efecto de sustancias hÚmicas sobre algunos …repository.ut.edu.co/bitstream/001/3116/1/maestría...
TRANSCRIPT
EFECTO DE SUSTANCIAS HÚMICAS SOBRE ALGUNOS PARÁMETROS INMUNES
DE GALLINAS PONEDORAS EN LA FASE POSMUDA
ROSA ANGELICA SANMIGUEL PLAZAS
Trabajo de grado como requisito parcial para optar el título de Magister en
Ciencias Pecuarias.
Director
IANG SCRHONILTGEN RONDON
Magister en Acuicultura en aguas continentales
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MAESTRIA EN CIENCIAS PECUARIAS
IBAGUÉ-TOLIMA
2014
2
3
DEDICATORIA
A Paula, porque es mi mayor motivación. A todos los que sufrieron mi ausencia
mientras desarrollaba este trabajo.
4
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue posible por contribución de la Universidad Cooperativa de Colombia
sede Ibagué y el personal del Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad
del Tolima a quienes les expreso mis agradecimientos: Carlos Eddy Viana S, William
Felipe Velásquez, Claudia Rodríguez, Adriana Lucía Cely, Luz Clemencia Fandiño,
Luis Hernando Ortiz. Este trabajo fue financiado por el Comité Central de
Investigaciones de la Universidad del Tolima.
5
CONTENIDO
DEDICATORIA................................................................................................................ 3
AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... 4
RESUMEN .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
ABSTRACT ..................................................................................................................... 9
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 10
1. OBJETIVOS............................................................................................................ 11
1.1OBJETIVO GENERAL ............................................................................................. 11
1.2OBJETIVOS ESPECIFICOS .................................................................................... 11
2. ARTÍCULO DE REVISIÓN: PERSPECTIVAS SOBRE EL USO DE LAS SUSTANCIAS HÚMICAS EN LA PRODUCCIÓN AVIAR. (Publicado en la revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, Volumen 9 N. 1 del 2014)........................................ 12
2.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 12
2.2. Pollos de engorde. ................................................................................................. 15
2.3CONCLUSIONES..................................................................................................... 22
3. ARTÍCULO ORIGINAL: EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE LAS SUSTANCIAS HÚMICAS SOBRE LOS PARÁMETROS PRODUCTIVOS EN GALLINAS PONEDORAS.........24
3.1 INTRODUCCIÓN ...............................................................................................................................24
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................................26
3.2.1 Condiciones experimentales.. ......................................................................................................26
3.2.2 Sustancias húmicas.......................................................................................................................26
3.2.3 Normatividad. ................................................................................................................................27
6
3.2.4 Diseño experimental......................................................................................................................27
3.2.5 Determinación de los parámetros productivos.. ........................................................................28
3.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................................28
3.4 RESULTADOS...................................................................................................................................28
3.4.1 Parámetros productivos. ...............................................................................................................29
3.4.2 Parámetros de calidad del huevo ................................................................................................30
3.5 DISCUSIÓN........................................................................................................................................35
4. ARTÍCULO ORIGINAL: EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON SUSTANCIAS HÚMICAS SOBRE ALGUNOS PARÁMETROS DE INMUNIDAD INNATA EN GALLINAS PONEDORAS EN FASE POSMUDA....................................................................................................38
4.1 INTRODUCCION ...............................................................................................................................38
4.2 METODOLOGÍA ................................................................................................................................40
4.2.1 Condiciones experimentales: .....................................................................................................40
4.2.2 Normatividad. ..................................................................................................................................40
4.2.3 Sustancias húmicas. ......................................................................................................................41
