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EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS
PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA
ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
DIANA PAOLA ALFONSO PULIDO
EDNA ROCIO SANDOVAL SISA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el titulo de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C.
Julio de 2008
2
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y
a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
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EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS
PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA
ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
DIANA PAOLA ALFONSO PULIDO
EDNA ROCIO SANDOVAL SISA
APROBADO
Directora Codirectora
Ma. CLEMENCIA F. DE LA ROTTA Ma. Fernanda Charry
ING. AGR. M. Sc. FITOPATOLOGÍA Microbióloga industrial
Asesora
Zulma Arguelles
Bacterióloga Floramérica C.I
David Gómez M. Sc. Juan C. Hio
Jurado Jurado
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EVALUACIÒN “In Vitro” DE FUNGICIDAS PARA EL CONTROL DE HONGOS
PATÓGENOS EN ESQUEJES DE CLAVEL DURANTE LA
ETAPA DE ENRAIZAMIENTO
DIANA PAOLA ALFONSO PULIDO
EDNA ROCIO SANDOVAL SISA
APROBADO
Ingrid Schuler Ph.D Janeth Arias Palacios M. Sc.
DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
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A Dios por haberme brindado paciencia y fortaleza para salir
adelante obteniendo grandes triunfos.
A mis padres Alberto y Rosaura por todo su amor, esfuerzo e
incondicional apoyo durante toda mi vida.
A mi hermana por su compañía y apoyo.
A mi tia Blanca y Fernando por su constante apoyo.
A “My princess” Valery por ser la luz de mis ojos y darle alegría a mi
vida.
A las personas que están ausentes pero desde donde se encuentran
siempre fueron un apoyo espiritual.
A todos mis amigos por su apoyo e incondicional amistad.
A Edna por su compañía en los momentos difíciles.
6
A Dios por las personas que ha puesto en mi camino, por guiar cada
instante de mi vida y permitir la finalización exitosa de este proyecto.
A mi mama por fomentar en mí, valores de honestidad, superación y
esfuerzo, si no fuera por su sacrificio no sería lo que soy y este sueño
no la habría cumplido.
A mi hermana, fiel amiga y consejera, por levantarme en los momentos
más difíciles que hemos afrontado y por darme la alegría más grande
de mi vida: mis sobrinitas.
A mi papa, a pesar de la distancia en nuestros corazones por
apoyarme de corazón y por los buenos recuerdos.
A Andrés por darme momentos tan felices, por su amor incondicional
y por sus palabras de aliento en los momentos indicados.
A Paola por su humildad, comprensión y su gran amistad.
7
AGRADECIMIENTOS
A la Dra María Clemencia Forero De La Rotta por guiarnos en el desarrollo de este
proyecto y por su constante apoyo.
A laboratorios Dr Calderon Asitencia Técnica Agrícola LTDA. por su colaboración
en la financiación de este proyecto.
Al laboratorio de sanidad vegetal de C.I. Floramerica LTDA. Por su contribución en
el desarrollo de este proyecto.
A María Fernanda Charry por estar siempre incondicionalmente en los momentos
que más la necesitamos.
A Zulma Arguelles Ramirez por su asesoría y apoyo en el desarrollo de este
proyecto.
A Andrés Libardo Rojas por su colaboración en el proyecto.
A Liseth Castellanos por su aporte en el proyecto.
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TABLA DE CONTENIDO
PAGINA
1. Introducción 1
2. Marco Teórico 3
2.1. Generalidades del clavel 3
2.1.1.Suelos y clima 3
2.1.2.Taxonomía del clavel 3
2.2. Proceso de producción de las flores 4
2.3 Principales enfermedades en bancos de enraizamiento en clavel 9
2.3.1. Mancha foliar anillada Cladosporium echinulatatum. 11
2.3.2. Pudrición del tallo por Fusarium roseum 13
2.3.3. Pudrición de la corona Rhizoctonia solani 17
2.3.4. Alternariosis o tizón por Alternaría dianthi 21
2.4. Mecanismos de control de enfermedades 24
2.4.1. Control químico de fungicidas 24
2.4.2. Tipos de fungicidas 25
2.4.3. Mecanismos de acción 27
2.4.4. Resistencia a los fungicidas 27
2.5. Control biológico 29
2.5.1 Organismos útiles en control biológico 31
2.5.2. Mecanismos de control biológico 32
3. Justificación 35
4. Objetivos 36
4.1. Objetivos general 36
4.2. Objetivos específicos 36
5. Materiales y Métodos 37
5.1. Diseño experimental 37
9
5.2. Aislamiento de los hongos 38
5.3. Caracterización macroscópica y microscópica de los hongos 39
5.4. Evaluación del efecto fungicida y fungistático de los fungicidas 39
5.5. Inhibición de crecimiento micelial 40
5.5.1. Método de Bloques de Agar 41
5.5.2. Prueba de acción fungicida o fungistático 42
5.6. Evaluación por halos de inhibición 42
5.6.1. Métodos de pozos 42
5.6.2. Método de los discos de papel 43
5.7. Análisis estadístico 44
6. Resultados 45
6.1. Aislamiento y caracterización macroscópica y microscópica
de los hongos. 45
6.2. Evaluación in vitro de fungicidas 48
6.2.1. Evaluación por halos de inhibición 48
6.2.2. Inhibición de crecimiento micelial 56
7. Discusión 64
8. Conclusiones 68
9. Recomendaciones 70
10. Referencias bibliográficas 71
11. Anexos 80
10
LISTA DE FIGURAS
PÁG
Figura 1: Síntomas en hojas de clavel causados por C. echinulatum 13
Figura 2. Ciclo de infección Fusarium sp en trigo 16
Figura 3. Síntomas ocasionados por F. roseum en hojas de clavel. 17
Figura 4. Ciclo de infección de Rhizoctonia sp 20
Figura 5. Síntomas causados por Rhizoctonia sp en raíces de clavel. 20
Figura 6. Ciclo de infección Alternaria sp 23
Figura 7. Síntomas causados por A. dianthi en hojas de clavel. 23
Figura 8. Características macroscópicas y microscópicas de A. dianthi. 45
Figura 9. Características macroscópicas y microscópicas de C. echinulatum. 46
Figura 10. Características macroscópicas y microscópicas de F. roseum 47
Figura 11. Características macroscópicas y microscópicas de R. solani 47
Figura 12. Halos de inhibición A. dianthi. 49
Figura 13. Halos de inhibición micelial A. dianthi. 50
Figura 14. Halos de inhibición C. echinulatum, Técnica de pozos Procloraz. 51
Figura 15. Halos de inhibición micelial obtenidos técnica de sensidiscos
en la evaluación de fungicidas contra C. echinulatum. 51
Figura 16. Halos de inhibición F. roseum. para Trichoderma spp. 52
Figura 17. Halos de inhibición F. roseum. Técnica de sensidiscos para
Carboxin + Captan 53
Figura 18. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de
Sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra F. roseum. 53
Figura 19. Halos de inhibición R. solani con Trichoderma spp 54
Figura 20. Halos de inhibición R. solani. con Metalaxil + Mancozeb. 55
Figura 21. Halos de inhibición micelial obtenidos técnica de
sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra R. solani. 55
11
Figura 22. Halos inhibición técnica sensidiscos R. solani. 56
Figura 23. Porcentajes inhibición técnica de bloques A. dianthi. 57
Figura 24. Técnica de Bloques A. dianthi frente a Trichoderma spp 58
Figura 25. Técnica de Bloques C. echinulatum frente a Trichoderma spp 58
Figura 26. Porcentajes inhibición técnica de bloques C. echinulatum 58
Figura 27. Técnica de Bloques para F. roseum frente a Trichoderma 60
Figura 28. Porcentajes de inhibición micelial contra F. roseum. 60
Figura 29. Técnica de Bloques para R. solani frente a Trichoderma spp. 61
Figura 30. Porcentajes inhibición técnica de bloques R. solani. 62
Figura No 31. Productos con mayor eficacia para el control de patógenos
en clavel. 63
12
LISTA DE TABLAS
PÁG
Tabla No 1. Comparación entre sustratos utilizados en el enraizamiento:
Ventajas y Desventajas. 7
Tabla 2. Principales agentes causales de enfermedades en cultivo de
clavel a nivel mundial 10
Tabla 3. Fungicidas evaluados con sus respectivos tratamientos. 40
13
RESUMEN
Los cultivos de flores día a día enfrentan problemas fitosanitarios donde se incluyen
enfermedades causadas por hongos y bacterias los cuales disminuyen la calidad del
producto final generando grandes perdidas económicas. El interés del proyecto fue
evaluar tres tratamientos para 10 productos utilizados en el control de A. dianthi, C.
echinulatum, F, roseum y R. solani hongos presentes en bancos de enraizamiento
de clavel. Los productos se evaluaron mediante las técnicas in vitro de pozos,
sensidiscos y trozos, lo que permite definir el mejor producto químico o biológico de
control, expresado en porcentaje o halos de inhibición micelial, mediante un análisis
de varianza ANOVA multifactorial.
De acuerdo a los resultado obtenidos en la investigación el mejor producto fue
Trichoderma spp, el cual mostró una eficaz inhibición de los hongos fitopatógenos
evaluados, seguido de procloraz, carboxin + captan, etridiazol y metalaxil +
mancozeb. Para los tratamientos se encontró diferencia estadísticamente
significativa siendo el Tratamiento 1 el que mostró mas eficacia en la evaluación de
los productos. Entre las técnicas de pozos y sensidiscos no se evidencio una
diferencia estadísticamente significativa, pues los resultados para ambas técnicas
fueron homogéneos. La acción fungistática o fungicida de los productos no se logro
evaluar mediante la técnica de bloques pues se encontraron desventajas en el
montaje de la técnica.
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ABSTRACT
The flowers’ crops day by day have problems phytosanitary, illnesses which include
caused by fungi and bacteria which reduce the quality of the final product generating
great economic losses. The interest of the project was to evaluate three treatments
for 10 products used in controlling A. dianthi, C. echinulatum, F. roseum and R.
solani fungus present in rooting banks of carnation. The products were evaluated by
in vitro techniques of wells, absorbent paper disc and cuts, which lets you set the
best chemical or biological control, expressed as a percentage of inhibition or halos
mycelial through an analysis of variance Anova multifactorial. According to the result
obtained in the investigation Trichoderma spp was the best product, which showed
an effective inhibition of fungal pathogens evaluated, followed by prochloraz,
carboxin + capture, and etridiazol metalaxyl + mancozeb. For treatments was found
statistically significant difference being the Treatment 1 showed that the most
effective in evaluating products. The statistical analysis no showed significative
differences in the fungus growth obtained for absorbent paper disc and wells
techniques, since the results for both techniques were homogeneous. The action
fungistática or fungicides of the products are not evaluated by the technical
achievement of blocks as they found disadvantages in the assembly of the
technique.
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1. INTRODUCCION
El negocio de las flores en Colombia tiene sus comienzos en la década de 1960,
donde un número de empresarios, al descubrir las ventajas que tenia el país para
entrar a competir en el mercado norteamericano, encaminaron la producción de sus
tierras hacia la siembra de flores. La primera exportación comercial se realizo en
1965 por una suma de veinte mil dólares. A partir de ello se presento un gran
crecimiento en las tierras dedicadas a la floricultura, el cual se estabilizo en la
década de 1980. Así mismo, los productores en este periodo buscaron un
fortalecimiento en la comercialización de la flor, por lo que establecieron firmas
dedicadas a esta función en Miami, ciudad que dada su proximidad, se convirtió en
el centro comercial más importante de las flores colombianas en Estados Unidos
(Vásquez, 2003).
A comienzos de 1990 Ecuador entro fuertemente en el mercado a competir
dirigiéndose a los minoristas exclusivos que buscan flores de nuevas variedades,
con mejores características y precios. Este hecho, sumado a las ventajas
competitivas que tenía Ecuador en cuanto a costos salariales y condiciones
climáticas, llevó a que los floricultores colombianos tuvieran que realizar grandes
inversiones en nuevas variedades. De la misma manera el clavel y el mini clavel,
los cuales se consideraban como productos más tradicionales, empezaron a perder
su importancia, debido a la aparición de enfermedades vasculares causadas por
Fusarium oxysporum y algunas foliares causadas por Alternaria dianthi y
Cladosporium echinulatum (Vásquez, 2003).
Los primeros floricultores Colombianos fueron verdaderos visionarios pues
identificaron una clara oportunidad para la exportación de flores, representada en
factores climáticos, geográficos y culturales. La ubicación ecuatorial de Colombia,
implica la ausencia de estaciones climáticas marcadas, es decir, la posibilidad de
producir flores al mismo costo en cualquier época del año, sin necesidad de enfriar o
calentar los invernaderos (Pizano, 2000).
16
La industria de flores desde su iniciación en Colombia en el año 1967 alcanzó una
posición destacada en el mercado internacional a lo largo de los años. Gracias a la
oportuna intervención del gobierno y grandes empresarios la industria de las flores
para exportación ha presentado un incremento constante en la producción y
exportación; actualmente ocupa el tercer lugar como productor de flores. (Díaz et
al., 2002).
En la actualidad en Colombia hay 7290 Ha destinadas para el cultivo de flores tipo
exportación, de las cuales un 79 % están ubicadas en la sabana de Bogotá, el 17 %
en Antioquia y el 4% en otras zonas como Valle, Cauca y el eje cafetero. Igualmente
las áreas cultivadas para cada tipo de flor están distribuidas de la siguiente manera:
rosas con un 30.3 %, clavel 13.5 %, mini clavel 8 %, crisantemo y pompón 8.2 % y
otras especies ornamentales 33 % (Asocolflores, 2007).
Los floricultores han encaminado sus esfuerzos a una producción sostenible con un
desarrollo de los canales logísticos y de comercialización, permitiéndoles un mayor
conocimiento de sus mercados, especialmente el de Estados Unidos, país al cual se
dirigen la mayoría de las exportaciones. Según cifras de Asocolflores (2007) de las
exportaciones en el 2007 el 81 % de estas están dirigidas a Norte america, Rusia
3.8 %, Reino Unido 3.7 %, Canada 2.1 %, Japon 1.8 % y Alemania 1.1%.
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3. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades del clavel
El clavel tiene su origen en el mediterráneo ya que se encuentran múltiples especies
silvestres de Dianthus en Europa, Asia y Japón de donde se han distribuido por todo
el mundo. Actualmente se cultivan con interés comercial variedades de origen
americano y europeo, que se adaptan con alguna facilidad a las zonas productoras
del mundo. En países del trópico vienen cultivándose desde hace mas de 30 años,
con ventaja sobre países con estaciones, ya que se logra producción durante todo el
año sin adecuaciones muy costosas (Hogares Juveniles Campesinos, 2008).
