escuela de química y farmacia
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Escuela de Química y Farmacia INFORME DE INTERNADO REALIZADO EN REGULACIÓN Y ADMINISTRACION DE MEDICAMENTOS COMO PARTE DE LOS REQUISITOS PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO-FARMACÉUTICO LUGAR DE REALIZACIÓN: LABORATORIO NACIONAL DE CONTROL, ANAMED, INSTITUTO DE SALUD PÚBLICA. FECHA INICIO: 03/12/2013 FECHA TÉRMINO: 03/06/2014 TUTOR DEL INTERNADO: Q.F. RODRIGO BARRIGA GONZALEZ PROFESIONAL ANALISTA PROFESOR RESPONSABLE: PROF. DR. JULIO HUMBERTO DÖLZ
NICOLÁS ALEJANDRO IBÁÑEZ VÁSQUEZ VALDIVIA – CHILE
1
ÍNDICE
GLOSARIO……………………………………………………….…………………….2
ABREVIATURAS…………………………………………………………….………..4
RESUMEN……………………………………………………………………………...5
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………...6
1.1 Misión………………………………………………………………………………..7
1.2 Visión…………………………………………………………………………………7
1.3 Organigrama ANAMED……………………………………………………………8
1.4 Laboratorio Nacional de Control………………………………………………..…9
2. DESARROLLO…………………………………….…….…..………………10
2.1 Actividades Realizadas………………………………………………………........10
2.1.1 Preparación Bibliográfica……………………….……………………10
2.1.2 .Inducción……………………………………………………………...10
2.1.3 Capacitación HPLC…………………………………………………..11
2.1.4 Verificación Equipo HPLC………………………………….………12
2.1.5 Preparación de muestras de salbutamol….….……………………...13
2.1.6 Montaje Metodología Analítica………….….………………….……13
2.1.7 Validación Metodología Analítica………………….………………..14
2.2 Análisis FODA……………………………………………….…………………....28
2.3 Proyecciones para el profesional Químico Farmacéutico………………….…..30
3. CONCLUSIONES…………………………………………………………31
REFERENCIAS……………………………………………………………………….32
ANEXOS…………………………………………………………………….................33
2
GLOSARIO
Analito: Sustancia (química, física o biológica) buscada o determinada en una muestra, que
debe ser recuperada, detectada o cuantificada por el método.3
Coeficiente de variación de Horwitz: Es el coeficiente de variación definido por W. Horwitz.
Es utilizado para calcular un coeficiente de variación adecuado para los análisis en los que la
concentración del analito es muy pequeña.3
Control de serie: De acuerdo al DS 03/10, el Control de Serie se aplica a todos los
medicamentos biológicos de fabricación nacional o importados, antes de ser comercializados
en el país. Entre ellos se incluyen vacunas, sueros de origen humano y animal, hemoderivados,
biotecnológicos, hormonas, antibióticos y otros productos de origen biológico o no que el
Instituto de Salud Pública determine fundadamente.1
Depósito de Dosis: Se refiere a la cantidad de principio activo (un % de la dosis emitida) que
llega al sitio de acción en los pulmones (alvéolos).
Especificidad: Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultánea o
separadamente los analitos de interés de forma inequívoca sin interferencia de impurezas,
productos de degradación, compuestos relacionados, excipientes y otras sustancias presentes
en la matriz de la muestra.2
Exactitud: Expresa la proximidad entre el Valor que es aceptado convencionalmente como
valor verdadero, valor nominal, teórico o un valor de referencia y el valor encontrado
experimentalmente.2
Linealidad: Capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente (o por
medio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito en la
muestra dentro de un rango establecido.2
3
Metodología Analítica: Procedimiento que explica detalladamente todas las operaciones
necesarias para realizar un análisis concreto.2
Precisión: Capacidad de un método para proporcionar resultados próximos entre sí. Grado de
dispersión de los resultados analíticos respecto a su valor medio. Se puede evaluar en tres
niveles. Repetibilidad: Evalúa la precisión del método efectuando una serie de análisis sobre
la muestra en las mismas condiciones operativas (aparatos, reactivos, analista) en un mismo
laboratorio y en un periodo de tiempo corto; Precisión Intermedia: Evalúa la precisión del
método frente a variaciones internas del laboratorio (analista, día, instrumento, etc. Es la
precisión intralaboratorio; Reproducibilidad: Evalúa la precisión entre laboratorios
diferentes.2
Validación: Establecimiento de la evidencia documental que un procedimiento analítico
conducirá con un alto grado de seguridad a la obtención de resultados precisos y exactos
dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos.2
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ABREVIATURAS
LNC: Laboratorio Nacional de Control
ISP: Instituto de Salud Pública
ANAMED: Agencia Nacional de Medicamentos
CS: Control de Serie
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (cromatografía líquida de alta eficiencia)
BP: British Pharmacopoeia
USP: United States Pharmacopoeia
FR: Factor de Respuesta
CV: Coeficiente de Variación
DE: Desviación Estándar
P.A: Principio Activo
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RESUMEN
El informe describe todas las actividades realizadas en la sección físico-químicas del
subdepartamento Laboratorio Nacional de Control de la Agencia Nacional de Medicamentos
(ANAMED), perteneciente al Instituto de Salud Pública de Chile (ISP). Lugar en el que
distintos profesionales, entre ellos Químicos Farmacéuticos, Ingeniero Químicos,
Bioquímicos y Técnicos Analistas realizan controles de calidad a los medicamentos
comercializados en nuestro país según los distintos programas que poseen para ello.
Toda metodología de análisis de medicamentos instalada en el ISP debe estar validada para
poder ser ejecutada en el análisis de medicamentos, lo que permite garantizar que los análisis
se realizan de manera óptima y con resultados confiables. Esto tiene un gran impacto en la
salud pública, ya que puede significar el lanzamiento de un nuevo medicamento al mercado,
como en el caso de biotecnológicos que deben ser aprobados por el ISP antes de su salida al
mercado, o el retiro de otros medicamentos ya presentes en el mercado nacional.
Ahora bien, el proceso de validación de un método analítico, que en este caso fue destinado
a la identificación, valoración y depósito de dosis de salbutamol sulfato en inhalador, requiere
de la ejecución de múltiples pasos, entre ellos, una investigación bibliográfica, montaje de la
metodología analítica, y evaluación de distintos parámetros requeridos, según el tipo de
validación, como por ejemplo: estabilidad, especificidad, linealidad, precisión, exactitud,
intervalo, etc. La determinación de estos parámetros involucra una serie de tratamientos
estadísticos, los que fueron realizados como parte de este internado y que serán detallados a
continuación.
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1. INTRODUCCIÓN
El siguiente informe describe las actividades realizadas durante el periodo de internado
realizado en la sección fisicoquímica del Laboratorio Nacional de Control subdepartamento
de la Agencia Nacional de Medicamentos (ANAMED) unidad perteneciente al Instituto de
Salud Pública (ISP). Este internado cuya duración es de seis meses, y forma parte de los
requisitos para optar al título de químico farmacéutico, fue realizado entre los meses
Diciembre de 2013 y Junio de 2014.
El departamento Agencia Nacional de Medicamentos del Instituto de Salud Pública de
Chile fue creado el año 2011 bajo Resolución Exenta N° 334/2011 del Instituto de Salud
Pública y tiene entre sus funciones el control de los productos farmacéuticos, cosméticos y de
los dispositivos médicos autorizados por ley, que se fabrican localmente o se importan para
ser comercializados en el país, garantizando su calidad, seguridad y eficacia. Otorga las
autorizaciones sanitarias y registro de los medicamentos farmacéuticos y cosméticos. Además
de ejercer una fiscalización y vigilancia activa de los mismos. Controla la internación y uso
lícito de sustancias estupefacientes, psicotrópicas y de sus precursores, al tiempo, que
mantiene actualizadas las bases de datos que registran su uso en el país para responder a
convenios internacionales de control de dichas sustancias.1
La ANAMED del ISP está conformado por ocho subdepartamentos4: Subdepartamento de Registro y sanitarias Subdepartamento de Farmacia Subdepartamento de Inspecciones Subdepartamento Laboratorio Nacional de Control Subdepartamento de Biofarmacia y Bioequivalencia Subdepartamento de Farmacovigilancia Subdepartamento de Dispositivos médicos Subdepartamento de Estupefacientes y Sicotrópicos
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1.1 Misión
La misión del Departamento ANAMED de ISP es velar por la seguridad, eficacia y calidad
de los productos sujetos a control sanitario que se comercializan en el país.
