INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EFECTO DEL TRATAMIENTO TÉRMICO, ENZIMÁTICO Y TERMICO-ENZIMATICO SOBRE LOS PIGMENTOS Y MICRO

ESTRUCTURA DE LA FLOR DE CALABAZA.

DIRECTORA DEL PROYECTO: Dra. Ma. Eugenia Jaramillo Flores

1. INTRODUCCIÓN

En la Industria alimentaría se tienen varios parámetros para definir la calidad de

un producto y uno de los más importantes es el color. Este es un atributo que

los consumidores asocian con el sabor, olor e incluso con el dulzor de los

alimentos (Griffiths, 2005). Muchos colores artificiales se emplean para darle

uniformidad a los alimentos en cada estación y para cada lote. También se

usan colorantes naturales los cuales son consumidos en nuestra dieta diaria.

Estos se pueden obtener de animales, vegetales y minerales; por ejemplo:

frutas (mango, piña, sandia, uva, entre otras); flores (flor de calabaza,

zempoalxochitl) y verduras (zanahoria, camotes, jitomate). Estos colorantes

son sensibles a las condiciones adversas del ambiente (Downham y Collins,

2000).

Una característica importante de los colores derivados de fuentes naturales

que tienen muchas frutas y vegetales es que son compuestos bioactivos como

el efecto antioxidante demostrado en pigmentos como carotenoides (carotenos,

astaxantina, licopeno, luteína); antocianinas, entre otros. (Rodríguez-Amaya,

2001; Griffiths, 2005).

Los carotenoides son más de 600 pigmentos, responsables de los colores

amarillos, naranjas y rojos, de animales, flores, frutas y vegetales, tal es el caso

de la flor de calabaza, que se cultiva en los estados de Querétaro, Toluca,

Hidalgo y Puebla, entre otros. La flor de calabaza presenta un color amarillo

característico y pertenece a la familia de las cucurbitáceas. Por cada 100

gramos de flor aporta 47 g de calcio, 86 mg de fósforo y 67 µg de retinol (Ferriol

y col., 2003).

El color amarillo característico de la flor de calabaza se debe a que contiene

carotenoides, los cuales son utilizados como colorantes naturales en alimentos.

Los compuestos susceptibles al calor, como los carotenoides pueden ser

procesados y conservados a través de un método útil como es la

microencapsulación por secado por aspersión (Büchi, 2002; Alamilla, 2004),

que tiene la finalidad de proporcionar un medio de protección a materiales

sensibles a la luz, oxígeno y temperaturas altas y así facilitar los procesos

posteriores como es la adición de los colorantes a alimentos.

Considerando lo mencionado anteriormente se plantea realizar un estudio del

efecto protector del proceso de microencapsulación por secado por aspersión

sobre los pigmentos de la flor de calabaza y su actividad antioxidante.

3. JUSTIFICACIÓN La flor de calabaza se cultiva en varios lugares de la República Mexicana y

tradicionalmente el pueblo mexicano la consume como alimento en diferentes

formas. Desafortunadamente, el período de vida de esta flor después de su

cosecha, es corto, por lo que el tiempo disponible para su consumo es limitado.

Una característica importante que presentan estas flores es un intenso color

amarillo, pigmentación debida al contenido de carotenoides, los cuales

presentan propiedades como antioxidante, benéfica para la salud, misma que

ha sido ampliamente documentada. Sin embargo, estos pigmentos son

altamente sensibles a luz, temperatura, oxígeno, por lo que, cualquier método

utilizado para su conservación, deberá considerar evitar en lo posible, la

degradación de los pigmentos presentes. Una opción que se ha utilizado para

proteger la actividad de fármacos, aromas, pigmentos, entre otros, es la

microencapsulacion a través de secado por aspersión. Emplearemos este

método de conservación con el fin de aumentar la vida media de la flor de

calabaza; conservar los pigmentos y sus propiedades y así, promover su uso

en sopas, cremas, sazonadores, etc. Dada las pocas investigaciones sobre los

pigmentos de la flor de calabaza, en este trabajo se plantea el estudio del

efecto del proceso de microencapsulación por secado por aspersión sobre los

pigmentos de la flor de calabaza y su actividad antioxidante.

