1

Efecto del grado de acetilación en las características morfológicas, fisicoquímicas y 1

estructurales del almidón de cebada 2

3

Resumen 4

Se acetiló almidón de cebada a dos niveles bajo grado de sustitución (BGS) y alto 5

grado de sustitución (AGS) y se determinaron las características morfológicas, 6

fisicoquímicas y estructurales del almidón acetilado de cebada. Los almidones 7

acetilados presentaron la señal a 1226 cm-1 correspondiente al estiramiento C-O de los 8

grupos acetilos. El estudio morfológico mostró una fusión de los gránulos de almidón 9

en el almidón acetilado con AGS. Este efecto fue evidente en la prueba del 10

comportamiento de pastas debido a que el perfil visco amilográfico del almidón AGS no 11

presentó el pico de viscosidad, el rompimiento de la viscosidad y el setback de la 12

viscosidad. El pico de gelatinización fue similar para el almidón nativo el almidón BGS 13

y disminuyó en el almidón acetilado AGS. El valor de la entalpía de gelatinización 14

mostró una diferencia entre las muestras, indicando una mayor pérdida del orden de las 15

dobles hélices más que una pérdida de la cristalinidad, y esta fue mayor en el almidón 16

acetilado de AGS. En la prueba de retrogradación, la sustitución de AGS evitó la 17

retrogradación debido a que se obtuvo el más bajo valor de entalpía en este almidón 18

acetilado. Los valores de los parámetros Mw y de Rz disminuyeron debido al proceso de 19

acetilación, indicando una despolimerización de los componentes del almidón y esto se 20

evidenció por el incremento en la concentración de cadenas cortas en las muestras 21

acetiladas. 22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

Palabras clave: cebada; almidón; oxidación; estructura; propiedades fisicoquímicas. 32

Introducción 33

34

2

La acetilación es uno de los métodos más comúnmente usado para la 1

estabilización del almidón. Este tipo de modificación se obtiene por la esterificación del 2

almidón nativo con los reactivos de anhídrido acético, vinil acetato o ácido acético 3

(Jarowenko, 1986; Rutenberg y Solarek, 1984; Wurzburg, 1964). El almidón acetilado 4

se clasifica dependiendo del grado de sustitución (GS) en alto y en bajo GS. Los 5

almidones acetilados con bajo GS se usan comúnmente en la industria de los alimentos 6

debido a que confieren consistencia, textura y estabilidad. Los almidones con alto GS se 7

usan como sustitutos termoplásticos del acetato de celulosa (de Graaf y col., 1995; Xu y 8

col., 2004). Recientemente, los acetatos de almidón (con bajo y alto GS) se sugirieron 9

para la elaboración de materiales biodegradables empleados en el empacado de 10

alimentos y en diversas aplicaciones farmaceúticas (Chen y col., 2007; Elomaa y col., 11

2004; Heins y col., 1998; Santayanon y Wootthikanokkhan, 2003; Xu y Hanna, 2005). 12

Las propiedades del almidón acetilado dependen de la fuente botánica del 13

almidón, el GS, la relación amilosa/amilopectina y de cómo fue modificada la estructura 14

molecular del almidón. En la reacción de acetilación, el número de grupos acetilos que 15

se incorporan en la molécula de almidón, y la velocidad y la eficiencia, dependen del 16

tipo de reactivo y la concentración, el pH, la presencia de catalizador, el tiempo de 17

reacción, el origen botánico del almidón y el tamaño y las características estructurales 18

del gránulo nativo (Betancur-Ancona y col., 1997; Huang y col., 2007; Huber y 19

BeMiller, 2000; Rutenberg y Solarek, 1984). Diversos investigadores han reportado las 20

características del almidón acetilado de varias fuentes botánicas (Chen y col., 2007; de 21

Graaf y col., 1995; Elomaa y col., 2004; Heins y col., 1998; Huang y col., 2007; 22

Santayanon y Wootthikanokkhan, 2003; Xu y Hanna, 2005). 23

La cebada (Hordeum vulgare) es uno de los principales cultivos de cereales. El 24

grano de cebada es usado principalmente en la industria cervecera y del malteado y 25

como forraje para la alimentación animal. Aunque el interés en la cebada como un 26

componente en los sistemas alimenticios se debe principalmente a los potenciales 27

efectos benéficos a la salud de los -glucanos (Song y Jane, 2000), la cebada todavía 28

representa una importante fuente de almidón para los alimentos y las aplicaciones 29

industriales. El principal componente de los granos de cebada es el almidón, el cual 30

consiste de dos gránulos distintos: los grandes, con forma de disco, clasificados como 31

del tipo A y los pequeños, de forma esférica y conocidos como del tipo B (Ao y Jane, 32