Asegurar la calidad y al información de los medicamentos, cosméticos y los productos de
uso médico sujetos a control sanitario utilizados en Chile, desde su investigación hasta su
utilización, para contribuir al mejoramiento de la salud de la población.
Asegurarle a la población el acceso a medicamentos, cosméticos, dispositivos médicos de
seguridad, calidad y eficacia comprobada, cumpliendo con los requisitos legales y de calidad
aplicables.
Resguardar la salud de la población que accede a medicamentos y cosméticos a través del
control y la fiscalización de los diferentes procesos, desde las buenas prácticas
manufactureras, autorizaciones sanitarias y vigilancia de la pre y la post comercialización de
los productos.1
1.2 Visión
Posicionarse como agencia regulatoria nacional de excelencia, que vela por el control de
los productos farmacéuticos, cosméticos y dispositivos médicos sujetos a control sanitario que
se usan o comercializan en el país y, también por la calidad de los mismos que son exportados.
Agencia reconocida a nivel internacional por las organizaciones rectoras de la salud a nivel
regional y mundial. De elevado prestigio y apreciada por sus pares, por sus regulados y por
toda la población del país.
Potenciar la interacción y la cooperación con los actores internacionales que se relacionan
con los medicamentos, cosméticos y los productos de uso médico sujetos a control sanitario
utilizados en Chile: Organización Mundial de la Salud (OMS), Organización Panamericana
de la Salud (OPS), Agencias de Medicamentos, Ministerio de Salud, autoridades ministeriales
y de Gobierno, profesionales de la salud, Universidades y sociedades científicas.1
8
1.3 Organigrama ANAMED1
9
1.4 Laboratorio Nacional de Control.
El subdepartamento Laboratorio Nacional de Control, efectúa el control de calidad de los
productos farmacéuticos sometidos a control sanitario. Esta labor se realiza en calidad de
Laboratorio Oficial del Estado en estas materias, sobre la base de la información técnica
disponible y de acuerdo con los requisitos normativos que establece la ley o el reglamento, de
esta forma durante el año se realizan distintos tipos de programas que permitan asegurar la
calidad de los productos farmacéuticos contando con la tecnología apropiada y actualizada
para realizar los análisis fisicoquímicos, microbiológicos y biológicos de los medicamentos
en prueba. También se cuenta con la posibilidad de utilizar los servicios de instituciones
externas (universidades, laboratorios externos de control de calidad, etc.) que posean la
infraestructura adecuada, cuando el análisis requiera mayor complejidad.5
Entre los programas destinados al control de calidad, tanto de medicamentos
comercializados como aquellos que aún no salen al mercado, se encuentran Control de Serie
(CS), Control de Estantería y Muestras Legales por Denuncias.1
Es en este subdepartamento donde fue realizado el internado y cuyo objetivo fue ejecutar
la validación de una metodología analítica para la identificación, valoración y cuantificación
por depósito de dosis de productos terminados conteniendo Salbutamol Sulfato como P.A. la
forma farmacéutica de inhalador (sometido a CS) utilizando técnica de HPLC. Este producto
forma parte del programa de “Control de Serie del laboratorio nacional de control”.
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2. DESARROLLO
2.1 Actividades realizadas.
2.1.1 Preparación bibliográfica. Esta actividad consiste en revisar en profundidad bibliografía (libros, farmacopeas, papers,
etc.) relacionada con el tema a tratar, de manera de obtener nuevos conocimientos y refrescar
los ya adquiridos, esto con el objetivo de realizar de manera óptima las tareas que serán
asignadas a futuro y resolver los posibles problemas que estas conlleven. Este es un paso muy
importante y que deben realizar todos los alumnos que realizan actividades en la institución y
está determinado según la labor a realizar (elaboración de instructivos, planillas, hojas de
trabajo, validaciones, gestión de calidad, etc.).
Para ello el subdepartamento Laboratorio Nacional de Control cuenta con una pequeña
biblioteca con material específico para la sección, destinado a los profesionales, técnicos y
alumnos que allí se desempeñan.
Entre la bibliografía consultada se encuentran British Pharmacopoeia 2012 (BP 2012),
Introduccion a la HPLC de Oscar Quatrocci, Estadística y Quimiometría de Miller y Miller,
revisiones bibliográficas, USP36, manuales de equipos, instructivos de la institución. Esta
revisión es orientada a la ejecución de la validación de la metodología analítica para
identificación, valoración y cuantificación por depósito de dosis de salbutamol sulfato en
inhaladores. Este proceso tuvo una duración aproximada de 4 semanas.
2.1.2 Inducción. La inducción es realizada a profesionales, técnicos y alumnos que ingresan a la institución
y consiste en la capacitación en procedimientos generales y específicos tales como:
Conocimiento de la institución: fue realizado por un profesional Químico Farmacéutico
encargada de gestión de calidad. En esta inducción se entregan datos generales de la
institución así como algunas directrices, instrucciones, procedimientos, instructivos, registros,
etc.
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Seguridad al interior del laboratorio: fue realizada por un profesional Ingeniero Químico,
jefe de seguridad al interior del laboratorio. En esta inducción se dan a conocer las medidas
de seguridad necesarias (cofia, delantal, guantes, mascarilla, entre otros) para entrar al
laboratorio a realizar las diversas tareas encomendadas, así como procedimientos en casos de
emergencia, derrames, accidentes, los que se encuentran en un instructivo de seguridad
debidamente foliado y aprobado por la dirección del subdepartamento. Finalmente se debe
realizar una evaluación para medir los conocimientos adquiridos, la cual debe ser aprobada.
Uso de balanzas analíticas: a cargo de un profesional Químico Farmacéutico encargado de
la sala de balanzas analíticas. En esta capacitación se adquieren los conocimientos mínimos
necesarios para poder hacer uso de las balanzas (ubicadas en una sala especialmente dedicada
a la pesada de estándares y reactivos), de manera de asegurar una estandarización en el
procedimiento de pesada para reactivos y estándares. Esto según un instructivo de uso de
balanzas foliado y debidamente autorizado por el jefe de sección. Luego de este se debe
realizar una evaluación para medir los conocimientos adquiridos, esta debe ser aprobada para
poder utilizar los instrumentos de pesada.
Uso de pH-metro: a cargo de un profesional Ingeniero Químico encargado de equipos
menores. En esta capacitación se aprende a utilizar de manera correcta el pH-metro así como
la ejecución diaria de la verificación, y los registros que deben realizarse luego de su uso.
Todo esto según un instructivo de uso y verificación de pH-metro foliado y autorizado por el
jefe de sección. Al igual que las capacitaciones anteriores se debe realizar una evaluación que
debe ser aprobada para poder hacer uso del equipo.
2.1.3 Capacitación HPLC. La capacitación en el equipo HPLC fue hecha por un profesional Químico Farmacéutico quien
es el encargado del equipo a utilizar, y tuvo una duración aproximada de una semana. En esta
capacitación se repasaron los conceptos básicos de cromatografía, partes y funciones del
equipo, uso del software, uso de columnas, tratamiento de muestras a inyectar,
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implementación de metodologías analíticas, uso de bitácoras y otros registros. Luego de
realizada esta capacitación se puede trabajar en el equipo HPLC.
2.1.4 Verificación equipo HPLC. La verificación consiste en evaluar el desempeño de los equipos HPLC, con diversas
pruebas, de manera de asegurar el funcionamiento óptimo de todos los componentes del
equipo y es llevado a cabo por los profesionales Químico Farmacéuticos, o por alumnos bajo
la supervisión de los profesionales encargados de los equipos, según un instructivo de
verificación de equipos HPLC (Shimadzu Prominence en este caso) foliado y aprobado por el
jefe de sección.