4. HIPÓTESIS La microencapsulación por secado por aspersión de la flor de calabaza tendrá

un efecto protector sobre el color, actividad antioxidante y contenido de

pigmentos.

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo General

Estudiar el efecto del proceso de microencapsulación por secado por

aspersión sobre los pigmentos de la flor de calabaza y su actividad antioxidante.

5.2 Objetivos Particulares

1. Identificar y cuantificar contenido de carotenoides en Flor de Calabaza.

2. Evaluar el efecto del proceso de microencapsulación sobre el contenido de

carotenoides, color, actividad antioxidante y actividad enzimática de lipasa y

lipoxigenasa.

3. Determinar diferentes condiciones de microencapsulación por secado por

aspersión de la Flor de calabaza.

4. Determinar la morfología de las partículas de polvo obtenidas y algunas

características relacionadas con rehidratación de polvos.

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Acondicionamiento de la materia prima A la flor de calabaza se le corta el tallo dejándola libre del pistilo,

posteriormente se lava con agua para eliminar las impurezas (tierra), se tritura

en mortero hasta homogeneidad y finalmente se almacena en congelación

hasta su uso.

La materia prima se dividió en 4 lotes para someterlos a diferentes tratamientos

el primero es la flor de calabaza deshidratada y triturada, el segundo se trató

primero con la mezcla de pectinasa y celulasa (MACEREX PM) en una

proporción de 100 mL/Ton a 15°C y posteriormente con una mezcla de

celulasa-hemicelulasa y β-glucanasa (CELLUZYME) al 0.5% en base seca a

50 °C, se dejan actuar por espacio de 2 h; el tercero se sometió a un

tratamiento térmico a 93°C durante 3 minutos y el último se sometió a

tratamiento enzimático, descrito para el segundo lote y un tratamiento térmico.

6.2 Determinación de color en la flor de calabaza La medición de color se realiza mediante la lectura directa de la muestra en el

Espectrofótometro Color Mate HDS (marca Milton Roy, Diano Color Products),

utilizando el sistema Cie-Lab y CIE. Con Iluminación C dando los siguientes

parámetros: L*, a* y b* del sistema Cie-Lab, y los parámetros X, Y; y Z del

sistema CIE, donde L* corresponde a la claridad y a* y b* a la cromaticidad,

definiendo el componente rojo-verde con el parámetro a*; rojo para valores

positivos y verde para valores negativos. El parámetro b* define el componente

amarillo- azul; amarillo para los valores positivos y azul para los valores

negativos. Los colores son tanto más saturados cuanto más separados se

encuentren del centro del gráfico los puntos que los definen.

Para evaluar la cromaticidad se definen las llamadas coordenadas de

cromaticidad: x, y, z; las cuales se obtienen al expresar los valores tríestimulo

(X, Y, Z) como fracciones de su suma total. Matemáticamente se expresa por:

ZYXZz

ZYXYy

ZYXXx

++=

++=

++= ;

Posteriormente se grafican “x” y “y” en el diagrama de cromaticidad para

obtener la longitud de onda predominante de la muestra, el % de saturación y

la claridad esta dada por “Y”.

6.3 Extracción de carotenoides en la Flor de Calabaza La extracción de los carotenoides se lleva a cabo mediante el método de

Rodríguez- Amaya (1999). Los carotenos se extraen ya homogeneizados,

triturando las muestras en un mortero añadiendo acetona a 10°C.

Posteriormente, se realiza la saponificación de las muestras agregando en

forma estratificada a la fase etérea un volumen de 1:1 de solución de hidróxido

de potasio al 10% en metanol, se agita y se deja en reposo durante 18 horas.

Una vez hecha la saponificación, los carotenoides se transfieren a éter de

petróleo, luego se separa la fase etérea (color) de la fase grasa. La fase etérea

es lavada con agua destilada varias veces para remover la acetona residual y

el agua residual es removida con sulfato de sodio anhidro y el extracto es

concentrado con nitrógeno gaseoso de alta pureza. Las muestras se guardan

en el refrigerador y protegidas de la luz.