4.2.4 Diseño experimental.. ....................................................................................................................41
4.2.5 Colecta de muestras......................................................................................................................42
4.2.6 Determinación del hematocrito. ...................................................................................................42
4.2.7. Prueba de actividad fagocitaria...................................................................................................43
4.2.8 Prueba de explosión respiratoria. ................................................................................................43
4.2.9 Prueba de actividad de la lisozima. .............................................................................................44
4.2.10 Prueba de aglutinación bacteriana............................................................................................44
4.2.11 Prueba de actividad bactericida del suero. ..............................................................................44
4.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................................44
4.4 RESULTADOS...................................................................................................................................45
4.5 DISCUSIÓN ............................................................................................................ 54
5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES GENERALES....................................................... 58
6. REFERENCIAS......................................................................................................... 63
7
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Cuadro comparativo sobre los estudios arriba que evalúan el efecto de la
sustancias húmicas en gallinas ponedoras. .................................................................. 19
Tabla 2.1. Peso de las gallinas, Porcentaje de producción, peso del huevo, consumo de
alimento y tasa de conversión alimenticia con la suplementación de sustancias húmicas
...................................................................................................................................... 29
Tabla 2.2. Grosor de la cáscara, grosor de la albúmina y color de la yema de huevos de
gallinas suplementadas con SH .................................................................................... 30
Tabla 2.3. Color de la yema de huevos de gallinas suplementadas con SH................. 33
Tabla 3.1. Hematocrito y tasa heterófilos/linfocitos de gallinas suplementadas con
sustancias húmicas. ...................................................................................................... 45
Tabla 3.2. Índice fagocítico, explosión respiratoria, actividad bactericida del suero y
aglutinación bacteriana de gallinas suplementadas con SH. ........................................ 48
Tabla 3.3. Diferencia de la actividad de la Lisozima con respecto al control negativo de
gallinas suplementadas con SH .................................................................................... 53
8
RESUMEN
En diversos países se ha investigado ampliamente los efectos de las sustancias
húmicas (SH) comerciales en la alimentación de animales de producción con el
propósito de mejorar los parámetros productivos encontrándose que en gallinas
ponedoras dichos parámetros responden de manera positiva especialmente en los
períodos medio y tardío de producción. Con el propósito de relacionar el desempeño
productivo con la respuesta de la inmunidad innata, se tomaron gallinas ponedoras Hy
Line Brown (n=120) en la fase de posmuda, las cuales fueron divididas en cuatro
grupos: El primer y segundo tratamiento fueron suplementados con 0,1 y 0,2% de SH
respectivamente, el tercer grupo fue suplementado con 0,25m/kg de levamisol y el
cuarto grupo no tuvo suplementación durante un período de 60 días. Se evaluó el
efecto de la suplementación de la dieta con SH sobre parámetros productivos y algunos
parámetros hematológicos y de inmunidad innata (hematocrito, tasa
heterófilos/linfocitos, actividad bactericida del suero, índice fagocítico, aglutinación
bacteriana, explosión respiratoria, actividad de la lisozima). La suplementación con SH
no tuvo ningún efecto sobre el peso de las gallinas, el porcentaje de producción, el
peso del huevo y la tasa de conversión alimenticia (p>0.05). Por otro lado, el grosor de
la cáscara y de la albúmina aumentó significativamente al día 30 y 60 respectivamente,
mientras que al día 45 el color de la yema mejoró con la suplementación de SH. El
hematocrito, la tasa H/L y el IF aumentaron al día 30 y 60 de suplementación con SH,
la actividad bactericida del suero y la actividad de la lisozima se aumentaron en el día 8
pero no presentaron diferencia significativa con los grupos no suplementados el resto
del tiempo, la explosión respiratoria fue significativamente mejor al día 30 con 0,2% de
SH y durante todo el experimento la aglutinación bacteriana fue mayor (P<0,05)en los
grupos suplementados. Los resultados inmunológicos demostraron que las sustancias
húmicas se comportan como agentes inmunoestimulantes en la fase temprana de la
posmuda sin afectar los parámetros productivos.
Palabras clave: Inmunidad innata, fase pos muda, Sustancias húmicas.