Entre las pruebas realizadas se encuentran6:
Registro Modelo - N° inventario – N° de Serie
Chequeo documentación equipo
Verificación de funcionamiento
Verificación de Encendido
Verificación de conexión PC/Software
Verificación Alarma Sobre Presión –Hermeticidad (test de fuga)
Verificación Alarma de Baja Presión
Verificación de Sensores de Fuga
Verificación de Flujo
Verificación de Exactitud Temperatura del Horno
Verificación del Muestreador Automático (autosampler)
Verificación de Horas de Uso de Lámparas
Verificación de Exactitud de Longitud de Onda e Intensidad de Lámparas.
Verificación de Exactitud Temperatura del Sampler Cooler, si procede.
Verificación de Mezcla de Gradiente
Verificación Linealidad del Detector
Este proceso se realiza cada 6 meses o en casos en que el equipo ha sido trasladado hacia
otro lugar y dura aproximadamente 10 días. Si el equipo cumple de manera satisfactoria con
todas las pruebas mencionadas anteriormente puede ser utilizado para realizar los análisis
correspondientes.
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En este caso se realizó la verificación de dos equipos HPLC Shimadzu Prominence. El
primero bajo la directa supervisión y compañía de un profesional Químico Farmacéutico con
una duración de 10 días. El segundo bajo supervisión parcial del encargado del equipo, de
manera de poner en práctica la totalidad de los conocimientos adquiridos durante la
capacitación en HPLC. Esta segunda verificación tuvo una duración de dos semanas.
2.1.5 Preparación de muestras de salbutamol. Previo al montaje de un método analítico para el análisis de salbutamol, es necesario
conocer el modo de ejecución del procedimiento de preparación de muestras para su
valoración y cuantificación por depósito de dosis de inhaladores, por lo que se realizó una
capacitación en este ámbito a cargo de un Químico Farmacéutico experto en el análisis de
muestras en esta forma farmacéutica. Ver anexo 1: Metodología, Valoración y depósito de
dosis.
2.1.6 Desarrollo y montaje Metodología Analítica. Antes de comenzar con la validación propiamente tal, es necesario probar que la
metodología elegida funciona adecuadamente para el producto en cuestión, en este caso
salbutamol sulfato en inhalador.
Luego de varios intentos fallidos por montar una metodología adecuada se determinó que
las características óptimas serían las siguientes:
Fase Móvil: Metanol: Acetato de amonio 0,1% (55:45)
Flujo: 1mL/min
Longitud de onda λ: 276 nm
Volumen de inyección: 20µL
Solvente de disolución: Fase Móvil
Columna: XBridge 250 x 4,6mm C18. Tamaño de particula 5µm.
Las condiciones cromatograficas fueron obtenidas de la farmacopea británica (BP),
monografía salbutamol, a las que se le realizaron algunas modificaciones.
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2.1.7 Validación Metodología Analítica. El proceso de validación de un método de análisis, ya sea de carácter prospectivo,
retrospectivo o de revalidación, consiste en demostrar experimentalmente, la funcionalidad
del método para las aplicaciones analíticas propuestas, como también en obtener la evidencia
documentada del procedimiento seguido, lo cual debe corresponder a un diseño experimental,
a un tratamiento estadístico de datos apropiado y a unos criterios de aceptación acorde con el
tipo de análisis. La validación de los métodos analíticos se fundamenta en la determinación
de diversos parámetros, que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezca el
compuesto a analizar7.
Según la USP los métodos analíticos se clasifican en las siguientes categorías para su
validación:
• Categoría I: métodos analíticos para la cuantificación de los componentes principales de
fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos
farmacéuticos terminados.
• Categoría II: métodos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a granel
o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Estos métodos incluyen
análisis cuantitativos y pruebas de límite.
• Categoría III: métodos analíticos empleados para evaluar las características de desempeño
(por ejemplo, disolución, liberación del fármaco).
• Categoría IV: pruebas de identificación.
La siguiente Tabla da a conocer los parámetros a considerar para la validación de un
método analítico dependiendo de la categoría a la que pertenece el compuesto en estudio.
Parametros requeridos para la validación según USP8
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La validación se realizó según la metodología de análisis descrita en la monografía de
salbutamol sulfato de la BP 20129 (con algunas modificaciones) para HPLC, aplicando los
criterios de validación de la Categoría I USP.
Las pruebas realizadas fueron las siguientes: Pruebas de aptitud del sistema, estabilidad,
especificidad, linealidad, precisión y exactitud.
Pruebas de aptitud del sistema.
Luego de montar una metodología que cumplió satisfactoriamente con la identificación
de salbutamol se realizaron las pruebas de aptitud del sistema definidas por la USP.
Para ello se preparó una solución estándar de salbutamol sulfato a la concentración de
trabajo (0,01mg/mL) y se inyecto en el equipo HPLC para su análisis.
Las pruebas de aptitud del sistema realizadas fueron las siguientes:
Número de platos teóricos (N): el número de platos teóricos es una medida de la
eficacia del sistema cromatográfico. El cálculo del número de platos teóricos se
basa en la relación entre el tiempo de retención y la anchura del peak
cromatográfico. Lo mínimo necesario son 20007 platos teóricos, con esta columna
se obtuvieron 3550, por lo que cumple con esta prueba.
Factor de asimetría o de cola (Tailing): la asimetría es una medida de la asimetría
de la señal generada por el analito. El tailing debe ser inferior a 27, y el resultado
fue 1,5 aprox, por lo que cumple con esta prueba.
Estabilidad de la solución.
Para demostrar que la solución (estándar) permanece estable durante un determinado
período de tiempo es necesario conocer su comportamiento luego de ser preparada y
almacenada bajo determinadas condiciones.
Para realizar el estudio de estabilidad se preparó una solución estándar de salbutamol
sulfato a la concentración de trabajo (0,01mg/mL aprox) de la cual se realizaron 5 lecturas o
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determinaciones por día durante 5 días, guardando la solución en refrigerador, protegida de la
luz y humedad. A las 5 lecturas de cada día se les determinó el CV, el cual debe ser < 2.0%7.
A las lecturas del día 1 más las lecturas del día 2 en su conjunto se les determinó el CV,
el cual debe ser < 2.0 %. Este proceso se realizó con los resultados de cada día, comparándolos
cada vez con los del primer día 1.
Resultados: TABLA #1
Día Promedio
áreas
Promedio
FR
DE área CV área
%
De ER CV FR
%
1 66175,2 6630781,6 163,05 0,25 16337,2 0,25
2 66267,4 6640020,04 135,3 0,2 13556,7 0,2
3 66021,6 6615390,8 217,7 0,33 21813,4 0,33
4 65528 6565911,8 272,4 0,42 27298,3 0,42
5 65754,8 6588657,3 125,3 0,19 12555,9 0,19
TABLA#2 TABLA#3
Calificación: Cumple Calificación: Cumple
TABLA#4 TABLA#5
Calificación: Cumple Calificación: Cumple
Los resultados del estudio de estabilidad fueron satisfactorios, por lo tanto, se pudo
determinar que la Metodología cumple con el parámetro de Estabilidad.
Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 2
Área FR Promedio 66221,3 6635400,802 DE 149,37 14967,07 % CV 0,23 0,23
Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 3
Área FR Promedio 66098,4 6623086,17 DE 198,57 19897,24 % CV 0,30 0,30
Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 5
Área FR Promedio 65965,0 6609719,43888 DE 260,55 26107,37 % CV 0,39 0,39
Tomando los 5 valores del día 1 y los 5 del día 4
Área FR Promedio 65851,5 6598346,69 DE 401,53 40233,49 % CV 0,61 0,61
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Especificidad.
Se busca demostrar que la metodología en cuestión es específica para el analito
(salbutamol sulfato) y que no aparecen interferentes en el análisis de este2.
Para el estudio de especificidad de la metodología se ejecutaron las siguientes acciones7:
Estudio de la Metodología Analítica, de la molécula a analizar.
Revisión bibliográfica de los excipientes para determinar si leen a la misma longitud
de onda o si presentan alguna incompatibilidad con el analito en estudio.
Lectura (en equipo HPLC) del solvente (fase móvil), en las mismas condiciones de
diluciones que la muestra.
Lectura del solvente con una gota de detergente.
Lectura del estándar a la concentración de trabajo (0,01mg/mL).
Lectura de cada una de las muestras disponibles para ver su comportamiento.
Determinación del tiempo de retención, inspección visual de cromatogramas, etc.
