a organoclorados y piretroides. El hecho que una especie de insecto sea resistente a varios tipos distintos de insecticida, se le denomina resistencia cruzada. En la Gráfica 4 se muestra las relaciones más comunes de resistencia cruzada reportadas en resistencia a insecticidas (Brogdon y McAllister, 1998)

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Gráfica 4. Relación de resistencia cruzada entre diversas familias de insecticidas, y los mecanismos que confieren dicha resistencia.

Fuente: Tomado de Brogdon y McAllister, 1998.

II.1.4. Técnicas usadas para estudiar resistencia a insecticidas Históricamente, la caracterización mecanística detallada de la resistencia a insecticidas ha ocurrido solamente después de que el control de insectos efectivo ha sido comprometido. Sin embargo, la identificación de mutaciones que confieren resistencia ofrece la oportunidad de diseñar herramientas de diagnóstico molecular capaces de detectar alelos que confieren resistencia a insectos individuales, por lo tanto facilitando la detección temprana y monitoreo de los genes de resistencia en poblaciones bajo presión selectiva. La identificación de la mutación L1014F en cepas resistentes ha llevado al desarrollo de varios ensayos diagnósticos diseñados para detectar esta mutación en particular en poblaciones de pestes. Aunque estos ensayos son herramientas poderosas para determinar la frecuencia de alelos resistentes y cambios en la frecuencia alélica en respuesta a tácticas de manejo, estos son efectivos solo en aquellos casos en los que las mutaciones que confieren resistencia han sido previamente identificadas. Por ejemplo, el ensayo diseñado para detectar la mutación L1014F en poblaciones de A. gambiae no detectó un segundo alelo resistente que contenía la mutación L1014S. En vista de la diversidad de mutaciones capaces de conferir resistencia knockdown, los resultados de los ensayos moleculares diseñados para detectar una sola mutación previamente identificada deben ser interpretados con mucha precaución. La caracterización molecular de la resistencia knockdown también provee un método empírico para identificar compuestos de control de insectos con actividad no impedida o aumentada contra insectos resistentes knockdown. Un dogma central del campo de

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resistencia knockdown es que este tipo de mutación confiere una resistencia cruzada a los piretroides. Sin embargo, este dogma está basado principalmente en resultados de bioensayos de toxicidad con moscas de casa resistentes knockdown y es, en términos estrictos, relevante solo en instancias en las que la resistencia es causada por mutaciones L1014F y M918T. Poco se sabe sobre el espectro de resistencia de las formas de resistencia knockdown causadas por otras mutaciones del canal de sodio. Ensayos de expresión heterólogos con canales de sodio mutados proveen un acercamiento experimental a la determinación del perfil de resistencia de otros tipos de resistencia knockdown, que pudieran sugerir en turno tácticas de manejo de resistencia específicos involucrando la rotación o uso secuencial de insecticidas piretroides particulares. Dichos ensayos pudieran también identificar otros agentes actuando en los canales de sodio que exhiben actividad incrementada contra los sitios blanco de los insectos resistentes knockdown. II.1.4.1 Hibridación substractiva de supresión (SSH) La hibridación substractiva es una poderosa técnica que permite a los investigadores comparar dos poblaciones de ARNm y obtener clones de genes que son expresados solo en una población pero no en la otra. Debido a que los organismos resistentes a insecticida presentan un fenotipo diferente a aquellos susceptibles, la expresión génica ha de ser distinta, y esta técnica facilita la detección de aquellos genes diferencialmente expresados.