9
ABSTRACT
In several countries the effect of commercial humic substances (HS) in the food animal
production has been assessed in order to improve productive parameters and some
physiologic parameters showing that in poultry was affected positively that parameters
response positively especially in the medium and late production period. In this
research, posfasting hens Line Brown hens were taken (n=120) eich were distribuited
into four groups: The first and the second trial were supplemented with 0,1 and 0,2 % of
HS respectively. The third group was supplemented with 0,25 mg/kg on levamisole
hydroclorhide and fourth group did not have supplementation during sixty day period.
The effect of supplementation with HS was evaluated over productive parameters and
some hematological and innate immunity parameters (hematocrit,
Heterophil/Limphocyte ratio, serum bactericidal activity, phagocytic index, bacterial
agglutination, respiratory burst and lisozyme activity). Supplementation with HS did not
have effect over the weight in hens, production percentage, weigh in eggs and
conversion feed ratio (p>0,05). In the other hand eggshell thickness and the egg
albumin increased significantly after 30th and 60th day respectively while on the 45th
day the color of the yolk improved with HS supplementation. Hematocrit,
heterophile/Limphocyte ratio and IF increased at 30 th days of supplementation with
HS. Serum bactericidal activity and lisozyme activity improved on 8 th day but did no
differ with unsupplemented groups the rest of time, respiratory burs was significantly
better at 30 th day with 0,2% of HS and along of the time bacterial agglutination was
greater un supplemented groups. Immunologic results showed that humic substances
behave like immunostimulant agents in the posfasting early phase without affect
productive parameters.
Keywords: Innate immunity, pos fasting phase, humic substances.
10
INTRODUCCIÓN
A partir de los conceptos sobre la necesidad de encontrar sustitutos orgánicos de los
antibióticos promotores de crecimiento, la naturaleza estresante de la muda forzada en
gallinas ponedoras y del uso de sustancias húmicas (SH) en la alimentación animal
para mejorar parámetros productivos como aditivo en bajos porcentajes en caballos,
rumiantes, cerdos y aves, surgió el interrogante sobre el efecto de las SH en la
inmunidad innata de gallinas ponedoras durante la fase de posmuda y su relación con
el desempeño productivo.
En el presente documento se muestran los resultados finales de la investigación
realizada en la granja experimental de la Universidad Cooperativa de Colombia sede
Ibagué, en los cuales se evaluó el efecto de las Sustancias Húmicas (SH) sobre
algunos parámetros productivos, de la calidad de los huevos, hematológicos y de la
inmunidad innata en la fase de posmuda en gallinas ponedoras Hy Line Brown.
En el Capítulo 1 se aborda el marco teórico y el estado del arte de las propiedades y
uso potencial de las sustancias húmicas en la agricultura, industria y en la alimentación
animal, haciendo énfasis en los resultados obtenidos en el área de avicultura tanto en
pollos de engorde como en gallinas ponedoras.
En el Capítulo 2, se presentan la metodología, resultados y discusión del experimento
donde se evaluó el efecto de las SH sobre los parámetros productivos y de la calidad
del huevo.
La metodología, resultados y discusión del experimento que evaluó la influencia de las
SH sobre algunos parámetros hematológicos y de inmunidad innata, se presentan y
discuten en el capítulo 3.
11
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la suplementación de la dieta con 0,1 y 0,2% de sustancias
húmicas sobre algunos parámetros de inmunidad innata en gallinas ponedoras
comerciales en la fase posmuda y su posible relación con los parámetros productivos
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Cuantificar el índice fagocítico de los leucocitos de gallinas ponedoras en la fase
post muda al suplementar con 0,1 y 0,2% de sustancias húmicas.
Estudiar la actividad de lisozima de suero sanguíneo de gallinas ponedoras en
la dase post muda al suplementar con 0,1 y 0,2% de sustancias húmicas.
