tercera fase enzimologia

7/21/2019 Tercera Fase Enzimologia

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Enzimologa Ivn Paz Aliaga

CAPTULO VIIIPURIFICACIN DE ENZIMASCONTENIDO

Precauciones que se deben tomar al trabajar con enzimasEtapas generales de un proceso de puriicaci!nPreparaci!n del e"tracto de puriicaci!nT#cnicas de puriicaci!n por precipitaci!nT#cnicas cromatogr$icas%#todos au"iliares de puriicaci!n

8.1. INTRODUCCINLa puriicaci!n de una enzima es un proceso complejo debido a la

alta inestabilidad que muestran estas mol#culas & resulta ser un reto parael Enzim!logo pues durante el mismo debe aplicar una serie deestrategias' seleccionando de muc(os m#todos aquellos que (agan al

procedimiento m$s rentable)La puriicaci!n enzim$tica desarroll! enormemente gracias a la aparici!nde nue*as t#cnicas bioqu+micas all$ por los a,os -.s & /.s del siglopasado & esto (a permitido tambi#n el a*ance de la Enzimolog+a puesreci#n con una enzima pura se pudo determinar los mecanismoscatal+ticos' las propiedades qu+micas' la masa molecular' los residuosaminoac+dicos que orman parte del centro acti*o' etc) de la misma)

Antes de considerar los aspectos pr$cticos de una puriicaci!n esnecesario deinir cual es el prop!sito u objeto de uso de la enzimapuriicada0 si se quiere por ejemplo (acer una caracterizaci!n molecularde la misma' esta debe estar con un alto grado de pureza & en grandescantidades0 pero si el objeti*o es utilizarla para estudios cin#ticos' serequerir$ en peque,as cantidades & no totalmente pura) Una *ezestablecido el prop!sito de la enzima' se debe deinir el n1mero derequerimientos m+nimos para el producto inal en t#rminos de calidad'cantidad & eiciencia de la puriicaci!n' o que se traduce en t#rminos de

pureza' rendimiento & econom+a)


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8.2. PRECAUCIONES QUE SE DEBEN TOMAR AL TRABAJARCON ENZIMASLas enzimas se desnaturalizan e inacti*an $cilmente' por esta

raz!n al manipularlas deben tomarse en cuenta las siguientesconsideraciones2

3eben e*itarse los tratamientos *iolentos 4$cidos o $lcalis uertes'altas temperaturas' reacti*os uertes' etc)5

6o e"poner a las enzimas a temperaturas ma&ores de 789C 6oe"poner a las enzimas a p:s menores de - ni ma&ores de ;)

Al adicionar $cidos o $lcalis debe (acerse por las paredes delrecipiente para e*itar la producci!n de una zona de destrucci!n

alrededor del c(orro del reacti*o cuando este penetra a la soluci!n0 lasoluci!n debe estar en permanente agitaci!n durante el agregado)

%uc(as enzimas se desnaturalizan en la supericie de la soluci!n porla presencia de aire & esto se maniiesta por la ormaci!n de espuma'por lo tanto debe e*itarse0 por ejemplo al agregar sales s!lidas' estastrasladan burbujas de aire que pueden desnaturalizar a la enzima' siesto ocurre es mejor adicionar las mismas como una soluci!nsaturada)

Los sol*entes org$nicos inacti*an a la ma&or+a de enzimas atemperatura ambiente' el raccionamiento con alco(ol o acetona deberealizarse a la menor temperatura posible0 asimismo' se debe e*itar elcalentamiento que produce la mezcla de algunos sol*entes org$nicoscon el agua)

Las centriugaciones deben (acerse en centr+ugas rerigeradas0 si lasdierencias de densidad entre las ases s!lida & l+quida es peque,a' esmejor usar iltraci!n que centriugaci!n)


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8.3. ETAPAS GENERALES DE UN PROCESO DEPURIFICACINLa selecci!n & secuencia de los m#todos de puriicaci!n a

emplearse deben (acerse con cierto criterio lo cual implica tomar encuenta los siguientes aspectos2

8.3.1. Conocii!n"o #! $% !n&i%'


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Acti*idad enzim$tica por mililitro de muestra@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@

%iligramos de prote+na por mililitro de muestra

Este *a aumentando a medida que progresa la puriicaci!n' de locontrario el procedimiento utilizado no es correcto)

El R!n#ii!n"o es el porcentaje de la acti*idad remanente de la enzimatotal de una etapa de puriicaci!n 4n5' respecto a la etapa inicial 45 & seobtiene2

Acti*idad enzim$tica total 4etapa n5 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ " ..Acti*idad enzim$tica total 4etapa 5

Este debe ir disminu&endo al aplicar las distintas etapas de puriicaci!n'debido a que siempre se pierde algo de enzima en cada etapa depuriicaci!n)

La Pureza indica las *eces que se *a puriicando la enzima & es el

indicador de la eiciencia del proceso & se determina de la siguientemanera2

Acti*idad espec+ica 4etapa n5@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@

Acti*idad espec+ica 4etapa 5

Este par$metro debe ir aumentado a medida que progresa la puriicaci!n)

8.3.3. S!$!cci(n #! $% )!n"!La uente debe ser aquella donde la enzima se encuentre en ma&or

cantidad & sea m$s estable' aunque muc(as *eces no (a& posibilidad deselecci!n pues la uente &a est$ deinida0 en este caso' se puedeincrementar en ella el contenido de la enzima' por ejemplo' e*itando sudegradaci!n a tra*#s del uso de ini4i#o-! #! ,-o"!%%' adicionandoagentes estabilizadores de la enzima' estimulando su s+ntesis por

agregado de sustrato0 e incluso' con la a&uda de la Ingenier+a gen#tica' sepuede introducir *arias copias del gen responsable de su s+ntesis'desreprimir el gen directamente o mutarlo' o en el mejor de los casos'introducir *arias copias del gen de la enzima a utilizar' en el genoma de


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una bacteria la cual por su corto tiempo de generaci!n' $cil culti*o & portener un n1mero menor de contaminantes que una c#lula eucari!tica' nos*a a proporcionar un mejor rendimiento)

8.3.5. E6"-%cci(n #! $% !n&i%La localizaci!n de la enzima es un elemento importante para

(acer la selecci!n del m#todo a emplear)


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8.3.7.1. T*cnic% #! 4%% -!o$)ci(nAqu+ se encuentran las t#cnicas que se basan en dierencias de

solubilidad de las prote+nas0 su capacidad de procesamiento es alta pero

tienen un bajo poder resoluti*o' por lo general estas se aplican al iniciode la puriicaci!n con la inalidad de eliminar los contaminantes que seencuentran en ma&or proporci!n) Estas t#cnicas tambi#n se emplean paraconcentrar el componente deseado)

A este grupo pertenecen las precipitaciones' salina' isoel#ctrica' por calor& por sol*entes org$nicos)

8.3.7.2. T*cnic% #! %$"% -!o$)ci(nEstas muestran una baja capacidad de procesamiento pero un

alto poder resoluti*o0 a estas pertenecen todos los tipos decromatogra+as2 de adsorci!n' de partici!n' de e"clusi!n molecular' deintercambio i!nico' de ainidad & por supuesto la cromatogra+a :PLC' lacual puede utilizar el principio de cualquiera de las anteriores pero a altapresi!n' esto permite reducir el tiempo del procedimiento' lo cual essiempre adecuado en una puriicaci!n enzim$tica) Estas t#cnicas seaplican en las 1ltimas etapas del proceso)

8.5. PREPARACIN DEL E9TRACTOLa preparaci!n del e"tracto crudo es una etapa cla*e en el proceso

de puriicaci!n' esta depende del origen de la uente & de lascaracter+sticas de la enzima0 la obtenci!n de enzimas microbianas resultaser m$s rentable que obtenerlas de c#lulas animales o *egetales' como(emos *isto0 por lo tanto el proceso se inicia con un culti*o de lasmismas' el que puede ser s!lido o l+quido)

C)$"io ($i#oAqu+ el microorganismo crece & se desarrolla sobre la supericie delmedio de culti*o0 se emplea undamentalmente para enzimase"ocelulares) El microorganismo es la*ado de la supericie del medioutilizando un buer apropiado' luego se iltra & el iltrado que contiene laenzima segregada constitu&e el e"tracto)

C)$"io $0+)i#o o )!-:i#o

El microorganismo crece en el interior del medio' el cual se encuentra enpermanente agitaci!n0 se emplea para puriicar tanto enzimase"ocelulares como endoenzimas) Una *ez completado el tiempo deculti*o' se centriuga la mezcla & se obtiene en el precipitado la masa


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microbiana que contiene las enzimas endocelulares & si es e"oenzima' ele"tracto lo constitu&e el sobrenadante)


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8.5.1. RUPTURA CELULARE"isten muc(os m#todos de desintegraci!n celular' porque (a&

muc(os tipos de c#lulas0 no es recomendable utilizar un tratamiento m$s

*igoroso que el necesario' pues este puede inestabilizar a la enzima)

Los tejidos animales *ar+an desde aquellos que se rompen $cilmentecomo los eritrocitos' (asta materiales sumamente duros como el tejidomuscular liso' con alto contenido en ibras de col$geno) Las c#lulas*egetales son mu& di+ciles de romper' debido a la estructura celul!sicaque presentan sus paredes) En relaci!n a los microorganismos' (a& unagran *ariedad de tipos' desde aquellos medianamente r$giles que sepueden romper con s(ocFG osm!tico' (asta aquellas especies con pared

celular gruesa que necesitan de tratamientos mec$nicos *igorosos) En latabla ) se (ace un listado de estos procedimientos)

En algunos casos es preerible romper los tejidos pre*iamente 4cuando(a& *arios tipos celulares en el mismo5 para obtener poblaciones(omog#neas de c#lulas intactas' esto se puede (acer por m#todosmec$nicos o enzim$ticos o la combinaci!n de ambos0 los m#todosmec$nicos como agitaci!n & (omogenizaci!n sua*e a menudo da,an laintegridad de las c#lulas as+ que los m#todos enzim$ticos son los de

elecci!n) En cualquiera de ellos es normal incluir EDTApues los ionescalcio est$n in*olucrados en ad(esi!n celular0 asimismo' la adici!n de%$4;in% #! )!-o #! 4oino es beneiciosa pues acompleja $cidosgrasos que podr+an da,ar las membranas celulares)

La enzima m$s utilizada para la desagregaci!n celular es la co$%:!n%%de Clostridium histolyticum a una concentraci!n entre .'. a .' gH porperiodos entre - minutos a una (ora) Asimismo son usadas tambi#n"-i,in%' !$%"%% & ,-on%%) La separaci!n de las c#lulas se (ace deacuerdo a su tama,o o por su densidad a la centriugaci!n)

Cuando la enzima por puriicar est$ presente en alg1n organoide' esmejor romper la membrana plasm$tica primero' con un tratamiento notan *igoroso' para luego aislar el organelo por c!n"-i):%ci(n#i!-!nci%$ & reci#n con un tratamiento uerte' romper la membrana delmismo para obtener el e"tracto' muc(o menos contaminado)


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T%4$% 8.1' %#todos para romper c#lulas

M*"o#o Ti,o #! c*$)$% oT!i#o

P-inci,io

S)%!