Aunque existen varios métodos diferentes, la teoría básica detrás de la sustracción es simple. Primero, las dos poblaciones de ARNm se convierten a ADNc: el ADNc que contiene los transcriptos específicos (expresados diferencialmente) es conocido como “tester” y el ADNc de referencia es conocido como “driver” los ADNcs tester y driver son hibrizados y las secuencias híbridas son luego removidas. Consecuentemente, los ADNcs sin hibridizar representan los genes que son expresados en el tester y están ausentes del ARNm del driver. Aunque los métodos tradicionales de hibridación han sido exitosos en algunos casos, estos requieren de varias rondas de hibridación o no están bien adaptados para la identificación de mensajeros raros. Para sobreponerse a esto, en la Gráfica 5 se presenta un breve esquema del procedimiento. En primer lugar hay que sintetizar el ADNc de las dos condiciones a comparar. ADNc del tester y del driver son digeridos con RsaI, una enzima de restricción de cuatro bases que produce blunt ends. El ADNc tester es entonces subdividido en dos porciones, y cada uno es ligado a un distinto adaptador de ADNc. Las puntas del adaptador no contienen grupos fosfato, entonces solamente un lado de cada adaptador se va a unir a las puntas 5’ del ADNc. Los dos adaptadores tienen porciones de secuencia idénticos para permitir la alineación de un primer de PCR una vez los extremos se han completado. Dos hibridaciones son entonces realizadas. En la primera, un exceso del driver es agregada a cada muestra del tester. Las muestras son entonces desnaturalizadas por calor y se dejan alinear, generando las moléculas de tipo a, b, c y d en cada muestra (Gráfica 5).

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Gráfica 5. Esquema general que describe el procedimiento de hibridación substractiva de supresión (SSH).

Fuente: Tomado de Diatchenko et al., 1996.

El ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formación de los productos de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se re-hibridizan en presencia de un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. El enriquecimiento en las moléculas e se logra durante la amplificación por PCR ya que: i) a y c pueden unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificación de b está suprimida debido a la complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador que promueven la formación de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de unión a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrán de transcriptos presentes esencialmente en el tester y ausentes en el driver y además su representación

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estará normalizada ya que los fragmentos diferenciales abundantes tendrán mayores posibilidades de formar moléculas de tipo b.

A pesar de que el método de SSH enriquece en gran medida los genes expresados diferencialmente, la muestra substraída siempre va a contener algunos ADNc que correspondan a ARNm comunes tanto al tester como al driver, dependiendo esto en cierta medida en la calidad de la purificación de ARN y en el desarrollo de la sustracción particular. Sin embargo, esto se da mayormente cuando muy pocas especies de ARNm son expresadas diferencialmente en el tester y driver. En general, pocos ARNm expresados diferencialmente y poca diferencia cuantitativa pueden llevar a un background mayor, aun cuando se obtiene un buen enriquecimiento para los ADNc. Cuando se espera que el background presente sea alto, la identificación de los ADNc se recomienda incorporar un paso de tamizaje diferencial como un medio eficiente y adecuado para minimizar el background antes de realizar análisis por northern blot.

Hay dos tipos de tamizaje diferencial de una librería substraída. El primero es hibridizar la librería substraída con sondas ADNc marcado con [α32P]dCTP sintetizadas directamente de los ARNm del tester y del driver. Los clones correspondientes a los ARNm expresados diferencialmente van a hibridizar con las sondas del tester y no con las sondas del driver. Aunque este método es ampliamente usado, tiene una desventaja importante: solamente las moléculas de ADNc correspondientes a ARNm altamente abundantes (ARNm que constituyen más del ~0.2% del ADNc total en las sondas) puede hibridizar con los clones. Clones correspondientes a ARNm de baja abundancia expresados diferencialmente no van a ser detectados por este proceso de tamizaje. Para evitar perder genes de baja abundancia se puede usar un proceso en el que la librería substraída es hibridizadas con mezclas de ADNc substraídas forward y reverse. Los clones representando los ARNm que son realmente expresados diferencialmente van a hibridizar solamente con la sonda forward; clones que hibridizan con la sonda reverse van a ser muy probablemente genes expresados constitutivamente.

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PARTE III III. RESULTADOS El primer paso para la identificación de los genes involucrados a la resistencia a deltametrina en An. albimanus, fue la selección de una cepa resistente. Para esto se utilizaron hembras de una cepa susceptible (parental) a deltametrina, y se expuso a diferentes concentraciones con la finalidad de encontrar las dosis que causarán una mortalidad del 50% y 90% de la población. El valor de la LD50 fue de 0.1ug/mL y LD90 fue 0.3ug/mL para la cepa SANARATE. La cepa RDELTA fue seleccionada durante 18 generaciones, inicialmente fue con la dosis que causaban una mortalidad del 90% en la población expuesta y se fue aumentando hasta 1.12ug/mL. Los resultados de mortalidad para cada generación se detallan en la Tabla 8.