Es una planta herbácea, anual o perenne, de tallos articulados y nudosos, sus hojas
son lineales, rígidas y paralelinervias de color verde azuloso, revestidos de una capa
cerosa y dispuestas en partes opuestas y decusadas. Las flores se producen al final
de los tallos y son hermafroditas, con cáliz gamosépalos, verde coriáceo,
persistentes. Los pétalos están fuertemente sujetos por el cáliz y son de colores
muy diversos (Botón et al., 1994)
El genero Dianthus abarca unas 250-300 especies, teniendo interés en jardinería
solamente unas 30; de estas, se destacan Dianthus caesius, D. barbatus, D.
chabaud, D. chinensis, D. deltoides, D. heddewigii, D. plumaris y D. caryophyllus,
del cual proceden los claveles reflorescentes (Garcia et al., 1977).
2.1.1. Suelos y clima
El clavel se comporta bien a temperaturas de 12 - 14ºC en la noche y 20º - 25ºC en
el día con un promedio de humedad relativa cercano al 65 %. Los suelos que mas
los favorecen son los que presentan buena retención de humedad, pero también
buen drenaje interno y un pH entre 5.5 - 7.5. Un pH alto dificulta el desarrollo de
patógenos, especialmente Fusarium oxysporum que es una de las mayores
limitaciones en este cultivo (Hogares Juveniles Campesinos, 2008).
18
2.1.2. Taxonomía
Reino: Plantae
Phylum: Angiospermas
Clase: Dicotiledoneas
Subclase: Archiclamideas
Orden: Centrospermales
Familia: Caryophyllaceae
Genero: Dianthus
Especie: Dianthus caryophyllus L.
Nombre Comun: Clavel
(Pérez, 2003).
Existen dos grupos hortícolas de clavel que son: Clavel estándar y Clavel miniatura.
Para exportaciones comerciales este cultivo se produce bajo cubierta, ya que de
esta forma se obtiene una calidad muy superior a la producida en campo abierto
(Barbosa, et al., 1993)
2.2. PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS FLORES
La reproducción del clavel se efectúa por semilla y esqueje. La reproducción por
semilla esta reservada a la obtención de nuevas variedades, por ser el clavel hibrido
reflorescente, extremadamente heterocigótico y por tanto, su descendencia por
semilla es totalmente irregular.
El único sistema empleado comercialmente es por esqueje y su puesta en
funcionamiento requiere tener en cuenta prácticas especiales, dentro de las que se
tienen cuatro etapas que permiten el desarrollo de la flor (Garcia et al., 1977):
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Propagación de plantas madres
Anteriormente el clavel se multiplicaba por acodo, actualmente la mejor forma de
propagación de material vegetal, es mediante esquejes procedentes de plantas
madres; de esta manera, se pueden mantener las características de la variedad. La
propagación sexual o mediante semilla se usa únicamente para la obtención de
nuevas variedades (Hogares Juveniles Campesinos, 2008).
Es el área del cultivo donde se siembran las plantas madre para producción de
esquejes; los esquejes seleccionados se agrupan en conjuntos de 25- 50 unidades y
se tapan con plástico, colocándolos en cuartos refrigerados (Asocolflores, 2002).
Es importante que los esquejes exhiban un fenotipo de características vegetativas,
es decir, de apariencia compacta, sin entrenudos visibles o poco visibles solo en la
base del mismo e idealmente con cuatro a seis pares de hojas. Deben ser lo mas
homogéneos posible entre si, de manera que aquellos que resulten disimiles (cortos,
largos, o con demasiada disparidad en vigor, peso, y cantidad de pares de hojas)
deben descartarse. De la misma manera se debe eliminar cualquier esqueje
aparentemente afectado por enfermedades o plagas (Pizano, 2000)
Bancos de enraizamiento
Son sitios destinados para colocar los esquejes sin raíz, obtenidos en el proceso
anterior, con el objeto de lograr su enraizamiento, en un sustrato determinado estéril
e inocuo (Asocolflores, 2002).
Esta operación se hace normalmente a mano; un buen esqueje debe tener dos
nudos bien desarrollados y otro en formación. Al cortarlo se dejan en la planta un
par de hojas para que siga brotando. El cultivo de plantas madres dura un año y se
puede sacar una media de 20 esquejes por planta (Garcia et al., 1977).
Para inducir la emisión de raíces la base del esqueje se trata con sustancias
estimulantes de enraizamiento; el compuesto mas utilizado ha sido por tradición el
ácido indól butírico (IBA), que debe ser disuelto y diluido en alcohol y agua destilada
20
(Pizano, 2000). Después de tratada la base del esqueje, se puede poner este a
enraizar o guardarlo en frigorífico (Garcia et al., 1977).
Sustratos para Enraizamiento
En el proceso de enraizamiento del clavel se utilizan varios sustratos lo cuales van a
determinar el éxito de dicho proceso en los esquejes del clavel. En la Tabla 1 se
citan los principales sustratos para el enraizamiento con sus respectivas ventajas y
desventajas. Los requisitos técnicos de un buen sustrato son:
Porosidad adecuada para la propagación por nebulización.
pH entre 6.5 y 6.8
Peso relativamente ligero al encontrarse en capacidad de campo.
Calidad uniforme y consistente.
Adaptabilidad de los esquejes al sembrar en campo (Pizano, 2000)
Al realizar una combinación de estos sustratos se pueden observar ventajas como:
reducción de costos. Igualmente las camas para el enraizamiento deben profundas
para alojar completamente la raíz del esqueje. En el caso de cultivar clavel en
sistemas semihidropónico con cascarilla de arroz, es recomendable enraizar en el
mismo material ya que luego la adaptación de los esquejes al trasplante y siembra
en campo es mucho más fácil. Los esquejes sembrados en bandejas de turba
requieren riego frecuente y cuidadoso pues la mayor parte de las raíces se
encuentran confinadas al “plug” y lo mas frecuente es que el esqueje se inserte
superficialmente en el suelo o sustrato del lugar final de producción (Pizano, 2000).
Antes de enterrar los esquejes, el sustrato debe estar húmedo al menos hasta
capacidad de germinación. Si se humedece cuando se encuentra relativamente
seco, es recomendable voltearlo con alguna herramienta limpia, para asegurar un
porosidad máxima (Pizano, 2000).
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Tabla 1. Comparación entre sustratos utilizados en el enraizamiento: Ventajas y Desventajas.
SUSTRATO DE ENRAIZAMIENTO
VENTAJAS DESVENTAJAS
Arena Gruesa (de mina) Bajo costoLimpia
PesadaMala retención de agua
Arena fina (de rio) Bajo costo
Posible contaminaciónPesada
Excesiva retención de agua
Escoria ( De carbón coke)
Bajo costoPorosidad ( si no es demasiado
fina)Medianamente pesada
ConsistenciaPosible contaminación
Cascarilla de arroz quemada
Limpia ( si se maneja adecuadamente)De peso ligero
Porosidad
UniformidadSe requiere vapor
Escoria/cascarilla (50/50) PorosidadPreparación uniforme
Se requiere vaporAtractiva para los pájaros
Mezcla de turba y perlita Ligera,Porosidad
CostoPuede tener pH bajo
Plugs o pellets de turba
Limpias, MecanizaciónManejo Mínimo
Raíces son visiblesMayor densidad
Menos nebulización/m2
CostoAdaptación al suelo d
campo
Fuente: (Pizano, 2000)
Enraizamiento de esquejes
Se realiza en mesones de concreto o macetas que tengan un buen drenaje, con un
sustrato de material poroso que no se inunde fácilmente. El mas utilizado es la
perlita, material gris-blanco de origen volcánico y cascarilla de arroz quemada, de
acuerdo con los resultados que se presentan en la Tabla Nº 1, que compara las
ventajas y desventajas del enraizamiento con diferentes sustratos.
La altura del sustrato debe ser de unos 10 cm, y los esquejes van enterrados hasta
el primer par de hojas. El sustrato debe ser renovado o desinfestado a fondo antes
de colocar una nueva serie de esquejes (Garcia et al., 1977).
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La decisión mas importante, clave para el enraizamiento exitoso de los esquejes de
clavel, reside en el sustrato utilizado. El costo es por supuesto un factor limitante,
dado el volumen requerido. El material debe estar libre de contaminación si no se
dispone de esterilización con vapor. Un buen esqueje debe formar raíces
abundantes aunque no excesivas y en todo caso, sobre la totalidad de su base. Los
esquejes de enraizamiento pobre o parcial deben ser eliminados (Pizano, 2000)
Producción
El aspecto más importante a tener en cuenta en la siembra de esquejes, es la
profundidad a la cual se realiza. Si bien las raíces deben quedar en posición vertical,
(sin geotropismo invertido) y cubiertas por el sustrato, el esqueje mismo y sus pares
de hojas, deben quedar libres de tierra; de lo contrario se puede favorecer la
infección por hongos como Rhizoctonia sp y Pythium sp., causantes de pudrición
temprana de plántulas (Pizano, 2000).
Dada la fragilidad del sistema radicular del esqueje no es conveniente apretar la
tierra a su alrededor, pues se puede perder parte de las raíces favoreciendo la
penetración de patógenos e implicando un gasto energético para la planta que debe
reponer las porciones perdidas (Pizano, 2000)
Una vez enraízados los esquejes se llevan al área de producción para ser
sembrados; en esta área se llevan a cabo diferentes sub-procesos como son:
preparación y desinfestación del suelo, siembra, riego y fertilización, control de
plagas y enfermedades, cosecha de flor y labores de renovación del cultivo, entre
otros (Asocolflores, 2002).
Normalmente un brote desarrollado en condiciones normales de luminosidad, llega a
contar con 17 a 21 pares de hojas en promedio, desde la base hasta el botón floral
apical, siendo esta ultima zona la mas reproductiva, y la parte basal la mas
vegetativa (Pizano, 2000).
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Post-cosecha
Comprende todas las actividades de selección de las flores, el empaque y la
conservación de las mismas para exportación. En la post-cosecha se realiza:
clasificación, “boncheo” (armados los ramos, que se cubren con un capuchón
plástico), tratamiento sanitario, empaque y traslado a cuartos fríos de conservación
(Asocolflores, 2002).
2.3. PRINCIPALES ENFERMEDADES EN BANCOS DE ENRAIZAMIENTO EN
CLAVEL
El clavel es atacado por gran variedad de enfermedades causadas por bacterias,
hongos, nematodos, virus y micoplasmas. Dentro de estas, las más importantes son
las vasculares causadas por hongos que generan grandes pérdidas, debido a su
persistencia en el suelo, la facilidad de propagación a otras áreas y a los altos
costos generados en las medidas necesarias para su control, este es el caso del
marchitamiento vascular del clavel causado por el hongo Fusarium oxysporum.
Tabla 2. Principales agentes causales de enfermedades en cultivo de clavel a nivel mundial
PATOGENO O AGENTE CAUSAL NOMBRE COMUN
Bacterias
Pseudomonas woodsiiPseudomonas caryophilli
Erwinia chrysanthemiAgrobacterium tumefaciens
Rhodococcus fascinas
Mancha foliar bacterialMarchitez bacterial
Marchitez bacterial lentaAgalla de la corona
Fasciación
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Hongos
Alternaria dianthiAlternaria dianthicola
Stemphyllium botryosumPeronospora dianthicola
Cladosporium echinulatumFusarium roseum
Fusarium oxysporumBotrytis cinereaPythium ultimun
Rhizoctonia solani
Tizón alternaríaTizón alternaría
Pudrición del cálizMildeo vellosoMancha foliar
Pudrición del talloMarchitez vascular
Moho grisPudriciónPudrición
Fuente: APS
Esta es la enfermedad más limitante y por tanto importante en este cultivo en
Colombia, debido a la fácil propagación a partir de material infectado. Hasta 1975
los cultivos Colombianos estuvieron libres del fitopatógeno, pero debido a la
frecuente importación de esquejes procedentes de Holanda, Francia, Alemania,
Israel y Estados Unidos, la enfermedad se presento en nuestros cultivos (Dimaté,
2002).
En el cultivo de clavel se han reportado un elevado número de agentes patógenos,
sin embargo, solo unos pocos causan pérdidas económicas graves como lo muestra
la Tabla 2. Principales agentes causales de enfermedades en el cultivo de clavel a
nivel mundial (Pizano, 2000).
Dentro de las enfermedades presentes en cultivos de clavel, las mas importantes
son las enfermedades vasculares por las altas perdidas que ocasionan, por la
facilidad de propagación a través de los esquejes, alta persistencia en el suelo y el
alto costo de algunas medidas de control utilizadas (Arbeláez, 1997).
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2.4.1. MANCHA FOLIAR ANILLADA Cladosporium echinulatum
(Heterosporium echinulatum).
Es la enfermedad foliar del clavel de mayor importancia en Colombia, especialmente
en bancos de enraizamiento y en variedades susceptibles, a diferencia de otros
países en donde este patógeno es un problema secundario (Pérez, 2003).
La enfermedad fue registrada por primera vez en Colombia en 1927 en los jardines
de algunas casas del Departamento de Antioquia. Las primera epidemias de
mancha foliar anillada se presentaron en 1972 y 1973 y llevaron incluso al instituto
Colombiano Agropecuario a tomar medidas cuarentenarias en algunos cultivos, con
la prohibición de exportar claveles hasta tanto la enfermedad no se erradicara
(Pizano, 2000).
Este hongo perteneciente a la familia Dematiaceae, llevan largas cadenas
ramificadas de conidias, los cuales finalizan con elemento mas pequeños
(Formación basifugá). Las esporas son ovoides, unicelulares o con un tabique
(Koneman, 2004).
Descripción morfológica: El micelio joven es de color claro, sin septas y
con terminaciones redondeadas; es septado, nudoso y oscuro en estado adulto, el
micelio puede ramificarse dicotómica o tricotómicamente. Los conidióforos son
septados, oscuros, fasciculares, agrupados o simples. Las conidias son oblongas,
oscuras, echinuladas, desde cuatro hasta seis septas (Barbosa, 1993)
TAXONOMIA
Division: Eumycota
Subdivision: Deuteromycotina
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Clase: Hyphomycetes
Orden: Moniliales
Familia: Dematiaceae
Genero: Cladosporium
Especie: echinulatum
Nombre científico: Cladosporium echinulatum (Berkeley) de Vries, 1952.
(Barbosa, et al., 1993).
Epidemiología. La mancha foliar es ocasionada por el hongo C. echinulatum
(anteriormente conocida como H. echinulatum) de la clase Deuteromycetes, orden
Moniliales. Inicialmente la espora cae sobre el tejido verde y bajo condiciones
favorables germina y forma un tubo germinativo que penetra la planta, crece dentro
del tejido formando manchas necróticas redondas. El período de incubación del
hongo es de nueve días en condiciones favorables (Pérez, 2003).
Las condiciones favorables para el desarrollo de la enfermedad son: altas
temperaturas con humedad relativa alta, follaje mojado por daños en el plástico, alta
densidad de siembra, baja ventilación, exceso de agua en el suelo entre otros
(Pérez, 2003).