Lisis celular Eritrocitos uptura osm!tica de la membranacelular)

3igesti!n enzim$tica ?acterias 3igesti!n de la pared celular conLisozima por ejemplo & liberaci!n delcontenido celular por rupturaosm!tica)

:omogenizadorPotterBE*e(jem

Oocitos Las c#lulas son orzadas a pasar por un estrec(a brec(a 4.'.- B .'/mm5entre el #mbolo & un recipiente de*idrio 4presi!n5)


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c#lula) 17 &=>3M durante la ruptura' estabiliza lamembrana lisosomal0 tambi#n se pueden agregar ini4i#o-! #!

,-o"!%%)En condiciones de baja uerza i!nica muc(as prote+nas se inestabilizan'por lo que se utilizan buers a conc!n"-%cion! !#i% 4=>=1M porejemplo5 & p: isiol!gico) A *eces' dependiendo de la enzima que sedesea aislar' es con*eniente o"idar los grupos sul+drilo de las ciste+nasde la enzima' para e*itar que un medio o"idante cause la ormaci!n depuentes disuluro & de (idr!geno' & con ello la agregaci!n & ladesnaturalizaci!n de las prote+nas) Esto se puede e*itar agregando

!-c%,"o !"%no$ o #i"io"-!i"o$)

La adici!n de EDTA a&uda a e*itar la in(ibici!n de enzimas por ionesmet$licos & e*ita tambi#n la o6i#%ci(n #! $% !n&i%' la cual esa*orecida por los propios iones) Algunas *eces se puede incrementar laestabilidad de una enzima agregando su sustrato o alg1n in(ibidorcompetiti*o de la misma' acilit$ndose la e"tracci!n)

3urante la e"tracci!n es mu& recuente que el e"tracto sea turbio' por lo

tanto se debe clariicar0 esta turbidez puede deberse a part+culas de grasaque pueden lotar luego de una centriugaci!n o eliminarse por iltraci!na tra*#s de $%n% #! i#-io o una "!$% )/ in%) En otros casos puededeberse a material particulado en suspensi!n como organoides &o restosde membranas0 en estos casos' se pasa el e"tracto a tra*#s de unacolumna de c!$i"%' la cual adsorber$ este material)

Los tejidos animales tienen tambi#n un alto contenido de grasa &estructuras membranosas que quedan en suspensi!n0 la acidiicaci!n a

,? entre @>= & 7>=pro*oca generalmente la agregaci!n & el materialpuede ser separado por centriugaci!n a baja *elocidad' igual se procedecon los ribosomas) Para bajar el p: se debe usar ci#o %c*"ico 1M &luego de la centriugaci!n' se debe regresar el p: al *alor inicial)

Los tejidos *egetales son m$s ac+dicos & presentan menos cantidad dematerial particulado' el problema en ellos es la presencia de co,)!"o!n($ico los que se oscurecen por o"idaci!n & se unen co*alentemente alas prote+nas' inacti*ando muc(as enzimas0 esto se debe a la acti*idad de

!no$ o6i#%% end!genas) La inclusi!n de compuestos ti!licos como el

!-c%,"o!"%no$' disminu&e la acti*idad catal+tica de las enolo"idasas0 tambi#n puede usarse ,o$iini$,i--o$i#on% en pol*o' queadsorbe compuestos en!licos)


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La e"tracci!n de enzimas a partir de microorganismos tiene tambi#n susproblemas' el primero es que tienen ma&or cantidad de $cidos nucleicos'&a que son c#lulas de r$pida prolieraci!n & en segundo lugar' durante la

ruptura celular las paredes celulares se dispersan en part+culas mu& inaso se solubilizan parcialmente en orma mucilaginosa' pro*ocandoproblemas en la puriicaci!n) Un ejemplo de esto se tiene al obtenere"tractos bacterianos usando la prensa rancesa' la ultrasonicaci!n olisozima) Los $cidos nucleicos pueden precipitarse adicionandomacromol#culas policati!nicas como el quiiosan el cual acilita laagregaci!n0 la ,-o"%in% de salm!n & la c$),!0n% de arenque cu&aunci!n natural es unirse al 36A' cumplen tambi#n con este rol & son losmateriales m$s usados) S)$%"o #! ,-o"%in% es lo que m$s se usa 4-mg

por gramo de material crudo5' aunque algunas *eces puede precipitarprote+nas0 si esto ocurre con la enzima a puriicar' es mejor emplearDNA%& los ribosomas pueden precipitarse con !"-!,"oicin%)


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ZONAS HIDROFBICASGRUPO POLAR SIN CARGA+ -GRUPO POLAR


como membranas mitocondriales' cloroplastos' ret+culo endopl$smico'etc)' (a& que solubilizar este material usando detergentes los cualesenlazan a la prote+na & ocupan el lugar de los componentes lip+dicos de

las membranas0 el incon*eniente es que al eliminar el detergente' laprote+na puede desnaturalizarse o al menos agregarse & precipitar)

Un m#todo cl$sico empleado en estos casos es la e"tracci!n del materiallip+dico con %c!"on%para obtener los denominados ,o$o c!"(nico0 elm#todo consiste en una des(idrataci!n gradual con acetona (asta que estadisuel*a a los componentes grasos de las membranas' se liberan lasprote+nas & luego se e*apora el sol*ente org$nico) El residuo s!lidoobtenido es luego dispersado en un buer acuoso donde se recupera a la

enzima)

8.7. TCNICAS DE PURIFICACIN POR PRECIPITACINEl principio b$sico de esta t#cnica es pro*ocar una alteraci!n de

alguna propiedad del sol*ente original' que promue*a la precipitaci!n desustancias0 estas sustancias precipitadas pueden ser separadas mejor porcentriugaci!n a *elocidades relati*amente bajas) Estas t#cnicas sonaplicadas al inicio de un proceso de puriicaci!n & pueden tener el in deeliminar contaminantes o concentrar el e"tracto)

La distribuci!n de los residuos (idroilicos e (idro!bicos en la supericiede las prote+nas' es el actor que determina la solubilidad en dierentessol*entes0 aquellas prote+nas mu& solubles en agua presentan una baja(idroobicidad en la supericie de la mol#cula' mientras las menossolubles presentan un ma&or n1mero de grupos (idro!bicossupericiales) Aunque la tendencia de los grupos (idro!bicos esconcentrarse en el interior de la mol#cula de prote+na' pueden e"istircierto n1mero de estos residuos en la supericie' en contacto con elsol*ente) Ver igura ))

Fi:)-% 8.1. epresentaci!n de la distribuci!n de dierentes grupos


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supericiales en una prote+na)

Por esta raz!n' los grupos (idro!bicos supericiales son tan importantesen la determinaci!n del comportamiento de las mol#culas proteicas'como los grupos cargados & otros grupos polares) Esto (ace comprensiblela posibilidad de aislar una prote+na integral de membrana utilizandosol*entes no acuosos' &a que presenta una gran cantidad de grupos(idro!bicos supericiales que interact1an con la zona (idro!bica de labicapa lip+dica) Las propiedades de solubilidad de las prote+nas ensol*entes acuosos se pueden alterar mediante cambios en la uerza i!nica'p:' adici!n de sol*entes org$nicos miscibles o de solutos inertes o

pol+meros' as+ como la combinaci!n de esos cambios con *ariaci!n de latemperatura)

1.7.1. PRECIPITACIN POR LA ADICIN DE SALESNEUTRAS

La ma&or+a de las enzimas se presentan en los luidos celulares enorma soluble' en un medio mu& concentrado que puede tener alrededorde un D.H de prote+na) Keneralmente las enzimas son mu& solubles encondiciones salinas isiol!gicas' a una uerza i!nica' generalmente ente.'-J.'=% & a p: neutro) Cuando se realiza la e"tracci!n' estascondiciones cambian r$pidamente & por tanto el incremento de laconcentraci!n de las prote+nas' al eliminar sol*ente o la disminuci!nsustancial de la uerza i!nica' por la eliminaci!n de iones de baja masa

molecular' pudiera con*ertirse en un incon*eniente durante el proceso)La solubilidad es el resultado de las interacciones polares con el sol*enteacuoso' las interacciones i!nicas con las sales presentes & la e"istencia deuerzas electrost$ticas repulsi*as entre mol#culas o agregadosmoleculares peque,os & solubles con cargas id#nticas) Los agregadosmoleculares peque,os enmascaran uerzas electrost$ticas de atracci!n'permitiendo que se presenten interacciones repulsi*as que dan comoresultado una solubilizaci!n del agregado)

En la igura )= se muestran en orma esquem$ticas las dierentesinteracciones electrost$ticas que pueden presentarse entre mol#culas &peque,os agregados moleculares' & que permiten comprender la


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solubilidad en sol*ente acuosos)


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ATRACCINEnzimologa Ivn Paz Aliaga

Fi:)-% 8.2. Muerzas electrost$ticas entre mol#culas proteicas & peque,osagregados moleculares)

Algunas prote+nas orman precipitados en un rango de uerza i!nica entrecero & el *alor isiol!gico' debido a que las uerzas repulsi*as son

insuicientes) En estos casos se presenta una alta (idroobicidadsupericial' lo que implica una baja interacci!n con el agua' 4si a uerzai!nica es cero5 o con la soluci!n salina 4si la uerza i!nica es ma&or quecero5' &a que (a& poca interacci!n de los grupos cargados & las sales)

Un incremento de la uerza i!nica' por la adici!n de sales neutraspro*oca un aumento en la solubilidad de la prote+na &a que los gruposcargados de la prote+na interact1an m$s con los iones de la sal & sea*orece un ma&or n1mero de zonas supericiales cargadas' que pro*ocan

repulsiones moleculares) Este en!meno se denomina %$"in: in osolubilizaci!n por salado0 *er igura )7)

Fi:)-% 8.3. epresentaci!n esquem$tica del salting in & su eecto en lasolubilidad de la prote+na)