Tabla 8. Mortalidad a los 15 minutos de hembras de la cepa RDELTA expuestas a la LD90 de deltametrina.

Generación Cantidad mosquitos expuestos

Dosis de exposición (ug/mL)

Mortalidad (%)

F0 8388 0.30 85.7 F1 3146 0.30 34.0 F2 7136 0.30 40.0 F3 8195 0.50 46.5 F4 7835 0.70 57.6 F5 4905 1.00 70.6 F6 3591 1.12 70.4 F7 810 1.12 81.1 F8 957 1.12 86.3 F9 3555 1.12 66.9 F10 6089 1.12 59.5 F11 3557 1.12 78.2 F12 1810 1.12 77.2 F13 1766 1.12 55.0 F14 1768 1.12 57.0 F15 1865 1.12 71.7 F16 935 1.12 79.6 F17 998 1.12 64.4 F18 660 1.12 57.6

Fuente: FODECYT 042-2007

Los resultados presentados en la Tabla 8, indican que la cepa RDELTA alcanzo una fijación de la resistencia hasta del 57.6% de mortalidad a una dosis de 1.12ug/mL con un factor de resistencia de 3.7 respecto al valor de LD90 de la cepa susceptible SANARATE.

34

De la población parental (SANARATE) y F18 (RDELTA) se realizaron ensayos de exposición a LD50 y LD90 de deltametrina y se colectaron las muestras para el análisis de expresión. El análisis de la expresión génica fue realizado por medio de la técnica de SSH. Para lo cual fue extraído ARN de poblaciones parental y F18 expuestas y no expuestas a deltametrina. Debido a que la calidad del ARN era un factor crítico en el desarrollo de esta técnica, se realizó un análisis de la concentración, pureza e integridad de este (Tabla 12 y Fotografía 1). Tabla 9. Resultados del análisis por espectrofotometría del ARN total de mosquitos.

Muestra analizada Lectura a 260 nm

Lectura a 280 nm

260/280 Concentración (ug/ul)

Parental no expuesta 0.4943 0.2532 1.95 1.9772 Parental expuesta a 0.3 ug/ml de deltametrina (*) 0.8248 0.3997 2.06 3.2992

F18 no expuesta 0.2704 0.1487 1.82 1.0816 F18 expuesta a 0.3 ug/ml de deltametrina (*) 1.0249 0.6129 1.67 4.0996

F18 expuesta a 1.12 ug/ml de deltametrina 0.5028 0.2388 2.10 2.0112

Las muestras marcadas con (*) fueron diluidas en un factor de 10 para realizar el análisis.

Fuente: FODECYT 042-2007 1 2 3 4 5 6

Fotografía 1. Gel de ARN poly A para corroborar la integridad de las muestras (Fuente: FODECYT 042-2007). Filas: 1) marcador molecular de 1 kb, 2) vacío, 3) F18 expuestos a 1.12 ug/ml de deltametrina, 4) F18 no expuestos a deltametrina, 5) parental no expuesto a deltametrina y 6) parental expuesta a 0.3 ug/ml de deltametrina.

Los datos de la Tabla 12, indican que se obtuvieron concentraciones de ARN adecuadas para la producción de ADNc. De este modo, se procedió a realizar la producción de ADN complementario, de dos hebras, cortado con RNsa I para obtener fragmentos aptos para realizar la hibridización de supresión substractiva según el esquema de la Gráfica 9. Este procedimiento permitió separar aquellas secuencias no expresadas en una población de An. albimanus (driver: cepa no seleccionada, no expuesta a deltametrina), pero si en la otra (tester: cepa seleccionada F18 expuesto a deltametrina en concentración 1.12 ug/ml). Y al hacer el PCR posterior, se realizó una amplificación selectiva de estas secuencias ya que es un PCR de supresión que permite amplificar las secuencias blanco reduciendo al mínimo la amplificación de secuencias no deseadas.

