UNIVERSIDAD DE SONORADEPARTAMENTO DE INVESTIGACIN Y DESARROLLO EN ALIMENTOS

CIENCIA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS

CONSERVACIN Y PROCESAMIENTO DE PRODUCTOS MARINOS

BIOQUMICA DE ALIMENTOS

Mecanismos de Regulacin de la Enzima Proteoltica Tripsina en Mamferos

ROSA LINDA LPEZ ENRQUEZ

HERMOSILLO, SONORA DICIEMBRE, 2012

CONTENIDOPgina

CONTENIDO2

INTRODUCCIN 3

REVISIN BIBLIOGRFICA4

Enzimas Involucradas en el Proceso General de la Digestin de Protenas 4

Caractersticas Generales de las Serina Proteasas4

Estructura y Funcin Metablica de la Tripsina5

Regulacin de la Actividad Proteoltica de la Tripsina7

Activacin por Modificacin Covalente (Protelisis)7

Inhibicin por Unin No Covalente 9

Inhibidor Pancretico Bovino de Tripsina (BPTI)9

Inhibicin por Unin Covalente 9

Serina Proteasas Inhibitorias (Serpinas)9

Inhibidores de Tripsina en la Industria Farmacutica y Alimentaria10

CONCLUSIONES11

REFERENCIAS12

3

INTRODUCCINLas protenas son macromolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos unidos por enlaces peptdicos. Se consideran indispensables para la vida pues tienen un sinnmero de funciones de gran importancia para mantener la homeostasis del organismo humano (estructural, contrctil, regulacin, inmunidad, catlisis, sealizacin, transporte y protectora) (Mathews et al., 2002). Las protenas una vez consumidas tienen que ser digeridas en el estmago e intestino delgado para poderse absorber. La tripsina es una de las enzimas proteolticas ms importantes secretadas en el jugo pancretico en el intestino delgado. Esta enzima es una endopeptidasa pues cataliza la hidrolisis de enlaces peptdicos con especificidad del lado carboxilo de los aminocidos arginina y lisina. La tripsina se produce en pncreas por estimulacin por colecistoquinina y se secreta en el duodeno como el zimgeno tripsingeno (forma inactiva). Una vez en el intestino, la enzima enteropeptidasa hidroliza al tripsingeno en un punto de su cadena aminoacdica para activar la enzima tripsina. ste mecanismo de activacin es necesario, pues de esa manera se evita la degradacin de los tejidos del pncreas de accin de la proteasa. En este sentido, es conocido que una mala regulacin de la activacin del zimgeno de tripsina conduce a la enfermedad denominada pancreatitis.Existen otros mecanismos de regulacin de la enzima tripsina que se basan en la unin de un compuesto anlogo al sitio activo de la enzima ya sea por unin covalente o no covalente. Ejemplos de estos compuestos son los inhibidores de serina proteasas (serpinas) los cuales se unen por un enlace covalente a la proteasa diana, y el inhibidor pancretico de tripsina, el cual se une de manera no covalente al sitio activo.En este trabajo se pretende revisar las caractersticas generales de la tripsina como su estructura, funcin metablica y regulacin (activacin e inhibicin). As tambin este trabajo tuvo inters en revisar ms detalladamente aspectos relacionados con la inhibicin de de la tripsina y los compuestos que ocasionan dicha inhibicin.

REVISIN BIBLIOGRFICAEnzimas Involucradas en el Proceso General de la Digestin de Protenas Para lograr el aprovechamiento de las protenas en el organismo humano, stas tienen que ser digeridas para producir compuestos de un bajo peso molecular que puedan ser absorbidos en el tracto gastrointestinal. La digestin de las protenas se lleva a cabo en el tubo digestivo, mediante la accin de varias enzimas proteolticas (proteasas), que hidrolizan las uniones peptdicas (Pea-Diaz et al, 1988)En general se pueden distinguir las enzimas endopeptidasas y las exopeptidasas. Las primeras hidrolizan uniones peptdicas del interior de la cadena polipetidica. En cambio, las exopeptidasas (aminopeptidasas y carboxipeptidasas) hidrolizan especficamente uniones peptdicas de los aminocidos terminales. Las endopeptidasas ms importantes son la pepsina, la tripsina y la quimiotripsina. Las tres enzimas se sintetizan en forma de precursores inactivos (zimgenos); el pepsingeno se convierte en pepsina por accin de la extrema acidez del jugo gstrico en el estmago, y por un proceso autocataltico de la propia molcula (Pea-Daz, 1988). La activacin de pepsina; se realizar por protelisis de la misma; y el fragmento aminoacdico liberado por su activacin, acta como pptido de sealizacin para la liberacin de la hormona colecistoquinina, la cual, a su vez libera tripsinogeno y quimiotripsinogeno al intestino delgado. La enzima enteroquinasa, sintetizada en las clulas de la pared intestinal, cataliza la conversin de tripsingeno en tripsina, y sta la de quimotripsingeno en quimotripsina. Estas endopeptidasas producen oligopeptidos, por lo que stos son hidrolizados por otro grupo de enzimas (aminopeptidasas, carboxipeptidasas, dipeptidasas y tripeptidasas). Los productos de la digestin de las protenas son aminocidos libres y/o pptidos (dipeptidos o tripeptidos), los cuales son fcilmente absorbidos por las paredes del tracto gastrointestinal (Rodrguez-Rivera, 2008).