Resultados:
TABLA#6
Muestra Señal TR Área
Blanco
(solvente)
No presenta señal
Solvente +
Detergente
No presenta señal
Estándar
Salbutamol
Sí
2,768
64462
Muestra 1 Sí 2,759 75747
Muestra 2 Sí 2,766 86509
Muestra 3 Sí 2,769 77528
Muestra 4 Sí 2,765 84284
Muestra 5 Sí 2,764 76372
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Luego de comprobar que las señales presentes en el cromatograma tienen el mismo tiempo
de retención, la ausencia de interferencia de las soluciones blanco y blanco + detergente y que
las áreas de las muestras están “dentro de lo esperado” se pudo determinar que la metodología
analítica cumple con el parámetro de especificidad
Linealidad.
El objetivo de este estudio es demostrar que la concentración es directamente proporcional
a la respuesta entregada por el equipo (área) dentro de un determinado intervalo de
concentración2.
El análisis de Linealidad se realizó de manera concomitante con el estudio de precisión. El
rango de trabajo fue determinado por el ensayo que tiene el criterio de aceptación más amplio,
en este caso, para depósito de dosis el límite inferior es 35% y 80% el superior; y para
valoración el límite inferior es 80% y el superior es 120% de la concentración de trabajo
(0,01mg/mL), vale decir, 0,0035 mg/mL y 0,012mg/mL respectivamente. Debido a que el
estudio de linealidad debe abarcar estas concentraciones se determinó que el rango de análisis
debía estar entre 0,0015mg/mL y 0,0140mg/mL (15%– 140 %), con 7 niveles de
concentración y de los cuales se realizó 5 lecturas de cada uno. En cada nivel el CV debe ser
inferior a 4%.
Nota: En general cada punto de la curva se prepara a partir de una solución madre
realizando las diluciones correspondientes. Pero en este caso como se realizó en conjunto
con la precisión se prepararon 3 soluciones con tres pesadas independientes, de las cuales se
obtuvieron las 7 soluciones de los 7 niveles de concentración.
Los niveles de concentración fueron los siguientes:
0,01400 mg/mL o 140%
0,01190 mg/mL o 120%
0,01002 mg/mL o 100% (concentración de trabajo)
0,00802 mg/mL o 80%
0,00512 mg/mL o 50%
0,00307 mg/mL o 30%
0,00154 mg/mL o 15%
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El test se considera conforme si:
El coeficiente de correlación (r) es igual o superior a 0,95.
La representación gráfica concentración v/s área tiene aspecto lineal.
Test de Student: texp>ttabla con n-2 grados de libertad y 95% de confianza.
Resultados:
TABLA#7
Nivel Concentración
mg/mL Promedio
Área Área*10^5 Porcentaje FR 1 0,01400 95107 9,51E-01 99,8 679486602,4 2 0,01190 80854 8,09E-01 99,8 679591751,4 3 0,01002 68058 6,81E-01 99,7 678888887,8 4 0,00802 54286 5,43E-01 99,4 676888869,8 5 0,00512 34859 3,49E-01 100,0 680878325,9 6 0,00307 20706 2,07E-01 99,0 674057667,0 7 0,00154 10452 1,05E-01 99,9 680503306,8 0,00767 Promedio 99,7 678613630,2 0,0005403 DE 0,35 2388371 5 % CV 0,35 0,35
A. Evaluación coeficiente de correlación y determinación.
La curva de regresión se determinó por el método de los mínimos cuadrados. En el eje de
la “x” aparece la concentración de analito y en el eje “y”, la repuesta analítica, en este caso
área (por tratarse de un método cromatográfico).
TABLA#8
Estadísticas de la regresión Calificación Coeficiente de correlación r 0,99999 Cumple Coeficiente de determinación r^2 0,99999 Cumple Error típico Sy/x 0,0011 Nº Determinaciones 7 Pendiente 67,9740 Intercepción eje Y -0,00067 Desviación estándar del intercepto Sa (eje Y) 0,0009
t student (n-2) 5 2,5706
Intervalo confianza Valor Min
Valor Max Cumple: Intervalo de
confianza del intercepto incluye el cero del Intercepto eje Y
+ 0,0027 -0,0033 0,0020
20
B. Evaluación aspecto lineal del gráfico.
FIGURA#1
Calificación: Cumple
C. Prueba t-student.
Si el coeficiente de determinación r2 < 0,9974 se hace prueba t de Student a dos colas con
n-2 grados de libertad y un 95 % de confianza7.
texp = r x √(n-2) √(1-r2)
Donde: r = Coeficiente de Correlación r = 0,999995 r2 = Coeficiente de Determinación r2 = 0,999989 n = Numero de niveles de la curva de Calibración n = 7
Si el valor “t experimental” es mayor que el valor de “t de tabla” se rechaza la hipótesis
nula y se concluye que hay correlación entre X e Y7.
H0 = no existe correlación entre X e Y
H1 = existe correlación entre X e Y
TABLA#10
Prueba t Student Valor Calificación t experimental 685,4162 Cumple t de tabla 5 2,5706
Luego de ejecutar los test estadísticos se pudo concluir que la metodología analítica
cumple con el parámetro de linealidad en el rango 15% a 140% de la concentración de trabajo.
y = 67,974x - 0,0007R² = 1
0,00E+00
2,00E-01
4,00E-01
6,00E-01
8,00E-01
1,00E+00
0,0000 0,0050 0,0100 0,0150
Are
a
Concentracion (mg/ml)
Grafica Concentracion v/s Area
21
Precisión.
El objetivo de este estudio es medir el grado de repetibilidad del método analítico realizado
en condiciones normales.
Para el estudio de la precisión se determinó la repetibilidad y la precisión intermedia. Para
ello se efectuaron 6 determinaciones (lecturas) o inyecciones de 3 niveles, cada uno preparado
con una pesada independiente y cuya concentración se encuentra dentro del intervalo de la
linealidad, incluyendo el 100% y repitiendo el proceso en dos días distintos. Por esto los
niveles seleccionados fueron 15% - 100% - 140%. Las 3 soluciones del día 1 fueron utilizadas
también en el estudio de la linealidad.
Lo resultados fueron los siguientes:
TABLA#11
Día Nivel Promedio áreas
Promedio % Recuperación
Promedio FR
DE área
CV % área
DE FR CV % FR
1
15% 10450,3 100,10 6803947,9 46,30 0,44 30146,0 0,44 100% 68052,8 99,87 6788373,5 30,71 0,05 3063,1 0,05 140% 95149,7 100,01 6797885,7 305,7 0,32 21841,7 0,32
2
15% 10317,5 99,89 6790263,6 69,16 0,67 45518,2 0,67 100% 67450 99,18 6741662,8 171,5 0,25 17142,4 0,25 140% 94900,2 99,74 6780060,4 415,9 0,44 29718,3 0,44
Para evaluar si la metodología analítica cumple con el parámetro de precisión se efectúa la
comparación de medias de los porcentajes de recuperación de ambos días por cada nivel.
A. Comparación de medias.
Se compara el valor del estadístico "t experimental" con el valor crítico de "t de tabla",
para un nivel de significancia de 0,95 y (n1 + n2 -2) grados de libertad (a dos colas). Si t <
tcrítico no existe diferencias significativa entre las dos medias7.
B. Comparación de varianzas.
El valor de “F calculado” debe compararse con el valor “F crítico” (obtenido en tablas o en
Excel) para el nivel de significancia correspondiente (0,95) y los grados de libertad referidos
a la varianza del numerador n1-1 y del denominador n2-1. Si Fcrítico es mayor que F calculado
22
se concluye que no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las varianzas de
los dos conjuntos de datos. Si las varianzas son iguales se realiza el test de Student. Si las
Varianzas son distintas se aplica el test de Cochran.
En ambos casos se cumple el test si el “t experimental” es menor o igual al “t crítico” y a
“t'”7.