Identificar el índice de explosión respiratoria en la sangre de gallinas ponedoras
en la fase post muda al suplementar con 0,1 y 0,2% de sustancias húmicas.
Evaluar la actividad bactericida del suero sanguíneo de gallinas ponedoras en la
fase post muda al suplementar con 0,1 y 0,2% de sustancias húmicas.
Estudiar la aglutinación bacteriana del suero sanguíneo de gallinas ponedoras
de 40-44 semanas al suplementar con 0,1 y 0,2% de sustancias húmicas.
Identificar el efecto de la suplementación con 0,1 y 0,2 % de sustancias húmicas
sobre el porcentaje de mortalidad, consumo de alimento, porcentaje de
producción, peso del huevo, tasa de conversión alimenticia y color de la yema.
12
2. ARTÍCULO DE REVISIÓN: PERSPECTIVAS SOBRE EL USO DE LAS
SUSTANCIAS HÚMICAS EN LA PRODUCCIÓN AVIAR. (Publicado en la revista CES
Medicina Veterinaria y Zootecnia, Volumen 9 N. 1 del 2014)
2.1 INTRODUCCIÓN
El humus es el producto final estabilizado, amorfo coloidal de color pardo oscuro que
resulta de la desintegración de materia orgánica (Shuldt, 2006). Este es utilizado
ampliamente en la agricultura como estabilizador, recuperador de suelos y como
estimulante del crecimiento radicular (Rodríguez, Venegas, Angoa, montañez, 2010).
Entre las principales sustancias que conforman el humus se encuentran las SH (ácidos
húmicos, ácidos fúlvicos, ácido úlmicos y ácidos húmico melánicos) siendo los más
abundantes los ácidos húmicos y los ácidos fúlvicos a los cuales se les atribuyen
efectos benéficos sobre el crecimiento radicular en vegetales, los parámetros
productivos y sanitarios en diferentes especies animales (Pasqualñoto, Lópes,
Ojkorokova y Rocha, 2001; Vlcová, Grasset, Antosová, Pekar, Kucerik, 2009),.
Las sustancias húmicas tienen uso en la agricultura por su potencial en la conservación
de suelos y como promotor del crecimiento radicular lateral de las plantas, en el sector
industrial para reducir los olores de las excretas o como quelantes en el tratamiento de
aguas y suelos contaminados (Lipczynska-Kochany y Kochany, 2009; Paqualoto et al.,
2002; Van Stempvoort, Lesage, Steer, 2003), también son usados como absorbentes
de metales pesados especialmente Cd, Zn y Cu en aguas residuales a partir del efecto
quelante de la carga negativa de las SH (ácidos húmicos y fúlvicos) presentes en los
ácidos carboxílicos, fenólicos e hidroxilos que hacen parte de la estructura química de
las SH (Matos, Arruda, 2003; Patti et al., 2013; Pereira, Arruda, 2013).
Existen evidencias del uso potencial como antibacteriales, antivirales, antinflamatorios
(Naudé, Cromarty, Van Rensburg, 2010; Sabi, Vrey, Van Rensburg, 2011; Van
13
Rensburg, Van Rensburg, Van Rissen, 2006), antidepresivos, así como para el
tratamiento de diarreas, dispepsia e intoxicaciones agudas y para la alimentación
animal como aditivo en caballos, rumiantes, cerdos y aves con el propósito de mejorar
los parámetros productivos y reducir el impacto ambiental disminuyendo la emisión de
amonio en las heces (Islam, Schuhmacher, Gropp, 2005; Ji, McGlone, Kim, 2006;
Samudovska, Demeterová, 2010). Sumado a esto, en modelos murinos no se han
identificado efectos teratogénicos ni otros efectos adversos con el consumo crónico de
SH (Sabi et al., 2011) y la toxicidad es marcadamente baja. En dichos estudios, se ha
reportado una dosis letal 50 (DL50) de 0,536 g/kg de peso corporal y una seguridad total
de 50 mg/kg de peso corporal, lo cual según la OMS se cataloga como un producto
poco peligroso (de 500 a 2000 mg/kg), conceptos que generan una vía abierta para el
uso de las SH como suplementos alimenticios relativamente seguros (Laub, 1998;
Lotosh, 1991).