2007; You y Izydorczyk, 2007). Se han reportado diversos estudios con respecto al 33

almidón nativo de cebada (Rojas y col., 2008; Rolland-Sabaté, 2007; Stevnebø y col., 34

3

2006; You y Izydorczyk, 2007), pero muy pocos se han reportado sobre el almidón 1

modificado químicamente de cebada. Forssell y col. (1995) realizaron una oxidación en 2

almidón de cebada y de papa, determinando que el almidón de cebada fue más difícil de 3

oxidar que el almidón de papa debido a las diferencias en las estructuras granulares de 4

ambos almidones (Forssell y col. 1995). Jeon y col. (2003) comprobaron la potencial 5

aplicación de encapsulación del almidón succinado de cebada y observaron resultados 6

prometedores. 7

Recientemente, Nilsson y Bergenstahl (2007) modificaron hidrofóbicamente 8

almidón de cebada con anhídrido de octenil succinato y evaluaron sus propiedades 9

emulsificantes y de adsorción. Realmente son escasos los estudios realizados por la 10

modificación química por acetilación al almidón de cebada. El objetivo de este estudio 11

fue investigar las propiedades morfológicas, fisicoquímicas y estructurales del almidón 12

acetilado de cebada a dos diferentes niveles. 13

14

Materiales y métodos 15

Materiales 16

La Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo proporcionó los granos de cebada de 17

la variedad M-16 (Hordeum sativum jess). La empresa Arancia Productos de Maíz 18

(Toluca, Estado de México) donó el almidón de maíz común. Se compró la isoamilasa 19

(CE 3.2.1.68) derivada de la bacteria gram negativa Pseudomonas amyloderamosa de 20

los Laboratorios Bioquímicos Hayashibara, Inc. (Kayama, Japón). Se adquirió NaOCl 21

(contienendo 13 % de cloro activo) de la compañía Hycel de México, S.A. de C.V. 22

Todos los reactivos químicos fueron grado ACS (American Chemical Society). 23

24

Aislamiento del almidón 25

Los granos de cebada se lavaron con agua destilada para eliminar el polvo y otras 26

substancias adheridas. El almidón de cebada se aisló usando el método de Adkins y 27

Greenwood (1966) con algunas modificaciones. Los granos de cebada se remojaron en 28

una solución amortiguadora de acetato de sodio 0.02 M (pH 6.5) conteniendo cloruro de 29

mercurio 0.01 M. La relación de la solución de remojo a los granos fue de 2:1 (v/p). La 30

mezcla se mantuvo a temperatura ambiente y se agitó ocasionalmente por 24 h. Se 31

removió la solución y los granos ablandados se lavaron completamente con agua 32

destilada. Después los granos se homogeneizaron en una licuadora (modelo 33

BLM2350P, Black & Decker, México, D.F.) por 1 min a la velocidad máxima. La 34

4

solución se tamizó sucesivamente por las mallas no. 40 (425 m), 100 (150 m), 200 1

(75 m), 270 (53 m) y 325 (45 m). En cada malla el residuo se lavó con agua 2

destilada hasta que no salió nada de almidón. La suspensión final se mantuvo a 3

temperatura ambiente por 24 h para sedimentar el almidón, y entonces se decantó el 4

agua. Se resuspendió el almidón en una solución acuosa de NaCl:tolueno (7:1) al 0.1 M 5

y entonces se mezcló a 50 rpm a temperatura ambiente. Se centrifugó la suspensión a 6

9000 x g por 15 min, y se desechó el sobrenadante de la fase de tolueno conteniendo 7

proteínas y lípidos. Se removió cuidadosamente la superficie superior de color gris del 8

precipitado, y la superficie inferior de color blanco conteniendo almidón se lavó 9

repetidamente con una solución de NaCl-tolueno. Posteriormente, el almidón aislado se 10

secó a 40 °C y se almacenó a temperatura ambiente en un recipiente. 11

12

Acetilación del almidón 13

Se realizó la modificación del almidón por acetilación utilizando el método modificado 14

de Mark y Mehltretter (1972). Para lo cual, se pesaron 15 g de almidón (en base seca) y 15

se mezclaron con 120 mL de anhídrido acético (Reasol, Milan, Italia) en un matraz de 16

reacción con dos cuellos, agitando a 200 rpm con un agitador (Ika-Werke, Cincinnati, 17

Oh.) por 5 min; posteriormente, se agregaron 1.65 g de una solución de NaOH al 50 % 18