Síntomas: Las plantas de clavel son susceptibles en cualquier estado de
desarrollo y durante todo el ciclo productivo. La fase de enraizamiento y los primeros
3 – 6 meses de producción son los periodos donde ocurre la mayor incidencia
(Barbosa, 1993).
La mancha foliar anillada se presenta en las hojas, los tallos y los sépalos según la
susceptibilidad de la variedad. En las hojas los primeros síntomas corresponden a
puntos cloróticos de apariencia aceitosa y redondeada, luego las manchas
aumentan de tamaño presentándose un borde rojizo, menores a 1 mm de diámetro,
los cuales son difíciles de evidenciar a trasluz (Figura 1). En algunos casos las
27
manchas presentan un halo violáceo alrededor de la lesión, observándose tanto en
el haz como en el envés (Barbosa, 1993) (Pérez, 2003).
Figura 1: Síntomas en hojas de clavel causados por Cladosporium echinulatum.Fuente el autor.
Epidemiologia y ciclo de vida: En cualquier enfermedad infecciosa, se
lleva a cabo una serie de eventos sucesivos mas o menos distintos que propician el
desarrollo y la constancia de la enfermedad y del patógeno. C. echinulatum ser un
parasito facultativo, presenta una penetración pasiva por heridas y estomas; la
germinación de las conidias se da a una temperatura de 30º C, aproximadamente
en 4 horas y la diseminación se hace por el viento, agua, o por acción del hombre
(Barbosa, 1993).
2.4.2. PUDRICIÓN DEL TALLO POR Fusarium roseum
Es una enfermedad que potencialmente puede ser muy destructiva y alarmante, ya
que en pocas semanas el patógeno puede ocasionar la muerte de las plantas
28
completas. Es la enfermedad más importante en cultivo de clavel en bancos de
enraizamiento (Pérez, 2003).
La incidencia de F. roseum se relaciona por lo general con las labores de cultivo, y
aunque es más recomendable realizar la cosecha de flores o de esquejes
manualmente, ya que la diseminación de esporas se reduce, algunas variedades
tienen tallos demasiado recios y se requiere utilizar algún tipo de cuchilla para hacer
los cortes. Lo mismo sucede en plantas madres o de producción en estadios finales
de su ciclo productivo cuando los tallos son ya bastante leñosos. Si bien el corte con
cuchilla es más limpio, es importante tener en cuenta que la herramienta utilizada
para actuar como factor diseminante del hongo, por lo que es necesario
desinfestarla periódicamente (Bayer CropScience, 2008).
F. roseum, es un hongo perteneciente del genero que causa la marchitez vascular
del clavel (F oxysporum), es causante de pudrición del tallo sobre todo a nivel del
suelo, pero también de sus ramificaciones.
El efecto de F. roseum sobre la productividad durante las fases iniciales del cultivo
es poco predecible, pero puede afirmarse que mientras no se tomen las medidas
sanitarias adecuadas la producción se puede ver drásticamente afectada. A pesar
de la importancia que reviste este problema, no ha sido suficientemente
documentado en la literatura con respecto a la producción de clavel (Bayer
CropScience, 2008)
Descripción: F. roseum es un hongo imperfecto que esporúla profusamente
sobre la superficie del tejido hospedero, en forma de esporordoquios o estructuras
fructificantes de un color rosado-durazno típico, rodeado de micelio algodonoso
blanco. Una característica descriptiva a nivel microscópico es que no forma
clamidiosporas y las microconidias son muy escasas; por lo tanto se observan
principalmente macroconidias, largas y delgadas, con tres o mas divisiones y forma
de huso típica del genero. El hongo se aísla fácilmente en el laboratorio,
29
produciendo colonias de un típico color rojizo, que sirve para diferenciarlas de
aquellas de F. oxysporum, de color morado (Pizano, 2000).
TAXONOMÍA
Reino: Fungi
División: Deuteromycota
Clase: Deuteromycetes
Orden: Moniliales
Familia: Tuberculariaceae
Genero: Fusarium
Especie: roseum
Epidemiología y ciclo de vida: Este patógeno produce dos tipos de
conidias: macroconidias largas, hialinas y multiseptadas; microconidias ovales y
hialinas. El hongo permanece en el suelo o sustrato en forma de micelio o
clamidosporas, las cuales corresponden a estructuras de resistencia (Pérez, 2003).
Este hongo tolera niveles bastantes bajos de acidez, se ha establecido que no tiene
requerimientos especiales para germinar, sólo necesita agua y es muy adaptable a
una gran diversidad de condiciones nutricionales del medio de cultivo (Pérez, 2003).
Este hongo requiere un punto de entrada a los tejidos susceptibles (usualmente una
herida), razón por la cual ataca principalmente tres estadios diferentes de su ciclo
productivo: a nivel de la propagación en las plantas abuelas y plantas madres, a
través de los puntos de cosecha de los esquejes y en los esquejes que se
encuentran en proceso de enraizamiento, pues la base del esqueje es una vía
abierta para la infección; y en plantas que se encuentran en procesos de floración, a
través de los puntos de cortes de las flores (Figura 2) (Pizano, 2000).
30
Figura 2. Ciclo de infección Fusarium sp en trigo.Fuente: http://www.zoetecnocampo.com/Documentos/fusarium/fusarium.htm
Síntomas: Los primeros indicios incluyen manchas rojizas sobre la zona
afectada, que de pronto dan lugar a una clara pudrición que llega hasta los tejidos
vasculares, induciendo marchitez y mas tarde la muerte del brote afectado o toda la
planta según la severidad de la infección (Figura 3). La presencia de F. roseum se
distingue claramente cuando el hongo esporúla por el color típico de los
esporodoquios (Pizano, 2000).
31
Figura 3. Síntomas ocasionados por Fusarium roseum en hojas de clavel. Fuente: el Autor
2.4.3. PUDRICIÓN DE LA CORONA Rhizoctonia solani
El genero Rhizoctonia sp cumple con las siguientes características generales:
producir esclerocios de estructura uniforme y encontrarse asociado con raíces de
plantas (Cardona et al., 2002).
Adicionalmente, y luego de una completa evaluación microscópica, presenta las
siguientes características:
Ramificación de las hifas vegetativas jóvenes cerca al septo distal de las
células.
Formación del septo en la ramificación cercana al punto de origen
Constricción de las hifas ramificadas en el punto de origen
Ausencia de conexiones en abrazadera
Ausencia de conidias
32
Dentro de cada uno de los tres principales grupos de Rhizoctonia sp pueden
realizarse subdivisiones basadas en un fenómeno conocido como Anastomosis
Hifal, implementado en el año de 1969 por Parmeter, el cual es la manifestación de
incompatibilidad somática o vegetativa entre aislamientos (Cardona et al., 2002).
Esta reacción puede alcanzar la fusión de las paredes y las membranas de las hifas
de los aislamientos enfrentados (reacción de auto-anastomosis, con formación de
una hifa heteocariotica), como puede no presentarse (reacción de incompatibilidad
somática); aquellas reacciones intermedias, en las cuales las paredes y
posiblemente las membranas, reconectan pero no se fusionan, ocurre típicamente
entre miembros de mismo grupo de anastomosis (Cardona et al., 2002).
R. solani causa varios tipos de enfermedades en una gran cantidad de plantas,
siendo las mas importantes la pudrición temprana de plántulas o “Damping off” y el
Chancro o pudrición de los tallos (Pizano, 2000). Esta enfermedad ataca también
gran variedad de cultivos, pudiéndose convertir en un potencial problema en el
cultivo del clavel sino se detecta y se maneja a tiempo. (Pérez, 2003)
Descripción: Aunque se ha identificado una fase perfecta de este hongo
capaz de reproducirse sexualmente (el basidiomiceto Thanatephorus), lo cierto es
que en la naturaleza se presenta usualmente como un hongo estéril que produce
abundante micelio sin formar conidio o esporas de ningún tipo. Forma estructuras de
supervivencia conocidas como esclerocios, de color negro y forma redondeada que
para todo efecto practico constituyen su medio de diseminación.
TAXONOMIA
Reino:Fungi
Filo: Basidiomycota
Clase: Basidiomycetes
33
Subclase: Agaricomycetidae
Orden: Polyporales
Familia: Corticiaceae
Género: Rhizoctonia (fase imperfecta). Thanatephorus (fase perfecta)
Especie: solani (fase imperfecta). cucumeris (fase perfecta)
(Galindo et al., 1986)
Epidemiologia y Ciclo de vida: El hongo sobrevive en forma de micelio o
esclerocios bajo condiciones adversas. Puede ser diseminado en material de
propagación, con el agua de riego, herramientas y labores culturales. El micelio es
capaz de infectar los tejidos susceptibles formando un cojín de infección típico
(Figura 4). En el clavel, la pudrición por R. solani es de especial importancia en
plántulas recién trasplantadas, pudiendo causar perdidas económicas considerables
en las primeras etapas del cultivo, especialmente durante las 10 primeras semanas
después de la siembra. El hongo tiene requerimientos bastante específicos de
humedad y temperatura, siendo óptimos 15º - 18ºC y una alta humedad del suelo
(Pizano, 2000).
Síntomas: En el clavel produce una pudrición en la base del cuello, en la
raíz presentándose una constricción típica de color pardo claro que evoluciona a
marrón oscuro. Dicha constricción termina por afectar el transporte de solutos y
nutrientes a través de los haces vasculares de la planta, razón por la cual puede
pasar desapercibida confundiéndose con la marchites vascular.
La enfermedad se encuentra frecuentemente en plantas recién sembradas, aunque
ocasionalmente puede presentarse en plantas adultas. Sí la planta es atacada por
las raíces, el primer síntoma es el marchitamiento durante el día y la recuperación
en la noche. Las raíces afectadas se pudren rápidamente y aparecen lesiones de
color café rojizo en la base del tallo o justo bajo el suelo, las lesiones progresan
formando chancros que con el tiempo estrangulan el tallo (Figura 5). (Pérez, 2003).
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Figura 4. Ciclo de infección de Rhizoctonia sp.Fuente: www.apsnet.org/.../Rhizoctonia/discycle.htm
Figura 5. Síntomas causados por Rhizoctonia sp en cuello de raíces de clavel.Fuente: El autor
Este hongo se caracteriza por formar esclerocios irregulares, que actúan como
estructuras de supervivencia. Cuando el hongo habita en el suelo, forma estos
esclerocios sobre los desechos orgánicos, dado su comportamiento de saprofito
facultativo (Galindo, 1986)
35
2.4.4. ALTERNARIOSIS O TIZÓN POR Alternaría dianthi.
Los tizones causados por Alternaria sp fueron el problema mas serio para la
producción de clavel en la primera mitad del siglo pasado en EE.UU. Esta
enfermedad reporta grandes perdidas en cultivos al aire libre o bajo invernadero
cuando la humedad relativa es muy alta y se combina con la alta temperatura
(Pizano, 2000).
Este hongo causa manchas en hojas de plantas, pequeñas y de color púrpura al
comienzo. Principalmente deshidratan los tejidos infectados, provocando su muerte
(García et al., 1977).
Descripción: En cultivo presenta colonias de colores oscuros, grises,
oliváceos, marrones o negros. Sus conidióforos simples o ramificados, de color
marrón claro a oscuro. La célula conidiógena es integrada, terminal o simpodial.
Los conidios de Alternaria sp. pueden aparecer solitarios o encadenados y son
fácilmente reconocibles debido a su tamaño (40 x 12 micras) (Dimaté, 2002).
Es una enfermedad que reporta pérdidas graves en cultivos de clavel a campo
abierto o bajo invernadero cuando la humedad relativa es muy alta y se combina
con alta temperatura. Estas condiciones bajo invernadero son usuales durante el
enraizamiento de los esquejes, por consiguiente es importante prestar las medidas
de manejo pertinentes en este ciclo (Pérez, 2003).
TAXONOMIA
Reino:Fungi
Filo: Ascomycota
Clase: Dothideomycetes
36
Subclase: Pleosporomycetidae
Orden: Pleosporales
Familia: Pleosporaceae
Genero: Alternaria
Especies: dianthi
(Bayer CropScience, 2008)
Epidemiología ciclo de vida: El tizón del clavel es una enfermedad producida
por el hongo A dianthi de la clase Deuteromycetes. Alternaría es un hongo
imperfecto y cosmopolita, que sobrevive fácilmente en el suelo asociado con materia
orgánica en descomposición (Figura 6).
Produce conidias profusamente sobre el tejido hospedero, que se desprenden
fácilmente y son diseminados por el agua y el aire. Al observar el hongo al
microscopio se observa un micelio oscuro y esporas periformes multicelulares
(Pérez, 2003).
Síntomas: Se desarrollan manchas sobre las hojas, tallos e incluso las flores,
inicialmente pequeñas de color morado, que pronto adquieren un borde amarillento,
tornándose el centro de color gris oscuro. En casos avanzados las manchas pueden
unirse afectando brotes complejos e incluso plantas enteras (Pizano, 2000).
A nivel de propagación es usual observar esquejes en proceso de enraizamiento
con las puntas negras o afectadas por A. dianthi. Las puntas de las hojas con
frecuencia sufren daños asociados a la temperatura del invernadero una vez se
sacan del cuarto frio. El tejido muerto restante es un espacio ideal de infección para
este hongo (Pizano, 2000).
37
Figura 6. Ciclo de infección Alternaria spFuente: www.apsnet.org/.../PotatoTomato/discycle.htm
Figura 7. Síntomas causados por Alternaria dianthi en hojas de clavel.Fuente: El autor
En las hojas los primeros síntomas son generalmente pequeños puntos de color
violeta. Bajo condiciones húmedas estos aumentan hasta formar manchas típicas de
hasta 1,5 cm de diámetro. Las márgenes de las manchas son usualmente violáceas
en color y con el centro marrón grisácea (Figura 7). Pueden estar presentes esporas
negras en esta área central, dando a la mancha una apariencia sucia, las lesiones
38
llegar a unirse produciendo la muerte de la hoja. Algunas variedades son más
susceptibles que otras, especialmente las de origen Mediterráneo (Pérez, 2003).
2.5. MECANISMOS DE CONTROL DE ENFERMEDADES
2.5.1. CONTROL QUIMICO “FUNGICIDAS”
La palabra fungicida se deriva de los términos latinos “fungus”: hongo y “caedo”:
matar. En este sentido etimológico, fungicida es todo agente con habilidad para
destruir organismos fungosos. El calor, los ácidos, la luz ultravioleta, son agentes
físicos fungicidas. Sin embargo, el termino fungicida se refiere a los productos
químicos usados en la prevención y en algunos casos en la erradicación o curación
de enfermedades producidas por hongos fitopatógenos (Ochoa, 2004).
En este sentido estricto, es conveniente distinguir entre acción fungicida y acción
fungistática. Se habla de la primera cuando la sustancia química produce la
destrucción del organismo fungoso, es decir, ocasiona una acción irreversible. En
cambio, cuando la actividad es reversible, produciendo un efecto inhibitorio temporal
en la germinación de las esporas, se hace referencia a una acción fungistática
(Ochoa, 2004).
