enzimologia
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Enzimas
Tema 4
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Catalizadores Biológicos
Ejemplos de reacciones catalizadas
Anhidrasa carbónica
Péptido o proteína
Proteasa
• 1011 veces más rápida que sin enzima• La especifidad depende del grupo R1
• Convierte 6x105 moléculas por segundo
• 107 veces más rápida que sin enzima
• Catalizador:– Aumenta la velocidad de
reacción– No varía ∆G de la
reacción– Facilita la reacción en
condiciones no extremas– No se consume durante la
reacción
• Los catalizadores biológicos son:– Casi siempre proteínas
(enzimas)– Excepcionalmente RNA
catalítico (zibozimas)
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El Centro Activo
Uracilo(parte delSustrato)
Serina
Treonina
Ribonucleasa
Centro activ
o
Ejemplo de un centro activo• Las enzimas son específicas por sus sustratos– Interacción precisa enzima-
sustrato– Sitio de interacción: “centro
activo”• Hendidura tridimensional• Zona pequeña de la enzima• Propiedades especiales para
la unión y para la catálisisdel sustrato
– Sustrato y centro activo tienen formas complementarias
– Interacción a través de enlaces débiles
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El Estado de Transición
Explicación termodinámica
S S* P
Sustrato (S)
Producto (P)
Progreso de la reacción
En
erg
ía lib
re
De reacción
(No catali-zada)
Estado de
transición S*
(catalizada)
Energía de activación
• La reacción transcurre a través de un estado de transición (S*)– Intermedio entre S y P– Mayor energía que S
• Barrera de energía de activación
• La enzima facilita la formación de S*– Reduce la energía de
activación• Acelera la reacción
– S* es complementariocon el centro activo
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Modelos del Complejo Enzima-Sustrato
• La llave y la cerradura(Fisher, 1890)– Centro activo y sustrato
son perfectamente complementarios
• Reconocimiento molecular
• Ajuste inducido(Koshland, 1958)– La unión del sustrato
induce un cambio en el centro activo que aumenta la complementariedad
• Reconocimiento molecular dinámico
Sustrato
Enzima
Complejo ES
Enzima
Complejo ES
Sustrato
Estado detransición
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Tipos de Enzimas
• Oxidoreductasas– Catalizan reacciones de
oxidoreducción• Deshidrogenasas, oxidasas,
oxigenasas, reductasas, peroxidasas
• Transferasas– Catalizan transferencias de
grupos químicos• Transcarboxilasas,
transaminasas, transmetilasas
• Hidrolasas– Catalizan la rotura de
enlaces por adición de agua• Esterasas, fosfatasas,
peptidasas
• Liasas– Catalizan la eliminación de
grupos para formar un doble enlace
• Descarboxilasas, deshidratasas, desaminasas
• Isomerasas– Catalizan reordenamientos
moleculares• Epimerasas, mutasas
• Ligasas– Catalizan formaciones de
enlace entre dos sustratos, con energía aportada por la hidrólisis de ATP
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Cofactores Enzimáticos
• Componentes no proteicos requeridos para la actividad de la enzima–Apoenzima + cofactor = holoenzima–Dos tipos
• Iones metálicos– Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, ...
• Coenzimas– Moléculas orgánicas pequeñas– Muchas derivan de las vitaminas
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Vitaminas
• Moléculas orgánicas pequeñas necesarias en la dieta– Los organismos superiores no pueden
sintetizarlas• Han de ser ingeridas• Su carencia provoca enfermedades
• Dos tipos, según su solubilidad:– Hidrosolubles
• La mayoría son precursoras de coenzimas
– Liposolubles• Participan directamente en funciones importantes
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Vitaminas Hidrosolubles
Vitamina Coenzima Reacción típica Consecuencias de la deficiencia
Tiamina (B1)Pirofosfato de tiamina
Transferencia de aldehído
Beriberi (pérdida de peso, problemas de corazón)
Riboflavina (B2)Flavina adenina dinucleótido (FAD) Oxidación-reducción Estomatitis angular,
dermatitis
Piridoxina (B6) Fosfato de piridoxal Transferencia de grupo químico en aminoácidos
Depresión, convulsiones
B125’-desoxiadenosil-cobalamina
Transferencia de grupos metilo
Anemia perniciosa, acidosis metilmalónica
Ácido nicotínico (niacina)
Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) Oxidación-reducción Pelagra (dermatitis,
diarrea, depresión)
Ácido pantoténico Coenzima A Transferencia de grupos acilo Hipertensión