TABLA#12 TABLA#13
TABLA#14
Comparación de Medias Solucion Nivel 3Día 1 Día 2
Media 100,10 99,89Varianza 0,197 0,448Nº Determinaciones 6 6
F critico (tabla) 4,28F calculado 2,2799Varianza Común 0,323Grados de libertad 10
Estadístico t 0,4288
Valor crítico de t (2 colas) 2,2281
0,4288
Valor t` Cochran (2 colas) 2,57058
Varianzas Iguales
Comparación de Varianza
Estadístico t experimental No Considerar
para Analisis
Calificación t'
Varianzas Iguales
Cumple
Cumple
Varianzas Distintas
Considerar para Analisis
Calificación t
Comparación de Medias Solucion Nivel 1Día 1 Día 2
Media 100,01 99,74Varianza 0,10 0,19Nº Determinaciones 6 6
F critico (tabla) 4,28F calculado 1,8513Varianza Comun 0,1472Grados de libertad 10
0,5997
Valor crítico de t (2 colas) 2,2281
0,5997
Valor t` Cochran (2 colas) 2,57058
Varianzas Iguales
Varianzas Iguales
Estadístico t experimental
Estadístico t experimental
Varianzas Distintas
Considerar para Analisis
Comparación de Varianza
Calificacion t Cumple
No Considerar
para AnalisisCalificacion t' Cumple
Comparación de Medias Solucion Nivel 2Día 1 Día 2
Media 99,87 99,18Varianza 0,00 0,06Nº Determinaciones 6 6
F critico (tabla) 4,28F calculado 31,319Varianza Comun 0,0328Grados de libertad 10
Estadístico t 1,6563
Valor crítico de t (2 colas) 2,2281
1,6563
Valor t` Cochran (2 colas) 2,57058
Varianzas Iguales
Varianzas Distintas
Calificacion tVarianzas Distintas
Cumple
Comparación de Varianza
No Considerar
para Analisis
Calificacion t' Cumple
Considerar para Analisis
Estadístico t experimental
23
Con estos test estadísticos se pudo determinar que no existen diferencias significativas
entre las varianzas y las medias en ambas mediciones, por lo tanto se puede establecer que la
metodología analítica cumple con el parámetro de Precisión entre los niveles 15% y 140% de
la concentración de trabajo.
Exactitud
La exactitud fue estudiada dentro del rango de la linealidad (realizada previamente); esta
se realizó en 3 niveles de concentración y con 3 lecturas para cada nivel. Los niveles de
concentración son inferior, medio y superior del intervalo de linealidad establecido. Los
niveles determinados fueron 35% - 95% - 140%.
Para ello se preparó una solución estándar control cercano al 100% (0,01mg/mL),
realizando 5 lecturas de esta concentración.
Posteriormente se preparó un “Blanco Madre” tomando una cantidad de muestra
representativa de cada producto en estudio (10 impactos de cada inhalador) de manera de
obtener una solución con muestras cercana a la concentración de trabajo (0,01 mg/mL); de
esta solución (blanco madre) se tomó una alícuota y se preparó un “blanco de trabajo”, del
cual se realizaron 3 lecturas (para la preparación del blanco de trabajo se considera la cantidad
de principio activo declarada en la muestra, para que la solución este cercana al límite inferior
de la curva de calibración). Vale decir, la concentración del blanco madre es 0,01 mg/mL y la
del blanco de trabajo es aproximadamente 0,0015 mg/mL.
Luego se realizaron tres pesadas independientes de estándar para preparar los tres niveles
de concentración (35%, 95% y 140%) a cada una de las soluciones estándar, posteriormente,
se le adicionaron cantidades iguales del blanco madre (15 mL a cada nivel). De cada solución
se realizaron tres lecturas independientes. Las concentraciones de cada nivel deben lograrse
sumando la cantidad de estándar con la del blanco madre adicionado.
Esto es: Solución estándar 1 + Blanco madre = 34,9%;
Solución estándar 2 + Blanco Madre = 95,2%;
Solución Estándar 3 + Blanco madre = 139,7%.
A las lecturas de las soluciones de estándar + blanco madre se le resta la lectura realizada
a la solución del blanco de trabajo, obteniendo de esta manera la lectura que se genera por el
estándar en cada nivel. Esta lectura es indicativa de la cantidad de estándar encontrado en el
24
ensayo y debe ser comparada con la cantidad real añadida para determinar el porcentaje de
recuperación.
Se considera que la metodología cumple con el parámetro de exactitud si7:
Cada una de las lecturas realizadas está en el rango 96 - 104 % (%recuperación) y el
promedio de los niveles se encuentra dentro del rango 98 -102 % (%recuperación).
Se realiza una prueba de “t” de Student de acuerdo con la siguiente ecuación:
tEXP = |100 – R| . x √n CV
Dónde: tEXP es el valor experimental de t, R es el porcentaje recuperado, n (n
=9) es el número de determinaciones y CV el coeficiente de variación.
El valor de tEXP debe ser menor que el valor tabulado de t, con n-1 grado de libertad,
para poder afirmar que ambos valores no difieren significativamente para el nivel
de significación de 0,950.
El coeficiente de regresión debe ser mayor o igual que 0,995 y la pendiente mayor o
igual a 0,95 en la gráfica de la cantidad encontrada v/s la cantidad agregada.
Si el método es muy preciso (CV bajo), se utiliza 100 + 4S. Siendo S la mayor
desviación estándar obtenida en el cálculo de la precisión intermedia, expresada en
porcentaje. Se cumple el test si el promedio de la recuperación (en porcentaje) para n
determinaciones, está dentro de 100 + 4S.
Resultados: Solución estándar Concentración: 0,0100199 mg/Ml
TABLA#14 Área STD FR Promedio 68375,00 6823906,78 DE 232,10 23163,98 % CV 0,34 0,34
Blanco de Trabajo Concentración: 0,0018 mg/Ml
TABLA#15 Área Blanco FR Promedio 12726,33 7070185,2 DE 10,60 5888,19 % CV 0,08 0,08
25
Estándar Nivel 1+ Blanco (139,7%)
Concentración Estándar Agregado: 0,0124 mg/mL Concentración Final Estándar + Blanco Madre: 0,0142 mg/Ml TABLA#16
Área Std + Blanco
Área blanco de
trabajo
Área del estándar agregado
Concentración std encontrada
(mg/mL) Promedio 96663,67 12726,33 83937,33 0,01230
DE 174,08 10,60 174,08 0,00002 % CV 0,18 0,08 0,21 0,21
Estándar Nivel 2 + Blanco (95,2%)
Concentración Estándar Agregado: 0,0080mg/mL Concentración Final Estándar + Blanco Madre: 0,0098 mg/ml TABLA#17
Área Std + Blanco
Área blanco de
trabajo
Área del estándar agregado
Concentración std encontrada
(mg/mL) Promedio 67348,33 12726,33 54622,0 0,00800
DE 282,23 10,60 282,23 0,00004 % CV 0,42 0,08 0,52 0,52
Estándar Nivel 3 + Blanco (34,9%)
Concentración Estándar Agregado: 0,00199 mg/mL Concentración Final Estándar + Blanco Madre: 0,00379 mg/Ml
TABLA#18
Área Std + Blanco
Área blanco de trabajo
Área del estándar agregado
Concentración std encontrada (mg/mL)
Promedio 26100,67 12726,33 13374,33 0,00196 DE 17,67 10,60 17,67 0,000003 % CV 0,07 0,08 0,13 0,13
26
Promedio porcentajes de recuperación. TABLA#19
Nivel de
Trabajo
Concentración
std agregado
Concentración
std encontrado
Promedio%
Recuperación
Calificación
1 0,01247 0,012300 98,6 Cumple 2 0,0080159 0,008005 99,9 Cumple 3 0,001992 0,001960 98,4 Cumple Promedio 98,96
Cumple DE 0,79 CV % 0,79
A. Prueba t-student.
Prueba t Student Calificación t experimental 4,170 No Cumple t de tabla 2,306
B. Regresión y pendiente.
TABLA#20
Estadísticas de la regresión Calificación Coeficiente de correlación r 0,99994 Cumple Coeficiente de determinación r^2 0,99988 Cumple Error típico Sy/x 0,0001 Nº Determinaciones 3 Intercepción eje Y 0,0000 Pendiente 0,98783 Cumple
C. Evaluación gráfico estándar encontrado v/s estándar agregado.
FIGURA#2
Calificación: Cumple
27
D. Prueba 4S
TABLA#21
Calificación
Desviación estándar mayor P. Intermedia 415,97 nivel 1 día 2
% Promedio recuperado (n=9) 98,96 Intervalo + 4S 1663,88
Valor Min Valor Max Rango de aceptación (100 + 4S) -1563,88 1763,88 Cumple
Luego de realizar los test estadísticos se determinó que el método analítico no cumple con
el parámetro de exactitud según la prueba t-student, sin embargo, cumple con la prueba de 4
desviaciones estándares. Esto se debe a que el método puede ser muy preciso y su curva no
sea la típica de una distribución normal. De esta manera y considerando los otros test
estadísticos (regresión, recuperación, etc.) se considera que cumple con el parámetro de
exactitud.