(v/v). Se incrementó la temperatura a 120 °C en 15 min, empleando un recipiente de 19

aluminio con aceite mineral, una vez que se alcanzó esta temperatura, se paró la 20

reacción a dos diferentes tiempos de reacción (0.5 y 6 h) obteniendo almidón acetilado 21

con bajo y alto grado de sustitución, respectivamente. Cuando finalizó el tiempo de 22

reacción, se retiró el matraz del contenedor hasta que el medio de reacción alcanzó 50 23

°C, entonces, se precipitó el almidón con 100 mL de alcohol etílico al 96 %. En seguida, 24

se centrifugó la solución (5000 rpm, 15 min), el residuo se lavó con alcohol etílico (100 25

mL) y posteriormente con agua destilada (100 mL) hasta que se eliminó la mayoría del 26

anhídrido acético. Se secó la pasta resultante de estos lavados a 50 °C por 24 h. 27

Finalmente, para obtener un tamaño de partícula uniforme se molió el almidón 28

modificado y se tamizó en una malla del número 50 (US). 29

30

Espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (EITF) 31

Se determinó el espectro de infrarrojo del almidón nativo y del almidón acetilado 32

utilizando el método de KBr reportado por Pushpamalar y col. (20006). Para lo cual se 33

mezcló la muestra seca con KBr en una relación de almidón/KBr 1:4. Se prensó la 34

5

mezcla para obtener una pastilla y se introdujo en el espectrofotómetro (MIDAC, 1

prospect 269, Costa Mesa, CA, USA). Se analizó cada espectro en el intervalo de 2

resolución de 400-4000 cm-1 y se colectaron 16 barridos. 3

4

Microscopia electrónica de barrido (MEB) 5

Se examinó la morfología de los gránulos de almidón utilizando MEB. Se fijaron las 6

muestras con una cinta conductiva de cobre con doble pegamento; el cual se cubrió con 7

una capa de carbón de 20 nm de espesor. Se depositó al vacío con un evaporador en un 8

microscopio electrónico JEOL JSMP 100 (Tokio, Japón). Posteriormente, se cubrieron 9

las muestras en el ionizador de metales JEOL con una capa de oro de 50 nm de espesor. 10

11

Difracción de rayos X 12

Se obtuvieron los patrones de difracción de rayos X de los almidones con un tubo de 13

rayos X con ánodo de cobre utilizando un difractómetro Analítico Philips (Philips, 14

Almelo, Holanda). Se trabajó el difractómetro a 27 mA y 50 kV. La región de barrido 15

del ángulo de difracción (2) fue de 5° a 45° a una amplitud de 0.1° con un tiempo de 16

conteo de 2 s. Se equilibraron las muestras de almidones en una cámara al 100 % de 17

humedad relativa por 24 h a temperatura ambiente. Se midieron el área total y el área 18

amorfa con un planímetro. Se trazó una línea recta entre los puntos a 5° y 45° la cual se 19

consideró como la línea base. Se trazaron todos los puntos base de cada pico de 20

difracción desde 5° hasta 45° como una línea límite separando las región cristalina de la 21

región amorfa. La región cristalina se observó como el área superior de la línea límite, y 22

el área bajo la línea fue la región amorfa. La cristalinidad relativa (%) se calculó 23

mediante la siguiente fórmula: 24

010 x totalárea

amorfa área totalÁrea(%) relativa dadCristalini

25

26

Prueba viscoamilográfica 27

Se utilizó la técnica propuesta por la AACC (2000) para determinar el perfil de 28

viscosidad (UB = unidades Brabender) de los almidones. Para lo cual se prepararon 29

dispersiones con 5 % (p/v) de contenido de sólidos totales; se transfirieron 100 mL de la 30

dispersión (muestra) a un vaso de un microviscoamilógrafo (Brabender OHG, Duisburg, 31

Alemania). El equipo se programó para trabajar a un ciclo de ca lentamiento-cocción-32

6

enfriamiento que comenzó a 30 °C y después incrementó a 95 °C, permaneciendo a esta 1

temperatura por 10 min, posteriormente se enfrió a 40 °C y se mantuvo a esta 2

temperatura por otros 10 min. Durante el ciclo se utilizó una velocidad de calentamiento 3

y enfriamiento de 2.5 °C min-1 con una velocidad de agitación de 125 rpm. 4

5

Análisis térmico del almidón 6

Para estudiar las propiedades térmicas de los almidones, se utilizó un calorímetro 7

diferencial de barrido (CDB, TA Instruments, modelo 2010, New Castle, USA) 8

calibrado previamente con indio. Para evaluar la temperatura de transición se utilizó el 9

método propuesto por Paredes-López y col. (1994), el cual consistió en pesar 2 mg de la 10

muestra (en base seca, n = 3) en una charola de aluminio y se le agregaron 7 L de agua 11

desionizada. Se selló herméticamente la charola y se mantuvo de esta forma por 1 h 12

antes de realizar el análisis. Se utilizó una charola vacía de aluminio como referencia. 13