35

Como se puede observar en la Fotografía 2, se obtuvo un patrón de bandas esperado en las substracciones forward y reverse. Fotografía 2. Resultados del PCR de sustracción en el SSH (Fuente: FODECYT 042-2007)

Filas: 1) Escalera de 1 Kb, 2) Sustracción de muestra de la generación F18 expuesta a deltametrina (1.12 ug/ml) como tester y muestra parental no expuesta a deltametrina como driver en sustracción forward, 3) Sustracción reverse, 4) Control de sustracción de cDNA positivo (proporcionado por el kit), 5) control negativo de PCR y 6) Escalera de 1 Kb. En la sustracción forward que se realizó, existen varias secuencias amplificadas, que varían entre 250 pb y 700 pb. Para poder identificar los genes correspondientes a dichas secuencias se ligó las mismas en un plásmido pCR®2.1 linealizado y se clonó en células de Escherichia coli INVαF’. La identificación de las células transformadas se realizó por medio de la selección blanco/azul según la Fotografía 3. Fotografía 3. Selección de clones con insertos producidos en el SSH (FODECYT 042-2007).

De las colonias recuperadas después de la transformación (A), las colonias blancas (B) son aquellas que adquirieron un plásmido con inserto y las colonias azules (C) adquirieron plásmido pero sin inserto, por lo que no son útiles.

Teniendo aisladas las colonias con los plásmidos, se guardaron cultivos madre a -80°C. De los cultivos madre, se produjeron cultivos de trabajo a partir de los cuales fuera

1 2 3 4 5 6

36

posible purificar el plásmido con el PureLink HQ Mini Plasmid Purification Kit (Invitrogen). Con los plásmidos purificados se utilizó las secuencias M13, que flanquean los sitios de inserción de la secuencia, para amplificar estos y determinar la variabilidad de los tamaños de producto obtenida. Inicialmente se comenzó el proceso de estandarización del PCR con la enzima Platinum Taq de Invitrogen. Sin embargo, durante la optimización de la técnica, se determinó que la enzima KAPA2G Fast HotStartReadyMix (2X) era más rápida y eficiente. En la Fotografía 4 se observan los resultados de los PCR realizados, donde se puede observar que varios secuencias, de tamaños diferentes, fueron ligadas. En la tabla 13, se indica la cantidad de secuencias de un mismo tamaño, y el porcentaje que esta representa en el total de secuencias clonadas. Fotografía 4. Productos de PCR de los insertos correspondientes a los clones obtenidos en la sustracción forward de F18 expuestos a 1.12ug/mL de deltametrina versus parental no expuesta.

500 bp

500 bp

Esca

lera

00

1100

1 00

1100

2 00

1100

3 00

1100

4

0011

005

0011

006

0011

007

0011

008

0011

009

0011

010

0011

011

0011

012

0011

013

0011

014

0011

015

Esca

lera

00

1101

6 00

1101

7 00

1101

8 00

1101

9 00

1102

0 00

1102

1 00

1102

2 00

1102

3 00

1102

4 00

1102

5 00

1102

6 00

1102

7 C

trol (

-)

A)

B)

37

C)

Fuente: FODECYT 042-2007

A) muestras de la 001001 a la 0011015, B) muestras de la 0011016 a la 0011027, incluyendo control negativo, y C) muestras de la 0011028 a la 0011043. En todos los geles fue cargado como marcador molecular una escalera de 1 kb, en la cual se señala la banda correspondiente a 500 pb como referencia. Tabla 10. Tamaños de las secuencias de ADN obtenidas mediante la sustracción forward insertadas en los clones.

Pares de bases del producto

Cantidad de clones con secuencia del mismo tamaño Porcentaje

400 5 11.627907 450 7 16.2790698 500 7 16.2790698 550 6 13.9534884 600 5 11.627907 625 4 9.30232558 675 5 11.627907 700 1 2.3255814 750 1 2.3255814 900 2 4.65116279

Total 43 100 Fuente: FODECYT 042-2007

El plásmido de cada clon se envió a secuenciar la reacción reverse y forward a Macrogen Inc (Seoul, Korea). Con las secuencias obtenidas de cada clon se determinó una secuencia consenso, la cual fue analizada mediante la herramienta Nucleotide BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) contra la base de datos de Anopheles del GenBank, que se encuentra en el sitio de NCBI (National Center for Biotechnology Information), http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. El análisis de las secuencias indicó, que se lograron clonar genes del mosquito pero ninguno relacionado a resistencia a insecticidas.