6.4 Determinación de carotenoides totales en la flor de calabaza Se pesan de 2 a 5g pétalos de flor de calabaza, se extraen los carotenoides

como se mencionó en el punto anterior. Se mide el volumen de la fase etérea y

se lleva a 10mL con éter de petróleo. Se toma una alícuota de 0.25mL y se

afora a 10mL en un matraz aforado. Finalmente se lee en el espectrofotómetro

a 450 nm y aplica la siguiente formula:

)100*%()10**()(

6

cmAyAgx =µ

x = concentración de carotenoides

y = volumen de la solución que da una absorbancia de A en una longitud de

onda específica

A%cm = es el coeficiente de absorción del carotenoide en el disolvente usado,

según especificaciones (Para éter de petróleo es 2592)

6.5 Determinación de la actividad antirradical con el radical ABTS El ABTS +• se genera mezclando el reactivo 2,2 azino-bis (3-etilbenzotiazolina-

6-ácido sulfónico) (ABTS) (SIGMA, A1888) a una concentración 7mM con

peroxidisulfato de potasio (SIGMA,P5592) 2.45mM (concentración final en 10

mL de agua) y se mantiene en un cuarto oscuro de 12-16 horas antes de su

uso. La solución acuosa de ABTS se diluye en etanol (1:100) teniendo una

absorbancia de 0.7 ( ± 0.02) a 734 nm en una celda de 1cm a 30 ºC.

Las muestras se someten al proceso de extracción de carotenoides (ver 6.3) y

se resuspenden en 500µL de acetona. Se adiciona 990mL de solución ABTS +

a las muestras (10µL). Se mezclan y después de 1 minuto se mide la

absorbancia de cada muestra a 734nm, durante 7 minutos. Se debe correr un

testigo. Los valores de absorbancia son corregidos de la siguiente forma:

)(0)(0)(0

)(5)(0

/)()(

solventetsolventetmuestrat

muestratmuestratmuestra AAA

AAA

===

==

−

−=∆

%inhibición= muestraA∆ *100

Las determinaciones se hacen por triplicado tanto de muestras como del

estándar (Charurin y col., 2002).

6.6 Determinación de actividad de lipasa en la flor de calabaza fresca La flor de calabaza previamente acondicionada se tritura con Tris 50mM–

CaCl2 7.5mM (pH= 8.0), posteriormente se centrifuga durante 10 minutos a

10000 rpm para obtener el extracto enzimático de la Flor de Calabaza. Se

preincuba el substrato (0.05% de tributirina, previamente sonicado durante

10min) en Tris 100mM-CaCl2 25mM (pH= 8.0), a 37 °C durante 5 minutos.

Se agregan 0.3mL del extracto enzimático de la Flor de Calabaza a 2.4mL de

substrato (tributirina) en tubo de ensayo y 0.6mL de la solución Tris 50mM–

CaCl2 7.5mM (pH= 8.0), se incuba a 37°C durante 30 min en agitación

constante y se lee la densidad óptica a 450nm de longitud. Finalmente se

interpola en la curva de actividad enzimática de lipasa.

6.7 Determinación de actividad de lipoxígenasa (LOX) en la flor de calabaza fresca

La flor de calabaza previamente acondicionada se tritura con Regulador de

Borato de Sodio 0.2M (pH=9.0), posteriormente se centrifuga durante 10

minutos a 10000 rpm para obtener el extracto enzimático de la Flor de

Calabaza.

Se agrega 0.05mL del extracto enzimático a 0.1mL de Ac. Linoleico 7.5mM,

0.1mL de EtOH y 2.75mL de de regulador de Borato 0.2M (pH 9.0) y se lee el

incremento de absorbancia a 234nm durante 3 min cada 30 segundos.

Finalmente se interpola en la curva de actividad enzimática de LOX.

6.8 Identificación y cuantificación de carotenoides en la Flor de Calabaza Las muestras concentradas se resuspenden en 500 µL de acetato de etilo

grado HPLC (1mL), se filtran a través de una membrana de nylon con poro de

0.45µm y después se inyectan en una columna C18 de HPLC.

Se utiliza un sistema de elución en gradiente con acetato de etilo 100% como

fase móvil A y metanol: agua (9:1) como fase móvil B y una velocidad de flujo

de 1.0 mL/min, y una longitud de onda de 450nm Todos los disolventes son de

grado HPLC. Se observará el perfil de las muestras.

