Diagnstico por Mtodos Inmunolgicos

LABORATORIO DE INMUNOLOGIA Y METODOS DE INMUNOENSAYO

PALOMINO LLERENA, JULIO CESARINMUNOLOGIA ESPECIALQUE ES UN LABORATORIO CLINICO?Es el lugar donde se realizan anlisis clnicos que contribuyen al estudio, prevencin, diagnstico y tratamiento de los problemas de salud de los pacientesDOS TIPOS DE LABORATORIOS CLINICOSLABORATORIOS DE RUTINA: tiene 4 departamentos bsicos HematologaInmunologaMicrobiologaQumica ClnicaORGANIZACION DEL LABORATORIOInmunologa: realiza pruebas sobre anticuerpos que revelan la actividad y presencia de microorganismos en el cuerpoORGANIZACIN DEL LABORATORIOPodemos organizar el laboratorio en distintas reas de trabajo.Sala de espera y recepcin: se recibe a los pacientesToma de muestras: esta es la zona donde se toman las muestras a los pacientes, para luego distribuirlas a las diferentes secciones del laboratorioORGANIZACIN DEL LABORATORIOrea de preparacin de medios y cultivos

Zona de lavado y esterilizacin de los materialesEQUIPOS DEL LABORATORIO CLINICOMicroscopioCentrifugaBalanza AnalticaEspectrofotmetroEsterilizadores

PARTES DE LA CENTRIFUGATapaderaCmaraBaseInterruptor de encendidoMarcador de tiempoTacmetroFrenoControl de velocidad

CENTRIFUGA

BALANZA ANALITICA

PARTES DEL ESPECTROFOTOMETROChasisPorta cubetaSelector de filtroSelector de modoAjuste gruesoSelector de longitud de ondaIndicador de longitud de ondaPantalla

ESPECTROFOTOMETRO

ESTERILIZADORES

Principios de los Mtodos SerolgicosLa reaccin entre un antgeno y un anticuerpo dirigido especficamente contra l da lugar a un complejo antgeno anticuerpoUtilizada ampliamente en los laboratorios para la deteccin y cuantificacin de gran cantidad de sustancias en diversos medios biolgicos. Reaccin Antgeno-Anticuerpo

Reacciones de AglutinacinCuando el antgeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo, el complejo antgeno-anticuerpo resultante se observa como una aglutinacin

El proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin por formacin de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los antgenos

Dan fenmeno de prozona (aglutinacin aparente por exceso de antgeno o anticuerpo sin aglutinacin

Reacciones de Aglutinacin DirectaPara deteccin de antgenos

Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos

Distintos tipos de tcnicas segn la naturaleza fsica de soporte

Aglutinacin al ltex: partculas de ltex fcilmente visiblesDeteccin en LCR de antgenos de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae

Reacciones de Aglutinacin DirectaPara deteccin de anticuerposSe pueden hacer en tubo, portaobjetos, placa o pocillo de microplaca

Se enfrentan las partculas microbianas (generalmente muertas) en suspensincon el suero del paciente.

Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la microplaca.

Reacciones de Aglutinacin IndirectaPara deteccin de anticuerpos

Se adsorben los antgenos en un elemento partculado (partculas de ltex, gelatina o bentonita, o clulas como hemates humanos, ovinos o de pavo

Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de microplaca

Reacciones de InhibicinBasadas en la incapacidad de algunos microorganismos para realizar determinadas actividades biolgicas en presencia de anticuerpos especficos. Las mas utilizadas son dos:

Inhibicin de la Hemaglutinacin

Esta aglutinacin puede ser inhibida por la presencia de anticuerpos especficos en el suero del paciente

Neutralizacin

Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citoptico habitual en clulas de cultivo celular cuando hay presentes anticuerpos especficos.Pruebas de Fijacin de ComplementoSe incuba suero del paciente con el antgeno. En presencia de anticuerpos en el suero se forman complejos antgeno-anticuerpo.

Se aade una cantidad de complemento (todos los elementos).

Si inicialmente se haban formado inmunocomplejos se produce la activacin del complemento , consumiendo todos los componentes del sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el sistema permanece.

Se agrega un sistema revelador constituido por hemates unidos a anticuerpos antihemates (hemolisina)

Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra) se fija a los complejos hemate-hemolisina y los eritrocitos Se lisan.Reacciones de PrecipitacinFormacin de estructuras insolubles por unin ente el antgeno soluble y el anticuerpo especfico incapaces de permanecer en solucin

El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante tcnicas de nefelometra o inmunoturbidimetra.

Inmunodifusin dobleSe enfrentan concentraciones conocidas de antgeno soluble con un antisuero problema en un medio gelificado

Tras un perodo en el que se permite difundir a ambos elementos puede observarse en el caso de que existan anticuerpos, bandas de precipitacin que pueden ser identificadas a simple vista o mediante tincin proteica.

Inmunodifusin RadialSe disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos diluciones del antgeno.

Si se corre simultneamente una curva patrn puede cuantificarse por regresin la cantidad de antgeno.

Es mas til para para la deteccin de antgenos que de anticuerpos

ContrainmunoelectroforesisPuede ser utilizada tanto para detectar antgenos como anticuerpos

Combina la electroforesis (migracin de antgenos y anticuerpos en un gel de agarosa por accin de un campo elctrico) con la precipitacin (formacin de lneas de precipitado en un gel de agarosa cuando se produce la reaccin antgeno-anticuerpo).