Caractersticas Generales de las Serina ProteasasCasi una tercera parte de todas las proteasas se pueden clasificar como serina proteasas, su nombre se lo deben a un residuo nucleoflico de serina en su sitio activo (Hedstrom, 2002). Las enzimas ms comunes dentro de este grupo de proteasas son la tripsina, quimiotripsina, la acetilcolinesterasa y la elastasa (Whitfor, 2005). stas proteasas catalizan la hidrolisis de los enlaces peptdicos de las protenas con cierta especificidad. Entran en la clasificacin de endopeptidasas, pues hidrolizan uniones internas de los pptidos, es decir no liberan aminocidos terminales (Pea-Daz et al., 1988). Las uniones que hidrolizan no son al azar, pues muestran una especificidad de sustrato que difiere ampliamente de una enzima a otra.Las serina proteasas manifiestan estructuras similares con un sitio activo que contiene tres residuos invariantes dispuestos en estrecha proximidad. Los residuos son His57, Asp102 y Ser195 y juntos forman una trada cataltica unidos por una red de enlaces de hidrgeno (Polgar, 2005). Adems de dichos residuos invariantes, las serina proteasas tienen un hueco localizado cerca de la serina del sitio activo, el cual influye fuertemente en la especificidad de sustrato. A pesar de la adaptacin de especificidad de sustrato a travs de las propiedades del hueco, todas las proteasas de serina manifiestan un mecanismo cataltico similar basado en el residuo de serina altamente reactive (Hedstrom, 2002). Las secuencias de tripsina, quimiotripsina y elastasa exhiben una homologa de aproximadamente 40%. Se sabe que la estructura tridimensional de todas estas enzimas comparte similares conformaciones plegadas. La similitud en la secuencia y la estructura entre quimotripsina, elastasa y tripsina indica que estas protenas surgieron de la duplicacin gnica de un gen de la proteasa ancestral con la contabilidad de la evolucin posterior de las diferencias individuales (Whitford, 2005).

Estructura y Funcin Metablica de la TripsinaLa tripsina es una serina proteasa que hidroliza a los polipptidos de las protenas preferentemente despus de cadenas laterales cargadas positivamente, tales como arginina o lisina (Whitford, 2005). Se encuentra en el sistema digestivo de vertebrados, donde hidroliza las cadenas peptdicas de las protenas (Rawlings y Barret, 1994).

Figura 1. Estructura molecular de la tripsinaFuente: PDB, 2003

En general, la tripsina presenta un sitio activo similar a las dems serina proteasas, una triada cataltica que consiste en His57, Asp102 y Ser 195 (Polgar, 2005). Como se describi anteriormente, la estructura de las serina proteasas se caracteriza por tener un hueco en donde resguardan el sitio activo. En el caso de la tripsina, el hueco es relativamente largo y estrecho con un carboxilato de una cadena lateral estratgicamente situada en la parte inferior del hueco. En vista de la especificidad preferida de la tripsina para la segmentacin cadenas laterales despus de lisina o arginina, este hueco parece haber sido adaptado para capturar el sustrato de manera muy eficaz (Whitford, 2005)

Figura 2. Sitio activo de la tripsina. Aqu se presenta la triada cataltica conformada por histidina 57, Aspartato 102 y Serina 195.Fuente: PDB, 2003