La solubilidad por ejemplo de las globulinas disminu&e cuando laconcentraci!n salina decrece0 esta caracter+stica es apro*ec(ada en lapuriicaci!n de enzimas &a que al disminuir la uerza i!nica del e"tracto&a sea por agregado directo de agua o por di$lisis contra agua' ocurrir$ lain*ersi!n de la solubilizaci!n por salado' precipitando algunas prote+nas)


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Esto puede tambi#n constituir un incon*eniente pues la desalinizaci!ncomo etapa de puriicaci!n puede pro*ocar la ormaci!n de precipitado)Cuando la desalinizaci!n se realiza mediante di$lisis' el precipitado

puede recuperarse por centriugaci!n & redisoluci!n en un buer deuerza i!nica apropiada' pero si se desaliniza en una columnacromatogr$ica como la de sep(ade" K=.' se corre el riesgo que laprecipitaci!n ocurra en la columna)

El salting in describe la baja solubilidad de algunas prote+nas a bajauerza i!nica & a p:s cercanos a su punto isoel#ctrico0 sin embargo' lagran ma&or+a de las prote+nas muestran una baja solubilidad a altasconcentraciones salinas 4%$"in: o)"5) El salting out o precipitaci!n por

salado depende undamentalmente de la (idroobicidad de la prote+na'mientras que la solubilizaci!n por salado depende m$s de la distribuci!nde cargas el#ctricas supericiales & de las interacciones polares con elsol*ente)


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Log.Solubilidad

2 ! "

-#$%

-%$&

%

%$&


supericiales' agregar$n m$s pronto que aquellas que presentan poca(idroobicidad supericial0 estas 1ltimas requieren de concentracionessalinas muc(o m$s altas para precipitar)

La solubilidad de una prote+na pura se describe con la siguiente ecuaci!nemp+rica2

Log < Q J F

R

s

3onde2 < solubilidad de la prote+na

Q logaritmo de la solubilidad de la prote+na a uerzai!nica de cero' 4depende da la naturaleza de laprote+na' del p: & la temperatura5

F

R

s

constante de salting out 4depende de la sal utilizada5

uerza i!nica

Es la igura )- se puede obser*ar el comportamiento de algunasprote+nas al incrementar la concentraci!n de sulato de amonio)Obs#r*ese que a peque,os cambios en la uerza i!nica se producencambios dr$sticos en la solubilidad de una prote+na)

Fi:)-% 8.7.


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sales es generalmente ma&or' &a que las prote+nas tienen all+ el ma&orn1mero de grupos cargados) A p: coincidente con el PI' la agregaci!nocurre con ma&or acilidad) Tambi#n la naturaleza de la sal es un

elemento importante' as+ como sus caracter+sticas +sicas0 la altasolubilidad de una sal por ejemplo permitir$ su utilizaci!n a altasconcentraciones)

Las caracter+sticas del cati!n & del ani!n son tambi#n importantes) Lassales m$s eecti*as para la precipitaci!n son las que presentan anionespoli*alentes' tales como el sulato' osato' citrato0 mientras que el cati!nes menos importante) La capacidad de precipitaci!n por salado de losaniones sigue la !-i! #! ?o!i"!-) Para algunos aniones comunes la

serie tienen el siguiente orden ascendente2


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2!" #% #2

SOLUBILIDAD


del tipo de sal)

En la zona de salting in los cationes son m$s importantes que los aniones'

siendo m$s eecti*os los cationes mono*alentes) La sal m$s utilizada esel sulato de amonio debido a tres razones principalmente2

) Es altamente soluble en agua

=) Tiene una alta F

R

s

4constante de salting out5' lo que permite laprecipitaci!n de la prote+na en un inter*alo estrec(o de concentraci!nde sal)

7) Tiene un eecto estabilizante sobre las prote+nas' lo que a*orece lapuriicaci!n enzim$tica)

Las enzimas precipitadas con sales neutras mantienen su conormaci!nnati*a & se pueden redisol*er sin p#rdidas apreciables de su acti*idad0 unprecipitado proteico de sulato de amonio es recuentemente una de lasmejores ormas de conser*ar una prote+na durante el proceso depuriicaci!n o cuando &a est$ pura)

8.7.2. PRECIPITACIN ISOELCTRICAEl p:es un actor que puede (acer *ariar la carga supericial de las

mol#culas proteicas0 la repulsi!n electrost$tica de grupos con igual tipode carga' acilita el incremento de la solubilidad' mientras que laeliminaci!n de de la repulsi!n acilita la agregaci!n & por tanto laprecipitaci!n) Cerca al PI estas repulsiones disminu&en' siendo m+nimasal *alor del p: isoel#ctrico' al cual la carga neta es cero) Ver igura )8)

Fi:)-% 8..


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SOL'(NT(ORG)NICOZONAS HIDROFBICAS


La precipitaci!n isoel#ctrica se puede combinar con el eecto salino para(acer m$s eiciente la insolubilizaci!n) Esto se puede utilizar para separarla enzima de inter#s si se conoce su PI o para precipitar contaminantes

ma&oritarios de puntos isoel#ctricos conocidos)

A p:s e"tremos se produce desnaturalizaci!n de las prote+nas &a que endeterminadas zonas de la mol#cula se presentan cargas id#nticas queoriginan una repulsi!n interna0 o tambi#n se pierden cargas que est$nin*olucradas en uerzas de atracci!n necesarias para el plegamiento de lamol#cula' en la conormaci!n nati*a)

8.7.3. PRECIPITACIN CON SOL


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Fi:)-% 8.8. Mormaci!n de agregados proteicos en la mezcla de aguaB

sol*ente org$nico)

En la igura ) se esquematiza la agregaci!n de las prote+nas comoresultado de las interacciones entre zonas con cargas opuestas en lasupericie de las mol#culas proteicas)

Al seleccionar un sol*ente se deben tener en cuenta *arios aspectos

como' el sol*ente debe ser completamente miscible con el agua' noreaccionar con la prote+na & tener un buen eecto precipitante) Adem$sdel etanol & la acetona' tambi#n se (an empleado !"%no$' n,-o,%no$'io,-o,%no$' #io6%no' 2!"o6i!"%no$' entre otros' pero la noci*idad as+como la inlamabilidad de algunos (an (ec(o que (a&an sido descartadospara procesos de puriicaci!n' como el dio"ano & el =Bmeto"ietanol)

La temperatura a la cual se realiza la precipitaci!n por sol*entesorg$nicos debe ser baja' &a que desde los .9C los eectos

desnaturalizantes comienzan a maniestarse) La desnaturalizaci!n se debea que el sol*ente org$nico aecta las interacciones (idro!bicasintramoleculares de las prote+nas' que estabilizan la estructuratridimensional nati*a de la mol#cula) A bajas temperaturas es di+cil queel sol*ente pueda penetrar a la estructura interna de la mol#cula0 sinembargo' a temperaturas superiores' las peque,as mol#culas del sol*enteorg$nico pueden entrar a tra*#s de brec(as que se presentanespont$neamente en la supericie' debido a la le"ibilidad natural de laestructura)

Una *entaja del raccionamiento con sol*entes org$nicos es que elproceso se puede realizar a temperaturas por debajo de cero grados' &aque los sol*entes org$nicos miscibles en agua disminu&en el punto decongelaci!n de la mezcla por debajo de .9C) Los alco(oles de cadenalarga est$n siendo utilizados 1ltimamente)

8.7.5. PRECIPITACIN CON POLHMEROS ORGNICOSPol+meros solubles en agua' neutros & con alta masa molecular

tienen la capacidad de agregar prote+nas' sin pro*ocar desnaturalizaci!n'


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por lo cual se pueden emplear como agentes precipitantes en lapuriicaci!n de enzimas)


23/83

%

*(STRUCTURANATI'AR(+AN(NT(

&% !% ,% T C

2&

&%

,&

#%%

AB

CD

"%


desnaturalizaci!n para dierentes prote+nas (ipot#ticas0 cuando se conoceel *alor m$"imo de la temperatura a la cual la enzima es estable' en unperiodo de tiempo determinado' se puede aplicar este principio como una

etapa que elimina a aquellos contaminantes no estables a la temperaturautilizada)

Fi:)-% 8.. Cur*as de desnaturalizaci!n t#rmica de un grupo de

prote+nas (ipot#ticas)

8.@. TCNICAS CROMATOGRFICASEn estas t#cnicas el principio de separaci!n est$ relacionado con

una propiedad particular de la mol#cula proteica' lo que les coniriere unma&or poder resoluti*o) Entre las t#cnicas cromatogr$+cas podemosencontrar una gran *ariedad de tipos' que adem$s de dierenciarse en elprincipio de separaci!n' tambi#n pueden presentar distintos grados deresoluci!n & capacidad) La gran *ariedad de t#cnicas cromatogr$+cas que

e"isten se debe al desarrollo tecnol!gico alcanzado (asta el presente)

[email protected]. CROMATOGRAFHA DE REPARTOEn ella las sustancias se colocan en un sistema que consta de dos

componentes distinguibles' una ase m!*il & una ase estacionaria0 lossolutos se separan debido a dierencias de distribuci!n entre ambas ases)El mo*imiento relati*o de cada mol#cula es el resultado de un equilibrioentre la uerza de transmisi!n 4el mo*imiento de la ase m!*il5 & la

uerza que tiende a renar este desplazamiento 4la ase estacionaria5)A la ase estacionaria se le llama sorbente0 s+ este es un l+quido que esmantenido en orma estacionaria por un s!lido' este 1ltimo recibe el


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nombre de soporte o matriz) La ase m!*il es el disol*ente o re*elador)

La cromatogra+a de reparto se basa en que' si dos ases se encuentran en

contacto & si una de las dos contiene un soluto' este se distribuir$ entrelas dos ases0 esto se conoce como reparto & *iene descrito por elcoeiciente de reparto' es decir' la relaci!n entre las concentraciones delsoluto en las dos ases)

La cromatogra+a de reparto empleada en puriicaci!n enzim$tica constade una columna 4un tubo de material $cilmente cortab+e5' lleno de unsorbente & un disol*ente0 una soluci!n que contiene el soluto se coloca enla parte superior del sorbente & puede penetrar en su interior) A

continuaci!n se permite luir el disol*ente a tra*#s de la columna)Aunque el sorbente & el disol*ente adoptan una disposici!n continua atodo lo largo de la columna' esta puede considerarse ormada por un grann1mero de capas indi*iduales 4$in% "!(-ic%5 que contienen cada unalas dos ases)