Pruebas con Anticuerpos FluorescentesSe utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes (fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja de acridina.

Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando con un microscopio de fluorescencia

Dos variantes:

Tcnica directa (para deteccin de antgenos): se fija la muestra en un portaobjetos con acetona, se agrega el anticuerpo marcado con el florocromo (inmunofluerescencia directa IFD).

Tcnica indirecta (para deteccin de anticuerpos): se agrega primero el suero del paciente sobre antgeno improntado en portaobjetos; en la segunda fase se incuba con anticuerpo anti humano marcada con fluorocromo (inmunofluorescencia Indirecta IFI)

Inmunohistoqumica enzimticaSe usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos marcados con enzimas.

Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de color.

Usado para detectar antgeno, en ocasiones post mortem, por ejemplo pacientes infectados con Rabia

InmunoensayosPara detectar antgenos Metodologa ELISA

Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo, portaobjetos, esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc.

InmunoensayosPara detectar anticuerpos Metodologa ELISA

Utilizan antgenos unidos a un elemento slido (esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al que se le aade suero del paciente.

Si el suero tiene anticuerpos especficos se unen a Los antgenos.

La reaccin se revela mediante un segundo anticuerpo conjugado con:

Enzima Enzimoinmunoensayo (EIA)Istopo radioactivo (I125)Radioinmunoensayo (RIA)Sustancia fluorescenteFluoroinmunoanlisis (FIA)

Se lee la seal con un espectrofotmetro (EIA), contador de centelleo (RIA) o un fluormetro (FIA)

TECNICAS de INMUNOENSayo31Se utilizan ENZIMAS como marcadores inmunoqumicos, que permiten detectar las uniones primarias antigeno-anticuerpo. Las enzimas son molculas estables, econmicas.Son fcilmente conjugables con anticuerpos o con antgenos.32La intensidad de la coloracin o de la inmunofluoresencia es proporcional a la cantidad de elemento analizado presente en la muestra.33TECNICA DE ELISAENZYMED LINKED INMUNOSORBENT ASSAY34VENTAJASMtodo sensible.Bajo costo.Fcil manejo.Permite desarrollar un gran nmero de muestras en un corto perodo de tiempo.Buen equilibrio entre sensibilidad y especificidad.35ETAPAS DE LA TECNICA ELISAFOSITOTAPIZADOCON ANTIGENOOANTICUERPO

MUESTRA CONANTICUERPOO ANTIGENOLAVARFOSITOTAPIZADOCON ANTIGENOOANTICUERPO

CONJUGADO DEAG O AC CON ENZIMAINCUBACION36FOSITOTAPIZADOCON ANTIGENOOANTICUERPO YCONJUGADO

INCUBARLAVARFOSITOTAPIZADOCON ANTIGENOOANTICUERPO YCONJUGADO

SUSTRATO

FOSITOTAPIZADOCON ANTIGENOOANTICUERPO YCONJUGADOCOLOREADO

37COMPONENTES DEL KIT DE ELISA

SOL.SUBSTRATOSOL.DILUYENTECONTROLESSOL.STOPPLACACON FOSITOSCONJUGADO38MATERIALES Y EQUIPO

PUNTAS DESCARTABLES39

MICROPIPETASESPECTROFOTOMETRO40

41RECOMENDACIONESMANTENER UN CONTROL ESTRICTO DEL TIEMPO EN CADA INCUBACIN Y RESPETARLO!!!!Colocar la cantidad exacta de reactivo y muestra a analizar.No deben haber burbujas de aire en las puntas ni en los fositos de la placa.

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43MODO CORRECTO DE UTILIZAR LA MICROPIPETA

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47TIPOS48ELISA INDIRECTODETECCION DE ANTICUERPOS49La reaccin se lleva a cabo en los fositos de la placa, donde se adsorbe el antigeno conocido, con el suero problema. 50La actividad enzimtica sobre el sustrato apropiado, aadido al final de la reaccin, se revela por cambio de color cuantificable por espectrofotometra, la intensidad es proporcional a la cantidad de antiinmunoglobulina marcada captada, que a su vez es proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el suero problema.

51ELISA COMPETITIVO52Puede utilizarse para la determinacin de anticuerpos o de antigenos.53ANTICUERPOSSe establece una competencia entre los anticuerpos del suero problema y UN ANTICUERPO SECUNDARIO (conjugado).

54La muestra se incuba con el antigeno conocido para la formacin de los inmunocomplejos.Luego se agrega el conjugado que contiene un anticuerpo especifico secundario MARCADO ENZIMATICAMENTE.55Este anticuerpo se unir a el antigeno libre del fosito. (SUEROS NEGATIVOS) Esta reaccin es la que se colorea.56 POR LO TANTO LAS MUESTRAS POSITIVAS NO TOMAN NINGUN COLOR PORQUE LA ENZIMA NO SE LIGA AL COMPLEJO ANTIGENO ANTICUERPO QUE SE FORM.

57ELISA DIRECTO

58En la placa de poliestireno se encuentra el anticuerpo especifico para detectar el antigeno en la muestra.

La solucin de conjugado contiene la enzima ligada con un segundo anticuerpo especifico conocido que se une por otro epitopo al antigeno.CAPTURA DE ANTIGENOSANDWICH59El antigeno queda capturado en una especie de SANDWICH.El cambio de color al agregar el sustrato demostrara la presencia del antigeno.La intensidad de la reaccin cromtica se relaciona directamente con la cantidad de antigeno.60