Esca

lera

00

1102

8 00

1102

9 00

1103

0 00

1103

1 00

1103

2 00

1103

3 00

1103

4 00

1103

5 00

1103

6 00

1103

7 00

1103

8 00

1103

9 00

1104

0 00

1104

1 00

1104

2 00

1104

3

500 bp

38

III.2 DISCUSION DE RESULTADOS Debido al uso sostenido de mosquiteros impregnados con deltametrina en los programas de control de la malaria, este es un insecticida sumamente importante en el control de la enfermedad. Sin embargo, la aparición de mosquitos resistentes supone un gran problema para la sostenibilidad y efectividad de los programas. Comprender las bases moleculares de dicha resistencia ayudaría a diseñar insecticidas cuyo mecanismo de acción sea más duradero o eficiente, implementar un programa de vigilancia de resistencia a insecticidas y mejorar las medidas de control vectorial. Para el estudio de estas bases moleculares, es necesario contar con poblaciones de mosquitos resistentes, para comparar las diferencias de expresión genética con respecto a las poblaciones de mosquitos susceptibles. Para obtener una cepa de mosquitos resistente a deltametrina, se seleccionó durante 18 generaciones una población de hembras por exposición a deltametrina. El factor de resistencia para la generación 18 fue de 3.7, el cual representa un incremento en la dosis de exposición y por lo tanto un aumento de la resistencia a deltametrina. Seguidamente, se realizó el análisis de expresión génica con mosquitos hembras de la generación 18 expuesta a 1.12ug/mL y la parental no expuesta. Para esto, la integridad del ARN extraído de los tejidos de mosquitos es sumamente crítica. Lo idealmente esperado es encontrar dos bandas claras correspondiente a los rRNA 28S y 18S en muestras eucarióticas. Esta banda 28S tiende a tener un radio 2:1 de intensidad respecto a la 18S y esto es un buen indicador de si el ARN está completamente intacto. El ARN completamente degradado aparece como smears de pesos moleculares muy bajos, lo cual no es el caso del ARN trabajado. Cuando se seleccionan muestras de ARN poly A, como en la metodología aplicada, las muestras no van a contener bandas fuertes de rRNA y aparecen como un smear de aproximadamente 6 a 0.5 kb (dependiendo de la población de mRNAs, y las condiciones y tiempo de exposición), siendo el área entre 1.5 y 2 kb la más intensa. En la Fotografía 1 se puede apreciar que el ARN obtenido del proceso de purificación presenta una integridad aceptable y que corresponde con lo esperado para purificaciones de ARN poly A ya que el producto está aproximadamente en 0.6 kb. Con los resultados obtenidos, Fotografía 2, fue posible identificar diversas secuencias de ADNc que serían producto de genes expresados diferencialmente en los mosquitos expuestos y los no expuestos. Sin embargo, con los resultados obtenidos es siempre de considerar que no todos los genes expresados diferencialmente son enriquecidos equivalentemente por el SSH. El nivel de enriquecimiento de un ADNc particular depende en su abundancia original, el radio de su concentración en las muestras que son substraídas y el número de genes expresados diferencialmente. Otros factores, como la complejidad del material inicial, el tiempo de hibridización y el radio de las dos muestras siendo substraídas, afectan significativamente el resultado del SSH. Siempre es de considerar como posibilidad la inclusión de clones “falsos positivos” que generen una señal diferencial en un procedimiento primario de tamizaje, pero que no sean confirmados por subsecuentes análisis detallados. Por lo tanto, fue necesario