Ácido fólico Tetrahidrofolato Síntesis de timina Anemia, defectos en tubo neural (en niños)
Ácido ascórbico (C) AntioxidanteEscorbuto (inflama-ción y hemorragia de encías)
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Vitaminas Liposolubles
Vitamina Función en la que interviene Consecuencias de la deficiencia
A
Visión, crecimiento, reproducciónPrecursora del retinal (pigmento de la visión) y del ácido retinoico(activador de la transcripción)
Ceguera nocturna, lesión en la córnea y en aparatos digestivo y respiratorio
D
Regulación del metabolismo del calcio y del fosfatoPrecursora de la hormona 1,25-dihidroxicolecalciferol (1,25-DHCC)
Raquitismo (en niños)Osteomalacia (en adultos)
EAntioxidanteNeutraliza especies reactivas de oxígeno (radicales libres)
Inhibición de la producción de esperma, lesiones musculares y nerviosas
KCoagulación sanguíneaParticipa en la carboxilación de residuos de glutamato
Hemorragias subdérmicas
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Nociones de Cinética Química
• En condiciones de equilibrio
• Velocidad de reacción
Velocidad
Consumo de A
Formación de B
Constante de velocidad
A Bk1
k -1
En el equilibrio v = 0
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Nociones de Cinética Química
A B C
• Reacciones sucesivas– La velocidad depende del paso más lento
k1 k2
Si k2 << k1, entonces B C es el paso limitante de la reacción, y la velocidad depende sólo de k2
k2
B = Intermediario
– Cuando la primera reacción es reversible, la llamamos preequilibrio
A B Ck1
k -1
k2
Si k2 << k-1, entonces A y B pueden llegar virtualmente al equilibrio, y decimos que se alcanza un estado estacionario
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Cinética de la Catálisis Enzimática
Producto
Complejo enzima-sustrato (intermediario)
Preequilibrio
E + S ES E + Pk1
k -1
k2
Fase de catálisis: transformación de S en P y recuperación de E
Fase de afinidad: unión de S al centro activo de E y formación del complejo ES
Es el paso limitante
Constante de disociación del complejo ES Constante
catalítica (kcat)
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Modelo Cinético de Michaelis-Menten
• Relaciona la velocidad de catálisis con la concentración de sustrato
• Parte de los siguientes supuestos1. P no se convierte en S
– Es cierto cuando [P] es muy baja (al inicio de la reacción). Consideramos velocidades iniciales (V0)
2. K2 << k-1– Se alcanza el estado estacionario– [ES] se considera constante
3. [E] << [S]– [S] ≈ [S]inicial
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Estado Estacionario
TiempoEstadoPre-estacionario
Conce
ntr
ació
n
Equilibrio
Estado estacionario: d [ES] / d t ≈ 0 [E]
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Ecuación de Michaelis-MentenE + S ES E + P
k1
k -1
k2
1 Velocidad Inicial:
2 En el estado estacionario:
Constantede Michaelis
V0 alcanza el valor máximocuando [ES]=[E]total
Ecuación de Michaelis(curva hiperbólica):
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Representación de la Ecuación de Michaelis
• Se representan valores de velocidad inicial , V0 , para distintos valores de concentración inicial de sustrato [S]1, [S]2, etc
• V0 aumenta al aumentar [S], hasta llegar a la saturación ([ES] ≈ [E]total, se alcanza Vmax)
• KM representa la [S] para la cual se alcanza la mitad de la Vmax
• Vmax es un valor asintótico (se alcanza para [S] = ∞ ). No se puede obtener de la representación hiperbólica
Equilibrio
Tiempo
Pro
duct
o
[S]1
[S]2
[S]3
[S]4
Vel
oci
dad
de
reacc
ión
Concentración de sustrato [S]
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Linealización de la Ecuación de Michaelis
• Para determinar Vmax y KM con precisión la ecuación de Michaelis se transforma en una función lineal
• Representación de Lineweaber-Burk (o de dobles inversos)
Inverso
1/ V0
1/ [S]
1/ Vmax
-1/ KM
Pendiente: KM / Vmax
PendienteOrdenada en el origen
Recta
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Significado de la KM
• Dos significados– KM es la [S] para cual V0 = ½Vmax
• Nos dice cuál es la [S] necesaria para que ocurra una catálisis significativa
– Cuando k2 << k-1, KM ≈ KS (constante de disociación del complejo ES)
• Nos informa de la afinidad de la enzima por el sustrato (si KMes grande, KS es grande y la afinidad es pequeña, y viceversa)
• KM Tiene unidades de concentración (M)
• Para una enzima determinada– KM varía según el sustrato y las condiciones (pH,
temperatura, fuerza iónica, ...)