La tripsina rompe las cadenas de pptidos principalmente en el lado carboxilo de los aminocidos lisina o arginina, excepto si estn seguidas por prolina (Evnin et al., 1990). En este sentido, Olsen et al. (2004), utilizando espectroscopia de masas, identificaron que en los pptidos obtenidos por hidrolisis de tripsina fueron cortados nicamente del lado carboxilo terminal de la arginina y lisina, corroborando la especificidad de esta enzima.La tripsina se activa a partir de la protelisis de su zimgeno (tripsingeno) en el intestino delgado por enteropeptidasa. La tripsina cataliza la hidrolisis de enlaces peptdicos en el duodeno, rompiendo a las protenas en pptidos de bajo peso molecular. A su vez, estos pptidos se pueden seguirse hidrolizando en aminocidos por otras proteasas (exopeptidasas) antes de entrar en el torrente sanguneo (Rodrguez-Rivera, 2008).Regulacin de la Actividad Proteoltica de la TripsinaActivacin por Modificacin Covalente (Protelisis)La proteolisis regula la actividad enzimtica por la sntesis de enzimas precursoras inactivas que contienen secuencias de precursores en el terminal N. La eliminacin de estas regiones por proteasas conduce a la activacin de la enzima. La tripsina se sintetiza inicialmente como una molcula precursora ms grande e inactiva llamada tripsingeno o zimgeno de tripsina. La tripsina se produce en pncreas por estimulacin por colecistoquinina y se secreta en el duodeno como el zimgeno tripsingeno (forma inactiva). Una vez en el intestino, la enzima enteropeptidasa se secreta por la membrana mucosa y corta un hexapptido del N terminal del tripsingeno para formar tripsina (Pea-Daz et al., 1988; Whitford, 2005). La forma inactiva de sta proteinasa evita el ataque proteoltico al pncreas y a la propia pared del tracto gastrointestinal (Rodrguez-Rivera, 2008). La enteropeptidasa est bajo control hormonal, el producto es la tripsina con una especificidad natural para el corte de residuos de Lys o Arg y una pequea cantidad de tripsina producida es capaz de catalizar la produccin adicional de tripsina a partir del zimgeno. Como resultado este proceso describe a menudo autoltico (Whitford, 2005).Los zimgenos son comunes para las enzimas proteolticas, tales como las que se encuentran en el tracto digestivo de mamferos, donde la produccin de la enzima activa podra conducir a la degradacin de clulas inmediatamente despus de la traduccin. La activacin de la tripsina por hidrolisis proteoltica del tripsingeno en el pncreas puede conllevar a una serie de situaciones que provoquen la auto-digestin pancretica, lo que resulta en la enfermedad denominada pancreatitis. La pancreatitis aguda es una enfermedad que se da por el dao al pncreas, y ste resulta de la activacin prematura de las enzimas digestivas (Voet y Voet, 2004).

Figura 3. Activacin del tripsingeno a tripsina. Protelisis limitada del tripsinogeno por una enteropeptidasa y donde se remueve una hexapptido corto del N-terminal.Fuente: Whitford, 2005

La tripsina juega un papel importante en la activacin de otras enzimas proteolticas pancreticas (Figura 4). La tripsina activa a la quimotripsina y a la elastasa mediante la ruptura proteoltica del quimotripsingeno y de la proelastasa, respectivamente (Mathews, 2002; Whitford, 2005).

TripsingenoTripsinaQuimotripsingenoProelastasaQuimiotripsinaElastinaEnteropeptidasa

Figura 4. Activacin de zimgenos mediante ruptura proteoltica. En este esquema se muestra la activacin de los zimgenos que pasan a ser catalticamente activos cuando sufren ruptura.Fuente: Mathews et al., 2002

Inhibicin por Unin No Covalente Los procesos de inhibicin y regulacin de las enzimas estn interrelacionados con el procesamiento de las protenas en las clulas que inhiben enzimas como parte de la funcin celular normal (Whitford, 2005). La inhibicin reversible de la tripsina involucra la unin no covalente de un inhibidor de la enzima. Se da por inhibidores simples se unen como "llave-cerradura" y bloquean el acceso al sitio activo de la proteasas (Yamasaki et al., 2008).Inhibidor Pancretico Bovino de Tripsina (BPTI)El modo de inhibicin tipo unin no covalente, se manifiesta por el inhibidor de tripsina pancretica bovina (BPTI), que es una protena que acta como inhibidor natural de tripsina, previniendo su actividad proteoltica. La alta estabilidad de la molcula es debido a los 3 enlaces disulfuro que unen las 6 miembros de cistena de la cadena (Cys5-Cys55, Cys14-Cys38 y Cys30 Cys51. La cadena larga y bsica de la lisina 15 se une muy fuertemente en el hueco de especificidad en el sitio activo de la tripsina e inhibe su accin enzimtica (Kasell y Laskowski, 1965).