Consid#rese =-/ mol#culas id#nticas que se distribu&en equitati*amenteentre las dos ases2 estacionaria & m!*il' & una columna de diecioc(ol$minas 4*er igura ).5) En la l$mina superior las =-/ mol#culas est$n

distribuidas de orma que = se encuentran en cada ase) Cuando las =mol#culas de la ase m!*il pasan a la segunda l$mina' en est$ 1ltima sedistribu&en /D & /D en cada ase0 de las = que permanecen en la l$mina' tambi#n se distribuir$n en ella /D & /D respecti*amente)


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Solu;oAd4o2bido

Co3613;a6i>3 d1 Solu;o


Fi:)-% 8.1=. Muncionamiento de una columna de cromatogra+a dereparto)

La matriz utilizada en este tipo de cromatogra+a no debe adsorber a lossolutos0 los materiales m$s comunes son la "i!--% #! #i%"(nic% 4c!$i"!5'el :!$ #! 0$ic!' c!$)$o% !n ,o$o & algunos #!6"-%no como elS!,%#!6L?2=)

[email protected]. CROMATOGRAFHA DE ADSORCINEn este tipo de cromatogra+a' una supericie s!lida con una

amplia *ariedad de sitios de uni!n' por ejemplo' regiones con unadensidad electr!nica ele*ada 4cargadas negati*amente5' con una densidadelectr!nica baja 4cargadas positi*amente5' no polares' etc' se ponen encontacto con un l+quido que contiene un soluto)


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=5 la racci!n que se une no es una racci!n constante' s no quedisminu&e a medida que disminu&e la concentraci!n0 la *elocidad conque se mue*e la sustancia est$ relacionada con la uerza de uni!n' siendo

m$s lento el mo*imiento cuanto m$s irme es la uni!n) En consecuencia'las mol#culas pueden separarse si tienen isol+neas de adsorci!ndierentes' debido a que surir$n un grado dierente de retraso)

Una columna cromatogr$ica consiste en un tubo que se llena con elmaterial de la ase estacionaria' m$s un sol*ente) A continuaci!n secoloca un peque,o *olumen de la muestra 4una capa delgada5 sobre laose estacionaria0 se la deja penetrar en la columna 4esto se llama cargade la columna5) La cromatogra+a se desarrolla al dejar luir un disol*ente

4ase m!*il5 a tra*#s de la columna' 4*er igura )=5) Este 1ltimoproceso toma el nombre de elusi!n de la columna0 seg1n se *anmo*iendo las dierentes sustancias a tra*#s de la columna' se *anseparando & aparecen en el eluente cuando (an atra*esado la columna'en distintas racciones de recolecci!n)

Fi:)-% 8.12. Muncionamiento de una columna de adsorci!n' *#ase lasdos etapas dierentes de eluci!n)

El *olumen total del material de la columna tanto s!lido como l+quido'recibe el nombre de o$)!n #!$ $!co) El *olumen de la ase m!*il esel *olumen *ac+o o *olumen de retenci!n) La cantidad de *olumen que se

debe a,adir para producir un pico de un soluto concreto en el eluente sellama o$)!n #! !$)ci(n)

La orma en la que se prepara el lec(o de una columna se denomina


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empaquetamiento) Es mu& importante que el lec(o sea (omog#neo & nopresente burbujas' grietas o espacios entre las paredes0 el lujo desigualque diiculta el proceso se denomina lujo acanalado) El eecto normal de

este acanalamiento es la distorsi!n del patr!n de elusi!n' de orma queuna sustancia aparece en picos m1ltiples0 ello es el resultado delmo*imiento r$pido de la ase m!*il a tra*#s de la columna en estasdesigualdades & el restablecimiento del reparto o la adsorci!n en unnue*o punto)

El l+quido que abandona la columna se recoge en racciones discretasutilizando un colector de racciones como puede *erse en la igura )7)Los componentes que &a est$n separados se encuentran e identiican

titulando al+cuotas de cada racci!n 4midiendo acti*idad enzim$tica5)

Las columnas pueden ser eluidas de tres ormas2 el m#todo m$s sencilloconsiste en un $)o con"in)o del disol*ente a tra*#s de la columna) Elsegundo m#todo es la eluci!n por pasos' que se utiliza cuando la columnaunciona con prop!sitos preparati*os0 la columna es elu+da con undisol*ente (asta que se alcance un *olumen predeterminado0 acontinuaci!n se a,ade un segundo disol*ente) Este m#todo tiene la*entaja que un material concreto puede eluirse en un *olumen bastante

peque,o) Consid#rese una mezcla de sustancias en que la sustancia sure un uerte retraso cuando se emplea el disol*ente A' mientras que lasdem$s sustancias e"perimentan un retraso mu& peque,o0 adem$s' e"perimenta un retraso mu& d#bil con el disol*ente ?) Por lo tanto' s+ sela*a la columna con un e"ceso de disol*ente A' la ma&or parte delmaterial es elu+do de la columna' mientras que la ma&or parte de quedaunido a ella)


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A B


Fi:)-% 8.13. Colector de racciones autom$tico2 a medida que serecolecta una racci!n deinida' el colector gira al siguiente tubo) Laracci!n recolectada puede ser un *olumen ijo' un n1mero de gotas

determinado o un tiempo espec+ico de recolecci!n)

El tercer m#todo es el de !$)ci(n !n :-%#i!n"!' que consiste en cambiarla relaci!n de los dos disol*entes o ele*ar la concentraci!n de uno de loscomponentes del disol*ente 4por ejemplo la concentraci!n de una sal o laconcentraci!n de (idrogeniones5) Este m#todo es el m$s utilizado en lascolumnas de adsorci!n & de intercambio i!nico) Las gradientes sepreparan en aparatos similares a mostrado en la igura )D)

Fi:)-% 8.15. Aparato utilizado para preparar una gradiente de elusi!n2Consta de dos recipientes' un dep!sito 4A5 & una c$mara de mezcla 4?5que est$n conectados por sus bases0 el dep!sito contiene el sol*ente m$sconcentrado & la c$mara de mezcla el sol*ente en menor concentraci!n0el l+quido sale de la c$mara de mezcla & entra en la columna0 el l+quidolu&e simult$neamente del dep!sito a la c$mara de mezcla)

La cromatogra+a de adsorci!n utiliza una ase l+quida m!*il & una ase

estacionaria s!lida0 la separaci!n puede realizarse en columnas o en capaina) La tabla ) indica los adsorbentes m$s comunes & sus dierentesusos)

T%4$% 8.1MATERIALES DE USO CORRIENTE EN CROMATOGRAFHA

DE ADSORCIN

MATERIAL COMPUESTOS QUE SEPARA

Al1mina Peque,as mol#culas org$nicas' prote+nas

Kel de s+lice Esteroles' amino$cidos


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Ca


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Un gel es un ret+culo tridimensional cu&a estructura se dispone por logeneral al azar Los geles que se utilizan como tamices molecularesconstan de pol+meros entrecruzados' por lo general inertes' que no se

unen ni reaccionan con el material analizado & que no presentan cargael#ctrica) El espacio interior del gel est$ ocupado por un l+quido querellena la ma&or parte del gel)

Los geles de uso corriente son de tres tipos2 #!6"-%no' %:%-o% &,o$i%c-i$%i#%' para soluciones acuosas) El de"trano es un polisac$ridocompuesto por restos de glucosa & producido a partir de sacarosa por labacteria Leuconostoc mesenteroides)


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[email protected]. CROMATOGRAFHA DE INTERCAMBIO INICOUn intercambiador i!nico es un s!lido que tiene enlazados

qu+micamente grupos cargados' a los que se unen iones por uerzas

electrost$ticas0 puede intercambiar estos iones por iones de una soluci!nacuosa) Los intercambiadores i!nicos pueden utilizarse en columnas paraseparar mol#culas de acuerdo con su carga)

El principio de la cromatogra+a de intercambio i!nico es que lasmol#culas cargadas se adsorben a los intercambiadores de ormare*ersible' de modo que dic(as mol#culas pueden ser unidas o desunidascambiando el ambiente i!nico) La separaci!n mediante intercambiadoresi!nicos se realiza en dos ases2 en la primera' las sustancias a separar se

unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una uni!nuerte & estable0 a continuaci!n' se elu&e la columna con tampones dedierente p: o dierente uerza i!nica' compitiendo los componentes deltamp!n con el material' por los sitios de uni!n)


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3e"trano MC3CMA


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La ma&or+a de las prote+nas son estables dentro de un margen de p:determinado en el que est$n cargadas o positi*a o negati*amente) Por lotanto' si una prote+na es estable a *alores de p: por encima del PI' se

debe utilizar un intercambiador ani!nico0 si es estable por debajo del PI'utilizaremos un intercambiador cati!nico) La elecci!n entreintercambiadores uertes o d#biles tambi#n es importante & esta basadaen el eecto del p: sobre la carga & la estabilidad) Por ejemplo' si se *a acromatogra++ar una sustancia d#bilmente $cida que necesita p:s mu&altos o mu& bajos para su ionizaci!n' se requiere de un intercambiadoruerte debido a que este unciona a p:s e"tremos) 6o obstante' se lasustancia es l$bil' es preerible utilizar intercambiadores d#biles) Losintercambiadores d#biles son tambi#n buenos para separar mol#culas con

una carga ele*ada de aquellas con poca carga' debido a que los ionesd#bilmente cargados no se unen por lo general al intercambiador) Losintercambiadores d#biles permiten una ma&or resoluci!n si lasdierencias de carga son mu& peque,as)

[email protected]. CROMATOGRAFHA DE AFINIDADEs un tipo de cromatogra+a que utiliza la ainidad espec+ica entre

la sustancia que debe aislarse & una mol#cula a la que esta puede unirse

de orma especiica 4un ligando5) material de la columna se sintetizapor uni!n co*alente del ligando con una matriz insoluble0 a partir de estemomento la columna es capaz de adsorber en orma espec+ica' de lasoluci!n' la sustancia que *a a ser aislada) La eluci!n se realizacambiando las condiciones de manera que la uni!n &a no tenga lugar)

Para esta cromatogra+a deben cumplirse ciertos requisitos2

) La matriz no debe adsorber por si misma a ninguna mol#cula)

=) El ligando debe unirse a la matriz sin alteraci!n de sus propiedadesde uni!n)7) 3ebe escogerse un ligando cu&a uni!n sea uerte)D) 3ebe ser posible la eluci!n sin destrucci!n de la muestra)

El principal uso de esta cromatogra+a es la puriicaci!n de prote+nas'membranas & polisac$ridos2 Para la puriicaci!n de enzimas se puedeacoplar a la matriz el sustrato' un in(ibidor que se una con uerza o uncoactor)