6.9 Acondicionamiento de la Flor de calabaza antes de su deshidratación por aspersión. Se pesa la Flor de calabaza y se trata primero con la mezcla de pectinasa y

celulasa (MACEREX PM) en una proporción de 100 mL/Ton a 15°C y

posteriormente con una mezcla de celulasa-hemicelulasa y β-glucanasa

(CELLUZYME) al 0.5% en base seca a 50 °C, se dejan actuar por espacio de 2

h, después del cual se filtran, se escaldan y se adicionan al agua con el agente

encapsulante.

6.10 Preparación de la suspensión Se prepara la suspensión con flor de calabaza, acarreador y/o película

protectora, en las diferentes relaciones y concentraciones siguiendo el modelo

experimental, de Box-Behnken, de superficie de respuesta para el proceso de

secado, con el Software Design-Expert versión 7.03 (Stat-

Ease,Inc.,Minneapolis,Min.,2006).

A esta dispersión se le determina color, carotenoides totales y actividad

antioxidante, y actividades enzimáticos (lipasa y lipoxigenasa) como se

describió en los puntos 6.2, 6.6 y 6.7.

7. RESULTADOS y DISCUSION Las muestras se obtuvo de Texcoco Estado de México; y fue almacenada a

temperatura ambiente cubiertas con papel estraza posteriormente se dividió en

cuatro lotes de acuerdo al tipo de tratamiento al que se sometieron:

Muestra deshidratada a temperatura ambiente (cruda)

Tratamiento Enzimático

Tratamiento Térmico

Tratamiento Enzimático y Térmico

7.1Determinación de color de los pétalos de la flor de calabaza

De acuerdo a los resultados mostrados en el Cuadro 3, se observa una ligera

disminución del % de claridad o brillo, es decir que hay un obscurecimiento en

la luminosidad de las muestras con tratamiento enzimático y tratamiento

enzimático-térmico en comparación con la muestra cruda lo cual puede

deberse a la degradación de la clorofila presente, por acción de la luz, oxígeno

y enzimas, desenmascarando así los carotenoides (Suzuki, 2004). Y en la

muestra con tratamiento térmico se observó que aumentan los valores de

porcentaje de claridad, mientras que la longitud de onda correspondiente a

cada una de las muestras puede decirse que permanece entre amarillo y

naranja. En tanto a la diferencia de color con respecto a la muestra

deshidratada y sin tratamiento es mayor en las muestras que se sometieron a

un tratamiento enzimático, lo cual puede deberse al oscurecimiento que se

presenta por el largo periodo de exposición al oxígeno mientras se lleva a cabo

la hidrólisis enzimática.

Según Rodríguez Amaya (1997), es probable que existan las condiciones

necesarias para la isomerización y oxidación de los carotenoides en el proceso

de almacenamiento de alimentos, causando la pérdida de color entre otras

características, lo que explica la diferencia de color en las muestras con

tratamiento tanto enzimático como térmico.

Cuadro 3. Color Total de las muestras de Flor de Calabaza

MUESTRA λ nm

% saturación

Y (claridad o brillo)

%

∆E* Diferencia de color

CRUDA 585 (amarillo) 41.8 24 ----

ENZ 585 (amarillo) 34.5 22.8 9.6± 0.1

TERM 584 (amarillo) 38.9 27.9 4.4± 0.04

ENZ+TERM 584 (amarillo) 31.5 22.7 9.6± 0.1

Los resultados son promedio de tres determinaciones ± error estándar

7.2 Carotenoides Totales

En las muestras con tratamiento tanto enzimática como térmica y enzimático-

térmico se observa un aumento de cantidad de carotenoides (Cuadro 4), lo

cual puede deberse a que por el tipo de tratamiento exista una liberación de los

carotenoides presentes en la flor, ya que las carbohidrasas ayudan a hidrolizar

la fibra, mientras que la temperatura modifica la estructura de la fibra y en

consecuencia de la pared celular, probablemente haciéndola más permeable,

así como provoca la precipitación de algunas proteínas.