Tanto en avicultura como en otros sistemas de producción se ha documentado el
efecto benéfico de la inclusión de SH en la dieta (Wang et al., 2008), sin embargo aún
no han sido incluidos en la lista de aditivos de los alimentos (European union register
of feed additives, 2003; Fundacionfedna.org, 2010). Es importante tener en cuenta que
existen algunas variables en las aves tales como la edad, el sexo, el ayuno y el peso
corporal que pueden afectar la respuesta tanto en los parámetros productivos como en
los sanguíneos (Pires, Malheiros, Boleli, 2007) y por consiguiente los resultados
varían. Se puede demostrar que las SH poseen un efecto estabilizante de la flora
intestinal lo cual asegura la optimización de los nutrientes y esto a su vez se refleja en
menor tasa de conversión, aumento en el consumo de alimento, en el peso de los
huevos y el peso corporal de los animales (Celyk,Uzatici, Akin, 2008; Kaya, Tuncer,
2009).
La presente revisión tiene como objetivo contextualizar el uso de los ácidos húmicos en
avicultura como una alternativa para la optimización en los procesos de producción
limpia, así como para el mejoramiento de algunos parámetros productivos.
14
2.2 SUSTANCIAS HÚMICAS.
Las SH están conformadas por una mezcla compleja de cadenas alifáticas y/o anillos
aromáticos con contenido específico de grupos funcionales tales como carboxilos
(COOH), hidroxilos (OH) fenólicos, enólicos y alcohólicos, carbonilos (C=O), quinonas,
hidroxiquinonas, cetonas, auxinas, lactonas y éter, pero la concentración de dichas
sustancias en las SH difiere de acuerdo a los recursos de donde se originen
(Pasqualoto et al., 2002; Vlcová 2009a; Vlcová et al., 2009b). El porcentaje de SH
depende del grado de humificación y de la composición de los materiales orgánicos
originales, pues aquellos ricos en Lignina generan mayor cantidad de SH y los residuos
de origen antropogénico a partir de los desechos industriales inducen cambios
estructurales en ellas. Estos mismos autores afirman que entre residuos de frutas,
rastrojo de maíz, paja de trigo y estiércol de bovino, el material más rápidamente
transformado en compostaje es el estiércol de bovino y a su vez dichas sustancias
húmicas presentan diferencia significativa en cantidad de grupos carboxilos (COOH),
OH fenólicos y grupos carbonilos (C=O) (Canellas et al., 2002; Rocha, Rosa, Furlan,
1998; Rodríguez et al., 2010) lo cual indica que se forman moléculas distintas de
acuerdo al tipo de sustrato original como se mencionó anteriormente. Estas SH
presentan una interacción más débil con los materiales orgánicos que con los
inorgánicos y dichas uniones son potencialmente reversibles (Simpson 2002).
El estudio de la estructura molecular de las SH se ha considerado de alta dificultad
debido a su estructura compleja e irregular, lo cual no ha permitido el diseño de una
fórmula precisa a partir de los resultados obtenidos por métodos espectroscópicos,
pirolíticos y técnicas de ionización suave que pretenden entender la naturaleza de los
ácidos húmicos (Brighenti, Reis,Reis, 2010; Vlcová et al., 2009).
2.2.1 Sustancias húmicas (SH) en producción animal. Las SH extraídas en
concentraciones específicas han tenido aplicación en la producción de rumiantes y
monogástricos en los cuales ha demostrado resultados satisfactorios (Ji et al 2006;
Galip, Polat, Biricik, 2010). Cusack (2008) demostró que el uso de SH en bovinos
incrementó la ganancia de peso así como la eficiencia de la conversión alimenticia.