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puriicaci!n parcial)

8.. MTODOS AU9ILIARES DE PURIFICACIN

3urante una puriicaci!n es posible que la enzima que se est$puriicando no est# en condiciones apropiadas para aplicar el siguientepaso de puriicaci!n' por ejemplo puede estar en baja concentraci!n o enuna soluci!n con un alto contenido de sales0 para solucionar estosproblemas se aplican m#todos espec+icos que por sus caracter+sticas & elobjeti*o para los que son utilizados no constitu&en' con algunase"cepciones' *erdaderos m#todos de puriicaci!n pero que' sin embargo'son mu& 1tiles & a *eces imprescindibles)

8..1. CONCENTRACINE"isten *arias ormas de concentrar la muestra enzim$tica en

puriicaci!n' una de ellas es la concentraci!n por precipitaci!n por laadici!n de )$%"o #! %onio' aunque tambi#n puede (acerse agregando%c!"on%) La des*entaja de este m#todo es que el precipitado redisueltocontiene el agente precipitante' que muc(as *eces se debe eliminar) Estosm#todos de precipitaci!n son adecuados solamente cuando el contenidoproteico del e"tracto est$ por encima de mg por ml)

Otra orma de concentrar es por adsorci!n' por ejemplo en unintercambiador i!nico' en este caso' solo se requiere que la enzima seadsorba totalmente sin que importe el resto de prote+nas) Aunque losm#todos m$s importantes son aquellos en los que se produce eliminaci!nde agua conjuntamente con solutos de bajo peso molecular0 esto puedelograrse con una gran *ariedad de procedimientos utilizando membranassemipermeables 4#i$ii5 o el principio de cromatogra+a en gel) Laspart+culas secas de un


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m#todo el agua es orzada a salir a tra*#s de una membrana dejando atr$sla soluci!n de prote+na m$s concentrada)


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cual conser*a durante largos periodos de tiempo' sustancias quemantienen pr$cticamente todas sus propiedades iniciales' inclu&endoorganismos *i*os) Consta de 7 etapas undamentales2

) Precongelaci!n0 el producto se congela completamente=) 3es(idrataci!n primar+a2 se mantiene congelado el producto & se

e"trae el agua por sublimaci!n 4agua no ligada57) 3es(idrataci!n secundaria2 una *ez desaparecidos todos los cristales

de (ielo' el producto es cuidadosamente calentado & comienza laeliminaci!n del agua que no orm! (ielo 4agua ligada5 que seencuentra uertemente unida al producto' por en!meno de adsorci!n)

8..2. ELIMINACIN DE SALESLos dos m#todos m$s empleados para eliminar sales son la

di$lisis & la cromatogra+a en gel' este 1ltimo se coment! anteriormente)El uso con*encional de bolsas de di$lisis est$ basado en las uerzasosm!ticas0 las altas concentraciones de sales o sol*entes org$nicos en lamuestra pro*ocan que el agua entre el interior del saco' antes que lassales lo abandonen 4aumento de *olumen de la bolsa en los primerosmomentos si la concentraci!n del soluto es alta5) Por esta raz!n la di$lisis

se usa tanto para eliminar e"ceso de soluto de bajo peso molecular comopara introducir una soluci!n nue*a de buer a la muestra)

La eliminaci!n completa de las sales end!genas no se puede lograr enuna sola di$lisis0 si el *olumen del buer es -. *eces el de la bolsa'entonces la mejor diluci!n que se puede lograr es de -. *eces en elinterior del saco) Un sistema con agitaci!n continua alcanza el equilibrioentre = a 7 (oras) %ientras ma&or es el *olumen del buer contra el quese dializa' menos cambios se requieren' por ejemplo un *olumen de

tamp!n .. *eces ma&or que el de la muestra' justiicar+a solo unadi$lisis)

Antes de dializar es recomendable tratar las membranas para eliminaruna serie de sustancias contaminantes que se introducen durante sumanuactura) Un buen m#todo es (er*irlas con una soluci!n de E3TABbicarbonato) Para guardar membranas &a usadas es recomendableconser*arlas en una soluci!n de bicarbonatoBE3TA)

8..3. MTODOS PARA DETERMINAR CONCENTRACINPROTEICAPara la elaboraci!n de la tabla de puriicaci!n es imprescindible


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conocer el contenido proteico total por mililitro de muestra' para poderdeterminar la acti*idad espec+ica & la pureza en cada etapa depuriicaci!n) Los m#todos m$s utilizados son el ?iuret' Lo>r&BMolin

Ciocalteu' absorci!n de luz a =. nm o =.- nm & uni!n a colorantes)Cada uno de estos m#todos tienen *entajas & des*entajas particulares'pero es bueno indicar que todos ellos mientras no se equilibran con unaprote+na de id#ntica composici!n' brindan una respuesta apro"imada 4conerror50 en la pr$ctica esto sigmiica que mediciones e"actas de prote+nassolo pueden (acerse para prote+nas puras' despu#s de estandarizarlasrente a una determinaci!n de peso seco para alg1n m#todo)

MTODO DE BIURET


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'- para distintas prote+nas)

La absorci!n a =. nm brinda una idea apro"imada de la concentraci!n

de prote+na0 sin embargo' durante una puriicaci!n' es posible utilizar estamedici!n para tener un criterio relati*o sobre la eliminaci!n de prote+nasen cada paso de puriicaci!n) Para prote+nas puras' este es el m#todo m$sadecuado &a que no requiere de ninguna manipulaci!n 4e"cepto ladiluci!n si es necesaria50 asimismo se dice que este m#todo es nodestructi*oG por cuanto la cantidad utilizada en la determinaci!n puedeser de*uelta a la muestra original) El requerimiento principal ser+a elconocer el coeiciente de e"tinci!n para una prote+na en particular) Estem#todo tambi#n requiere de un blanco apropiado)

La absorci!n en el UV lejano es un m#todo m$s sensible & menosdependiente d#la composici!n aminoac+dica de la prote+na) equiere deespectroot!metros m$s costosos pues la lectura se (ace entre =.. & ==.nm0 la longitud de inda con menos *ariaci!n en su coeiciente dee"tinci!n es la de =.- nm' donde las distintas prote+nas oscilan entre ='-& 77) Este m#todo requiere de cubetas limpias' buers con m+nimaabsorci!n & tiene una sensibilidad entre .'. a .'.- mg)

U!IO! A COLORA!TESTiene una alta sensibilidad & rapidez similares al m#todo de Lo>r&)0 elcolorante m$s usado es el %&)$ #! Coo%i! G27=' en $cido 4$cidoos!rico5' toma un color pardo rojizo pero cuando se une a las prote+nasrestaura el color azul)


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7) XWu# *entajas muestra la cromatogra+a de e"clusi!n molecular sobrelas otras cromatogra+as en una puriicaci!n enzim$ticaY

D) XCu$l es el m#todo m$s recomendable para concentrar una muestracuando el contenido proteico esta por debajo de un mgmlY


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CAPITULO I

CONTENIDO

PRODUCCIN DE ENZIMAS MICROBIANAS

Las enzimas (an sido empleadas en la industria desde (ace muc(os a,os0(asta los a,os /. del siglo pasado' las enzimas pro*enientes de plantas &tejidos animales eran econ!micamente las de ma&or importancia0 la

d#cada de los 8.s se inicia con una re*oluci!n industrial en cuanto a laproducci!n de enzimas' pues se empiezan a producir enzimas de origenmicrobiano en gran escala' gracias al desarrollo de la %icrobiolog+a'?iolog+a molecular e Ingenier+a gen#tica)

El e"plosi*o desarrollo de las enzimas proteol+ticas de origen bacterianoempleadas en la abricaci!n de detergentes' in*irti! m$s r$pido de loesperado esta situaci!n) Para ;/; las *entas de la empresa 6o*oaumentaron -. *eces respecto a las de a,os anteriores en que solo

produc+an enzimas de origen eucari!tico) Pero la tecnolog+a del 36Arecombinante permit+a &a la obtenci!n de enzimas de organismossuperiores a partir de microorganismos)

EL MICROORGANISMOEl primer aspecto en considerar en el desarrollo de un sistema deproducci!n de enzimas es' desde luego' la selecci!n del microorganismoadecuado para el proceso) En este sentido se tienen muc(os a*ances

recientes en ?iotecnolog+a) Consideremos primeramente lascaracter+sticas deseables de los microorganismos2

) 6o debe ser pat!geno ni producir to"inas) La reglamentaci!n de la


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M3A 4Mood and 3rug Administraron5' considera KA< a una enzimaproducida por un microorganismo KA< 4Keneralmente reconocidocomo seguro5) 3e no ser as+' la enzima es catalogada como aditi*o &

se *e sujeta a largas & costosas pruebas para demostrar su inocuidadlo que puede retrasar su aplicaci!n unos a,os) Por esta raz!n' ungran n1mero de enzimas comerciales son producidas porA$ ni%er& A$ory'(e&R$ ory'(e' *er tabla ;))

=) Es preerible que la enzima sea producida e"tracelularmente &a quelos procedimientos de recuperaci!n son m$s sencillos puesto queadem$s de enrentarnos a una enzima m$s robusta' e*itar+amos laetapa adicional de ruptura celular' as+ como un e"tracto crudo que

contiene al menos -.. prote+nas contaminantes' mientras que une"tracto e"tracelular contiene solo unas cuantas)

7) La enzima debe ser producida con altos rendimientos' por lo que eldesarrollo del microorganismo implica alg1n tipo de mutaci!n)

D) El costo de producci!n debe ser razonable' lo que implica que elmicroorganismo pueda crecer r$pidamente en sustratos gradoindustrial' consumi#ndolos totalmente & con pocos requerimientosespec+icos) Por esta raz!n se preiere a las enzimas constituti*as con

respecto a aquellas que necesitan de alg1n agente inductor en elmedio' m$"ime cuando el requisito sea alg1n ion que (icieseimposible la aplicaci!n de la enzima en alguna industria 4un ejemplotenemos en los iones arsenato & molibdato en la obtenci!n de glucosaisomerasa por la industria alimentaria5)

TABLA .1ALGUNOS MICROORGANISMOS GRAS ENZIMAS QUE

PRODUCEN

Aspergillus Niger ala amilasa' celulasa' glucoamilasa' lactasa' pectinasa'catalasa' glucosa o"idasa' proteasa' lipasa)