Cuadro 4 Contenido de Carotenoides Totales en Flor de Calabaza con diferentes tratamientos

Muestras sin saponificar

Muestras saponificadas

Muestra (µgcarot/gpeso seco) Muestra (µgcarot/gpeso seco) cruda 3092.391±0.003 cruda 518.278±0.002

Enzimática 3227.436±0.009 Enzimática 643.770±0.001 Térmica 4189.009±0.003 Termica 752.840±0.002

Enz.+ Term. 5044.764±0.005 Enz.+ Term. 934.937±0.001 Los resultados son promedio de tres determinaciones ± error estándar

Lo anterior se puede corroborar ya que en las imágenes tomadas en el

microscopio Óptico de Barrido (SEM) se puede observar que la muestra

deshidratada a temperatura ambiente (Figura 3) tiene una estructura más

completa y rígida que la muestra con tratamiento térmico-enzimático (Figura 6)

la cual tiene una estructura en forma de red mostrando el rompimiento causado

por el tratamiento térmico (Figura 5) y el tratamiento enzimático (Figura 4),

teniendo un menor tamaño, comparándola con las muestras anteriores,

causando un efecto sinérgico reflejándose en una mayor cantidad de

carotenoides presentes en dicha muestra.

+

Figura 3 Muestra sin tratamiento (cruda) observada en el SEM

Figura 4 Tratamiento Enzimático observada en el SEM

Figura 5 Tratamiento Térmico observada en el SEM

Figura 6 Tratamiento Enzimático-Térmico observada en el SEM

En cuanto a las muestras saponificadas, podemos decir que el proceso de

saponificación daña notablemente a los carotenoides en todas las muestras,

sin embargo el hidrolizar los ésteres de carotenoides facilita la identificación de

los carotenoides en el perfil cromatográfico (Fernández, 2007).

7.3 Actividad Antirradical a) Muestras sin saponificar

Se puede observar (Cuadro 5) que en la muestra con tratamiento tanto térmico

como enzimático disminuye la actividad antioxidante, lo cual se debe a que

dichos tratamientos causan la oxidación de los carotenoides y por lo tanto la

isomerización de estos (Paiva y col., 1999). Mientras que la muestra sometida

al tratamiento enzimático-térmico tienen un aumento en dicha actividad.

Cuadro 5 Equivalentes Trolox en Flor de Calabaza con diferentes tratamientos con ABTS en relación con carotenoides totales

Muestras sin saponificar Muestra (mM)Eq.Trolox

ABTS µg carot/gpeso seco

cruda 15.3±0.2 3092.391±0.003 Enzimática 13.0±0.2 3227.436±0.009

Termica 14.1±.0.1 4189.009±0.003 Enz.+ Term. 22.0±0.2 5044.764±0.005

Muestras Saponificadas Muestra (mM)Eq.Trolox

ABTS µgcarot/gpeso seco

cruda 35.3±0.2 518.278±0.002 Enzimática 32.2±0.003 643.770±0.001

Termica 25.0±0.3 752.840±0.002 Enz.+ Term. 32.3±0.3 934.937±0.001

Los resultados son promedio de tres determinaciones ± error estándar Lo anterior se puede explicar al observar los cromatogramas de las muestras

cruda (Figura 7), con tratamiento enzimático (Figura 8) y térmico (Figura 9), ya

que existe un cambio en los perfiles que se puede asociar con la aparición de

isomeros y nuevos compuestos que posiblemente tengan una menor actividad

antirradical debido a la interacción que tienen entre ellos, mientras que en el

perfil cromatográfico de la muestra con tratamiento enzimático-térmico (Figura

10) se observan los picos más definidos que en las muestras anteriores, así

como un pequeño incremento del pico de Luteína.

Cruda

Figura 7 Perfil cromatográfico muestra deshidratada y sin tratamiento (cruda)

Figura 8 Perfil cromatográfico muestra sometida a un tratamiento enzimático

Figura 9 Perfil cromatográfico muestra sometida a un tratamiento térmico

Trat. Enzimático

Trat. Térmico

7.4 Actividad de lipasa En la Figura 15 podemos observar que la actividad de lipasa es mayor en

muestras que se sometieron a tratamiento térmico que en la muestra sin

tratamiento (deshidratada), lo cual nos indica que el tiempo del proceso térmico

no fue el suficiente para su inactivación, ya que por el contrario se incrementó

su actividad enzimática, por lo que se requiere efectuar una cinética de

inactivación de la enzima. Así mismo, la actividad de la muestra sometida al

tratamiento enzimático también aumento en comparación con la muestra

deshidratada; teniendose la mayor actividad de lipasa en la muestra sometida

al tratamiento enzimático-térmico debido a un efecto sinérgico de ambos

tratamientos.