En la actualidad se cuenta con un amplio espectro de compuestos fungicidas; estos
pueden adaptarse a las formulaciones que satisfagan necesidades precisas y puede
aplicarse en pequeñas parcelas o miles de hectáreas utilizando maquinas
apropiadas para este fin (Ochoa, 2004).
Entre las características deseables en un fungicida se encuentran:
39
Aspectos biológicos: debe ofrecer un control de la enfermedad eficaz y
consistente. No debe ser toxico a la concentración recomendada. No debe
afectar adversamente a otras partes del ecosistema del cultivo.
Aspectos toxicológicos: residuos que queden en el cultivo no deben ser un
problema para el consumidor. No debe construir un peligro durante la aplicación.
Aspectos de la formulación: debe ser seguro al almacenarse y transportarse. El
método de formulación debe aumentar su eficiencia como fungicida. Debe ser
fácil de aplicar a la concentración precisa (Ochoa, 2004).
2.5.2. TIPOS DE FUNGICIDAS
SEGÚN SU TOXICIDAD
Categoría I: toxicidad alta
Compuesto cuya DL50 va de 0.50mg del toxico por kg de peso. Estos productos son
muy peligrosos, solo pueden manejarse bajo normas de seguridad muy estrictas y
por personal preparado.
Categoría II: toxicidad media
Compuestos cuya DL50 va de 50-500mg del toxico por kg de peso. Productos
medianamente tóxicos y peligrosos que pueden manejarse bajo normas de
seguridad.
Categoría III: toxicidad baja o moderada
Se encuentran en ella productos con DL50 superior a 500mg del toxico por kg de
peso (Patiño et al., 2001).
40
CLASIFICACIÓN SEGÚN SUS USOS
En el caso de los fungicidas sistémicos, para poder determinar el modo de acción
es necesario cuantificar una amplia gama de interacciones complejas que son
difíciles de medir, ya que el producto necesita vencer algunos obstáculos para
llegara su sitio de acción. Estos obstáculos que el producto tiene que pasar son:
Cutícula de la planta
Células subcuticulares
Metabolismo de la planta hospedera
Absorción dentro de la planta durante la traslocación
Membrana del patógeno
Metabolismo que se desarrolla en el patógeno
(ACFCA, 1994).
CONTACTO: La mayoría de los fungicidas se usan como protectantes
debido a que forman una barrera protectora en la planta. Los fungicidas de contacto
actúan en sitios múltiples, ya que interfieren con los procesos metabólicos centrales
de los hongos. Además la mayoría de estos fungicidas afectan la producción de
energía o ATP, inhibiendo la respiración o desacoplando la fosforilación oxidativa
(Patiño et al., 2001).
SISTEMICOS: Actúan interrumpiendo el desarrollo del agente causante de la
enfermedad, después de iniciada la infección. Comprende un grupo reducido de
fungicidas, se usa con fines de protección sistémica, en la cual la sustancia química
se introduce o absorbe en el sistema circulatorio de la planta actuando como una
especie de vacuna. Esta ultima forma de control de enfermedades vegetales, recibe
el nombre se quimioterapia (Patiño et al., 2001).
41
2.5.3. MECANISMOS DE ACCIÓN
La acción fungicida es usualmente expresada en uno de los efectos físicamente
visibles: la inhibición de la germinación de esporas o la inhibición de crecimiento
micelial. Muchos fungicidas previenen la germinación de esporas o matan la espora
inmediatamente iniciado el proceso de germinación. Algunos de estos inhibidores
químicos o fungicidas también retardan o detienen el crecimiento del hongo cuando
se aplican después de que se ha desarrollado el estado de infección (Tabares,
2002).
Todos los fungicidas son inhibidores metabólicos; es decir, estos bloquean algunos
procesos metabólicos vitales de la célula. Por consideración se han clasificado los
deferentes mecanismos de acción dentro de tres amplios grupos:
Interferencia con la división celular
Inhibición de enzimas involucradas en el metabolismo celular
Interferencia con la función y síntesis de la pared celular de los hongos
(antracnosis) (Tabares, 2002).
2.5.4. RESISTENCIA A LOS FUNGICIDAS
La resistencia en los hongos se define como un fenómeno no observado en ciertas
clases de hongos normalmente susceptibles a ciertos fungicidas, que se manifiestan
por una reducción de la sensibilidad a dichos productos, con la consiguiente perdida
de eficacia de los mismos para dichos hongos. Hablando de fungicidas
comúnmente se consideran como equivalentes los términos resistencia, tolerancia o
reducción de sensibilidad, pero se refiere el termino resistencia (Guzmán, 1997).
La acción fungicida es realmente una reacción bioquímica que supone íntimo
contacto entre los componentes de la reacción. Si este íntimo contacto no ocurre,
no se presenta la reacción y hay resistencia; los mecanismos mas importantes se
pueden dividir en:
42
Menor permeabilidad de las membranas celulares: en este caso, los
individuos resistentes escapan a la acción fungicida porque las membranas
celulares no permiten la entrada del producto; los que si permiten la entrada, son
susceptibles (Guzmán, 1997).
Rutas metabólicas alternas: en este caso el toxico toma otra ruta en los
individuos resistentes, de manera que esquivan los sitios de acción de los
patógenos (Guzmán, 1997).
Detoxificación del fungicida: el patógeno resistente es capaz de
metabolizar el producto y los metabolitos producidos no son fitotóxicos (Guzmán,
1997).
Falta de activación del fungicida por el patógeno: en ciertos casos
algunos productos no son fungicidas en si mismos si no que deben sufrir un cambio
o metabolización (activación) dentro del patógeno para convertirse en fungitoxico;
en los individuos resistentes esta activación dentro del patógeno no ocurre y, por lo
tanto, escapan a la acción del producto (Guzmán, 1997).
Alteración del sitio reactivo: cuando el fungicida es de acción especifica
actúa sobre un solo sitio del patógeno, una modificación en este sitio puede traer
como consecuencia una falta de acople entre el patógeno y el fungicida resultar en
resistencia (Guzmán, 1997).
2.6. CONTROL BIOLOGICO
El control biológico de enfermedades ha sido definido por varios investigadores
como la reducción de la densidad de inoculo de las actividades del patógeno en
estado activo o en dormancia por uno o mas organismos, que ocurre en forma
natural o a través del manejo del medio ambiente, del hospedante o del antagonista
(Duarte et al., 1996).
43
A las interacciones hospedero patógeno y los factores ambientales se añade la
influencia de los agentes de control biológico. En este esquema, hay dos vías a
través de las cuales pueden actuar los agentes de control biológico. Externamente
al hospedero el agente de control pude ser antagonista, por lo tanto, reducir la
actividad, eficiencia, y/o densidad de inoculo del patógeno a través de antibiosis,
competición, o depredación / hiperparasitismo. Esto conduce a la reducción en el
potencial de inoculo de un patógeno, el cual es definido como “ la energía disponible
para la colonización de un hospedero o de un sustrato en la superficie del sustrato
que se va a colonizar” (Duarte et al., 1996).
El control biológico se ha constituido en una de las posibles soluciones al uso
inadecuado de productos químicos, con un relativo éxito en países como Brasil, EE
UU y algunos países de Europa, sin embargo actualmente Colombia esta tratando
de incorporar este control en algunos sistemas de producción (Duarte et al., 1996).
El control biológico de fitopatógenos mediante la adición de microorganismos
antagonistas al suelo presenta una alternativa para el control de enfermedades
vegetales. Sin embargo, para que este control sea efectivo se requiere de
cantidades significativas de inoculo, además, este control depende de varios
factores tales como la temperatura, el pH y las condiciones fisicoquímicas del suelo,
el tipo de inoculo usado (en el caso de bacterias: esporas o células vegetativas y en
el caso de los hongos: micelio, conidios, clamidosporas), tiempo de introducción del
antagonista en el suelo, en relación con el tiempo de siembra entre otras (Hutson et
al.,1998)
Han sido diferentes los factores que han impulsado un mayor desarrollo del control
biológico en este campo; tal vez uno de los más importantes es la percepción que
se tiene del impacto negativo en el medio ambiente que ocasionan los pesticidas y
la calidad de los productos agrícolas para el consumo humano y animal. La relativa
facilidad en el manejo de ciclos biológicos bajo condiciones controladas, la
determinación de enemigos naturales y la cría masiva de estos, han sido factores
que han permitido un mayor desarrollo en el control biológico de plagas (Duarte et
al., 1996).
44
Resulta, por una parte, que la actividad de los organismos vivos es afectada
sustancialmente por las condiciones ambientales, de tal forma, que el control que
ejercen estos agentes pueden resultar inconsistentes cuando se trata de
generalizar, resultados de investigaciones realizadas en un lugar determinado
(Duarte et al., 1996).
El potencial del control biológico es muy grande y ofrece alternativas en el manejo
de las enfermedades de las plantas. Son diversas las estrategias biológicas para el
control de las enfermedades, las cuales se encuentran basadas en los siguientes
puntos:
Reducción del inoculo del patógeno y de su actividad
Protección de la superficie de la planta a la infección por el patógeno: raíces,
hojas, frutos, semillas, heridas.
Estimulo a la resistencia de la planta.
(Duarte et al., 1996).
El agente de biocontrol puede operar de forma primaria en el tejido del hospedante,
iniciando por lo tanto una respuesta de resistencia en el hospedante (protección
cruzada) tornándose antagonista, o conllevando a la perdida de virulencia al ocurrir
anastomosis entre el patógeno y su línea avirulenta (hipovirulencia). Todas estas
interacciones están influenciadas por el ambiente, y este factor puede tener un
impacto en cuanto a determinar si el control biológico opera o no en un sistema
(Duarte et al., 1996).
2.6.1. ORGANISMOS UTILES EN CONTROL BIOLOGICO
La mayoría de los agentes antagonistas utilizados en control biológico son saprofitos
debido a su facilidad de adaptación al medio y a su alta capacidad de competencia
por nutrientes frente a otros organismos. Dentro de este grupo de agentes de control
biológico se encuentran varios tipos de organismos como protozoos, nematodos,
45
rotíferos, virus, bacterias y hongos. Dentro del grupo de los hongos se destacan el
genero Trichoderma sp, el cual posee varias características que lo ubican como un
buen agente antagonista de otros hongos fitopatógenos (Elias et al., 1984).
Dentro del genero Trichoderma se mencionan 11 especies caracterizadas por un
crecimiento rápido y por poseer una esporulación abundante. Varios autores
registran a las especies T. harzianum, T. hamatum, T. viride y T. koningii. Por su
actividad antagonista sobre varios hongos patógenos, logrando disminuir
enfermedades (Elias et al., 1984).
La actividad de estas especies varia de acuerdo a cada una de ellas y puede
involucrar mecanismos de antibiosis por la producción de metabolitos volátiles y no
volátiles, como ocurre con T. hamatu y T. viride. También se ha registrado la
actividad parasitica de T. harzianum y T. koningii sobre R. solani, Sclerotium spp. y
Pythium sp mediante la degradación y penetración del micelio de los hongos
parásitos; dicha actividad es facilitada por la producción de enzimas como la β 1,3
glucanasa y la quitinasa, las cuales degradan ciertos polímetros como a quitina
(Elias et al., 1984).
Trichoderma spp es un microorganismo cosmopolita que se encuentra en casi todos
los suelos y otros habitats naturales, especialmente en aquellos ricos en materia
orgánica. Trichoderma spp es considerado un colonizador secundario, dado si
frecuente aislamiento a partir de materia orgánica en descomposición, también es
frecuentemente aislado a partir de las superficies de las raíces de varias plantas, de
madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patógenos (Hutson et
al.,1998)
Se ha establecido que varias especies del genero Trichoderma incorporadas el
suelo, presentan un buen grado de antagonismo sobre patógenos tales como R.
solani, S. sclerotium, Sclerotium rolfsii, Pythium spp., Fusarium spp., causantes de
enfermedades en diversos cultivos de clima frio, medio y calido. En todos los casos,
el mayor éxito ha sido logrado con cepas y especies nativas de Trichoderma, ya que
están adaptadas a las condiciones locales (Hutson et al.,1998).
46
2.6.2. MECANISMOS DE CONTROL BIOLOGICO
COMPETENCIA
La competencia es “la demanda activa en exceso de un abastecimiento inmediato
de material o condiciones de parte de uno o mas organismo”. En el suelo, los
microorganismos compiten casi que exclusivamente por sustrato: sin embargo la
competencia también puede estar involucrada en ocupar los sitios de infección
potenciales por los agentes de biocontrol (Duarte et al., 1996).
El principio básico involucrado en la competencia es que el patógeno debe ser
privado de un nutriente especial para su proceso de infección y colonización. Por lo
tanto, la investigación esta dirigida a determinar los factores para la germinación
exitosa penetración por el patógeno en el patio de infección del hospedero. Los
agentes de control biológico son usados para crear deficiencias de estos elementos
esenciales. Factores hasta ahora encontrados, que son esencialmente potenciales
son el nitrógeno, el carbono y recientemente, el hierro (Duarte et al., 1996).
Este tipo de control biológico es observado con F. solani, agente causal de la
pudrición de la raíz del fríjol. El hongo sobrevive en el suelo mediante la producción
de clamidosporas. El carbón y el nitrógeno, esenciales para la germinación y
penetración del hospedero por el patógeno, son suministrados en los exudados del
hospedero, o están presentes en el suelo. Al suministrar celulosa o un residuo de
cultivo, por ejemplo el tamo de cebada, no se observan síntomas de pudrición de
frijol. El mecanismo implicado es la competencia por nitrógeno (Duarte et al., 1996).
HIPERPARASITISMO
El hiperparasitismo y la predación representan una forma útil de antagonismo que
consiste en el contacto directo entre el organismo parásito y el organismo patogeno;
este fenómeno se a registrado por diversos autores donde se destaca la actividad
de T. harzianum sobre Sclerotium sp y T. viride sobre R. solani (Gomez, 1996).
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Un ejemplo que ilustra este mecanismo es Trichoderma spp el cual es bien
conocido como un micoparásito de R. solani. Típicamente, sus hifas son atraídas
hacia los talos de los hongos patógenos alrededor de las cuales se enroscan,
ocasionando la desintegración de las células del hongo hospedero. Tal
hiperparasitismo durante el monocultivo de un hospedero susceptible puede reducir
las densidades de inóculo del patógeno hasta niveles indeterminables, por ejemplo
para R. solani (Duarte et al., 1996).
ANTIBIOSIS
Es un proceso basado en la actividad de metabolitos producidos por algunos
microorganismos los cuales disminuyen el desarrollo o la actividad metabólica de
otros organismos, por ejemplo: T. viride posee propiedades antibióticas sobre
algunos hongos mediante la producción de gliotoxinas y viridina (Gomez, 1996).
PROTECCION CRUZADA
En este caso, un agente de control biológico es inoculado en una planta
hospedante que reconoce la presencia de un microorganismo extraño e inicia la
respuesta de resistencia, la cual puede ser química y/o morfológica en su carácter.
Una introducción subsecuente de un patógeno virulento encuentra que el
hospedante ya esta “prevenido” y su resistencia aumenta (Duarte et al., 1996).Un
ejemplo de este sistema es F. roseum el cual induce una pudrición en los tallos de
clavel; el patógeno entra a través de heridas cuando los esquejes son tomados para
la propagación a partir de las plantas madres. Los conidios de los patógenos
germinan rápidamente e infectan el tejido herido. Cuando un aislamiento
patogénico de F. roseum (o algunos otros hongos) es ubicado en la herida, los
conidios del patógeno no germinan. El no patogénico en este caso, dispara una
respuesta donde el hospedante produce un potente agente antifungoso (Duarte et
al., 1996).
48
3. JUSTIFICACIÓN
Hace cincuenta años, la producción comercial de clavel se desarrollaba
principalmente en Estados Unidos, Holanda y los países mediterráneos, pero a
partir de los años 70 y 80 Colombia pasó a ser uno de los países con mayores
índices de producción y exportación mundial.
Los cultivos de flores han enfrentado diversos problemas como la presencia de
plagas y enfermedades causando daños irreparables en las plantas; así mismo,
disminuyen la calidad del producto generando grandes perdidas en la industria
florícola colombiana. Entre los principales agentes causantes de enfermedades en
cultivos de clavel se encuentran: Pythium sp, R. solani, F. roseum, F. oxysporum,
Sclerotinia sp, A. dianthi y C. echinulatum entre otros.
En el proceso de producción del clavel, la etapa de enraizamiento, es uno de los
puntos críticos en cuanto al diagnostico, manejo y control de estas enfermedades.
Esto se debe a que los esquejes portan el inoculo llevándolo hasta las áreas de
producción, donde las plantas jóvenes o en el punto de floración desarrollan los
síntomas característicos de cada enfermedad.
Teniendo en cuenta las grandes perdidas generadas en este proceso, la industria
agroquímica en su búsqueda de eliminar los problemas causados por hongos en
estos cultivos, han incrementado la frecuencia en la aplicación de fungicidas y
como medida alterna, utilizan inapropiadamente mezclas de productos agroquímicos
causando una alteración en los suelos. Debido al uso inapropiado en las dosis de
diversos fungicidas, se ha generado una resistencia de los hongos fitopatógenos
frente a diversos agroquímicos, que por cierto tiempo habían sido utilizados. Por
tanto, surge la necesidad de evaluar diversos productos químicos o biológicos que
tengan la capacidad de ejercer un efectivo control sobre los hongos patógenos sin
causar inestabilidad en el suelo y medio ambiente, además de evitar sobre costos
en control y manejo de las enfermedades en bancos de enraizamiento.
49
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la eficacia de diez fungicidas en la inhibición “in vitro” de un grupo de
hongos patógenos causantes de enfermedades en los bancos de enraizamiento en
clavel.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Aislar e identificar hongos patógenos a partir del material vegetal proveniente
de bancos de enraizamiento en clavel.
Evaluar mediante diferentes técnicas de laboratorio la actividad inhibitoria de
los productos seleccionados frente a un grupo de hongos patógenos en
clavel.
Establecer el nivel de inhibición que inducen los productos seleccionados
sobre los hongos patógenos asociados a bancos de enraizamiento en clavel.
Determinar la técnica in vitro mas apropiada para la evaluación de los
fungicidas.
Comprobar la acción fungistática y/o fungicida de los productos
seleccionados.
50
5. MATERIALES Y METODOS
5.1. DISEÑO EXPERIMENTAL
Este estudio se realizo en las instalaciones del Laboratorio Dr. Calderón Asistencia
Técnica Agrícola L.T.D.A. ubicado en la ciudad de Bogotá y en el Laboratorio de
sanidad vegetal de Floramerica ubicado en el municipio de Cajica.
Las muestras se obtuvieron de de diferentes fincas de la sabana de Bogotá, tales
como Carnation (Via Cota) y Flores de Serrezuela (Via Facatativa). Las pruebas se
realizaron mediante un diseño completamente aleatorizado, como se indica a
continuación:
Unidad experimental: cajas de petri.
Factores ó variables independientes: Fungicidas, tratamientos, técnicas y
replicas.
Numero de tratamientos: Tres tratamientos correspondientes a las dosis
evaluadas: T1 (Dosis Recomendada por la casa comercial), T2 (Dosis
recomendada +25 %), T3 (Dosis recomendada - 25 %). Estas dosis se
evaluaron para 10 productos en total, distribuidos de la siguiente manera: 9
químicos, uno biológico.
Numero de replicas: Tres por cada tratamiento.
Testigo Absoluto: Uno para cada cepa a tratar y uno para cada técnica.
Variable dependiente: Halos de inhibición y % de inhibición (Achicanoy, 1981).
Efecto fungicida: Capacidad de un fungicida para inhibir la viabilidad del patógeno.
51
Efecto fungistático: Capacidad de un fungicida para inhibir la germinación de las
esporas o el desarrollo inicial de un hongo, mientras permanezca en contacto
continuo (Achicanoy, 1981).
5.2. AISLAMIENTO DE LOS HONGOS
Para los aislamientos de los hongos se utilizó agar PDA para: R. solani y Fusarium
roseum y para el aislamiento de C. echinulatum y Alternaria sp se utilizó agar V8
especifico para la recuperación de estos microorganismos (Anexo 1).
Se recolectaron esquejes de clavel con síntomas característicos de enfermedades
producidas por los hongos patógenos trabajados en bancos de enraizamiento (R.
solani, F. roseum, A. dianthi, C. echinulatum) provenientes de diferentes cultivos de
flores muestreados en la Sabana de Bogotá. A partir del material vegetal
recolectado se realizó una desinfestacion de los tejidos con el fin de disminuir la
carga saprofita y así aislar el agente patógeno de interés. Para el aislamiento de los
hongos fitopatógenos se aplicaron dos métodos:
Cámara húmeda: se tomó parte del material vegetal recolectado y se introdujo en
hipoclorito de sodio al 25% v/v por 5 minutos. Posteriormente realizó un lavado con
agua destilada estéril, eliminando de esta forma el exceso de hipoclorito. A
continuación se secó el material con papel absorbente estéril. Se tomó un algodón
estéril humedecido con agua destilada estéril y se introdujo con las muestras
desinfestadas en un recipiente plástico, con el fin de proporcionar las condiciones de
humedad requeridas para el desarrollo de las estructuras reproductivas del hongo.
Posteriormente el recipiente se sello con papel vinipel para evitar la contaminación
de la muestra y mantener las condiciones de humedad necesarias que permitieran
la esporulación del microorganismo en estudio (French et al., 1982)
52
Aislamiento en agar PDA y V8: Se realizaron cortes de aproximadamente 4mm de
diámetro proveniente de plantas sintomáticas; se desinfestaron con hipoclorito de
sodio al 2,5% v/v por un tiempo de 5 minutos. Posteriormente se realizó un lavado
con agua destilada estéril y se secó el material con papel absorbente estéril. En
condiciones de esterilidad se introdujeron los bloques del material vegetal en agar
PDA y agar V8 (Quintero, et al., 1997).
Los diferentes aislamientos se llevaron a incubar a 22 +/- 2 º C por un periodo de 8
días.
5.3. CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE LOS
HONGOS
A partir de los aislamientos realizados, se determinó el género y especie
observando las características macroscópicas y microscópicas sobre el medio de
cultivo (PDA y V8). Los hongos se caracterizaron por la forma, tamaño y color en la
superficie de la colonia y en el anverso de la caja de petri; igualmente la textura,
aspecto y consistencia del micelio. Por otro lado se realizaron tinciones con azul
de lactofenol y se observaron las características microscópicas de cada hongo. La
caracterización taxonomica de las diversas cepas se realizó por medio de claves
especializadas en hongos como las de Booth (1977), Barnett et al (1998) y Nelson
(1983)
5.4. EVALUACIÓN DEL EFECTO FUNGICIDA Y FUNGISTATICO DE LOS
FUNGICIDAS
La evaluación del efecto preventivo de los fungicidas, tuvo como finalidad verificar
el efecto fungicida y/o fungistático que ejerce cada producto sobre los hongos
evaluados Tabla 3..
53
Tabla 3. Fungicidas evaluados para cada cepa con sus respectivos tratamientos.
TRATAMIENTOS(DOSIS)
HONGO
PATOGENOCONTROLADOR
PRINCIPIO ACTIVO
(T1) (T2) (T3)
Trichoderma sppTrichoderma
spp2 2.5 1.5
Terrazol Etridiazol 1.5 1.875 1.125
Difeconazole Difeconazole 0.6 0.75 0.45
VitavaxCarboxin +
Captan1 1.25 0.75
F. roseum
KocideHidroxido de
cobre1 1.25 0.75
Trichoderma sppTrichoderma
spp2 2.5 1.5
Dithane Mancozeb 1.2 1.5 0.9
Sportak Procloraz 0.6 0.75 0.45
Alternaria dianthi
Cladosporium echinulatum
Carbendazim Carbendazim 1 1.25 0.75
Trichoderma sppTrichoderma
spp2 2.5 1.5
Ridomil goldMetalaxyl + Mancozeb
1.2 1.5 0.9
Pro-groCarboxin +
Thiram1.2 1.5 0.9
Terrazole Etridiazol 1.2 1.5 0.9
Rhizoctonia solani
KocideCobre
maetalico1 1.25 0.75
Fuente: El autor
54
5.5. INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO MICELIAL
Preparación de concentraciones de los fungicidas en agar PDA.
Para la preparación de las concentraciones se calcularon las cantidades necesarias
de los fungicidas de acuerdo con los tratamientos seleccionados (Tabla 3). La
solución de cada fungicida se preparo en agar PDA, teniendo en cuenta el volumen
final de medio a preparar. Los tratamientos requeridos se expresaron en g/L para
los fungicidas sólidos y en ml/L para los fungicidas líquidos (Quintero, 1997).
Mezcla del medio de cultivo más el fungicida:
Con el fin de evitar que las cajas con el medio mas fungicida se contaminaran, la
mezcla se realizó en cámara de flujo laminar, adicionando lentamente la solución del
fungicida al agar PDA ó V8 fundidos a 45 – 50 ºC, para evitar inactivar cualquier
componente del principio activo del fungicida. Por ultimo se mezcló hasta lograr la
homogenización completa, del medio más el fungicida (Díaz, 1986).
5.5.1. Método de Bloques de Agar
En el centro de las cajas de petri que contenían las respectivas dosis del producto
químico incorporado al medio de cultivo, se colocó un bloque de PDA de 5 mm de
diámetro con el crecimiento micelial del microorganismo ensayado, previamente
incubado durante 7 días; las cajas de petri se mantuvieron a una temperatura de 22
+/- 2 ºC. (Achicanoy, 1991). Los testigos absolutos se inocularon sobre medios sin
solución fungicida.
La inhibición del crecimiento radial se determinó con base en el diámetro del
crecimiento radial (medido en mm) del hongo sin el efecto del fungicida, menos el
55
diámetro en mm del crecimiento del hongo influenciado por el fungicida, expresado
en porcentaje, tal como se especifica en la siguiente formula:
% IM = CML – CMI
CML
% IM: Porcentaje de inhibición crecimiento micelial
CML: Crecimiento micelial libre
CMI: Crecimiento micelial influenciado
(Patiño et al., 2001)
5.5.2. Prueba de acción fungicida o fungistático
Para evaluar el efecto fungicida o fungistático de las diferentes concentraciones del
producto químico, se tomaron bloques de agar provenientes de las cajas donde se
presento inhibición del microorganismo ensayado y se sembraron sobre medio de
cultivo sin fungicida; las cajas se incubaron bajo condiciones similares al ensayo
anterior (Patiño et al., 2001).
5.6. EVALUACION POR HALOS DE INHIBICION
5.6.1. Método de pozos
Preparación de la suspensión de esporas:
La suspensión de esporas se obtuvo a partir de un cultivo crecido de PDA
(aproximadamente 7 días) de los hongos patógenos a evaluar. La remoción de
esporas se realizó adicionando 5 mL de agua destilada estéril a cada una de las
x 100
56
cajas de petri; con ayuda de un rastrillo las esporas se removieron de la superficie
del agar, obteniendo de esta forma la solución madre (Sharvelle, 1983)
A partir de esta solución, se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3, hasta obtener
un recuento de 106 conidios/ mL, el recuento se realizo en cámara de Neubauer;
para la evaluación de uso la siguiente formula:
CamaraFactorDeLaLaCamaraDilucionDeNmlConidios /
Preparación de soluciones con los fungicidas.
Para la preparación de las soluciones se calcularon las cantidades necesarias de
los fungicidas de acuerdo con las dosis seleccionadas. La solución de cada
fungicida se preparo en agua destilada estéril, obteniendo un volumen final de 100
mL de solución de fungicida. Las dosis requeridas se expresaron en g/L para los
fungicidas sólidos y en ml/L para los fungicidas líquidos (Quintero, 1997).
Montaje de La Técnica
Se realizó una siembra masiva de los hongos patógenos evaluados a partir de la
solución de esporas (10-6esporas / mL). En cada caja, se colocaron pitillos de
plástico de 1.0 cm de alto previamente esterilizados (cuidando de no tocar la base
de la caja para evitar la difusión del fungicida por la base de la caja), a cada uno de
estos se les adicionó 50µL de la concentración del fungicida a evaluar con
micropipeta según el numero de concentraciones a evaluar; (DR + 25%, DR, DR –
25%).. En uno de los pozos se colocó agua destilada como control negativo. La
incubación se realizó por 7 días a una temperatura de 22 +/- 2°C.
En el día 7 se midió el diámetro en mm del halo de inhibición de cada hongo para
cada una de las concentraciones de fungicida evaluadas (Patiño et al., 2001).
57
5.6.2. Método de los discos de papel
Bajo condiciones de esterilidad en cámara de flujo laminar, se evaluaron tres
tratamientos de cada fungicida (DR + 25%, DR, DR – 25%). Los sensidiscos se
realizaron en papel filtro con un diámetro estándar de 0.5cm que luego se
esterilizaron.
Se realizó una siembra masiva de la suspensión de esporas utilizada con
anterioridad (106 esporas / mL) en agar PDA o V8. El mismo día de la siembra
masiva se colocaron los sensidiscos (4 por caja) de los cuales 3 se inocularon con
10 µL con las dosis del fungicida correspondiente, y en el cuarto se colocó agua
destilada como control negativo. La incubación se realizó por 7 días a una
temperatura de 22 +/- 2°C, al séptimo día de incubación se observaron y se
midieron los halos de inhibición. Estas pruebas se realizaron por triplicado para
cada fungicida y para cada hongo.
5.7. ANALISIS ESTADISTICO
Para comparar los resultados obtenidos con las diferentes especies de hongos
evaluados se realizo un ANOVA multifactorial, en el cual el halo de inhibición (HIMM
ó HINIB) y el porcentaje de inhibición micelial (PINB), fueron tomados como las
variables dependientes (Eje Y) y las técnicas, los fungicidas y los tratamientos como
las variables independientes o factores (Eje X). Se trabajo con un rango de
confianza del 95%.
Cuando el valor de F fue significativo para α<0.05 se realizaron pruebas de Tukey o
de diferencia mínima significativa (LSD). Para estas se empleo el programa
Statgraphics Plus 2.0 (Anexos 3, 4,5 y 6).
58
6. RESULTADOS
6.1. Aislamiento y caracterización macroscópica y microscópica de los
hongos.
A partir del material vegetal recolectado en las diferentes fincas de la sabana de
Bogotá, se aislaron en agar PDA 4 géneros de hongos patógenos para el cultivo de
clavel. Estos géneros corresponden a las características macroscópicas y
microscópicas reportadas por diversos autores (Booth, 1971; Barnett et al., 1998;
Nelson, 1983). Para realizar la caracterización microscópica y macroscópica de
Alternaria dianthi y Cladosporium echinulatum, fue necesario utilizar agar V8 por
ser un medio enriquecido que favorece el desarrollo apropiado de estos
microorganismos. En el caso de F. roseum y R. solani, se utilizó agar PDA
(Quintero, et al., 1997).
Alternaria dianthi: El aislamiento en agar V8 presento las siguientes características
macroscópicas: textura pulverulenta y vellosa de color café oscuro, borde regular.
(Figura 8 A). A nivel microscópico, el hongo produce conidióforos demateaceos
ramificados o individuales y septados. Los conidios son de color marrón oscuro, con
forma elongada, ovoides, con septos transversales y frecuentemente también
oblicuos o longitudinales, hifas de color café (Figura 8 B). (Patiño et al., 2001)
Figura 8. Características macroscópicas y microscópicas de A. dianthi. (A) Colonia vellosa café oscura. (B) Conidias demateaceas y elongadas. Fuente: El autor.
A B
59
Cladosporium echinulatum: Macroscópicamente las colonias son de color verde
oliva a verde oscuro, rugosas, pulverulentas, cubiertas por un micelio bajo y velloso
(Figura 9 A). Microscópicamente las hifas son demateaceas, septadas, presenta
conidióforos ramificados de color café (Figura 9 B). (Patiño et al., 2001)
Figura 9. Características macroscópicas y microscópicas de C. echinulatum. (A) Colonia rugosa verde oliva. (B) Conidias demateaceas y equinuladas. Fuente: El autor.
Fusarium roseum: Macroscópicamente las colonias son vellosas, algodonosas,
con una pigmentación rosa en el centro que difunde a todo el cultivo. Las colonias
pigmentadas tienen el centro rosa intenso, con zona marginal rosa pálido y bordes
blancos. Reverso de color rosa-naranja intenso (Figura 10 A). Microscópicamente
presentó conidióforos simples, cortos, tabicados, curvados y alargados (Figura 10
B) microconidias abundantes, monofialides alargadas; y en menor proporción
macroconidias (Trujillo et, al. 2005).
A B
60
Figura 10. (A) Características macroscópicas y microscópicas de F. roseum (A) Colonia algodonosa de color rosado en los extremos y en los bordes blanco. (B) Fuente: El autor.
Rhizoctonia solani: Formó colonias de color pardo con producción de escaso
micelio aéreo y esclerocios marrones (Fig 11 A). Microscópicamente posee hifas
hialinas, septadas con ramificaciones en ángulo agudo; las cuales se ramifican
ocasionalmente en ángulos de 90 grados (Fig 11 B). (CARDONA, et al., 2002.)
Figura 11. Características macroscópicas y microscópicas de R. solani (A) Colonia rugosa blanca a parda con el tiempo. (B) Hifas septadas hialinas. Fuente: El autor.
Las caracterizaciones microscópicas y macroscópicas realizadas en el laboratorio
fueron congruentes con la bibliografía (Barnett et al., 1998) (Gilman, 1963).
BA
BA
61
6.2. EVALUACION IN VITRO DE FUNGICIDAS
6.2.1. EVALUACION POR HALOS DE INHIBICIÓN
La finalidad de esta evaluación, fue determinar los tratamientos óptimos de los
fungicidas evaluados para el control de los hongos fitopatógenos de mayor
importancia en bancos de enraizamiento en clavel; estimados en la inhibición de
los microorganismos patógenos.
Se utilizaron las técnicas de pozos y sensidiscos para A. dianthi, C. echinulatum, F.
roseum y R. solani. Se partió de una suspensión de 10 6 conidios /mL a excepción
de R. solani, ya que este carece de cuerpos fructíferos.
Alternaria dianthi
Para este hongo se evaluaron 4 fungicidas: Mancozeb, Procloraz, Carbendazim y
Trichoderma spp. (Fitotripen).
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para A. dianthi,
se determinó que no hubo diferencia significativa entre las técnicas empleadas (F=
0.01; n=1 ; P= 0.9259) ni para las replicas (F= 0.07; n= 2; P= 0.9291); mientras que
para los fungicidas evaluados (F= 49.02; n= 3 P= 0.0000) y los tratamientos (F=
20.06; n= 2; P= 0.0000) se presentó diferencia estadísticamente significativa (Anexo
4).
A partir de la prueba Tukey, se encontraron tres comportamientos diferentes de los
fungicidas, que presentaron los siguientes resultados: en el primer grupo el fungicida
Carbendazim, no fue efectivo para A. dianthi, en el segundo grupo, Mancozeb y
Procloraz los cuales inhibieron en menor cantidad el crecimiento micelial de A.
dianthi. Por otro lado, Trichoderma spp. el cual se encuentra en el tercer grupo
presentando el mayor halo de inhibición (Figura 13).
62
En la Figura 12 se muestran los halos de inhibición generados por el fungicida para
las técnicas de pozos y sensidiscos; Igualmente se observa el control, el cual
contiene agua destilada y donde no hay presencia de halo de inhibición.
Figura 12. Halos de inhibición A. dianthi. A. Técnica de pozos para Procloraz.. B. Técnicade Sensidiscos para Trichoderma spp
Igualmente, se encontró tres comportamientos diferentes de tratamientos; en el
primer grupo T3, en el segundo grupo T1 y en el tercer grupo T2; el tratamiento
que mostró una efectividad mayor para el control de A. dianthi fue el T2
correspondiente a valores de 2.5 g/L de Trichoderma spp. (Figura 13).
A B
FITOTRIPEN
63
TECNICA DE SENSIDISCOS A. dianthi
0,00
4,00
8,00
12,00
16,00
20,00
24,00
28,00
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp
FUNGICIDAS
HA
LO
S D
E IN
HIB
ICIO
N M
ICE
LIA
L
(mm
)
T1 T2 T3
Figura 13. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos en la evaluación de fungicidas contra A. dianthi.
Cladosporium echinulatum
Para este hongo se evaluaron 4 fungicidas: Mancozeb, Procloraz, Carbendazim y
Trichoderma spp.
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para C.
echinulatum, se determinó que hubo diferencia significativa entre las técnicas
empleadas (F= 8.20; n=1 ; P= 0.0057), para los fungicidas evaluados (F= 99.76 ; n=
3 P= 0.0000) y los tratamientos (F= 31.48; n= 2; P= 0.0000) mientras que se no
presentó diferencia estadísticamente significativa para las replicas (F= 0.30; n= 2;
P= 0.7441) (Anexo 5).
A partir de la prueba tukey, se encontró que todos los fungicidas se comportaron de
diferente manera, pues no se encontraron comportamientos homogéneos.
Carbendazim, el cual no fue efectivo para C. echinulatum; Mancozeb, Trichoderma
spp. y Procloraz, este último fue el que presento mejor inhibición de C. echinulatum,
(Figura 14 y 15).
64
Figura 14. Halos de inhibición C. echinulatum, Técnica de pozos para Procloraz.
Igualmente, se encontró que todos los tratamientos se comportaron de diferente
manera. Sin embargo, el tratamiento que mostró una efectividad mayor para el
control de C. echinulatum fue el T2 correspondiente a valores 0.75g/L Procloraz.
(Fig. 15)
TECNICA DE SENSIDISCOS C. echinulatum
0
5
10
15
20
25
30
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichodermaspp
FUNGICIDA
HA
LO
S D
E IN
HIB
ICIO
N M
ICE
LIA
L
(mm
)
T1 T2 T3
Figura 15. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos en la evaluación de fungicidas contra C. echinulatum.
65
Fusarium roseum
Para este hongo se evaluaron 5 fungicidas: Difeconazol, Etridiazole, Hidroxido de
cobre, Captan + Carboxin y un producto biológico (Trichoderma spp.).
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para F.
roseum, se determinó que no hubo diferencia significativa entre las técnicas
empleadas (F= 1.57; n= 1; P= 0.2143) ni para las replicas (F= 0.08; n= 2; P=
0.9248); mientras que para los fungicidas evaluados (F= 86.49; n= 4; P= 0.00) y los
tratamientos (F= 5.32; n= 2; P= 0.0068) se presento diferencia estadísticamente
significativa (Anexo 3).
A partir de la prueba tukey, se encontró dos comportamientos diferentes de
fungicidas; en el primer grupo hidroxido de cobre, difeconazol y etridiazole, los
cuales no fueron efectivos para F. roseum. En el segundo grupo, Trichoderma spp.
y Carboxin + Captan los cuales inhibieron el crecimiento micelial de F. roseum. Sin
embargo como se muestra en las figuras 16, 17 y 18 carboxim + captan fue el que
presentó un mayor halo de inhibición.
Figura 16. Halos de inhibición F. roseum. A. Técnica de pozos para Carboxin + Captan B. Técnica de Pozos para Trichoderma spp.
A B
66
Figura 17. Halos de inhibición F. roseum. Técnica de sensidiscos para Carboxin + Captan.
Igualmente, se encontró dos comportamientos diferentes de tratamientos; en el
primer grupo T3 y T1. En el segundo grupo T1 y T2, el tratamiento que mostró una
efectividad mayor para el control de F. roseum fue el T2 correspondiente a valores
de 1.25 g/L de carboxin + captan y 2.5 g/L de Trichoderma spp. (Figura 18).
TECNICA HALOS DE INHIBICIÓN F. roseum
0
2
46
8
10
12
1416
18
20
Difeconazol Etridiazol Hidroxido decobre
Carboxin +Captan
Trichodermaspp
FUNGICIDA
HA
LO
DE
INH
IBIC
ION
MIC
EL
IAL
(m
m)
T1 T2 T3
.
67
Figura 18. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra F. roseum.
Rhizoctonia solani
Para este hongo se evaluaron 5 fungicidas: Etridiazole, Hidroxido de cobre,
Carboxin + Thiram, Metalaxil + Mancozeb y un producto biológico (Trichoderma
spp.).
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para R. solani
se determinó que hubo diferencia estadísticamente significativa entre las técnicas
empleadas (F= 17.65; n= 1; P= 0.0001), los fungicidas evaluados (F= 217.40; n= 4;
P= 0.0000) y los tratamientos (F= 23.78; n= 2; P= 0.0000) mientras que para las
replicas no hubo diferencia significativa (F= 0.07; n= 2; P= 0.9294) (Anexo 6).
A partir de la prueba tukey, se encontró tres comportamientos diferentes de
fungicidas; en el primer grupo Hidroxido de cobre y Etridiazol, los cuales no fueron
efectivos para R. solani; en el segundo grupo, Carboxin + Thiram, el cual inhibió en
menor proporción al patógeno en comparación con los productos del tercer grupo
Metalaxil + Mancozeb y Trichoderma spp. que presentaron el mayor halo de
inhibición (Figuras 19, 20, 21 y 22).
Figura 19. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Sensidiscos. A. Metalaxil + Mancozeb. B. Carboxin + Thiram
A B
68
Figura 20. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Sensidiscos para Trichoderma spp
Figura 21. Halos de inhibición R. solani. Técnica de Pozos para Metalaxil + Mancozeb.
Se encontró que todos los tratamientos se comportaron de diferente manera, pues
no se encontraron comportamientos homogéneos. Sin embargo, el tratamiento que
mostró una efectividad mayor para el control de R. solani fue el T2 correspondiente
a valores de 1.5 g/L de Metalaxil + Mancozeb y 2.5 g/L de Trichoderma spp. (Figura
22).
69
TECNICA DE SENSIDISCOS R. solani
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
Carboxin +thiram
Metalaxyl +Mancozeb
Hidroxido deCobre
Etridiazol Trichodermaspp
FUNGICIDA
HA
LO
S D
E IN
HIB
ICIO
N
MIC
EL
IAL
(mm
)
T1 T2 T3
17
Figura 22. Halos de inhibición micelial obtenidos por la técnica de sensidiscos para la evaluación de fungicidas contra R. solani.
6.2.2. INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO MICELIAL
Al evaluar el porcentaje de inhibición micelial, mediante la técnica de incorporación
de los fungicidas al medio de cultivo y la siembra de los diferentes microorganismos
en bloques de agar, se obtuvieron los siguientes resultados:
Alternaria dianthi
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para A. dianthi,
se determinó que no hubo diferencias significativas entre las réplicas empleadas (F=
0,07; n= 2; P= 0.9331); mientras que para los fungicidas evaluados (F= 831.36; n=
3; P= 0.0000) y los tratamientos se presentó diferencia estadísticamente significativa
(F= 9.15; n= 2; P= 0.0009) (Anexo 4).
70
A partir de la prueba Tukey, se encontraron tres comportamientos diferentes de
fungicidas; en el primer grupo: Carbendazim, presentó el menor porcentaje de
inhibición del crecimiento micelial en el ensayo. En el segundo grupo: Procloraz, en
el tercer grupo: Trichoderma spp. y Mancozeb presentaron altos porcentajes de
inhibición micelial, siendo los que permitieron la mayor inhibición, pero al evaluar su
acción como fungicida, se encontro que el único producto que presento tal
comportamiento para A. dianthi fue Trichoderma spp., por el contrario los demás
productos evaluados presentaron solamente una acción fungistática (Fig. 23 y 24).
TECNICA BLOQUES DE AGAR A. dianthi
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichoderma spp
FUNGICIDAS
% D
E IN
HIB
ICIO
N M
ICE
LIA
L
T1 T2 T3
Figura 23. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra A. dianthi.
Igualmente al comparar los diferentes tratamientos se encontraron dos
comportamientos diferentes de tratamientos; en el primer grupo T3 y T1. En el
segundo grupo T2, el tratamiento que mostró un mayor porcentaje de inhibición
micelial para el control de A. dianthi fue el T2 correspondiente a valores de 2.5 g/L
de Trichoderma spp. y mancozeb 1.5 g/L (Figura 23)
71
Figura 24. Técnica de Bloques de agar para A. dianthi Frente a Trichoderma spp
Cladosporium echinulatum
Para esta técnica no fue necesario realizar análisis de varianza ANOVA, teniendo
en cuenta que todos los fungicidas con sus respectivos tratamientos fueron
efectivos para inhibir el crecimiento micelial de C. echinulatum y presentaron el
mismo porcentaje de inhibición. Sin embargo, únicamente Trichoderma spp.
presentó un efecto inhibitorio eficaz sobre el patógeno (Figura 25 y 26).
Figura 25. Técnica de Bloques de agar para C. echinulatum frente a Trichoderma spp
72
TECNICA DE BLOQUES DE AGAR Cladosporium echinulatum
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Mancozeb Procloraz Carbendazim Trichodermaspp
FUNGICIDAS
% D
E IN
HIB
ICIO
N
T1 T2 T3
Figura 26. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra C. echinulatum
Fusarium roseum
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para F.
roseum, se determinó que no hubo diferencia significativa entre las réplicas
empleadas (F= 0,00; n= 2; P= 0.9998); mientras que para los fungicidas evaluados
(F= 17.60; n= 4; P= 0.0000) y los tratamientos se presentó diferencia
estadísticamente significativa (F= 7.58; n= 2; P= 0.0018) (Anexo 3).
A partir de la prueba Tukey, se encontró dos comportamientos diferentes de
fungicidas; en el primer grupo: Hidroxido de cobre, el cual presentó el menor
porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del ensayo. En el segundo grupo:
Difeconazol, Etridiazole, Trichoderma spp. y Carboxin + Captan presentaron altos
porcentajes de inhibición micelial, siendo los mejores Etridiazol y Trichoderma spp.,
presentando un comportamiento como fungistático. Sin embargo, el único
producto que presento acción fungicida para F. roseum fue Trichoderma spp. (Fig.
27 y 28).
73
Figura 27. Técnica de Bloques de agar para F. roseum frente a Trichoderma spp
Igualmente se encontró dos comportamientos diferentes de tratamientos; en el
primer grupo T3 y T1. En el segundo grupo T1 y T2, el tratamiento que mostró un
mayor porcentaje de inhibición micelial para el control de F. roseum fue el T2
correspondiente a valores de 2.5 g/L de Trichoderma spp. y Etridiazol 1.875 g/L (Fig.
28).
TECNICA DE BLOQUES DE AGAR F. roseum
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Difeconazol Etridiazol Hidroxidode cobre
Carboxin +Captan
Trichodermaspp
FUNGICIDA
% D
E IN
HIB
ICIO
N M
ICE
LIA
L
T1 T2 T3
74
Figura 28. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra F. roseum.
Rhizoctonia solani
De acuerdo al análisis ANOVA multifactorial utilizado en este estudio para F.
roseum, se determinó que no hubo diferencia significativa entre las réplicas
empleadas (F= 0,30; n= 2; P= 0.7408); mientras que para los fungicidas evaluados
(F= 56.45; n= 4; P= 0.0000) y los tratamientos se presentó diferencia
estadísticamente significativa (F= 3.72; n= 2; P= 0.0340) (Anexo 6).
A partir de la prueba Tukey, se encontró dos comportamientos diferentes de
fungicidas; en el primer grupo: Hidroxido de cobre, el cual presentó el menor
porcentaje de inhibición del crecimiento micelial del ensayo. En el segundo grupo:
Etridiazol, Trichoderma spp., Metalaxil + Mancozeb y Carboxin + Thiram que
presentaron altos porcentajes de inhibición micelial, Sin embargo, el único producto
con acción fungicida para R. solani fue Trichoderma spp., a diferencia de los demás
productos evaluados que presentaron acción fungistática (Fig 29 y 30)
Figura 29. Técnica de Bloques de agar para R. solani frente a Trichoderma spp.
Para la evaluación estadística de los tratamientos se realizó la prueba de rango
múltiple LSD, debido a que los datos eran homogéneos. Igualmente se encontró
dos comportamientos diferentes de tratamientos; en el primer grupo T3 y T1. En el
segundo T2, el tratamiento que mostró un mayor porcentaje de inhibición micelial
75
para el control de R. solani fue el T2 correspondiente a valores de 1.5 g/L
Etridiazol, 2.5 g/L Trichoderma spp., 1.5 g/L Metalaxil + Mancozeb y 1.5 g/L
Carboxin + Thiram (Figura 30)
TECNICA DE BLOQUES DE AGAR R. solani
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Carboxin +thiram
Metalaxyl +Mancozeb
Cobremetalico
Etridiazol Trichodermaspp
FUNGICIDA
% D
E IN
HIB
ICIO
N M
ICE
LIA
L
T1 T2 T3
Figura 29. Porcentajes de inhibición micelial obtenidos por la técnica de bloques de agar en la evaluación de fungicidas contra R. solani.
76
7. DISCUSIÓN
A partir del material vegetal muestreado, se observaron síntomas de las
enfermedades que atacan el cultivo del clavel descritas anteriormente, los cuales
concuerdan con los reportes bibliográficos consultados; sin embargo, fue necesario
realizar posteriores muestreos debido a la dificultad del aislamiento primario de los
patógenos. Esto se pudo deber a recientes aplicaciones de fungicidas en los
bancos de enraizamiento de clavel muestreados.
La evaluación de la eficacia de los productos en campo tiene muchas interferencias
y resulta más compleja; por lo que una primera evaluación in vitro siempre dirige
hacia los productos más eficaces. Sin embargo, los ensayos in vitro sólo dan una
estimación indirecta del valor práctico del producto por lo que deberá contrastarse
este resultado con los obtenidos posteriormente en campo. Un producto que es
eficaz in vitro no necesariamente lo será en campo pues en su actuación influyen
factores como la degradabilidad, persistencia, etc. Sin embargo, si un producto no
es útil in vitro difícilmente lo será en campo (González, 2005).
Con el fungicida carbendazim en las técnicas de sensidiscos y pozos no se encontró
el efecto inhibitorio esperado ya que según reportes hechos por OMAR et al., 2006
(en el cual se utilizó la metodología de bloques de agar), mostraron la efectividad de
este fungicida en diferentes hongos como consecuencia de su acción en la
inhibición de síntesis de ergosterol y en la germinación de esporas del hongo. En la
técnica de bloques de agar, carbendazim presentó menor inhibición en el
crecimiento micelial que los demás productos evaluados, demostrando la ineficacia
del producto para el control de A. dianthi.
Mancozeb, no presento una inhibición significativa en ninguno de los tratamientos
para las técnicas de sensidiscos y pozos. En la técnica de bloques de agar se
presento una mayor inhibición debido a que este es un fungicida multiacción, el cual
77
actúa inhibiendo enzimas importantes en el ciclo de Krebs impidiendo la producción
de ATP, y la biosíntesis de acido ribonucleico (Tabares, 2002).
Para el fungicida procloraz, se presento una eficaz inhibición en las tres técnicas
empleadas; esto se debe a que es un fungicida sistémico que actúa en la inhibición
de síntesis de ergosterol (compuesto celular de gran importancia en la estructura de
la membrana de diversos hongos). Al realizar las pruebas confirmatorias en la
técnica de bloques, se comprobó la viabilidad del patógeno contrario a los reportes
de Everett et al.,(1996) donde el fungicida afecto irreversiblemente el patógeno.
En el caso de C. echinulatum, los fungicidas evaluados mediante las técnicas de
pozos y sensidiscos presentaron inhibición al igual que para A. dianthi, Sin embargo
en la técnica de bloques de agar todos los fungicidas se comportaron de manera
homogénea, presentando porcentajes de inhibición micelial eficaces para el control
de C. echinulatum.
El producto compuesto por la mezcla de Carboxim + captan presento una eficaz
inhibición en las tres técnicas para el control de F. roseum, ya que el primer
compuesto es un fungicida sistémico que inhibe la enzima succínico
deshidrogenasa (importante de la respiración mitocondrial), además actúa
alterando la síntesis de compuestos esenciales como aminoácidos y enzimas
(Agrios, 2004), Por otro lado, inhibe la respiración y germinación de las esporas
(Martínez et al., 2008).
Los productos Etridiazol, difeconazol e hidróxido de cobre no presentaron inhibición
en las técnicas de pozos y sensidiscos para el control de F. roseum, a diferencia
de la técnica de bloques de agar donde los porcentajes de inhibición fueron
eficaces a excepción del hidróxido de cobre. Esto se debió a que F. roseum es un
patógeno ubicado en la corteza de la planta, por lo tanto el hidroxido de cobre, al ser
un fungicida de contacto pudo disminuir su acción frente a este patógeno.
Para la técnica de bloques de agar Etridiazol y difeconazol, inhibieron eficazmente el
crecimiento de F. roseum ya que al ser fungicidas sistémicos redujeron la
germinación de esporas, inhibiendo así su crecimiento. Estos productos in vivo
actúan inhibiendo el crecimiento subcuticular de la hifa patogénica que esta
78
infectando el tejido vegetal, evitando el desarrollo de los síntomas de la enfermedad
(ASCOLFI, 1994).
La mezcla de metalaxyl + mancozeb actúa inhibiendo la síntesis de RNA del
patógeno, mostrando su eficacia en las tres técnicas y todos los tratamientos para el
control de R. solani. (Meyer et al., 2006).
Para la técnica de bloques se obtuvo una inhibición eficaz por parte de etridiazol, al
igual que en los estudios realizados por Heungens et al., (2005), en donde el
mecanismo de acción fue mencionado anteriormente.
La mezcla de Carboxin + thiram mostró en las tres técnicas inhibición de R. solani,
este fungicida de acuerdo con Hutson, (1998), pudo inhibir la succinato
deshidrogenasa, enzima de gran importancia en la respiración del hongo.
En el caso del hidróxido de cobre para la técnica de pozos y sensidiscos no se
presentó inhibición del crecimiento de R. solani, a diferencia de la técnica de
bloques donde se obtuvo inhibición.
De acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba ANOVA, se determinó que
Trichoderma spp. fue el fungicida más efectivo para las tres técnicas evaluadas en
el control de los hongos fitopatógenos estudiados. Por otro lado, de los 10 productos
evaluados, Trichoderma spp. en sus tres tratamientos fue el único que presento
mayor eficacia contra todos los hongos. Este producto esta compuesto por tres de
las especies de Trichoderma, que han mostrado ser efectivas en el control de
diversos patógenos por varios mecanismos como: Producción de enzimas
extracelulares (celulasas, quitinasas, glucanasas, lipasas y proteasas) que
degradan la pared celular (Howell, 2005); Aunque el principal mecanismo de acción
es el micoparasitismo que también esta relacionado con la síntesis de quitinasas
extracelulares donde se produce un enrollamiento, penetración y lisis celular total
de las hifas del patógeno por la acción de las diferentes enzimas (Márquez, 2001).
Al no encontrarse diferencias estadísticamente significativas entre las técnicas de
pozos y sensidiscos, se determino que la más apropiada para la evaluación in vitro
de fungicidas fue la técnica de sensidiscos, debido a la facilidad en el montaje.
79
Con respecto a la técnica de bloques de agar, no se obtuvieron los resultados
esperados, debido a que bajo esta técnica no se pudo evaluar el efecto fungicida y
fungistático ya que se presentaron varias desventajas.
Las principales desventajas que presenta la técnica de bloques es no evaluar una
concentración determinada de conidios, pues en los bloques de agar dicha
concentración no es conocida, por lo tanto, existiría diferencia en cada una de las
replicas.
Por otro lado, en esta técnica se pueden presentar resultados erróneos debido a
que no se asegura el contacto directo del patógeno con el fungicida.
80
8. CONCLUSIONES
De acuerdo con los síntomas encontrados en las muestras tomadas en los
bancos de enraizamiento se encontraron tanto en los tejidos foliares como en los
basales las manifestaciones típicas de las enfermedades registradas, sin
embargo se observa alguna dificultad para diferenciar las enfermedades
ocasionadas por los hongos F. roseum y R. solani, ya que durante los primeros
estados de desarrollo de la enfermedad los síntomas son semejantes.
Para el aislamiento de los microorganismos A. dianthi y C. echinulatum, se
presentaron algunas dificultades, dada la lentitud para su crecimiento y la
escasa esporulación en el medio de cultivo PDA, situación que fue diferente
cuando se empleo el medio V-8.
Se encontró que el producto conocido comercialmente como Fitotripen, que esta
formulado con base a tres especies del hongo Trichoderma fue el mas efectivo
para el control de los hongos en todos sus tratamientos, pues fue el único
producto que mostro actividad como controlador, lo cual representa un gran
aporte para los productores de flores en el manejo de las principales
enfermedades que se presentan en bancos de enraizamiento.
A pesar de que el hongo Trichoderma es un habitante común en suelo, que se
registra como un buen biocontrolador de hongos como R. solani y Pythium sp.,
en trabajos recientes se observa que su acción también puede estar orientada al
control de microorganismos de acción patogénica en los tejidos aéreos de las
plantas, resultados similares a los encontrados en esta investigación, su efecto
permitió inhibir el desarrollo de los hongos que se presentan en los tejidos
foliares como A. dianthi y C. echinulatum.
De acuerdo con las evaluaciones realizadas se considera que el biocontrolador
puede estar actuando mediante mecanismos como hiperparasitismo e inhibición
por sustancias secretadas, que interfieren con el desarrollo de los hongos
81
evaluados, sin descartar que al entrar en contacto con los tejidos la planta pueda
inducir algún mecanismo de resistencia.
Bajo la técnica de bloques de agar no es conveniente evaluar el producto
compuesto por Trichoderma spp. teniendo en cuenta su rápido crecimiento en
comparación con los patógenos evaluados, limitando los resultados esperados.
También se observo que con la dosis recomendadas por las casas formuladoras
para los productos químicos ensayados, se inhibió el crecimiento de todos los
microorganismos que con frecuencia se presentan en los esquejes durante el
proceso de enraizamiento, sin embargo dada la presencia de fungicidas
sistémicos, es probable que sea necesaria su confirmación mediante nuevas
pruebas tanto de laboratorio como de campo.
Se determino que la técnica de sensidiscos fue la mas apropiada para evaluar la
eficacia de fungicidas in vitro, pues en esta técnica se evalúa una concentración
definida del patógeno (106 conidios/mL).
Se determino que los productos Procloraz, Carboxin + Captan y Metalaxyl +
mancozeb fueron eficaces para el control de los hongos patógenos evaluados
en este trabajo.
82
9. RECOMENDACIONES
Se recomienda adelantar estudios que permitan evaluar el comportamiento de
de los productos utilizados en esta investigación, en los bancos de
enraizamiento de los cultivos de flores de exportación o bajo condiciones de
campo con sus respectivas pruebas de fitotoxicidad.
En necesario estudiar cuales mecanismos le permiten a Trichoderma spp.
controlar los hongos que se presentan en los tejidos foliares, A. solani y C.
echinulatum.
Se deben investigar los métodos y frecuencia de aplicación de Trichoderma
spp., para el manejo de las enfermedades foliares.