Aspergillus oryzae ala amilasa' glucoamilasa' lactasa' lipasaRhizopus oryzae ala amilasa' glucoamilasa' pectinasaBacillus subtilis ala amilasa' proteasaRhizopus nveas KlucoamilasaSaccharomyces cerevisiae In*ertasa

Streptomyces rubiginosus glucosa isomerasaBacillus cereus eninaMucor mihei renina' lioasa' esterasa


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-) La selecci!n del organismo puede (acerse igualmente en t#rminos delas caracter+sticas deseadas para la enzima0 como ejemplo tenemos laselecci!n de organismos term!ilos para obtener enzimas

termoestables o bien la selecci!n de una uente de nitr!geno proteicaque obligue a la inducci!n de ciertas proteasas 4como queratinasas5)

?ACIA QUE APUNTAN LAS IN


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En&i% in#)ci4$!La ma&or parte de las enzimas comerciales son inducibles' es decir'requieren de una sustancia' generalmente el sustrato de la enzima' como

inductor) 3e acuerdo con el modelo de Zacob & %onod 4;/5' elinductor permite la s+ntesis de la enzima al unirse con el represor quebloquea al gen operador impidiendo su transcripci!n) Cuando el inductores de alto peso molecular & no puede atra*esar la pared celular de labacteria' por ejemplo celulosa' el d+mero celobiosa puede actuar comoinductor) En la tabla ;)= se muestran algunos ejemplos de enzimasinducibles)

TABLA .2EJEMPLOS DE ENZIMAS INDUCIBLES

ENZIMA MICROORGANISMO INDUCTOR 3e"transacarasa

3e"tranasaAla amilasa6aringinasaPululanasa

In*ertasaKlucosa isomerasaTirosinasa

Leuconostoc mesenteroides*enicillium +uniculosum

B(cillus su,tilisAs-er%illus ni%er

.le,siell( -neumonid(e

*ullul(ri( -ullul(nsB(cillus co(%ul(ns!euros-or( cr(ss(


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ENZIMAS SUJETAS A REPRESIN CATABLICA

ENZIMA MICROORGANISMO REPRES

In*ertasaLactasa

3e"transacarasaCelobiasaProteasasCatalasa

Ala amilasa

Neurospora crassaEscherichia coli

Leuconostoc mesenteroides

Trichoderma viride

Bacillus subtilis

Rhodotorula mucilaginosa

Bacillus estearthermophilus

KlucosaBrucKlucosa


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Una *ez deinidas las condiciones del ensa&o' se selecciona la t#cnicaanal+tica m$s adecuada para determinar la concentraci!n de producto

obtenido o bien la de sustrato & se procede a cuantiicarlos durante losprimeros minutos de la reacci!n' se obtiene as+ la *elocidad inicial dereacci!n) Un problema mu& com1n de las enzimas con aplicaci!n en el$rea de la industria alimentaria es la imposibilidad de aplicar lasUnidades de acti*idad enzim$tica' &a que los sustratos & sutransormaci!n' no pueden e"presarse en orma molar0 por esta raz!n esque se aplican deiniciones arbitrarias' basadas en consecuenciasadicionales de la acci!n de las enzimas) Ver tabla ;)-

TABLA .7DETERMINACIN DE LA ACTI


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puede (acerse directamente con una cantidad conocida de c#lulas0 o bienes necesario lle*ar a cabo un proceso de permeabilizaci!n de c#lulas parae*itar que la diusi!n a tra*#s de la membrana sea el paso limitante) Para

esto 1ltimo se emplea tolueno' alco(ol isoam+lico' sales' etc) En amboscasos la acti*idad medida puede reerirse a la cantidad de c#lulasempleadas en el ensa&o)

B Es necesario romper las c#lulas para e"traer la enzima pues de otraorma la acti*idad no se e"presa)


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enzimas producidas por ermentaci!n s!lida & en la igura ;) se obser*ala producci!n de celulasa por Trichoderm( )irideen culti*o semis!lido)

TABLA .@ALGUNAS ENZIMAS PRODUCIDAS POR CULTI


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sobre sal*ado de trigo' I)B aspersi!n de agua' IQ)B


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Estas dierencias son m$s notorias para las enzimas intracelulares0 as+ porejemplo' la enilalanina amonio liasa de Rhodotorul( %lutinis esproducida sin regulaci!n del p:' a un *alor inicial de 8'. & al inal del

proceso es e"tra+da a p: de '.) La de"transacarasa de Leuconostocmesenteroides es secretada con m$"ima producti*idad a p: /'-'adecuado para el crecimiento del microorganismo' siendo el p: dem$"ima acti*idad & estabilidad de -'=) La subtilisina de B(cilluslicheni+ormises estable entre - & .' tiene !ptima acti*idad entre ; & &la m$"ima producci!n se obtiene entre /'- & /')

Es e*idente que en el caso de todas las enzimas proteol+ticas' el p: dem$"ima estabilidad no coincide con el de m$"ima acti*idad pues la

enzima se autodigerir+a) Para la regulaci!n del p:' as+ como para losajustes al inicio & al inal del proceso' el $cido & la base debenseleccionarse' despu#s de asegurarse que no tengan eectos negati*ossobre la enzima) El (idr!"ido de sodio & el $cido ortoos!rico son losm$s empleados)

Aunque no constitu&e un m#todo de puriicaci!n en el sentido estricto delt#rmino' muc(as *eces se emplean tratamientos de p: &o temperatura alinal de un proceso de puriicaci!n para eliminar acti*idades enzim$ticascontaminantes menos estables que la de la enzima de inter#s0 en esesentido' tratamientos t#rmicos destru&en la acti*idad transglucosidasa dela glucoamilasa) El proceso de regulaci!n del p: puede e*itarse enalgunos casos' incrementando el poder amortiguador del medio deculti*o en la zona de m$"ima producti*idad)

E$ !#io #! c)$"io

Algunas enzimas requieren de ciertos iones en el medio para suproducci!n' estos cumplen roles importantes como coactores o comoestabilizadores de la enzima' por ejemplo la s+ntesis de ala amilasasrequiere la presencia de calcio & magnesio) Una *ez determinados losrequerimientos para la producci!n de la enzima por parte delmicroorganismo' los elementos restantes se basan en los requerimientospara el crecimiento del propio microorganismo como la uente decarbono & la uente de nitr!geno)

En la tabla ;)8 se presenta algunos ejemplos en los cuales la uente decarbono del medio es el substrato de la enzima que se desea producir'


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desempe,ando entonces *arias unciones' uente de carbono & de energ+apara el microorganismo e inductor de la enzima)

Por otro lado' para la uente de nitr!geno e"isten muc(as alternati*as' latabla ;) muestra las principales uentes de nitr!geno disponibles para laproducci!n de enzimas microbianas' aunque por lo general se preierenlas ormas complejas por ser m$s econ!micas)

TABLA .MEDIOS DE CULTI


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producci!n' por lo que es posible emplear materias primas de alto costo'pero de tal pureza que aciliten las etapas subsecuentes de puriicaci!n)

L% %i-!%ci(n

Por los requerimientos de o"+geno los procesos ermentati*os se di*idenen aerobios' microaerobios' anaerobios & anaerobios estrictos) El o"+genoes siempre di+cil de incorporar por su baja solubilidad en el medio' deall+ la necesidad de un sistema mu& eiciente de in&ecci!n de o"+geno &un sistema de mezcla apropiado' para la correcta distribuci!n del mismoen todo el medio de culti*o)

E"iste una concentraci!n !ptima de o"+geno para cada enzima' as+ la LBasparraginasa de E$ coli creciendo en glucosa' en condiciones deaerobiosis el rendimiento en c#lulas es ele*ado' pero se produce pocaenzima0 mientras que en anaerobiosis' se producen pocas c#lulas perocon un alto contenido de enzima)

Cin*"ic% #! ,-o#)cci(n #! !n&i%

La producci!n de enzimas est$ asociada al crecimiento de losmicroorganismos' as+ (a& unas cu&a s+ntesis se detiene al llegar a laase estacionaria0 sin embargo' lo com1n es encontrar la producci!nde enzimas en la ase post e"ponencial' sin ninguna relaci!n con elcrecimiento)

A dierencia de lo que sucede para muc(os metabolitos primarios' en elcaso de producci!n de enzimas no pueden establecerse relaciones

estequiom#tricas en la ermentaci!n) El rendimiento en enzima es mu&*ariable' pero los sistemas industriales sobre todo los basados enAs-er%illus' llegan a producir m$s de - gL de prote+na 1til secretada almedio' mientras que por manipulaci!n gen#tica por ejemplo' se (allegado a que =-H de la prote+na intracelular de un mutante sea solo unaenzima)

RECUPERACIN DE LA ENZIMA

La ma&or parte de las enzimas microbianas son producidas en culti*osumergido' por lo tanto uno de los principales objeti*os de la operaci!nde recuperaci!n es eliminar el agua al menor costo posible) Cuando la


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concentraci!n de la enzima al inicio de la puriicaci!n es alta' su preciode *enta es menor0 mientras menos concentrada est# al inicio 4implicauna metodolog+a de puriicaci!n mas costosa5' su precio ser$ cada *ez

ma&or) En este sentido se tiene algunos ejemplos2 las amilasasmicrobianas tienen una concentraci!n en el e"tracto inicial de -..mgHapro"imadamente & se *enden a un d!lar el Sg0 renina de origenmicrobiano inicia su proceso de puriicaci!n a una concentraci!n de .mgH & tiene un precio cercano a ... d!lares el Fg) Kliceroosatodes(idrogenasa tiene una concentraci!n inicial de alrededor de .'- mgH& se *ende apro"imadamente a ..... d!lares el Filo & uroquinasa & lama&or+a de enzimas terap#uticas inician su puriicaci!n en el e"tractomicrobiano a una concentraci!n de .'.. mgH & cuestan luego del

proceso de puriicaci!n' alrededor de ..... d!lares el gramo)

El tama,o de la producci!n tambi#n est$ relacionado con el costo de lamisma' mientras menor sea la producci!n enzim$tica' ma&or ser$ elprecio de la enzima0 para tener una idea' papa+na se produce en lotes de..... Filos' costando el Fg alrededor de -. d!lares0 renina se produceen cantidades de ....... de Filos' siendo el costo de la producci!n de7 d!lares el Sg0 mientras que glucoamilasa & amilasa se produce en lotesde -....... de Filos' con un costo por Filo de un d!lar)