Intervalo
El Intervalo es determinado utilizando los resultados obtenidos en los parámetros
linealidad, precisión (repetibilidad y precisión intermedia) y la exactitud. El intervalo está
determinado por aquel parámetro que posea el rango de trabajo más estrecho7.
Resultado Linealidad
Rango Linealidad 0,001536 mg/ml a 0,013997 mg/ml
Aproximadamente 15,35 % a 139,97%
Resultado Precisión
Rango Repetibilidad 0,001536 mg/ml a 0,013997 mg/ml Aproximadamente 15,35 % a 139,97%
Rango Precisión Intermedia 0,001512 mg/ml a 0,013997 mg/ml
Aproximadamente 15,12% a 139,97 %
28
Resultado Exactitud
Rango Exactitud 0,0034920 mg/ml a 0,013970
Aproximadamente 34,92 % a 139.7 %
Determinación Intervalo
Intervalo 0,0034920 mg/ml a 0,013970
Aproximadamente 34,92 % a 139.7 %
El intervalo obtenido para la Metodología Analítica de Salbutamol, (34,92 % a 139,7
%, de la concentración de trabajo (0,01 mg/mL), incluye las concentraciones teóricas
esperadas para las muestras y donde el método analítico es lineal, preciso y exacto.
Para el resumen de los resultados de la validación véase Anexo 2. Reporte de Validación.
2.2 Análisis FODA
Fortalezas:
Entre las fortalezas que posee ANAMED cabe destacar la existencia de un programa de
mejoramiento continuo de la calidad, el que es actualizado constantemente según sea
requerido, para ello se realizan, frecuentemente, auditorías internas, las que son realizadas por
profesionales de la misma institución pero de otros departamentos.
Además este departamento cuenta con profesionales altamente calificados para
desempeñar su labor, quienes se capacitan constantemente, ya sea dentro o fuera de la
institución, de manera de estar a la vanguardia en el uso de tecnologías recientes aplicadas al
análisis de productos que se encuentran o están por salir al mercado.
Otro punto a destacar es el grado de equipamiento que posee, es decir, se cuenta con
instrumental analítico de última tecnología, lo que permite dar frente a cualquier desafío que
se imponga.
29
Oportunidades:
Dentro de las oportunidades de se encuentran las futuras inversiones que se realizaran en
el subdepartamento de ANAMED como parte de un proyecto de ampliación de funciones,
para lo cual se crearan más programas de control para los distintos productos que aún no están
sometidos a control de calidad, vale decir, ciertos cosméticos, alimentos de uso médico,
suplementos alimenticios, entre otros.
También se encuentran en este ítem los procesos de acreditación frente a organizaciones
internacionales como la OMS, de manera de llegar a convertirse en un centro de referencia a
nivel internacional.
Debilidades:
Una de las principales debilidades de la Agencia Nacional de Medicamentos es la lentitud
con la que se lleva a cabo la ejecución de los distintos programas ya sea de control, inspección,
o aprobación de medicamentos nuevos. Esto tiene al menos un par de causas y que serían:
Retrasos en la entrega de recursos, lo que dificulta de sobremanera el cumplimiento
de metas de los distintos programas realizados por la institución, esto se debe
principalmente al engorroso y burocrático proceso obtención de recursos estatales.
Y el déficit de profesionales Químicos Farmacéuticos con el que se encuentra la
institución ya que la demanda de servicios por parte de la industria, servicios de salud,
entre otros, es superior al rendimiento de la institución.
Amenazas
La principal Amenaza que enfrenta ANAMED está relacionada con el “NO ser una entidad
autónoma”, es decir depende completamente de los lineamientos que determine el gobierno
durante su respectivo período. Esto trae como consecuencia la interrupción abrupta o
estancamiento de proyectos, programas, mejoras de gestión, etc. Y además se generan
cambios constantes en los objetivos de trabajo.
30
2.3 Proyecciones para el profesional Químico Farmacéutico
Las proyecciones para los profesionales Químico Farmacéuticos en este campo son
bastante alentadoras, ya que son cada vez más los productos farmacéuticos fabricados,
importados y comercializados en nuestro país, lo que conlleva estar al día con las nuevas
tecnologías y tendencias de la industria, de manera de asegurar la calidad, mediante controles
periódicos, tanto de los productos como en su proceso de manufactura. Además el proyecto
ANAMED contempla a mediano plazo la independencia total de su matriz, el ISP, lo que
amplía el horizonte y permite la generación de proyectos de ampliación de funciones, de
mejoras en infraestructura y de contratación de nuevos profesionales, principalmente
Químicos Farmacéuticos.
31
3. CONCLUSIONES
De ANAMED
Luego de los seis meses de duración del internado en ANAMED se pudo apreciar el arduo
trabajo que significa el velar por la seguridad, eficacia y calidad de los productos sujetos a
control sanitario que se comercializan en Chile; y que involucra a un equipo multidisciplinario
de profesionales, tales como Bioquímicos, Veterinarios, Ingenieros Químicos, Técnicos
analistas y por supuesto Químicos Farmacéuticos, cuyo rol es fundamental e indispensable en
este tipo de instituciones, puesto que de los anteriormente mencionados son los únicos que
pueden interpretar de manera certera los estudios que allí se realizan.
También se pudo apreciar lo importante que resulta la capacitación y actualización continua
de manera de estar a la vanguardia y poder exigir a la industria los máximos estándares de
calidad en sus productos.
De la validación.
Luego de la ejecución de todos los pasos mencionados en el desarrollo se puede
declarar que la validación exitosa de una metodología analítica es un proceso que requiere de
una exhaustiva preparación para familiarizarse tanto en los procedimientos propios de la
validación (estudios de estabilidad, especificidad, linealidad, precisión, exactitud), como en
estadística paramétrica, de manera de poder interpretar los resultados de los estudios
previamente mencionados.
Cabe destacar la gran importancia que tiene la validación de metodologías analíticas en
esta institución, pues es un proceso crítico que conduce a resultados que deben ser confiables
y certeros (como es el caso de control de medicamentos), ya que los resultados arrojados por
los análisis desarrollados con este tipo de metodologías puede significar la aparición o salida
del mercado de estos productos, lo que tiene un tremendo impacto en la salud de la población
Chilena.
32
REFERENCIAS
1.- Página Oficial del Instituto de Salud Pública de Chile, sección ANAMED. Consultado el
día 6 de junio de 2014 disponible en: www.ispch.cl/ANAMED,.
2.- A.E.F.I., Validación de Métodos Analíticos, 2001.
3.- Instituto de Salud Pública de Chile, Guía Técnica N°1, Validación de métodos y
determinación de la incertidumbre de la medición: “Aspectos generales sobre la validación de
métodos”, 2010.
4.- Instituto de Salud Pública de Chile, Documento Complementario N°1 del manual de
gestión integrado Departamento agencia nacional de medicamentos, 2012 Revisión 3.
5.- Resolución exenta 1553, 13.07.2012
6.- Subdepartamento Laboratorio Nacional de Control, Instructivo verificación equipo
cromatógrafo de alta eficiencia (HPLC) Shimadzu Prominence, revisión N3, 2012.
7.- Instructivo de Validación de métodos fisicoquímicos, ANAMED, Subdepartamento
Laboratorio Nacional de Control, 2012.
8.- Validación de Procedimientos Farmacopeicos, USP 36, PAG 1225.