15
Griban (1990) demostró un incremento en la producción de leche en vacas
suplementadas con SH. En rumiantes, las SH se han descrito como efectivas en la
reducción de emisión de amonio (Shi, Parker, Cole, Auvermann, Mehlhorn, 2001). Sin
embargo, trabajos de McMurphy et al., (2011) no evidenciaron dicha efectividad en
vacas Holstein puesto que el volumen ruminal es mayor que en el ganado de carne y
por consiguiente requieren mayores cantidades en la suplementación. Por otra parte,
Galip et al., (2010) demostraron cambios leves en el líquido ruminal consistentes en la
elevación en los niveles de sodio en individuos suplementados con SH y reducción de
algunas poblaciones de protozoarios. No obstante, Váradyová et al., (2009)
demostraron una baja actividad antiprotozoaria de las SH en un ambiente ruminal in
vitro. Es probable que la variabilidad del sustrato que origina las SH genere este tipo de
resultados controversiales.
En porcinos, Ji et al., (2006) demostraron que la inclusión de SH en las dietas de
cerdos incrementa la ganancia de peso así como reduce la emisión de amonio en las
heces, similar a lo reportado por Wang et al., (2008) quienes demostraron que las SH
en las dietas mejoran el desempeño de crecimiento, el conteo relativo de linfocitos y la
calidad de la carne.
2.2.2 Aplicación de las SH en la producción aviar
2.2.2.1Pollos de engorde. A raíz de las consecuencias negativas en la microbiota
intestinal originadas por el uso indiscriminado de antibióticos como promotores de
crecimiento (APC) y como tratamiento terapéutico para las infecciones
gastrointestinales, en la década del noventa la unión europea notificó la prohibición de
todos los antibióticos promotores de crecimiento en las dietas para animales, la cual
comenzó a regir a partir del año 2006, trayendo consigo la implementación de nuevas
estrategias de manejo, entre las que se encuentran la utilización de otras sustancias
alternativas y seguras como el uso de aditivos alimentarios naturales y terapias
alternativas no medicamentosas en remplazo de los antibióticos utilizados en
16
producción y sanidad animal (Rosmini et al 2004), que tengan efectos similares sobre
los niveles productivos de los animales, tales como el uso de prebióticos, probióticos,
simbióticos entre otros, los cuales incrementan la resistencia natural a la presentación
de enfermedades infecciosas del tracto gastrointestinal y optimizan los procesos de
digestión y absorción (Collins, Gibson, 1999; Wondmeneh, Getachew, Dessie, 2011).
Ya en el año 2002, Ceylan & Ciftcy habían sugerido el uso de SH comerciales como
una alternativa útil para remplazar el uso de antibióticos como promotores de
crecimiento en pollos de engorde y posteriormente otras investigaciones reportan
desempeño productivo similar cuando se comparan dietas suplementadas con humatos
frente a dietas suplementadas con microorganismos probióticos (Celyk et al., 2008;
Karaoglu, 2004; Yoruk, Gul, Hayirly, Macit, 2004), demostraron que con la
suplementación del 0,1% de SH, la tasa de conversión de alimento mejora en un 2%
frente a la suplementación con 0,2 y 0,3%, aunque no se afectan las características del
desempeño ni de la carcasa pero la mortalidad fue del 0% en comparación con el 1,8%
del grupo control. Adicionalmente, al incrementar la suplementación con SH en la dieta
de pollos de engorde al 0,05, 0,1 y 0,15% se observa que las características de color
en los muslos y pectorales mejoran, la conversión de alimento es más eficiente, y el
colesterol sanguíneo disminuye al igual que el peso de la grasa abdominal con la dietas
que contienen mayor porcentaje en la suplementación con SH (Ergin, Isa, Nuh, Guray,
2009). En concentraciones mayores, Rath et al., (2006) evaluaron la suplementación de
pollos de engorde con 1% y 2,5% de humatos, para lo cual concluyeron que a mayor
concentración el peso corporal disminuyó y la tasa de conversión alimenticia aumentó.