Inhibicin por Unin Covalente Serina Proteasas Inhibitorias (Serpinas)Las serpinas son una superfamilia de protenas clasicadas dentro de 16 secciones. El genoma humano contiene aproximadamente 36 serpinas implicadas en la regulacin de numerosos sistemas que incluyen la hemostasia y brinlisis, angiognesis, la cascada del complemento y la inamacin. (Rau et al, 2007). El nombre serpina se deriva de la combinacin de serina proteasa inhibitoria, en virtud de sus propiedades funcionales (Carrell y Travis, 1985). Los inhibidores de serina proteasas (serpinas) pueden formar un enlace covalente con la proteasa de serina, inhibiendo su funcin. Ejemplos de este tipo de inhibidores de tripsina son por ejemplo 1-antitripsin y antitrombina. Estos inhibidores son parte de la defensa contra su activacin inapropiada de tripsina (Voet y Voet, 2004). Todas ellas presentan un alto grado de homologa estructural. Estn tpicamente compuestas por aproximadamente 400 aminocidos que se organizan en 9 hlices y tres hojas (A, B, C). Las serpinas tambin poseen una regin expuesta denomina el bucle centro reactivo (RCL) que, en molculas inhibidoras, incluye la regin determinada especfica y forma la interaccin inicial con la proteasa diana (Whisstock et al., 2006).Un esquema minimalista de la cintica de inhibicin de las serpinas consta de dos pasos: 1) la formacin de un complejo michaeliano, donde la secuencia el bucle reactivo (RCL) es reconocida por la proteasa como un sustrato; y 2) la formacin de un complejo covalente donde la proteasa es atrapada en un estado inactivo (Burghaus et al., 2006)Las serpinas son de particular inters para la biologa estructural, debido a que sufren un cambio nico y dramtico en la forma (o cambio conformacional) cuando inhiben las proteasas diana (Huntington et al., 2000). Aunque el mecanismo de inhibicin de la proteasa confiere ciertas ventajas, tambin tiene desventajas, y las serpinas son vulnerables a mutaciones que resultan en mal plegamiento de protenas y la formacin de inactivos polmeros de cadena larga.

Figura 5. Estructura de la serpina 1-antitripsina humana.Fuente: PDB

Inhibidores de Tripsina en la Industria Farmacutica y AlimentariaEn la industria farmacutica, el estudio de los inhibidores naturales as como el desarrollo de inhibidores sintticos de tripsina puede ayudar de manera importante al control de enfermedades relacionadas con la actividad proteoltica de sta enzima, como es el caso de la pancreatitis. La investigacin los perfiles cinticos de reacciones catalizadas de la enzima en presencia de un inhibidor puede identificar los mecanismos de inhibicin y proporcionar pistas importantes en ausencia de datos estructurales de la geometra del sitio activo y la composicin. Armados con el conocimiento estructural, la industria farmacutica ha producido nuevos inhibidores con accin mejorada que desempean papeles cruciales en la lucha contra la enfermedad.Existen fuentes naturales de inhibidores de tripsina: jugo pancretico bovino, serpina, ovomucoide, soya, y frijol lima. Cada inhibidor acta como un substrato anlogo y se une con las serina proteasas para formar complejos inactivos, porque las proteasas se inactivan. Sin embargo, la presencia de inhibidores de tripsina en alimentos de consumo habitual puede ser un problema, pues comprometen la nutricin del organismo que los consume. Lo anterior sucede debido a que, al inhibir la enzima tripsina, no se lleva a cabo la degradacin de las protenas y se evita la absorcin de stas por el organismo.

CONCLUSIONESLas serina proteasas tienen una estructura similar, por lo que se considera que tienen una actividad similar. Pero la importancia de tripsina radica en que una vez activada en el intestino delgado, promueve la activacin de las otras serinas proteasas (quimotripsina y elastasa). La activacin de estas enzimas tiene que estar regulada, especialmente de la tripsina. Para esto, los inhibidores naturales de tripsina evitan que sta se active inapropiadamente y que degrade los tejidos del pncreas. El estudio de inhibidores de tripsina fisiolgicos o el desarrollo de inhibidores sintticos ha sido una alternativa para prevenir la activacin inadecuada de esta enzima y evitar o aliviar enfermedades como la pancreatitis.En relacin a la presencia de inhibidores de tripsina en alimentos, estos sin duda causan una reduccin de la disponibilidad biolgica de aminocidos para su absorcin en el organismo, por lo que es necesario controlar la presencia de inhibidores en productos alimentarios para no comprometer la salud nutricional de los consumidores.

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