El grado de puriicaci!n de la enzima depende del $rea de aplicaci!ninal2 alimentos' armacia' industria te"til' industria curtidora' industriapapelera' etc)' & de la orma en que *a a ser aplicada' diagn!stico' aditi*oen alimentos' medicamento' catalizador en la industria' etc) Estoscriterios se aplican igualmente en la ormulaci!n del producto inal0 as+

por ejemplo' los productos usados en detergentes biol!gicos contienen(asta un .H de enzimas' mientras que las preparaciones amilol+ticasempleadas como aditi*os para (arinas' contienen no mas de .'H de alaamilasa)

PRINCIPALES ETAPAS EN LA RECUPERACIN DE ENZIMASMICROBIANAS'

E9TRACCIN'


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enzimas intracelulares ligadas' se emplean detergentes como el

#!o6ico$%"o> SDS> "!!n> "-i"on' los cuales en condiciones de bajauerza i!nica & a un p: adecuado' se combinan con las prote+nas ligadas'

ormando miscelas & de esta orma las solubilizan) Un ejemplo es la

e"tracci!n de uricasa de C(ndid( utilis' la que se e"trae con

!-c%,"o!"%no$& "-i"on N1=1)

$i,%%> oo$i,%%> ,-o"!%%> +)i"in%% o :$)c%n%% seagregan para degradar parcial o totalmente las paredes celulares) Parabacterias grampositi*as que tienen mureina' se emplea $io&i%0 lasgramnegati*as requieren de tratamientos adicionales de $i,%% &oo$i,%%para eliminar la capa de lipopolisac$rido)

Pueden emplearse tambi#n +)i"in%% para el tratamiento de paredcelular de (ongos & :$)c%n%% para le*aduras) La presencia depolicationes a*orece el proceso' de all+ que se use +)i"o%n> +)i"o%ni#-o:$)"%%"o> ,o$i$iin% & algunos %n"i4i("ico) El policati!ndesestabiliza la pared celular)

RUPTURA CELULAR'

E"isten muc(as t#cnicas a ni*el de laboratorio' pero s!lo dos m#todosmec$nicos som empleados a gran escala2 el el (omogenizador de altapresi!n basado en el dise,o de M%n"on G%)$inpara lec(e 4D a = Fg dele*adura seca por (ora5 & el molino de eseras de alta *elocidad' el D/noi$$4=. Sg de le*adura seca por (ora5 tanto *ertical como (orizontal) A

ni*el de laboratorio el m#todo m$s usado es el ultrasonido)

Para ambos m#todos' el luido debe pasar *arias *eces por el equipo'dependiendo de la dureza de la c#lula) La optimizaci!n consiste endeterminar el n1mero m+nimo de pasos por el equipo' la m$"imaconcentraci!n de alimentaci!n & las condiciones de ruptura 4tiempo demolido o presi!n5 para obtener la m$"ima e"tracci!n' sin que la enzimapierda acti*idad por calentamiento & sin reducir demasiado el tama,o delas c#lulas' pues esto diiculta la separaci!n posterior de los residuos)

%as del -.H de los procesos industriales de obtenci!n de enzimasintracelulares emplean el (omogenizador' alrededor del .H emplean el


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molino de alta *elocidad & las dem$s' otras t#cnicas &a descritasanteriormente) Por su dureza' las c#lulas microbianas se clasiican enorden creciente en2

)B Mic!$io' =)B 4%ci$o :-%n!:%"io & coco' 7)B 4%ci$o:-%,oi"io' D)B$!%#)-%'-)Bcoco :-%n!:%"io &/)B!,o-%)

En las bacterias grampositi*as la gruesa capa de mure+na puede llegar a

constituir el ;.H del peso seco de la pared' de all+ su dureza0 en tanto que

en las bacterias gramnegati*as es tan solo el .H)

Algunos m#todos adicionales de ruptura celular e"clusi*os para

microorganismos son2 tratamiento alcalino' lisozima & E3TA parabacterias grampositi*as' tratamiento con detergentes' c(oque rio para

bacterias gramnegati*as' c(oque osm!tico' congelamiento &

descongelamiento' etc)

SEPARACIN DE SLIDOS'

La eliminaci!n de c#lulas al inal de la ermentaci!n' la eliminaci!n de

residuos celulares despu#s de la ruptura & la recuperaci!n o eliminaci!n

de precipitados 4prote+nas & $cidos nucl#icos5' se eect1a por

centriugaci!n o por iltraci!n) La selecci!n del equipo mas adecuado

depende de *arios actores dentro de los que podemos destacar' tama,o

de part+cula' dierencia de densidades entre las ases a separar' *iscocidad

del medio' la aglomeraci!n & caracter+sticas pegajosas del precipitado) En

todos los procesos pr$cticamente es necesario el agregado de loculantes

4(idrocoloides o polielectrolitos5 con el in de aglomerar las part+culas &

acilitar su separaci!n)

La operaci!n de separaci!n mas empleada en la recuperaci!n de enzimas

es la centriugaci!n0 el tiempo & la *elocidad deben ser cuidadosamente

seleccionadas en cada etapa en que se requiera) Otra operaci!n

importante es la ultrailtraci!n0 con el conocimiento del P% de la enzimaa procesar' se selecciona la membrana o la ibra con el tama,o de poro

adecuado para su retenci!n' permitiendo al sistema concentrar la muestra


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al eliminar agua' dializar & puriicar parci$lmente &a que las prote+nas

peque,as atra*ezar$n el poro)

La ultrailtraci!n tiene la *entaja de no cambiar de ase a la enzima' de

poder operarse a bajas temperaturas' no se agregan sustancias ajenas al

sistema' tiene bajos requerimientos energ#ticos & es $cilmente operada)

Tiene la des*entaja del mantenimiento & cuidado de las ibras o

membranas' que pueden bloquearse con acilidad) %uc(as enzimas son

comercializdas en orma l+quida sin ma&or procesamiento que la

eliminaci!n de c#lulas' la ultrailtraci!n & la ormulaci!n)

PRECIPITACIN> E9TRACCIN LHQUIDOLHQUIDO CROMATOGRAFHAS'

`a (emos estudiado los m#todos de precipitaci!n' todos los cuales son

aplicados en la e"tracci!n de enzimas microbianas0 la e"tracci!n l+quidoB

l+quido utiliza pol+meros como el polietilenglicol' de"tranos o osatoslos cuales al ser agregados al medio' atrapan a la enzima' e"trandola0

aunque como (emos *isto' el polietilenglicol es usado tambi#n para

concentrar la muestra a tra*#s de una membrana semipermeable & como

agente precipitante & estabilizante de prote+nas) En relaci!n a las

cromatogra+as' tambi#n casi todas son aplicables para microorganismos)

SECUENCIA DE OPERACIONES'

E"iste poca inormaci!n disponible sobre que operaciones seleccionar &

en qu# secuencia' al dise,ar un proceso de puriicaci!n de enzimas

microbianas) 3e un an$lisis de re*istas peri!dicas eectuado en ;D'

en .. publicaciones sobre puriicaci!n de enzimas' se encontr! que la

operaci!n mas usada es la cromatogra+a de intercambio i!nico 48-H de

los


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procesos la empleaban' 8-H de los cuales empleaban soportes con

deri*ados 3EAE5) En -8H de los casos se empleaba la precipitaci!n & en

8-H de estos se (acia con sulato de amonio)

SECADO FORMULACIN'

Las preparaciones enzim$ticas comercializadas en orma s!lida' son

secadas gener$lmente en !c%#o-! #! !,-!%' mientras que cuando laacti*idad es inestable' o no se preparan grandes *ol1menes de muestra o

se requiere de un manejo est#ril' la lioilizaci!n es la t#cnica m$s

apropiada)

En la ormulaci!n del producto es necesario tomar en cuenta *arios

actores en relaci!n con la dosis de enzima en la aplicaci!n inal para

acilitar su uso & e*itar grandes diluciones) En este sentido lasormulaciones l+quidas son de m$s $cil manejo' pero tiene el

incon*eniente de una menor estabilidad)

Keneralmente las preparaciones l+quidas contienen agentes estabilizantes2

:$ic!-o$> o-4i"o$> ,o$i!"i$!n:$ico$> etc)' as+ como agentespreser*antes24!n&o%"o> o-4%"o' etc) Por otro lado' el material inerteconsiste de %&;c%- 4glucosa' lactosa' etc)5 o de ($i#o #! %$i#(n

4adicionados antes del secado tienen un eecto protector sobre la enzima5'%$4preparaciones de papa+na para ablandamiento de carnes5 o inclusi*e"%$co) 6o e"iste una regla general sobre la ormulaci!n de productos)


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COSTOS'


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CAPITULO 9

CONTENIDO

INMO


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reutilizadas repetidamente) Posteriormente esta deinici!n se (a ampliadoa aquel proceso por el cual se restringen' completa o parcialmente' losgrados de libertad de mo*imiento de enzimas' org$nulos' c#lulas' etc) por

su uni!n a un soporte)

Como !n"%% del empleo de enzimas inmo*ilizadas podemos destacar2) El aumento de la estabilidad de la enzima)=) La posible reutilizaci!n del deri*ado' por lo que disminu&en los costesdel proceso)7) La posibilidad de dise,ar un reactor enzim$tico de $cil manejo &control' adaptado a la aplicaci!n de la enzima inmo*ilizada) Losdierentes tipos de reactores enzim$ticos aparecen en la Migura .))