9. - Inhalers, Salbutamol Sulphate, British Pharmacopoeia 2012,
33
ANEXO N° 1 METODOLOGÍA ANALITICA PARA LA IDENTIFICACION,
VALORACION Y CUANTIFICACION POR DEPOSITO DE DOSIS DE
SALBUTAMOL SULFATO EN INHALADOR
1. OBJETIVO Describir la metodología analítica para la valoración y depósito de dosis del principio activo Salbutamol en muestras sometidas a Control de Serie. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Producto farmacéutico terminado que contiene Salbutamol como principio activo, en la forma farmacéutica de inhalador. 3. FUNDAMENTO Determinación por HPLC; se mide el área del principio activo a 276nm en la muestra comparando contra estándar de referencia. 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS Basada en metodología BP 2012 modificada. 5. TERMINOLOGÍA
- HPLC : Cromatografía líquida de alta resolución - STD : Estándar - LNC : Laboratorio Nacional de Control - UV : Ultravioleta -Depósito de dosis emitida: Se refiere a la cantidad de principio activo (un % de la dosis emitida) que llega al sitio de acción en los pulmones (alvéolos).
6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1 REACTIVOS • Albuterol Sulphate estándar Primario USP • Acetato de Amonio • Metanol • Agua HPLC
6.2 INSUMOS • Micropipeta 1000-5000uL • Probeta graduada de 1000 mL • Embudo de vidrio • Filtros muestra GV con membrana PVDF de 0.22 um de poro y 13 mm de diámetro • Filtros Fase Móvil HA • Jeringas de vidrio para filtración
34
• Columna (C18) 4,6 x 250mm, 5um. C11/12 • Trípode de acero • Pipetas volumetricas 5mL • Pinzas • Espátulas •
6.3 EQUIPOS • Balanza analítica • Equipo de filtración y desgasificador • Equipo HPLC Shimadzu Prominence • Equipo Millipore para agua HPLC • Twin Impinger
7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
7.1 Muestreo
Personal del LNC distinto al que realiza los análisis (Inspectores de la Unidad de Toma de muestra) muestrean el producto según IT- 420.00-046 “Toma de muestra de productos sometidos a control de serie”. El ingreso de la muestra al laboratorio se realiza según el PR 420.00-024 “Toma, recepción, distribución y custodia de las muestras”
7.2 Preparación de Reactivos
• Fase Móvil: Pesar una cantidad suficiente de acetato de amonio (determinada por el
volumen de fase móvil requerida) de modo de obtener una solución de concentración 0,1%. Disolver con agua destilada purificada y llevar a baño de ultrasonido por 15 minutos. Posteriormente mezclar con un volumen determinado de Metanol grado HPLC de manera de obtener una solución en proporción 55:45 Metanol: Acetato de amonio 0,1%. Finalmente filtrar por bomba de vacío utilizando un filtro HA.
• Preparación de solvente: Ídem a anterior.
7.3 Preparación de curva de calibración.
Se realiza valoración contra un punto (concentración) del estándar.
35
7.4 Preparación de controles.
• Preparación de estándar control y de trabajo: Pesar 20 mg (por duplicado para Control y trabajo) de estándar de Salbutamol (Albuterol sulphate) y llevar a un matraz de 100mL. Agregar 30 mL aproz de solución fase móvil y homogeneizar y sonicar por 10 minutos. Luego enrasar. Posteriormente, utilizando una pipeta aforada, extraer una alícuota de 5mL y llevar a 100mL con fase Movil y homogeneizar. De esta manera se obtienen los las soluciones estándar de control y de trabajo.
7.5 Preparación de la Muestra o etapas previas a realizar la medición.
7.5.1 Valoración: Preparación de la muestra: Tomar un envase, agitar por 5 seg. eliminar un puff, esperar no menos de 5 seg., volver a agitar 5 seg. y eliminar. Posteriormente, y de la misma manera, repetir 3 veces más. Este procedimiento se realiza para cebar la válvula del inhalador. Retirar el adaptador, lavar el tubo y la férula de la válvula interna y externamente con fase móvil. Secar completamente. Colocar un trípode (descrito en BP 93 pág. 741) en un vaso de 50 mL, agregar 15 mL de solvente (fase móvil) o la cantidad suficiente para tapar el trípode unos 5 -8 mm. Agitar el envase, ponerlo en forma vertical e invertido sobre el agujero central del trípode, realizar una descarga, agitar 5 seg. y volver a descargar, repetir la operación hasta completar 10 descargas (etapa inicio). Llevar el contenido del vaso a un matraz aforado de 100 mL, lavar prolijamente el trípode, el vaso y la válvula del inhalador y recolectar en el matraz, para luego enrasar. Eliminar los próximos puff hasta llegar aproximadamente a la mitad de la cantidad de dosis declaradas en el rótulo (ver ejemplo). Repetir el procedimiento de descarga de los 10 puff sobre el trípode. (etapa medio) y llevar a matraz de 100 mL, continuar con el lavado y la recolección. A continuación, eliminar los siguientes puff hasta llegar a los puff del final del envase. Realizar la descarga de los 10 últimos puff sobre el trípode, lavar y recolectar a matraz de 100 mL (etapa final). Finalmente, eliminar los puff finales para contabilizar la cantidad real de puff. Por ejemplo: Inhalador de 250 dosis: • Cebar la válvula: 5 puff • Muestra inicio: 10 puff • Eliminar: 100 puff • Muestra medio: 10 puff • Eliminar: 105 puff • Muestra final: 10 puff • Eliminar Puff finales para contabilizar el Nº de dosis totales
36
Realizar la valoración en 10 envases. Preparación del estándar: Pesar exactamente alrededor de 20 mg de estándar de Salbutamol (Albuterol Sulphate ), llevar a matraz de 100 mL, agregar 30mL de solvente y sonicar 10 minutos. Enrasar, tomar una alícuota de 5 mL y llevar a 100 mL (C= 0.01 mg/mL). Filtrar la solución con membranas de 0.22 um.
Preparación del Solvente
Se utiliza Fase Móvil como solvente.
Condiciones cromatográficas: • Detector UV con arreglo de diodos: 276 nm • Columna Xbridge (C18) 4,6 x 250mm, 5um. C11/12 • Flujo: 1,0 mL/min. • Temperatura Horno: 25 ºC • T. Retención Salbutamol: 2,7 min • Volumen de inyección: 20 uL Cálculos: % = Area Muestra x Conc. Estándar (mg/mL)* x FP x 100 x 100 Area Estándar x dosis declarada ( en 10 puff (mg))
7.5.2 Depósito de dosis emitida y Uniformidad de dosis liberada Preparación de las muestras En la cámara inferior y superior del doble impactador se agregan 30 mL y 7 mL de solvente (fase móvil) respectivamente. Se conectan todas las piezas del equipo asegurándose de que el ensamble sea vertical y adecuado. Eliminar los primeros 5 puff del envase agitando a lo menos 5 seg. entre descargas para cebar la válvula. Conectar el adaptador del inhalador en la pieza A del equipo, tal como lo indica la BP. Ajustar la presión de la bomba a 60 ± 5 litros/minuto. Encender la bomba, colocar el inhalador en el adaptador y descargar. Retirar el inhalador y agitar 5 seg. , volver a descargar, siguiendo el mismo procedimiento, hasta completar 10 puff. Una vez completados, esperar no menos de 5 segundos y apagar la bomba. Desmantelar el equipo.