39

realizar una amplificación del inserto del plásmido de cada clon obtenido y así descartar los falsos positivos (Fotografía 4). Este tipo de tamizaje también disminuye los costos de secuenciación, al enviar únicamente clones con patrón de migración único y que tengan el inserto esperado. Finalmente, el análisis de las secuencias indico que los genes aislados no estaban asociados a la resistencia a insecticidas. Probablemente, los genes asociados a resistencia no se habían fijado totalmente en la población y no eran expresados diferencialmente respecto a la cepa susceptible lo cual no permitió su identificación medio de la técnica SSH. Esto puede ser resultado de un bajo grado de resistencia, ya que el factor de resistencia de la generación F18 aumento 3 veces respecto al de la cepa susceptible. Para obtener un mayor nivel de resistencia, hubiera sido necesario seguir seleccionado la cepa hasta obtener un factor de resistencia de 30 (alta resistencia) o aumentar la presión de fijación.

40

PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES 1. El uso de una botella de vidrio como matriz de exposición permite seleccionar

mosquitos resistentes a deltametrina.

2. El factor de resistencia alcanzado hasta la generación 18 fue de 3.7 respecto a la cepa susceptible SANARATE con una mortalidad del 57.6%.

3. La metodología utilizada permitió seleccionar una cepa de An. albimanus con un

factor de resistencia a deltametrina de 3.7 respecto a la cepa susceptible.

4. Se logro la creación de una librería de 43 clones de ADNc expresado diferencialmente en la cepa de An. albimanus seleccionada por la exposición a una dosis de 1.12ug/mL deltametrina.

5. Los genes expresados diferencialmente en An. albimanus de la generación 18

expuestos a 1.12ug/mL deltametrina no están asociados a resistencia a insecticidas.

6. El factor de resistencia obtenido no permitió identificar genes asociados a la resistencia a deltametrina porque no fueron expresados diferencialmente respecto a la cepa susceptible.

41

IV.2 RECOMENDACIONES 1. La generación de una cepa resistente en un periodo corto de tiempo se deberá realizar

aumentando la presión de selección, con alternativas como la utilización de machos resistentes de la generación sujeta a selección y generar una LD50 para cada generación que sirva como dosis de selección.

2. Incrementar la biblioteca de clones realizando múltiples substracciones utilizando hembras An. albimanus con un factor de resistencia a deltametrina de al menos 30 respecto a la cepa susceptible.

3. Se recomienda continuar con la selección de la cepa RDELTA de An. albimanus

seleccionando mosquitos machos para aumentar la presión de selección.

4. Se recomienda incrementar el tiempo de exposición de los mosquitos a la dosis de deltametrina para aumentar la presión de selección.

5. Se recomienda incrementar la dosis de deltametrina para exponer los mosquitos

machos y hembras en cada generación para aumentar la presión de selección.

42

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Arredondo-Jiménez, J.; Rodríguez, M.; Loyola, E. y Brown, D. 1997. Behaviour of

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IV.4 ANEXOS Anexo 1. Registro fotográfico del experimento Fotografía 5. Preparación de solución madre de deltametrina.

FODECYT 042-2007

Fotografía 6. Soluciones de deltametrina a diferentes concentraciones.

FODECYT 042-2007

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Fotografía 7. Bioensayo para calcular la LD50 de los mosquitos de la cepa SANARATE An. albimanus.

FODECYT 042-2007

Fotografía 8. Bioensayo de selección de mosquitos por exposición a deltametrina.

FODECYT 042-2007

Fotografía 9. Lavado de botellas impregnadas con deltametrina.

FODECYT 042-2007

47

Fotografía 10. Cepa SANARATE An. albimanus utilizada en la selección de la cepa resistente a deltametrina.

FODECYT 042-2007

Fotografía 11. Alimentación de mosquitos sobrevivientes al bioensayo de selección.

FODECYT 042-2007

Fotografía 12. Oviposición de los mosquitos sobrevivientes del bioensayo de selección.

FODECYT 042-2007

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Fotografía 13. Mantenimiento de la cepa resistente a deltametrina en el insectario hasta el estadío de pupa en bandejas plásticas con agua.

FODECYT 042-2007

Fotografía 14. Proceso de colecta de pupas de la cepa resistente a deltametrina.

FODECYT 042-2007

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PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO