Estudios MolecularesEstudios Moleculares

Hemoglobinopatías:Hemoglobinopatías:

SicklemiaSicklemia

-talasemia-talasemia

Hemopatías malignasHemopatías malignas

ESTUDIOS MOLECULARES ESTUDIOS MOLECULARES ENEN

ANEMIA DREPANOCÍTICAANEMIA DREPANOCÍTICA(SICKLEMIA)(SICKLEMIA)

Diagnóstico prenatalDiagnóstico prenatalDetección de Detección de -talasemia-talasemiaDeterminación de los Determinación de los

haplotipos asociados al haplotipos asociados al gen gen S S

Diagnóstico Prenatal de la Sicklemia

PRIMERA APLICACIÓN CLÍNICA DE LA BIOLOGÍA

MOLECULAR EN EL MUNDO Y EN CUBA.

1978- polimorfismo Hpa I. 1982- estudio directo de la mutación s. 1983- primer DP de la SS en el IHI. 1983- Primer lugar en el concurso “Premio Anual

de la Salud”. Se realizaron los primeros 100 estudios.

- - talasemia en SStalasemia en SS

Se determinó la frecuencia de Se determinó la frecuencia de -talasemia en -talasemia en pacientes SS (234 pacientes estudiados).pacientes SS (234 pacientes estudiados).

frec (- frec (- ) SS: 0.1880 ) SS: 0.1880

frec (- frec (- ) no-blancos AA: 0.1136 p) no-blancos AA: 0.1136 p 0.0010.001

Encontramos que la Encontramos que la -talasemia aumenta con la -talasemia aumenta con la edad, es decir, que aumenta la sobrevida.edad, es decir, que aumenta la sobrevida.

(G.Martinez et al: Age dependence of the gene (G.Martinez et al: Age dependence of the gene frequency of frequency of - thalassemia in sickle cell anemia in - thalassemia in sickle cell anemia in Cuba. Cuba. Blood 88: 1898,1996).Blood 88: 1898,1996).

Haplotipos asociados al Haplotipos asociados al gen gen ss

Se determinó la frecuencia de los diferentes Se determinó la frecuencia de los diferentes haplotipos asociados al gen haplotipos asociados al gen s (91 pacientes s (91 pacientes estudiados).estudiados).

Benin: 51% Bantú: 41% Senegal: 8%Benin: 51% Bantú: 41% Senegal: 8%

Se encontró que la frecuencia del haplotipo Bantú Se encontró que la frecuencia del haplotipo Bantú disminuye y el Senegal aumenta con la edad del disminuye y el Senegal aumenta con la edad del paciente SS.paciente SS.

(A. Muñiz et al: (A. Muñiz et al: Sickle cell anemia and Sickle cell anemia and - gene cluster haplotypes - gene cluster haplotypes in Cuba. Am J Hematol 1995, 49: 163).in Cuba. Am J Hematol 1995, 49: 163).

Bases Moleculares de la Bases Moleculares de la -talasemia-talasemia

Se establecieron las bases moleculares de la Se establecieron las bases moleculares de la -talase-talasemia en ia en la población cubana.la población cubana.

Se identificaron 17 mutaciones diferentes.Se identificaron 17 mutaciones diferentes.

Las mutaciones más frecuentes fueron:Las mutaciones más frecuentes fueron:Codón 39 (30.5%)Codón 39 (30.5%) IVS1- 110 (8.5%) IVS1- 110 (8.5%)-29 (13.4%) -29 (13.4%) IVS2- 1 (8.5%) IVS2- 1 (8.5%)

La gran variabilidad de las bases moleculares hace muy difícil el La gran variabilidad de las bases moleculares hace muy difícil el diagnóstico prenatal de la talasemia mayor y de diagnóstico prenatal de la talasemia mayor y de

la S/ la S/ -talasemia. -talasemia.

Los resultados moleculares conjuntos en SS y Los resultados moleculares conjuntos en SS y -talase-talasemia ia constituyeron el tema de una Tesis de Doctorado.constituyeron el tema de una Tesis de Doctorado.

Estudios Moleculares en Hemopatías Estudios Moleculares en Hemopatías MalignasMalignas

Reordenamiento de los genes de las Igs Reordenamiento de los genes de las Igs y RT en síndromes linfoproliferativos.y RT en síndromes linfoproliferativos.

Genes híbridos originados por Genes híbridos originados por translocaciones y otras alteraciones en translocaciones y otras alteraciones en leucemias.leucemias.

Quimerismo molecular en TMOQuimerismo molecular en TMO

Resultados en esta primera etapa (1980-90)Resultados en esta primera etapa (1980-90)

Los estudios del reordenamiento de los genes de Los estudios del reordenamiento de los genes de las Igs y del RT que demostraron:las Igs y del RT que demostraron:

Heterogeneidad molecular en la LLC.Heterogeneidad molecular en la LLC.

Reordenamiento no productivo en LLC Reordenamiento no productivo en LLC

(mutación tipo talasemia).(mutación tipo talasemia).

Estos resultados, unidos al estudio Estos resultados, unidos al estudio

inmunológico y la evaluación clínica recibieron inmunológico y la evaluación clínica recibieron

el Primer Lugar en el “Premio anual de la Salud” el Primer Lugar en el “Premio anual de la Salud”

(1989).(1989). Se contribuyó al diagnóstico y estadificación de Se contribuyó al diagnóstico y estadificación de

los linfomas.los linfomas.

Resultados en esta primera etapa Resultados en esta primera etapa (cont.)(cont.)

Se realizaron aportes en la LMC apoyando los Se realizaron aportes en la LMC apoyando los resultados de otros autores sobre la resultados de otros autores sobre la heterogeneidad molecular de esta entidad.heterogeneidad molecular de esta entidad.

Estos estudios en LMC dieron lugar a una Tesis Estos estudios en LMC dieron lugar a una Tesis de Doctorado.de Doctorado.

AlteraciónAlteración Gen híbridoGen híbrido

t(15;17)t(15;17) PML-RARPML-RAR t(12;21)t(12;21) TEL-AML1TEL-AML1

t(8;21)t(8;21) AML1-ETO AML1-ETO

t(9;22)t(9;22) BCR-ABL BCR-ABL

t(4;11)t(4;11) MLL-AF4 MLL-AF4

inv 16inv 16 CBF CBF-MYH11-MYH11

DIT FLT3DIT FLT3

AlteraciónAlteración Gen híbridoGen híbrido

t(15;17)t(15;17) PML-RARPML-RAR t(12;21)t(12;21) TEL-AML1TEL-AML1

t(8;21)t(8;21) AML1-ETO AML1-ETO

t(9;22)t(9;22) BCR-ABL BCR-ABL

t(4;11)t(4;11) MLL-AF4 MLL-AF4

inv 16inv 16 CBF CBF-MYH11-MYH11

DIT FLT3DIT FLT3

AlteraciónAlteración No. de casos No. de casos % %

PML-RARPML-RAR 104 (97) 104 (97) 93.0 93.0

AML1-ETO 78 (15) 20.0AML1-ETO 78 (15) 20.0

CBFCBF-MYH11 -MYH11 80 (4) 5.0 80 (4) 5.0

MLL-AF4 52 (1) 2.0MLL-AF4 52 (1) 2.0

DIT FLT3DIT FLT3 108 (17)108 (17) 17.0 17.0 ((DIT FLT3 (+) en LPA: 53%)DIT FLT3 (+) en LPA: 53%)

AlteraciónAlteración No. de casos No. de casos % %

PML-RARPML-RAR 104 (97) 104 (97) 93.0 93.0

AML1-ETO 78 (15) 20.0AML1-ETO 78 (15) 20.0

CBFCBF-MYH11 -MYH11 80 (4) 5.0 80 (4) 5.0

MLL-AF4 52 (1) 2.0MLL-AF4 52 (1) 2.0

DIT FLT3DIT FLT3 108 (17)108 (17) 17.0 17.0 ((DIT FLT3 (+) en LPA: 53%)DIT FLT3 (+) en LPA: 53%)

Diagnóstico Morfológico Diagnóstico Molecular

2 pacientes M3 ó M4 1 M4 1 M3 t(15;17)

4 pacientes M2 ó M3 1 M3 t(15;17) 3 M2 t(8;21)

1 paciente M3 ó M7 1 M3 t(15;17)

El estudio molecular comenzó en 1995.El estudio molecular comenzó en 1995.

104 pacientes estudiados 104 pacientes estudiados

97 (93 %) pacientes RT-PCR+ 97 (93 %) pacientes RT-PCR+ 7 ( 7 %) pacientes RT-PCR – 7 ( 7 %) pacientes RT-PCR – (En un paciente – se comprobó PLZF-RARA)(En un paciente – se comprobó PLZF-RARA)

Frecuencia de los puntos de ruptura (bcr):Frecuencia de los puntos de ruptura (bcr): bcr 1: 66 %bcr 1: 66 % bcr2: 5 %bcr2: 5 % bcr3: 29 %bcr3: 29 %

El estudio molecular comenzó en 1995.El estudio molecular comenzó en 1995.

104 pacientes estudiados 104 pacientes estudiados

97 (93 %) pacientes RT-PCR+ 97 (93 %) pacientes RT-PCR+ 7 ( 7 %) pacientes RT-PCR – 7 ( 7 %) pacientes RT-PCR – (En un paciente – se comprobó PLZF-RARA)(En un paciente – se comprobó PLZF-RARA)

Frecuencia de los puntos de ruptura (bcr):Frecuencia de los puntos de ruptura (bcr): bcr 1: 66 %bcr 1: 66 % bcr2: 5 %bcr2: 5 % bcr3: 29 %bcr3: 29 %

Posible quimera M3:M5 en LPA: diferente Posible quimera M3:M5 en LPA: diferente respuesta clonal al tto. con ATRA y respuesta clonal al tto. con ATRA y

quimioterapiaquimioterapia

Alteración No. casosAlteración No. casos % %

TEL-AML1TEL-AML1 164 (33) 164 (33)

21.021.0

BCR-ABLBCR-ABL 154 (3 M; 7 m) 154 (3 M; 7 m) 6.5 6.5

MLL-AF4MLL-AF4 154 (5) 154 (5) 3.2 3.2

Alteración No. casosAlteración No. casos % %

TEL-AML1TEL-AML1 164 (33) 164 (33)

21.021.0

BCR-ABLBCR-ABL 154 (3 M; 7 m) 154 (3 M; 7 m) 6.5 6.5

MLL-AF4MLL-AF4 154 (5) 154 (5) 3.2 3.2

t(9;22) bcr-ablt(9;22) bcr-abl

Puntos de ruptura No. Casos %

p210 b3-a2 61 (35) 57.4

p210 b2-a2 61 (24) 39.3

p210 b2-a3 1 1.6

p190 e1-a2 1 1.6

Puntos de ruptura No. Casos %

p210 b3-a2 61 (35) 57.4

p210 b2-a2 61 (24) 39.3

p210 b2-a3 1 1.6

p190 e1-a2 1 1.6

Quimerismo Molecular en TMOQuimerismo Molecular en TMO

12 TMO monitoreados:12 TMO monitoreados: 9 hemopatías malignas 9 hemopatías malignas 3 hemopatías no malignas3 hemopatías no malignas

Resultados al mes:Resultados al mes: QC: 9QC: 9 No quimera: 2 No quimera: 2 QM: 1 (que posteriormente pasó a QC).QM: 1 (que posteriormente pasó a QC).

Resumen de los Resumen de los resultados de nuestro resultados de nuestro Dpto.Dpto. Aproximadamente 100 publicaciones.Aproximadamente 100 publicaciones. 3 Premios del Concurso del Minsap3 Premios del Concurso del Minsap 3 Tesis de Doctorado3 Tesis de Doctorado 15 TTR de residentes de Hematología15 TTR de residentes de Hematología 1 TTR de un residente de Genética 1 TTR de un residente de Genética

MédicaMédica 8 Trabajos de Diploma de la Universidad8 Trabajos de Diploma de la Universidad Varios cursos nacionales e Varios cursos nacionales e

internacionales.internacionales.

¿Qué se está haciendo ¿Qué se está haciendo en el Mundo ahora?en el Mundo ahora?

RT-PCR cuantitativoRT-PCR cuantitativo Estudio del TranscriptomaEstudio del Transcriptoma Estudio del ProteomaEstudio del Proteoma Terapia Molecular DirigidaTerapia Molecular Dirigida

RT-PCR cuantitativaRT-PCR cuantitativa

Gran importancia en el seguimiento de la LMC.Gran importancia en el seguimiento de la LMC.

La importancia en LPA está aún por La importancia en LPA está aún por determinarse.determinarse.

En LLA, el resultado de la RT-PCR cuantitativa En LLA, el resultado de la RT-PCR cuantitativa al final de la inducción y al finalizar la al final de la inducción y al finalizar la consolidación determina el riesgo:consolidación determina el riesgo:

alto intermedio bajoalto intermedio bajo

GENGenoma

Perfil de la expresión

génica(Microarray analysis)

Progresión del Genoma al Proteoma

Transcriptoma (variantes de

empalme)

Modificacionespost-traduccionales

Funciones

ARNm

Proteína

+Interacción conotras proteínas

Proteoma

Transcripción

Traducción

Análisis delproteoma

(Proteomics)

Es el conjunto de ARNm expresados en una célula o Es el conjunto de ARNm expresados en una célula o tejido en un momento dado.tejido en un momento dado.

Permite identificar subclases moleculares que no se Permite identificar subclases moleculares que no se pueden detectar por técnicas convencionales.pueden detectar por técnicas convencionales.

Puede ayudar en el diagnóstico.Puede ayudar en el diagnóstico.

Permitirá conocer el mecanismo de resistencia a las Permitirá conocer el mecanismo de resistencia a las

drogas.drogas.

El objetivo futuro es caracterizar la célula madre para El objetivo futuro es caracterizar la célula madre para eliminar el clon neoplásico en su origen.eliminar el clon neoplásico en su origen.

Representa la población de proteínas en una célula Representa la población de proteínas en una célula

o tejido en un momento dado. o tejido en un momento dado.

Detecta la localización, las modificaciones post-Detecta la localización, las modificaciones post-

traduccionales, interacciones y recambio de las traduccionales, interacciones y recambio de las

proteínas.proteínas.

Es a nivel del proteoma que el gen ejerce su Es a nivel del proteoma que el gen ejerce su

función.función.

Ofrece una mejor comprensión del estado Ofrece una mejor comprensión del estado

fisiológico y patológico de un organismo.fisiológico y patológico de un organismo.

TranscriptomaTranscriptoma No detecta modificaciones post-traduccionales ni No detecta modificaciones post-traduccionales ni

las interacciones entre las proteínas.las interacciones entre las proteínas.

Existen diferencias entre la vida media de los Existen diferencias entre la vida media de los

ARNm y la vida media de las proteínas.ARNm y la vida media de las proteínas.

ProteomaProteoma Las técnicas son complejas.Las técnicas son complejas.

No puede detectar proteínas en poca cantidad.No puede detectar proteínas en poca cantidad.

No puede hacer un análisis en una sola célula.No puede hacer un análisis en una sola célula.

Cada día se conocen nuevos mecanismos moleculares en la Cada día se conocen nuevos mecanismos moleculares en la

patogenia de las leucemias. Esto ha permitido que se patogenia de las leucemias. Esto ha permitido que se

desarrollen terapias moleculares dirigidas contra una desarrollen terapias moleculares dirigidas contra una

mutación específica.mutación específica.Ejs. ATRA en LPAEjs. ATRA en LPA

Glivec en LMCGlivec en LMCInhibidores del FLT3Inhibidores del FLT3

El objetivo futuro es mejorar la El objetivo futuro es mejorar la terapia molecular terapia molecular y lograr y lograr que llegue a ser una terapia personalizada según el genotipo que llegue a ser una terapia personalizada según el genotipo de cada paciente.de cada paciente.