Investigar si formulaciones con diferentes especies, cepas y aislamientos del
hongo Trichoderma, tienen la capacidad de inhibir el desarrollo de
microorganismos patogenos de plantas que se localicen en el sistema foliar de
las plantas.
83
10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Agrónomo. Universidad Nacional De Colombia. Facultad de Agronomía. Bogotá
D.C.
SHARVELLE, E. 1983. The nature and uses of modern fungicides. Editorial Burgess
publishing company. Mineapolis. 308 págs.
TABARES, F. 2002. Evaluación in Vitro de diferentes compuestos químicos
agrícolas para el control de los hongos Colletotrichum glocosporoides y C. acutatum,
causantes de la antracnosis de los cítricos. Trabajo de grado para optar por el titulo
de Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias
Básicas.
89
TRUJILLO, E., MORENO, B., ACEVEDO, R., VERA, R. 2005. Variabilidad
genética de Fusarium spp., causante de la marchitez en clavel, determinada
mediante electroforesis. Fitopatología venezolana. Vol 18, No 1. 9-14 Págs.
VÁSQUEZ, M. 2003. Cadena de suministros globales en el mercado de las
flores. Trabajo de grado para optar por el titulo de ingeniero Industrial.
Universidad de los Andes. Facultad de ingeniería industrial. Bogotá D.C.
90
PAGINAS WEB
ASOCOLFLORES. 2002.
www.upme.gov.co/.../AGRICOLA%20Y%20PECUARIO/Guia%20ambiental%20para
%20el%20subsector%20Floricultor.pdf. Consulta 5 febrero 2008.
AMERICAN PHYTOPATHOLOGICAL SOCIETY
www.apsnet.org Consulta 14 de febrero 2008
www.apsnet.org/.../Rhizoctonia/discycle.htm Consulta 2 De Julio 2008
www.apsnet.org/.../PotatoTomato/discycle.htm Consulta 2 De Julio 2008
AGROGEA
www.zoetecnocampo.com/.../fusarium/fusarium.htm Consulta 2 De Julio 2008
AGROBIOLOGICOS SAFER
www.agrobiologicossafer.com/Trichoderma spp.htm Consulta 2 De Julio 2008
BAYER CROPSCIENCE
www.bayercropscience.com.ec/productdesc.aspx?prodid=43 Consulta 2 De Julio
2008
CHEMIPLANT
www.chemiplant.com.ar/es/nuestros_productos/fungicidas/kocide_101.htm Consulta
2 De Julio 2008
FLORINTEGRAL S.A.
www.florintegral.com.co/producto.php?id=productofi17 Consulta 2 De Julio 2008
SYNGENTA S.A.
www.syngentaagro.es/es/productos/producto.aspx?id=60&cat=15 Consulta 2 De
Julio 2008.
91
BAYER CROPSCIENCE
http://www.bayercropscience.com.pe/web/index.aspx?articulo=264 Consulta 2 De
Julio 2008
92
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO
AGAR PDA
Infusión de papa 4 g/L
D(+) Glucosa 20g/L
Agar agar 15g/L
Disolver 39 g por litro de agua y esterilizar en autoclave (15 min a 121°C). Para
ajustar el pH a aproximadamente 3.5, incorporar una solución estéril de acido
tartarico al 10% a razón de 14ml/L (Merck, 1999).
AGAR V8
Componentes para 1litro
Jugo V8 20ml
Carbonato de Calcio 0.3g
Agar agar 2g
Agua destilada 20ml
Esterilizar en autoclave por 15 minutos, 15 Lb de presión y 121ºC y servir el medio
en cajas de petri (Rodríguez, 1999).
93
ANEXO 2
AZUL DE LACTOFENOL
Fenol 20g
Glicerina 40ml
Ácido láctico 20g
Agua destilada 20ml
Azul de algodón 0.05g
Se mezcla el ácido láctico con la glicerina en agua destilada, se agregan los
cristales de fenol y se agita, se calienta al baño maría y se mezcla consistentemente
hasta que desaparezcan los cristales y por ultimo se agrega el azul de algodón
(Peña, et al. 2003).
94
ANEXO 3
ANOVAMULTIFACTORIAL PARA Fusarium roseum
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN
Source Sum of Squares Df Mean Square F P<0.05
MAIN EFFECTS
A: DOSIS 114,689 2 57,3444 5,32 0,0068
B: FUNGICIDA 3731,07 4 932,767 86,49 0,0000
C: REPLICA 1,68889 2 0,844444 0,08 0,9248
D: TECNICA 16,9 1 16,9 1,57 0,2143
RESIDUAL 862,778 80 10,7847
TOTAL (CORRECTED) 4727,12 89
95
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 % Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 18 0,0 X
DIFECONAZOL 18 0,0 X
TERRAZOLE 18 0,0 X
FITOTRIPEN 18 12,8889 X
VITAVAX 18 13,3889 X
Contrast Difference +/- Limits
DIFECONAZOL - FITOTRIPEN *-12,8889 3,05513
DIFECONAZOL - KOCIDE 0,0 3,05513
DIFECONAZOL - TERRAZOLE 0,0 3,05513
DIFECONAZOL - VITAVAX *-13,3889 3,05513
FITOTRIPEN - KOCIDE *12,8889 3,05513
FITOTRIPEN - TERRAZOLE *12,8889 3,05513
FITOTRIPEN - VITAVAX -0,5 3,05513
KOCIDE - TERRAZOLE 0,0 3,05513
KOCIDE - VITAVAX *-13,3889 3,05513
TERRAZOLE - VITAVAX *-13,3889 3,05513
* denotes a statistically significant difference.
96
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 30 4,13333 X
T1 30 4,83333 XX
T2 30 6,8 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 -1,96667 2,02502
T1 - T3 0,7 2,02502
T2 - T3 *2,66667 2,02502
* denotes a statistically significant difference.
ANALISIS DE VARIANZA PARA PORCENTAJES DE INIBICION
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 2815,1 2 1407,55 7,58 0,0018
B:FUNGICIDA 13074,8 4 3268,71 17,60 0,0000
C:REPLICA 0,0615148 2 0,0307574 0,00 0,9998
RESIDUAL 6685,18 36 185,7
TOTAL (CORRECTED) 22575,2 44
97
All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 15 70,9804 X
T1 15 80,8627 XX
T2 15 90,3529 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 -9,4902 12,1648
T1 - T3 9,88235 12,1648
T2 - T3 *19,3725 12,1648
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 9 49,1503 X
VITAVAX 9 76,6013 X
DIFECONAZOL 9 89,6732 X
TERRAZOLE 9 94,1176 X
98
FITOTRIPEN 9 94,1176 X
Contrast Difference +/- Limits
DIFECONAZOL - FITOTRIPEN -4,44444 18,444
DIFECONAZOL - KOCIDE *40,5229 18,444
DIFECONAZOL - TERRAZOLE -4,44444 18,444
DIFECONAZOL - VITAVAX 13,0719 18,444
FITOTRIPEN - KOCIDE *44,9673 18,444
FITOTRIPEN - TERRAZOLE 0,0 18,444
FITOTRIPEN - VITAVAX 17,5163 18,444
KOCIDE - TERRAZOLE *-44,9673 18,444
KOCIDE - VITAVAX *-27,451 18,444
TERRAZOLE - VITAVAX 17,5163 18,444
* denotes a statistically significant difference.
100
ANEXO 4
ANOVA MULTIFACTORIAL PARA Alternaria dianthi
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 575,444 2 287,722 20,06 0,0000
B:FUNGICIDA 2109,04 3 703,014 49,02 0,0000
C:REPLICA 2,11111 2 1,05556 0,07 0,9291
D:TECNICA 0,125 1 0,125 0,01 0,9259
RESIDUAL 903,597 63 14,3428
TOTAL (CORRECTED) 3590,32 71
All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 24 3,54167 X
T1 24 6,70833 X
T2 24 10,4583 X
101
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-3,75 2,62438
T1 - T3 *3,16667 2,62438
T2 - T3 *6,91667 2,62438
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
CARBENDAZIM 18 0,0 X
DITHANE FMB 18 5,83333 X
SPORTAK 18 6,61111 X
FITOTRIPEN 18 15,1667 X
Contrast Difference +/- Limits
CARBENDAZIM - DITHANE FMB *-5,83333 3,33149
CARBENDAZIM - FITOTRIPEN *-15,1667 3,33149
CARBENDAZIM - SPORTAK *-6,61111 3,33149
DITHANE FMB - FITOTRIPEN *-9,33333 3,33149
DITHANE FMB - SPORTAK -0,777778 3,33149
FITOTRIPEN - SPORTAK *8,55556 3,33149
* denotes a statistically significant difference.
102
ANALISIS DE VARIANZA PARA PORCENTAJES DE INIBICION
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 222,81 2 111,405 9,15 0,0009
B:FUNGICIDA 30368,5 3 10122,8 831,36 0,0000
C:REPLICA 1,69132 2 0,845662 0,07 0,9331
RESIDUAL 340,935 28 12,1763
TOTAL (CORRECTED) 30934,0 35
All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T1 12 69,0928 X
T3 12 69,3038 X
T2 12 74,4726 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-5,37975 3,52577
T1 - T3 -0,21097 3,52577
T2 - T3 *5,16878 3,52577
* denotes a statistically significant difference.
103
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
CARBENDAZIM 9 22,6442 X
SPORTAK 9 73,8397 X
DITHANE FMB 9 93,6709 X
FITOTRIPEN 9 93,6709 X
Contrast Difference +/- Limits
CARBENDAZIM - DITHANE FMB *-71,0267 4,49211
CARBENDAZIM - FITOTRIPEN *-71,0267 4,49211
CARBENDAZIM - SPORTAK *-51,1955 4,49211
DITHANE FMB - FITOTRIPEN 0,0 4,49211
DITHANE FMB - SPORTAK *19,8312 4,49211
FITOTRIPEN - SPORTAK *19,8312 4,49211
* denotes a statistically significant difference.
105
ANEXO 5
ANOVA MULTIFACTORIAL PARA Cladosporium echinulatum
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 568,361 2 284,181 31,48 0,0000
B:FUNGICIDA 2701,82 3 900,606 99,76 0,0000
C:REPLICA 5,36111 2 2,68056 0,30 0,7441
D:TECNICA 74,0139 1 74,0139 8,20 0,0057
RESIDUAL 568,764 63 9,028
TOTAL (CORRECTED) 3918,32 71
All F-ratios are based on the residual mean square error.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 24 4,0 X
T1 24 7,16667 X
T2 24 10,875 X
106
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-3,70833 2,08211
T1 - T3 *3,16667 2,08211
T2 - T3 *6,875 2,08211
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
CARBENDAZIM 18 0,0 X
DITHANE FMB 18 3,55556 X
FITOTRIPEN 18 9,77778 X
SPORTAK 18 16,0556 X
Contrast Difference +/- Limits
CARBENDAZIM - DITHANE FMB *-3,55556 2,64312
CARBENDAZIM - FITOTRIPEN *-9,77778 2,64312
CARBENDAZIM - SPORTAK *-16,0556 2,64312
DITHANE FMB - FITOTRIPEN *-6,22222 2,64312
DITHANE FMB - SPORTAK *-12,5 2,64312
FITOTRIPEN - SPORTAK *-6,27778 2,64312
* denotes a statistically significant difference.
108
ANEXO 6
ANOVA MULTIFACTORIAL PARA Rhizoctonia solani
ANALISIS DE VARIANZA PARA HALOS DE INHIBICIÓN
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS
A:REPLICA 1,48889 2 0,744444 0,07 0,9294
B:TECNICA 179,211 1 179,211 17,65 0,0001
C:DOSIS 482,756 2 241,378 23,78 0,0000
D:FUNGICIDA 8828,04 4 2207,01 217,40 0,0000
RESIDUAL 812,156 80 10,1519
TOTAL (CORRECTED) 10303,7 89
All F-ratios are based on the residual mean square error.
109
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 30 7,76667 X
T1 30 10,8333 X
T2 30 13,4333 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-2,6 1,96471
T1 - T3 *3,06667 1,96471
T2 - T3 *5,66667 1,96471
* denotes a statistically significant difference.
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
-
Method: 95,0 percent Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 18 0,0 X
TERRAZOLE 18 0,0 X
PROGRO 18 9,22222 X
RIDOMIL 18 21,8333 X
FITOTRIPEN 18 22,3333 X
110
Contrast Difference +/- Limits
-
FITOTRIPEN - KOCIDE *22,3333 2,96415
FITOTRIPEN - PROGRO *13,1111 2,96415
FITOTRIPEN - RIDOMIL 0,5 2,96415
FITOTRIPEN - TERRAZOLE *22,3333 2,96415
KOCIDE - PROGRO *-9,22222 2,96415
KOCIDE - RIDOMIL *-21,8333 2,96415
KOCIDE - TERRAZOLE 0,0 2,96415
PROGRO - RIDOMIL *-12,6111 2,96415
PROGRO - TERRAZOLE *9,22222 2,96415
RIDOMIL - TERRAZOLE *21,8333 2,96415
* denotes a statistically significant difference.
ANALISIS DE VARIANZA PARA PORCENTAJES DE INIBICION
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P<0.05
MAIN EFFECTS
A:DOSIS 231,927 2 115,964 3,72 0,0340
B:FUNGICIDA 7040,18 4 1760,05 56,45 0,0000
C:REPLICA 18,8662 2 9,43311 0,30 0,7408
RESIDUAL 1122,45 36 31,1791
TOTAL (CORRECTED) 8413,42 44
All F-ratios are based on the residual mean square error.
111
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE LSD PARA LAS DOSIS
Method: 95,0 percent LSD
DOSIS Count LS Mean Homogeneous Groups
T3 15 84,8571 X
T1 15 85,1429 X
T2 15 89,8095 X
Contrast Difference +/- Limits
T1 - T2 *-4,66667 4,13514
T1 - T3 0,285714 4,13514
T2 - T3 *4,95238 4,13514
* denotes a statistically significant difference.
112
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE SEGÚN TUKEY PARA LOS FUNGICIDAS
Method: 95,0 percent Tukey HSD
FUNGICIDA Count LS Mean Homogeneous Groups
KOCIDE 9 61,5873 X
PROGRO 9 92,8571 X
FITOTRIPEN 9 92,8571 X
TERRAZOLE 9 92,8571 X
RIDOMIL 9 92,8571 X
Contrast Difference +/- Limits
FITOTRIPEN - KOCIDE *31,2698 7,55757
FITOTRIPEN - PROGRO 0,0 7,55757
FITOTRIPEN - RIDOMIL 0,0 7,55757
FITOTRIPEN - TERRAZOLE 0,0 7,55757
KOCIDE - PROGRO *-31,2698 7,55757
KOCIDE - RIDOMIL *-31,2698 7,55757
KOCIDE - TERRAZOLE *-31,2698 7,55757
PROGRO - RIDOMIL 0,0 7,55757
PROGRO - TERRAZOLE 0,0 7,55757
RIDOMIL - TERRAZOLE 0,0 7,55757
* denotes a statistically significant difference.