La muestra se sometió a un programa de calentamiento en el intervalo de temperatura de 14

20 hasta 120 °C y a una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1. Se obtuvieron los 15

parámetros térmicos de temperatura de inicio de gelatinización (To), temperatura de pico 16

de gelatinización (Tp), temperatura final de gelatinización (Tf) y la entalpía de transición 17

(ΔH) directamente del análisis del programa TA Instruments Universal Analysis 2000 18

para windows versión 3.2B. Para determinar la transición de fase (retrogradación) de las 19

muestras almacenadas, se almacenaron por 7 y 14 días a 4 °C las muestras 20

gelatinizadas, posteriormente las charolas se dejaron a temperatura ambiente por 1 h y 21

después se analizaron en el equipo de CDB, utilizando las mismas condiciones descritas 22

previamente para el estudio de gelatinización. 23

24

Caracterización estructural del almidón 25

Se determinaron el peso molecular promedio (Mw), el radio de giro promedio z (Rz), y 26

la polidispersidad de la amilopectina nativa y oxidada utilizando un equipo de 27

cromatografía por exclusión de tamaño de alta resolución (HPSEC) con dispersión de 28

luz láser de multiángulo (MALLS) y detectores de índice de refracción (RI). El sistema 29

HPSEC-MALLS-RI consistió de una bomba Waters 515 HPLC (Waters Corporation, 30

Milford, MA) con un inyector de muestra de 200 μL, un degasador, un guarda columna 31

TSKgel PWXL (Tosoh, Corp, Tokio, Japón), unas series de dos columnas por exclusión 32

de tamaño (TSK gel G5000PWXL y G4000PWXL, Tosoh Corp.), un detector de 33

dispersión de luz de 18 ángulos DAWN-EOS (Wyatt Technology, Sta. Barbara, CA). 34

7

La muestra se preparó como se describe a continuación: se mezclaron 10 mg de almidón 1

desgrasado con 2 mL de dimetil sulfóxido al 100 % en un tubo de prueba con un 2

casquete de tornillo, y se calentaron en un baño con agua en ebullición por 1 h y 3

entonces se agitaron continuamente por 8 h a temperatura ambiente. Se precipitó una 4

alícuota de 0.5 mL con 10 mL de etanol, se dejaron a temperatura ambiente por 4 h, y se 5

centrifugaron a 1520 x g por 15 min. Se desechó el sobrenadante y se redispersó el 6

precipitado en 5 mL de agua desionizada, calentándose por 30 min en un baño con 7

agitación conteniendo agua en ebullición. Después de enfriarse, se centrifugó una 8

porción de la muestra de almidón disperso a 9000 x g por 10 min, y el sobrenadante se 9

inyectó dentro del sistema. La fase móvil consistió de NaNO3 al 0.15 M y NaN3 al 0.02 10

M (se filtró dos veces al vacío a través de un filtro de membrana de 0.1 m) a una 11

velocidad de flujo de 0.7 mL min-1. Los voltajes de salida para los detectores RI y LS se 12

colectaron con la temperatura de las columnas mantenidas a 55 °C y el detector RI a 35 13

°C, los puentes se colocaron en un detector de respuesta de 21 x LS, con un valor dn/dc 14

de 0.146, y se realizó el procesamiento de los datos con el programa ASTRA 5.1.3 15

(Wyatt, Technology). 16

17

Distribución de la longitud de cadena de la amilopectina 18

La distribución de la longitud de cadena de la isoamilasa desramificada se caracterizó 19

por cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución utilizando un detector de 20

pulsos amperométricos (HPAEC-PAD) de acuerdo al método de Kasemsuwan y col. 21

(1995) con algunas modificaciones. El sistema HPAEC-PAD (DX500, Dionex Co., 22

Sunnyvale, CA) consistió de una bomba de gradiente GP50, un organizador 23

cromatográfico LC20-1, un detector electroquímico ED40, un guarda columna de 4 x 50 24

mm CarboPac PA1, una columna analítica CarboPac PA1 de 4 x 250 mm, un 25

muestreador automático AS40. Se agregó agua desionizada (3.2 mL) a 10 mg de 26

almidón desgrasado y se calentó en una baño con agua en ebullición agitándolo por 1 h. 27

Después de enfriar a temperatura ambiente, se agregaron 0.4 mL de una solución 28

amortiguadora de acetato al 0.1 M de pH 3.5 y 5 L de isoamilasa (59,000 U/mg 29

Laboratorios Bioquímicos Hayashibara, Okayama, Japón), y la mezcla se incubó a 40 30

°C por 4 h en un baño de agua con agitación. Se detuvo la actividad enzimática por 31

neutralización con 0.21 mL de NaOH 0.2 M y calentando la muestra en una baño con 32

agua a ebullición por 15 min. La muestra se enfrió por 5 min y se filtró a través de un 33

8

filtro de jeringa de 0.45-L; se transfirieron 0.6 mL del filtrado dentro del vial del 1

automuestreador para la inyección. 2

3

Análisis estadístico 4

Se aplicó una análisis de varianza de una vía (ANOVA) al nivel de significancia del 5 % 5

(α = 0.05) a los resultados utilizando el programa estadístico SigmaStat para Windows 6

versión 2.03 (Fox y col., 1995), y cuando se encontraron diferencias estadísticas, se 7

aplicó la prueba de comparación múltiple de Tukey (Walpole y col., 1999). 8

9

Resultados y Discusión 10

Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (EITF) 11

El análisis de EITF se realizó para conocer si hay formación de enlaces durante la 12

acetilación a los diferentes tiempos de la prueba. El almidón nativo presentó señales 13

(Fig. 1) que corresponden al estiramiento de los principales grupos característicos de la 14

molécula de almidón (Mano y col., 2003). Los almidones de cebada acetilados a bajo 15

(BGS) y a alto (AGS) grado de sustitución presentaron señales en el intervalo entre 900 16

– 1250 cm-1 que corresponden al estiramiento del grupo C-O, la señal a 1226 cm-1 17

corresponde específicamente al estiramiento de los grupos acetilo C-O (Colthup y col., 18

1990). Esta señal fue similar en las muestras de almidón nativo y BGS, e incrementó en 19

la muestra AGS (ver flecha 1 en Fig. 1), indicando que solamente algunos grupos 20

acetilos se introdujeron en la muestra BGS. Cuando se llevó a cabo la reacción de 21

acetilación en la molécula de almidón, se observó una disminución en las señales 22

correspondientes a las vibraciones por estiramientos (3000-3900 cm-1) y a las 23

vibraciones por doblamiento (1650 cm-1) del grupo O-H debido a la introducción de los 24

grupos acetilo en el almidón, corroborando que se realizó la acetilación en las muestras 25

estudiadas. Adicionalmente, se observó un incremento en la señal a 1740 cm-1 en la 26

muestra con mayor grado de sustitución (ver flecha en Fig. 1) en comparación con el 27

almidón acetilado a bajo grado. Esta señal es característica de los modos vibracionales 28

en los grupos carbonilo presentes en el almidón acetilado (Xu y col., 2004; Xu y Hanna, 29

2005; Colthup y col., 1990; Adebajo y Frost, 2004; Aziz y col., 2004). 30

31

Microscopia electrónica de barrido (MEB) 32

En la Fig. 2 se muestran las micrografías electrónicas de barrido del almidón nativo y de 33

los almidones acetilados. Se observaron ligeras variaciones en el tamaño y forma de los 34

9

gránulos en el almidón BGS (Fig. 2b) con respecto al almidón nativo (Fig. 2a). Cuando 1

el grado de sustitución incrementó en el almidón AGS el efecto fue más notorio, debido 2

a una evidente fusión de los gránulos (Fig. 2c). Sin embargo, los gránulos de almidón 3

acetilado de bajo grado de sustitución maíz y de papa también presentaron fusión (Singh 4

y col., 2004). Singh y col. (2004) reportaron que el incremento en la concentración de 5

anhídrido acético produjo mayor fusión de los gránulos y que la fusión del gránulo 6

después de la acetilación se atribuyó a la introducción de grupos hidrofílicos en la 7

molécula de almidón, lo cual resultó resultó en un incremento del enlace por puente de 8

hidrógeno. Por lo tanto, la coalescencia de las moléculas de almidón resultó en la fusión 9

de los gránulos. 10

11

Perfil microviscoamilográfico 12

Durante la etapa de calentamiento (30 a 95 °C), la viscosidad (UB) incrementó 13

gradualmente hasta obtener un valor máximo (pico máximo de viscosidad) (Fig. 3). 14

Cuando el almidón es calentado en exceso de agua, los gránulos se hinchan y al mismo 15

tiempo, parte de sus componentes se solubilizan, originando una suspensión de 16

partículas en una fase continua (Thebaudin y col., 1998). El valor de viscosidad máxima 17

del almidón nativo de cebada fue de aproximadamente 2900 UB presentando una 18

temperatura de 92 °C, el almidón AGS presentó un patrón similar, pero presentó menor 19

viscosidad máxima (cercano a 2400 UB). Estos resultados están de acuerdo con el ligero 20

cambio producido durante la modificación química a 0.5 h, como se mostró en los 21

estudios de EITF y MEB. Después de este valor, la viscosidad disminuyó (disociación 22

del gránulo) durante la etapa de mantenimiento isotérmico a 95 °C, y por lo tanto, 23

durante la etapa de enfriamiento (reasociación) se observó un incremento en la 24

viscosidad debido a la reorganización de las cadenas lineales (principalmente amilosa) 25

solubilizadas durante las etapas de calentamiento y de mantenimiento isotérmico, que 26

origina un mayor número de enlaces entrecruzados durante el proceso de formación del 27

gel (Gimeno y col., 2004; Mali y col., 2003), produciendo una cadena que retiene una 28

mayor cantidad de moléculas de agua. 29

Este mismo patrón se obtuvo para el almidón nativo y BGS, pero esta muestra presentó 30

menor viscosidad. En el caso del almidón de cebada con alto grado de sustitución 31

(AGS), el perfil viscoamilográfico no presentó el pico de viscosidad, el rompimiento de 32

viscosidad y el setback de viscosidad. Este comportamiento se debió a la resistencia al 33

10

calor y al esfuerzo cortante por el alto grado de sustitución del almidón acetilado de 1

cebada. 2

3

Análisis térmico 4

En el Cuadro 1 se resumen las propiedades de gelatinización de los almidones nativo y 5

acetilado de cebada determinados por calorimetría diferencial de barrido (CDB). La 6

muestra de almidón nativo de cebada y BGS presentaron similares temperaturas de 7

gelatinización y se encontró una ligera (pero significativa) disminución en el valor de 8

entalpía de la muestra BGS. La gelatinización del almidón es controlada, en parte, por la 9

estructura molecular de la amilopectina (perfección y orden de los cristales, longitud de 10

cadena de la amilopectina con un GP comprendido entre 5-12, grado de ramificación, 11

masa molar y polidispersidad) así también como la estructura granular (relación de las 12

zonas cristalinas y amorfas) (Tester y Morrison, 1990). En este mismo sentido, el valor 13

de entalpía refleja la pérdida del orden de las dobles hélices más que de la cristalinidad 14

(Cooke y Gidley, 1992). Por lo tanto, se postuló que el valor de la entalpía de 15

gelatinización es afectado por el tamaño del gránulo y por la relación 16

amilosa/amilopectina más que la cantidad y la calidad de los cristales (Ahmad y col., 17

1999; Tester, 1997). La diferencia en el valor de la entalpía entre las muestras BGS y su 18

homólogo nativo refleja una desorganización parcial producida por la reacción de 19

acetilación. En la muestra AGS se observaron más cambios significativos en la 20

temperatura y entalpía de gelatinización corroborando que la acetilación del almidón de 21

cebada con alto grado de sustitución produjo una desorganización como se mostró por 22

EITF, MEB y pruebas de viscoamilografía. 23

Almidones acetilados de maíz y de papa con bajo grado de sustitución presentaron una 24

ligera disminución en el pico de temperatura (aproximadamente de 2 °C) y entalpía 25

(aproximadamente 2 J/g) de gelatinización comparados con sus respectivos almidones 26

nativos. Cuando se acetiló el almidón de papa a mayor grado de sustitución, la 27

temperatura de pico de gelatinización disminuyó 6 °C respecto a la muestra de almidón 28

nativo, pero la entalpía solamente disminuyó 2 J/g; se encontró un comportamiento 29

similar para el almidón de maíz pero la disminución en el pico de temperatura fue 30

únicamente de 3 °C y la entalpía de 1.7 J/g. La fuente botánica representa un papel 31

importante en las propiedades térmicas del almidón acetilado. 32

En el Cuadro 2 se muestran las características de retrogradación de los almidones nativo 33

y acetilado de cebada. El valor de entalpía del almidón nativo de cebada presentó un 34

11

ligero incremento cuando incrementó el tiempo de almacenamiento, pero no fue 1

estadísticamente significativo. Se obtuvieron valores y comportamiento similares en la 2

muestra BGS, mostrando que el bajo número de grupos acetilo introducidos en la 3

molécula de almidón no cambió sustancialmente su retrogradación. Sin embargo, la 4

muestra AGS presentó lo más bajos valores de entalpía y no cambió ( = 0.05) con el 5

tiempo de almacenamiento. La mayor cantidad de grupos acetilo en las cadenas de 6

almidón con la disminución concomitante de los grupos OH, evitó sus interacciones y la 7

disminución en el nivel de retrogradación. Un efecto similar se mostró cuando la 8

amilopectina presentó mayor cantidad de cadenas cortas (Yuan y col., 1993). 9

10

Estructura del almidón 11

En el Cuadro 3 se muestran el peso molecular promedio (Mw) y el radio de giro (Rz) de 12

los almidones nativo y acetilado. El Mw disminuyó debido al proceso de acetilación, la 13

muestra de almidón AGS presentó el más bajo valor. Se encontró que en el almidón 14

acetilado con alto grado de sutitución, se perdió la cristalinidad del gránulo y presentó 15

un patrón de difracción de rayos X amorfo (Chi y col., 2008; Xu y col., 2004). Estos 16

resultados indicaron que adicionalmente a la desorganización de los componentes del 17

almidón durante la acetilación, se produjo una despolimerización parcial en los 18

componentes del almidón, principalmente de la amilopectina. Los valores de M w están 19

de acuerdo con los valores Rz, debido a que este parámetro disminuyó con el grado de 20

acetilación. Recientemente, Chávez-Murillo y col. (2008) reportaron un valor de Mw de 21

8.9 x 107 g/mol y Rz de 141 nm para almidón nativo de cebada, los cuales son similares 22

a los mostrados en este estudio. También, en el almidón oxidado de cebada, ambos 23

parámetros Mw y Rz disminuyeron cuando incrementó el nivel de oxidación. No hay 24

más estudios disponibles sobre los parámetros Mw y Rz en almidones acetilados. 25

26

Distribución de la longitud de cadena de la amilopectina 27

En el Cuadro 4 se muestra la distribución de la longitud de cadena de la amilopectina 28

ramificada para el almidón nativo y acetilado de cebada. El almidón nativo de cebada 29

consistió de pequeñas proporciones de cadenas del tipo B2 y B3+. Se encontró la más 30

alta proporción de cadenas para los de grado de polimerización (GP) comprendido entre 31

13 y 24 que corresponde a las cadenas más cortas tipo B del modelo de racimo (Robin y 32

col., 1974), seguido de las cadenas tipo A. Este patrón es característico de los almidones 33

de cereales. La distribución de la longitud de cadena de la amilopectina de diversas 34

12

fuentes botánicas mostraron que la más alta proporción de cadenas fue de un GP 1

comprendido entre 10 y 13 (Koizumi y col., 1991; Suzuki y col., 1992). Patindol y 2

Wang (2002) reportaron que se desramificaron amilopectinas de variedades de arroz 3

con isoamilasa y se estudiaron con el mismo sistema cromotográfico. Estos autores 4

reportaron cuatro grupos de cadenas, el primer grupo consistió de cadenas tipo A y los 5

otros tres correspondieron a cadenas tipo B del modelo de racimo. De acuerdo a estos 6

investigadores, se encontró diferencia en el porcentaje de distribución de los cuatro 7

grupos entre las variedades. Cuando incrementó el grado de acetilación los almidones 8

acetilados de cebada presentaron un incremento en cadenas tipo A y una disminución en 9

las cadenas tipo B2 y B3+. Sin embargo, las cadenas tipo B1 no difirieron en el almidón 10

nativo y en la muestra BGS, pero disminuyeron en la muestra AGS. Este 11

comportamiento es un resultado de la polimerización durante la reacción de acetilación, 12

y explica la disminución en la temperatura y entalpía de gelatinización en la muestra 13

AGS y una temperatura similar entre el nativo y BGS. La magnitud de los cambios en la 14

distribución de la longitud de cadena fue similar en ambos almidones. Al 5 % de 15

NaOCl, la proporción de cadenas tipo B3+ disminuyó drásticamente para ambos 16

almidones, lo cual explicaría su disminución en la temperatura de gelatinizació n. 17

18

Conclusiones 19

La acetilación cambió las propiedades morfológicas, de empastado, térmicas y 20

estructurales del almidón de cebada debido a la despolimerización de los componentes 21

del almidón. No se alteraron las características morfológicas del gránulo de almidón, ni 22

las propiedades de gelatinización y retrogradación en el almidón acetilado de cebada 23

con bajo grado de sustitución. La temperatura y la entalpía de gelatinización 24

disminuyeron en la muestra acetilada con alto grado de sustitución, además, se observó 25

un patrón similar para la entalpía de retrogradación, mostrando una menor tendencia a 26

este fenómeno. La masa molar y el radio de giro, cuando se determinaron por 27

cromatografía por exclusión de tamaño de alta resolución, disminuyeron cuando 28

incrementó el grado de sustitución, indicando una mayor degradación de los 29

componentes del almidón. La distribución de la longitud de cadenas de la amilopectina 30

del almidón acetilado de cebada con bajo grado de sustitución mostró que las 31

proporciones de las cadenas tipo A incrementaron significativamente mientras que las 32

cadenas tipo B1, B2 y B3+ disminuyeron significativamente. Se determinó que el grado 33

de acetilación afectó la estructura del almidón de cebada con una reducción significativa 34

13

en la viscosidad de empastado, en la temperatura y entalpía de gelatinización y de 1

retrogradación. 2

3

4

5

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16

17

18

19

20

21

22

23

24

19

1 2 Tab. 1. Thermal parameters associated with gelatinization of native, low degree 3

(ABSLS) and high degree substitution (ABSHS) barley starch* 4 5

*Means of five replicates standard error 6

Means in the columns that do not share the same letters are significantly different 7

(=0.05) 8

To = onset of gelatinisation temperature 9 Tp = peak of gelatinisation temperature 10

Te = end of gelatinisation temperature 11 ΔH = enthalpy 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tab. 2. Enthalpies associated with retrogradation of native, low degree (ABSLS) and 22

high degree substitution (ABSHS) barley starch* 23 24

Sample ΔH J/g days

3 7 14

Native 4.5 0.3abA 4.9 ± 0.4aA 4.1 ± 0.3bA

ABSLS 4.8 0.5aA 4.7 ± 0.4aA 4.9 ± 0.2aB

ABSHS 3.2 0.6aB 3.6 ± 0.3abB 4.1 ± 0.2bA

*Means of five replicates standard error 25

Means in the rows that do not share the same lowercase letters are significantly different 26

(=0.05) 27

Means in the columns that do not share the same uppercase letters are significantly 28

different (=0.05) 29

ΔH = enthalpy 30 31

32 33 34

Thermal parameters

Sample To ºC Tp ºC Te ºC RG Te-To ΔH J/g

Native 56.35 1.22a 60.04 1.33a 71.59 1.32a 15.24 9.34 0.29a

ABSLS 58.60 0.90a 60.93 0.69a 74.12 2.00a 15.52 8.74 0.26b

ABSHS 53.13 2.23b 56.75 1.82b 65.44 2.68b 12.31 5.16 0.44c

20

1 2 3

4 5

6 7

8

Tab. 3. Molar mass (Mw), polydispersity (Mw/Mn) and gyration radius (Rz) of native, 9 low degree (ABSLS) and high degree substitution (ABSHS) barley starcha. 10

11

Sample Mw/Mn Mw x 108

g/mol

Rz

nm

Native 1.339 ± 0.10 1.44 ± 0.09 159.10 ± 7.53

ABSLS 1.254 ± 0.06 1.25 ± 0.08 152.23 ± 4.68

ABSHS 1.466 ± 0.03 0.51 ± 0.10 125.33 ± 3.23

aMeans of four replicates standard error 12

13

14

15 16 17 18 Tab. 4. Chain- length distribution of isoamylase-debranched native, low degree 19

(ABSLS) and high degree substitution (ABSHS) barley starch by HPAEC-20

PADa 21 22

Sample A chain

[DP 6-12]

B1 chain

[DP 13-24]

B2 chain

[DP 25-36]

B3+ chain

[DP≥37]

Average

chain length

DP

Native 26.98 0.71 50.27 0.42 14.69 0.83 8.06 0.70 19.57 0.17

ABSLS 29.48 0.35 50.26 0.49 13.31 0.02 6.96 0.13 18.85 0.03

ABSHS 37.30 1.25 48.81 1.16 9.70 0.79 4.18 0.44 16.75 0.48

aMeans of two measurements standard error. 23 24 25 26 27 28

29

21

1 2 3

4 5

6 7 8

9 10

11 12 13

14 15

16 17 18

19 20

21 22 23

24 25 26

27 28

29 30 31

32 Fig. 1. FT-IR spectrum of native, low degree (ABSLS) and high degree substitution 33

(ABSHS) barley starch 34 35 36

37 38

39 40 41

42 43

44 45 46

47 48

49 50

Wavenumbers (cm-1)

Tra

nsm

itta

nce

(%)

Native

ABSHS

ABSLS

1

22

1 2 3

4 5

6 7 8

9 10

11 12 13

14 15

16 17 18

19 20

21 22 23

24 25 26

27 28

29 30 31

32 33

34 35 36

37 38

39 40 41

42 Fig. 2. Scanning electron micrographs of: (a) native; (b) acetylated low degree; (c) 43

acetylated high degree, barley starch. 44

(a)

(b)

(c)

23

1

2 3

4 5 6

7 8

9 10 11

12 13

14 15 16

17 18

19 20 21

22 23

24 25 26

27 28

Fig. 3. Pasting profile of the native, low degree (ABSLS) and high degree substitution (ABSHS) barley starch.29

Time (min)

Tem

per

atu

re (

°C)

Vis

cosi

ty (

UB

)

Native

ABSLS

ABSHS

24