37
Llevar el contenido de la cámara inferior y superior por separado a matraces de 100 mL r Lavar las partes correspondientes de cada cámara y recolectar en los matraces. Llevar a volumen con solvente. Filtrar las muestras con membranas de 0.22 um. Inyectar tres veces cada una. Realizar el mismo procedimiento anterior para las dosis que se encuentran al medio y al final de cada envase (seguir ejemplo dado en la valoración). Llevar a cabo el test en a lo menos 5 envases. Preparación del estándar Pesar exactamente alrededor de 20 mg de estándar de Salbutamol, llevar a matraz de 100 mL, agregar 30mL de solvente y sonicar 10 minutos. Enrasar, tomar una alícuota de 5 mL y llevar a 100 mL (C= 0.01 mg/mL). Filtrar la solución con membranas de 0.22 um. Cálculos: Cámara Inferior: % = Área muestra inferior x Conc. Est *. x 100 x 100 Área estándar x CPA Cámara Superior: % = Área muestra superior x Conc. Est*. x 100 x 100 Área estándar x CPA CPA = % Valoración x dosis declarada (en 10 puff) 100 * Considerar la potencia del estándar según la siguiente expresión: Peso Std x Potencia Std 100 Una vez hechos los cálculos, los resultados se obtienen de la siguiente manera: a. Para Depósito de dosis Primero, determinar el porcentaje promedio por etapas de lo obtenido en todos los envases analizados (inferior inicio, inferior medio e inferior final), luego el resultado final de este test es el promedio de estos promedios
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b. Para Uniformidad de dosis liberada Para cada envase se deben sumar los porcentajes inferior y superior correspondientes a la misma etapa, y luego promediarlos. El resultado final se expresa como el rango entre el menor y mayor porcentaje promedio obtenido en todos los envases. 7.5.3 Nº de dosis por envase Se cuentan las dosis expulsables por envase, a lo menos 5 unidades Nota: Tomar en cuenta el número de puff utilizados y expulsados de los mismos envases que
7.6 Análisis de la muestra o realización de la medición. Condiciones instrumentales
7.6.1 Condiciones cromatográficas:
Columna : XBridge C18 4,6x250 mm, 5um. Detector : UV, λ = 276 nm. Flujo : 1 mL/min. Volumen de inyección: 20 μL. Temperatura : 25 ºC Tiempo de corrida : 9 minutos
7.6.2 Análisis de muestras: Proceder a cromatografiar las soluciones estándar control y de trabajo, y luego las soluciones de las muestras A y B. Inyectar según el siguiente esquema:
Muestra Lectura
Blanco 1 vez Estándar de Trabajo 3 veces Estándar de Control 3 veces Blanco 1 vez Muestra A 3 veces Muestra B 3 veces Blanco 1 vez Estándar de Trabajo 2 veces Estándar de Control 2 veces Blanco 1 vez
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7.7 Chequeo de Estándares y Rendimiento Instrumental Con las 5 lecturas del estándar de trabajo y las 5 lecturas del estándar control, se calcula el Factor de Respuesta FR = (Área / Concentración) para ambas soluciones y reportar los valores obtenidos. La diferencia entre el FR promedio de la solución de trabajo y el valor promedio del FR de la solución control, no debe exceder el 2 %. Inyectar al menos 3 veces cada solución muestra y calcule el porcentaje de Somatropina en cada inyección. Obtenga el valor promedio a partir de las 2 soluciones de la muestra (A y B), evaluando antes de esto si existen valores discrepantes y si se pueden eliminar.
7.7.2Test de Aptitud del Sistema (Test Suitability) Inyectar 5 veces el estándar de Albuterol sulphate y determinar los parámetros de desempeño de la metodología analítica, y evaluar su cumplimiento. No se puede comenzar el análisis de las muestras sino se cumplen todos los parámetros de desempeños descritos a continuación. CV : ≤ 5,0 % Factor Tailing : ≤ 2 Eficiencia : ≥ 3500 platos teóricos
7.8 Expresión de los Resultados. Concentración de la muestra (promedio inyecciones) mg/mL. % Salbutamol, calculado en base a dosis declarada.
8 CUADRO DE RESPONSABILIDADES
Responsabilidades con la ejecución del Método Ejecuta el método (Cargo)
Elabora el informe de resultados (Cargo)
Aprueba el informe de resultados (Cargo)
Profesional Analista Profesional Analista Jefe de Seccion 9 ANEXOS Cuando no se generen anexos, se indica “No Aplica”
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ANEXO N°2 REPORTE DE VALIDACIÓN
1.- OBJETIVO
Demostrar que el método de cromatografía liquida (HPLC) es consistente para determinar
salbutamol, en el ensayo de Valoración y depósito de dosis, presente en productos
farmacéuticos terminados en la forma farmacéutica de inhalador.
2.- ALCANCE
Se determinan los parámetros de desempeño correspondientes a la categoría I, USP 37, para
la cuantificación de componentes principales en productos farmacéuticos terminados
(linealidad, precisión, exactitud e intervalo).
3.- PRINCIPIO ACTIVO / MATRIZ
Las muestras contienen salbutamol sulfato como principio activo y sus matrices contienen los
excipientes propios de cada formulación.
Las muestras corresponden a los productos codificados como: RC-909/12, RC-967/13, RC-
348/13, RC-808/11, RC-1480/13
4.- METODOLOGÍA ANALÍTICA
La metodología analítica a ser validada corresponde a la señalada en el procedimiento ME-
422.00-017. (ver ANEXO 1)
5.- EQUIPOS Y ESPECIFICACIONES
5.1.- Balanza Analítica: Sartorius CP 225D de 0,01 mg de sensibilidad.
• Fecha última Calibración: 06 de Noviembre del 2012
• Fecha última Verificación: Diaria.
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5.2.- Cromatografo Líquido: Cromatografo líquido (HPLC) Shimadzu Prominence,
• Fecha última Mantención: 13 de Noviembre del 2013
• Fecha última Verificación: 10 de Enero del 2014
6.- ESTANDARES ANALÍTICOS
6.1.- Estándar Primario de Salbutamol sulfato:
• Nombre: Albuterol Sulphate
• Procedencia: USP
• Clasificación: Estándar Primario
• Potencia: 99,8%
7.- RESULTADOS
Parámetro Criterio de Aceptación Resultado Calificación
Observaciones
Especificidad
No Aplica
Linealidad Inspección visual lineal Grafica Lineal Cumple
Sin Observaciones
r2 > 0,995 r2 = 0,9999 Cumple Estadístico t de Student (0,95; n-2) Cumple si ttabla < texp.
ttabla = 2,5706 < texp. = 685,4162 (n = 4)
Cumple
CV% de cada nivel < 4%
CVN1 = 0,34% ; CVN2 = 0,10%
Cumple
CVN3 = 0,05% ;
CVN4 = 0,63% CVN6 = 0,49%
CVN5 = 0,16% ; CVN7 = 0,49%
CV del factor de respuesta < 5% CVFR(n=7) = 0,35% Cumple
Intervalo de confianza incluye el cero
Intervalo de confianza del intercepto incluye el cero Cumple
Precisión Repetibilidad CV de cada nivel < 4 %
CVN1-día-1 = 0,32% ; Cumple Sin
Observaciones
CVN2-día-1 = 0,045% ; CVN3-día-1 = 0,44%
CV de cada nivel < 4 % CVN1-día-2 = 0,44% ; Cumple
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Precisión Intermedia
CVN2-día-3 = 0,25% ; CVN3-día-2 = 0,67%
Comparación de Medias: Estadístico t de student (0,95; (n1 + n2-2)). Cumple si texp. < ttabla a dos colas
Nivel 1: texp=0,5997 < ttabla = 2,2281
Cumple Nivel 2: texp=1,6563 < ttabla =2,2281 Nivel 3: texp= 0,4288 < ttabla =2,2621
Exactitud (Recuperación)
Cada lectura realizada entre el rango 96 - 104%
Valores encontrados entre 98,3 y 100,5% Cumple
Sin Observaciones
El Promedio final y el de cada nivel esta en el rango de 98 - 102%
Nivel 1: 98,6%
Cumple Nivel 2: 99,9% Nivel 3: 98,4% X3 = 98,96%
8.- REGISTROS DERIVADOS DE LA VALIDACIÓN
• Hoja Trabajo Validación: Hojas de trabajo foliadas
9.- CONCLUSIONES
9.1.- La metodología analítica cumple con todos los requisitos establecidos para los
parámetros de la validación de la categoría I (USP 37).
10.- REVALIDACIÓN
• Si no hay cambios en las condiciones de análisis, revalidar cada 5 años.
• Si hay cambio de matriz de la muestra.
• Si hay cambios de las condiciones experimentales (equipos, instrumentos, traslados).
• Si hay cambios en la metodología analítica.
• Si hay actualizaciones tecnológicas.
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11.- PROFESIONAL(ES) RESPONSABLE(S)
Q.F. Rodrigo Barriga González. :
Nicolás Ibáñez Vásquez. :
Alumno en Práctica
12.- REVISIÓN Y VºBº JEFE DIRECTO
Q.F. Osmán Mercado Campos :
Jefe Sección Fisicoquímico
Fecha Inicio Validación : 19 de Marzo de 2013
Fecha de Término Validación : 24 de Mayo de 2013