≈
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Significado de Vmax y de k2 (kcat)
• La Vmax revela el número de recambio de la enzima– Número de recambio = kcat
• número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y por cada molécula de enzima, en condiciones de saturación
E + S ES E + Pk1
k -1
k2
1 / kcat es el tiempo necesario para la conversión de una molécula de sustrato en producto (un ciclo catalítico)
Unidades: M s-1
Unidades: s-1
Unidades: M
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Eficacia Catalítica (kcat / KM)
• En condiciones fisiológicas las enzimas no se encuentran saturadas ([S] < KM)–En estas condiciones
•Constante de velocidad para la interacción entre E y S
•Representa la eficacia catatalítica de la enzima
•Sirve para comparar la preferencia de una enzima por diferentes sustratos
•Unidades: M-1s-1
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Inhibición Enzimática
• Inhibición: Disminución de la actividad de una enzima por acción de un inhibidor– Irreversible
• El inhibidor se une fuertementa a la enzima– Ejemplos:
» La ampicilina: Modifica covalentemente una transpeptidasa responsable de la síntesis de la pared celular bacteriana
» La aspirina: Modifica covalentemente una ciclooxigenasa que produce señales inflamatorias
– Reversible• El inhibidor se une a la enzima por enlaces débiles, y el
complejo EI se encuentra en equilibrio con las formas libres (E e I)
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Inhibición Reversible Competitiva
Sin inhibidor
[S]
Vel
ocid
ad d
e re
acci
ón
SustratoInhibidor
competitivo• El inhibidor se une a la enzima libre– Compite con el
sustrato• Puede ser superada a
[S] elevada. No afecta a la Vmax (ni a la kcat)
• Afecta a la KM– Aumenta la KM, que
llamamos aparente(KM
aparente > KM)
– Suelen ser moléculas similares al sustratoo análogos del estado de transición
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Inhibición Reversible No CompetitivaSustratoInhibidor
no competitivo• El inhibidor se une tanto
al E y como al complejo ES– Se une en un sitio distinto
del sitio activo• No se supera con [S]
elevada
• Vmax disminuye
– Vmaxaparente < Vmax
• No afecta a La KMV
eloc
idad
de
reac
ción
Sin inhibidor
[S]
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Análisis Gráfico de la Inhibición
Inhibición competitiva
+ Inhibidor competitivo
Sin inhibidor
+ Inhibidor no competitivo
Sin inhibidor
Inhibición no competitiva
-1/KM
-1/KMap
1/Vmax
-1/KM
-1/Vmaxap
1/Vmax
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Mecanismos Moleculares de Regulación Enzimática
• Permiten la adaptación de la actividad a necesidades fisiológicas, estados del desarrollo o condiciones ambientales– Regulación temporal/espacial
• Utilización de isoenzimas
– Regulación lenta• Control de la disponibilidad y de la vida media de la
enzima
– Regulación rápida• Control alostérico• Modificación covalente
– Reversible– Irreversible
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Isoenzimas
• Son distintas formas de una misma enzima–Enzimas homólogas presentes en un
mismo organismo• Cada isoenzima en un tejido diferente o en un
momento distinto del desarrollo• Catalizan la misma reacción, pero con
pequeñas diferencias– Pequeñas diferencias en su secuencia
» Diferencias en su estructura» Distintos valores de KM y/o Vmax
» Distintas propiedades reguladoras
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Vida Media y Disponibilidad de las Enzimas
• Muchas enzimas presentan una vida media corta–En las células existe un recambio proteico
constante–La concentración de las enzimas se
encuentra regulada• A través de la regulación de su síntesis
– Regulación de la transcripción y de la traducción
• A través de la regulación de su degradación– Mediada por la ubiquitina y ejecutada por el
proteasoma
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Enzimas Alostéricas
• Contienen varios centros de unión y varias subunidades– Centros activos– Centro reguladores
• Efecto alostérico– A través de cambios
conformacionales
• Alosterismo homotrópico– Entre centros equivalentes
• Cooperatividad– Curvas sigmoides– No siguen la cinética de
Michaelis-Menten
• Alosterismo heterotrópico– Efecto de centros reguladores
sobre centros activossustrato
[sustrato]
V
VEstado R
Estado T
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Regulación de rutas Metabólicas
• Control a nivel de sustrato– La acumulación de producto inhibe la acción de
la enzima que lo genera
• Control por retroinhibición– El producto final de una ruta inhibe el primer
paso de la ruta
Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADPHexoquinasaInhibición
A B C D NRetroinhibición
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Modificación Covalente
• Irreversible– Activación por rotura
proteolítica de precursores inactivos (zimógenos)• Enzimas de la
digestión• Cascada de
coagulación• Activación de caspasas
en la apoptosis
• Reversible– Unión covalente de
un grupo químicoque altera las propiedades catalíticas de la enzima• Fosforilación-
desfosforilación• Oxidación-reducción• Acetilación-
desacetilación
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Cascada de la Coagulación
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Regulación por Fosforilación Reversible
• Fosforilación– Transferencia de grupo fosforilo desde el ATP a
grupos –OH de Ser Thr o Tyr– Es cataliza por proteínas quinasa– A menudo desencadena efectos amplificados
• Una sola quinasa activa centenares de otras enzimas que. A su vez cada una de ellas activará centenares de otras enzimas, ...etc.
• Desfosforilación– Eliminación de grupo fosforilo de proteína
fosforilada– Catalizada por proteína fosfatasa