Estos reactores con enzimas inmo*ilizadas permiten el empleo de cargasele*adas de enzima' la cual mantendr$ su acti*idad durante m$s tiempo)Estos sistemas pueden incluir el reciclado' lo que permite la obtenci!n deproductos con ma&or pureza)

Los principales incon!ni!n"! del proceso de inmo*ilizaci!n son D2) La alteraci!n de la conormaci!n de la enzima respecto de su estadonati*o)=) La gran (eterogeneidad del sistema enzimaBsoporte donde puedene"istir distintas racciones de prote+nas inmo*ilizadas con un dierenten1mero de uniones al soporte)7)


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Fi:)-% 1)B eactores enzim$ticos que emplean enzimas inmo*ilizadas)

En general' los *"o#o #! inoi$i&%ci(n se suelen clasiicar en dosgrandes categor+as2Retenci0n +1sic(& Uni0n 2u1mic($

%TO3O< 3E I6%OVILI[ACI\6 3E E6[I%A< PO ETE6CI\6M


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El atrapamiento' de gran sencillez desde el punto de *ista e"perimental'requiere poca cantidad de enzima para obtener deri*ados acti*os) Como

*entaja adicional' la enzima no sure ninguna alteraci!n en su estructura)3e todas ormas' el atrapamiento requiere un control riguroso de lascondiciones de polimerizaci!n' as+ como la comprobaci!n de que lanaturaleza qu+mica del proceso no altera los grupos reacti*os de laprote+na) Los geles de poliacrilamida son los m$s utilizados en elatropamiento de enzimas' aunque se pueden usar geles que se orman apartir de pol+meros naturales como la gelatina' el FBcarragenano' elalginato' el agar' etc)

Fi:)-% 1=.2)B %#todos de inmo*ilizaci!n mediante retenci!n +sica)

El atrapamiento de las enzimas en las ibras sint#ticas se realiza tras laadici!n de un agente coagulante 4como el tolueno o el eter de petr!leo5 auna emulsi!n ormada por una soluci!n acuosa que contienen la enzima &

un disol*ente inmiscible con el agua donde esta disuelto el pol+mero) Alentrar en contacto' se producen los ilamentos de ibra que contienenmicrogotas de soluci!n enzim$tica atrapadas en las microca*idades delpol+mero 4principalmente acetato de celulosa5) El atropamiento en ibraspresenta como *entaja principal rente a los geles la ele*ada supericie deuni!n a la enzima sobre todo si las ibras son inas) Por otra parte' lasibras son resistentes a $cidos d#biles & uertes' a soluciones de uerzai!nica ele*ada & algunos disol*entes org$nicos)


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En la actualidad' la tecnolog+a solBgel se esta imponiendo como m#todogeneral para el atropamiento de enzimas' debido a su gran sencillez &n1mero de aplicaciones como la preparaci!n de biosensores'

biocatalizadores e incluso !rganos artiiciales) En general' la (idr!lisis$cida de un precursor tetraBalco"iBsilano origina un gel tras laneutralizaci!n del $cido & la eliminaci!n del alco(ol liberado) Con el inde que el gel posea poros o canales de un tama,o suiciente para quediundan los sustratos & productos' se pueden a,adir dierentes agentesdurante la encapsulaci!n de las enzimas) Estos compuestos' como lagluclosa o el sorbitol' son eliminados tras sucesi*os la*ados) 3espu#s deuna etapa de en*ejecimiento del gel 4=B=D (oras5' este se puede secar(asta alcanzar el estado de "erogel) En este 1ltimo estado' la diusi!n de

los sustratos & productos no se *e alterada0 en cambio la enzima no puedeatra*esar los poros' &a que se encuentra totalmente atrapada en laestructura de la s+lice' *er igura .)7)

Fi:)-% 1=.3)B Inmo*ilizaci!n de enzimas mediante el m#todo solBgel

Inclusi0n en mem,r(n(s3 Di)idid( en dos ti-os3

) Mic-o!nc%,)$%ci(n2 En esta t#cnica' las enzimas est$n rodeadas demembranas semipermeables que permiten el paso de mol#culas desustrato & producto' pero no de enzima) Estas membranassemipermeables pueden ser permanentes 4originadas por polimerizaci!ninteracial5 o no permanentes 4generadas por suractantes' tambi#n

llamadas micelas re*ersasG5) Las microc$psulas obtenidas son de ormaes#rica' con tama,os comprendidos entre & .. m de di$metro)%ediante este m#todo se pueden encapsular simult$neamente una gran*ariedad de enzimas' c#lulas o biomol#culas' permitiendo que se lle*en a


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cabo determinadas reacciones que suceden en m1ltiples pasos) Ver igura.)D

Los liposomas son miscelas ormadas por una doble capa suractante' detal manera que el disol*ente e"terior es acuoso' en *ez de ser org$nicocomo sucede con las miscelas re*ersas) Las enzimas incluidas en estosmicroentornos permanecen acti*as & en algunos casos mejoran suacti*idad & estabilidad t#rmica 4igura .)-5)

Fi:)-% 1=.5) %#todo de microencapsulaci!n de enzimas porpolimerizaci!n interacial

Fi:)-% 1=.7) Enzimas incluidas en micelas re*ersas & liposomas


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.)7)B %TO3O< 3E I6%OVILI[ACI\6 3E E6[I%A< POU6I\6 WU%ICA

45$6$4$ Uni0n ( so-ortes


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Fi:)-%1=.) %#todos de inmo*ilizaci!n mediante uni!n qu+mica)

45$6$4$4$ Adsorci0n

En este tipo de inmo*ilizaci!n' la enzima se une a un soporte sinuncionalizar mediante adsorci!n de tres tipos2 +1sico& i0nico o por2uel(ci0n o uni!n a metales) La adsorci!n +sica es el m#todo m$ssencillo de inmo*ilizaci!n &a que s!lo consiste en poner la soluci!n deenzima en contacto con el soporte al que se une electrost$ticamente) La

adsorci!n i!nica se eect1a al utilizar resin(s de interc(m,io i0nico4como C%Bcelulosa' 3EAEBcelulosa' sep(ade"' amberlite' etc)5' lascuales contienen grupos uncionales por otros iones de la misma carga'sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble)Los principales+actores que inlu&en en la inmo*ilizaci!n de enzimas poradsorci!n' son24$ El -8 del medio2 controla el n1mero & la naturaleza de las cargas quepresenta la supericie de la prote+na & del s!lido)

9$ L( +uer'( i0nic(2 al aumentar la uerza i!nica se produce la desorci!nde la enzima' &a que los iones inorg$nicos se unen con m$s uerza alsoporte que la prote+na)6$ L( -erme(,ilid(d y el :re( su-er+ici(l3 en la ma&or+a de los casos escon*eniente una gran $rea supericie 4ma&or a .. m=g5 & un di$metrode poro grande' apro"imadamente dos *eces el tama,o del eje ma&or dela enzima 4ma&or a 7. nm5 para que la enzima & el sustrato puedanpenetrar $cilmente);$ L( -resenci( de iones que act1en como coactores de la enzima' &a

que pueden incrementar la carga enzim$tica del deri*ado)

Como principales )ent(/(s de este m#todo destacan2


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En cambio la inmo*ilizaci!n por enlace co*alente tambi#n presenta unaserie de incon)enientes3

) Es necesario conocer la densidad de grupos acti*os por unidad desupericie' &a que condiciona el n1mero de uniones enzimaBsoporte & sugeometr+a' que puede ser distorsionante & conducir a deri*ados inacti*os)=) El proceso de inmo*ilizaci!n puede alterar la estructura del centroacti*o) Para e*itar esta posible alteraci!n' se realiza la inmo*ilizaci!n enpresencia de un in(ibidor que bloquee el centro acti*o)7) La inmo*ilizaci!n co*alente no es aconsejable en aquellas enzimasmu& sensibles a cambios de p:' uerza i!nica' etc)


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45$;$ Reticul(do

Tambi#n denominado entrecruzamiento o cross


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Fi:)-% 1=.8) %icrootogra+as 4=-."5 de unos cristales reticulados4CLECs5 de penicilina acilasa de E


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encuentran en interase2 en el medio de reacci!n & en la ase constituidapor el soporte con la enzima) Como consecuencia' la acti*idadenzim$tica se *e aectada por eectos de tipo diusional' est#rico & del

microentorno)

45$>$4$ E+ecto de l( inmo)ili'(ci0n en l( est(,ilid(d de l(s en'im(s

Keneralmente se obser*a un incremento en la estabilidad de las enzimasdespu#s de su inmo*ilizaci!n' que se debe principalmente a las siguientesrazones2

) Un( est(,ili'(ci0n con+orm(cion(l de la enzima debido a la e"istencia

de uniones multipuntuales enzimaBsoporte) La estructura terciaria de laenzima adquiere una ma&or rigidez & se (ace m$s resistente a ladesacti*aci!n t#rmica o qu+mica) Este tipo de estabilizaci!n se obtiene1nicamente en aquellos m#todos en los que inter*ienen enlaces de tipoco*alente' como el reticulado o la uni!n a soportes acti*ados)La inmo*ilizaci!n co*alente multipuntual se puede combinar con laadici!n de reacti*os biuncionales que den ma&or rigidez a la estructurade la enzima)

=) Una -rotecci0n +rente ( l(s -rote(s(s en el medio)


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enzima poseer$ la cantidad necesaria de agua en su microentorno paramantener su conormaci!n acti*a)

45$>$9$ E+ectos de l( inmo)ili'(ci0n so,re l( (cti)id(d en'im:tic(

Tras una inmo*ilizaci!n' la acti*idad de la enzima puede disminuir eincluso perderse por di*ersas razones)


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b5 resistenci(s di+usion(les intern(s2 debida a que los sustratostienen que atra*esar el interior del gel' microc$psula' ibra o poro delsoporte donde se encuentra la enzima inmo*ilizada)

E"isten di*ersas maneras de minimizar estos eectos diusionales comopor ejemplo2 disminuir el tama,o del biocatalizador' aumentar laconcentraci!n de sustrato' incrementar la agitaci!n o el lujo en elreactor' etc) Con estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa de6ernst' & como consecuencia' el *alor de FmQ disminu&e)

=5E+ectos electrost:ticos entre el sustr(to y el so-orte3


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caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular' pero si se trata desustratos con pesos moleculares ele*ados' la acti*idad de la enzimainmo*ilizada disminu&e dr$sticamente) Por ejemplo' muc(as (idrolasas

unidas co*alentemente a soportes s!lidos' a pesar de que son mu& acti*asrente a sustratos peque,os' muestran una acti*idad mu& baja (aciaprote+nas' polisac$ridos & $cidos nucleicos) Este eecto est#ricoG sepuede e*itar mediante una inmo*ilizaci!n co*alente a tra*#s de un brazoespaciador enzimaBsoporte m$s largo)

D5E+ectos en el microentorno3

La enzima inmo*ilizada se encuentra en un entorno dierente al (abitual'especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados el#ctricamente) Eleecto obser*ado suele ser un desplazamiento en el *alor del p: !ptimode la cat$lisis enzim$tica &' muc(as *eces' un ensanc(amiento en elinter*alo de p: en el cual la enzima puede actuar) Por ejemplo' unaenzima unida a un soporte cargado negati*amente 4como el C%Bsep(ade"5 tendr$ en su microentorno una concentraci!n ma&or de(idrogeniones que en el medio de reacci!n) Como resultado' la enzimainmo*ilizada ser$ m$s acti*a a un p: m$s alcalino) La enzima ser+a m$sacti*a a p: m$s $cidos si estu*iera unida a un soporte cargadopositi*amente 4*)g) 3EAEBsep(ade"5)

.)/) I6%OVILI[ACIO6 3E COMACTOEeen sol*ent' enz&me and solid support in>aterBproo reaction media) Eur) Z) ?ioc(em) 8=2 -87B-8) ;

tercera fase enzimologia

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