Trat. Enzimático+Térmico

Act. Lipasa

0.00E+00

2.00E-06

4.00E-06

6.00E-06

8.00E-06

1.00E-05

1.20E-05

1.40E-05

cruda enz term enz+term

Muestras

U/ g

pes

o se

co

Figura 15 Actividad de Lipasa del Extracto de Flor de Calabaza

con diferentes tratamientos

7.5 Actividad de LOX En la Figura 16 podemos observar que la actividad de LOX es mayor en las

muestras que se sometieron al tratamiento térmico con respecto a la muestra

sin tratamiento, lo que indica que el tiempo del proceso térmico no fue

suficiente ya que se activaron las enzimas presentes en la flor de calabaza.

Por el contrario, la muestra sometida al tratamiento enzimático tal vez esté

produciéndose algún compuesto que inhibe o inactiva a la enzima LOX por lo

que disminuye la actividad de dicha enzima, así podemos ver el efecto

antagónico que tiene la actividad de LOX en la muestra enzimático-térmico.

Esto tomando como referencia el perfil cromatográfico de las muestras

saponificadas sometidas a tratamiento enzimático o enzimático térmico.

Actividad LOX

0.000E+00

5.000E-05

1.000E-04

1.500E-04

2.000E-04

2.500E-04

3.000E-04

3.500E-04

cruda enz term enz+term

Muestras

U/m

gpro

t

Figura 16 Actividad de LOX de Extracto de Flor de Calabaza

con diferentes tratamientos

8. CONCLUSIONES • Las muestras tienen una longitud de onda predominante

correspondiente al amarillo, las muestras con tratamiento tanto térmico

como enzimático disminuyen tanto en su porcentaje de saturación como

en el porcentaje de claridad con respecto a la muestra sin tratamiento.

• La diferencia de color es mayor en la muestras con tratamiento

enzimático con respecto a la muestra sin tratamiento

• El contenido de carotenoides totales aumentó en las muestras con

tratamiento tanto térmico como enzimático teniendo un efecto sinérgico

en el tratamiento enzimático-térmico.

• En las imágenes de flor de calabaza tomadas en SEM se puede

observar que la hidrólisis de la fibra tuvo mayor efecto en el tratamiento

enzimático-térmico.

• La actividad antirradical disminuye en las muestras que se sometieron al

tratamiento térmico y al tratamiento enzimático en comparación con la

muestra deshidratada, lo que se ve reflejado en los perfiles

cromatográficos en los que se observan picos no definidos.

• La actividad antirradical aumenta en la muestra sometida al tratamiento

enzimático-térmico en comparación con le muestra deshidratada, lo que

se ve reflejado en el perfil cromatográfico en el que se observan picos un

poco más definidos que los tratamientos enzimático y térmico por

separado.

• La actividad antirradical aumenta en las muestras sometidas al proceso

de saponificación.

• Las muestras sometidas al tratamiento enzimático tiene mayor actividad

antirradical que la muestra sometida al tratamiento térmico.

• La actividad antirradical de las muestras sometidas al tratamiento

enzimático se deben a 3 compuestos representados en los perfiles

cromatográficos durante el tiempo 3-8 minutos

• El proceso de saponificación dañó severamente a los pigmentos

reflejándose en una fuerte disminución en la concentración de

carotenoides totales.

• La actividad de lipasa es mayor en las muestras con tratamiento

enzimático y térmico que la muestra deshidratada, causandio un efecto

sinérgico en el tratamiento enzimático-térmico.

• En las muestras con tratamiento enzimático se inhibe o inactiva a la

enzima LOX por lo que disminuye la actividad de LOX.

• En las muestras con tratamiento térmico aumenta la actividad de LOX

por efecto de la temperatura.

• El tratamiento térmico-enzimático ayudó a disminuir el tamaño de

partícula de la suspensión de la flor de calabaza por lo que se logró

secar por aspersión.

• Se obtuvo un polvo color amarillo con una longitud de onda

predominante de 580nm, 39.6% de saturación y 47.89% de brillo o

claridad