Los autores no encontraron diferencias en la presentación de discondroplasia tibial ni
en los parámetros hematológicos ni bioquímicos excepto en la disminución de la tasa
heterófilos/linfocitos la cual se considera como un indicador de menor estrés.
Una comparación entre humatos sódicos y sustancias húmicas naturales en pollos
broiler, suministrando 0,5% en la etapa de iniciación y 0,7% en la etapa de levante y
engorde, demostró que la ganancia de peso fue mayor y la conversión de alimento fue
menor con humatos sódicos, mientras que los valores más altos de calcio sérico y más
bajos en AST fueron observados con las sustancias húmicas naturales (Samudovska et
17
al., 2010), Con lo que se puede inferir que hay una mejor asimilación y metabolismo del
Calcio dietario y una mejor estructura hepática, no obstante otros estudios (Celyk et al.,
2008; Kaya et al., 2009) han evaluado el efecto de ácidos húmicos en el desempeño
bioquímico sanguíneo al suplementar con 0,25% de humatos en pollos broiler durante
los primeros 42 días de vida y no se observaron diferencias estadísticas en los
parámetros bioquímicos (Conteo de leucocitos, diferencial de leucocitos,
transaminasas, proteína, albúmina, glucosa, BUN, Fe, Ca, P) con respecto al grupo
control como tampoco se vio afectado el peso de los órganos internos (Molleja, hígado
y proventrículo). Los autores asocian el efecto promotor de los humatos con el aumento
en el desempeño productivo, con base en la estabilización de la flora intestinal y por
consiguiente mejorar la utilización de nutrientes por parte del animal, dicho efecto se
asocia con el aumento de peso corporal y la ganancia de peso observada en la
investigación.
Otro aspecto importante en la calidad de la producción de carne de pollo es la baja
oxidación del contenido lipídico de la carcasa. En un estudio realizado con
suplementación en varios porcentajes de sustancias húmicas se concluyó que con el
0,1% se obtuvo la mayor tasa de disminución de oxidación lipídica de las patas y la
pechuga especialmente después del cuarto día de almacenamiento pos sacrificio, en
comparación con el grupo control.
2.2.2.2 Gallinas ponedoras. En gallinas ponedoras en periodo temprano de
producción (de 22 a 40 semanas) la adición de 0,15% de sustancias húmicas
comerciales (35% de humato sódico y 6% de ácidos fúlvicos) no genera cambios
significativos en porcentaje de producción, calidad del huevo, mortalidad ni parámetros
hematológicos como lo evidenciaron Yalcin et al., (2006). En dicho estudio las gallinas
suplementadas con humatos fueron significativamente más pesadas que las del grupo
control y presentaron un mayor consumo de alimento aunque el porcentaje de
colesterol sanguíneo y de la yema disminuyeron. En este mismo periodo de producción
al suplementar la dieta con 100 y 200 ppm (Lipczynska-Kochany et al., 2009), la dieta
con 200 ppm presentó diferencias significativas en el peso del huevo y en el porcentaje
18
de producción y contrario al reporte anteriormente mencionado, el peso corporal no se
vio afectado, sin embargo el peso relativo del bazo, ovario, longitud del oviducto, la
concentración de calcio plasmático y el grosor de la cáscara evidenciaron incrementos
significativos, durante las últimas doce semanas del experimento (semanas 32-44).
Estas dos últimas variables muy correlacionadas por su fisiología para la formación de
la cáscara. En cuanto al conteo de eritrocitos, glóbulos blancos y la concentración de
proteínas totales también se evidenció aumento.
Utilizando concentraciones más bajas, durante el periodo medio de postura (semana 36
a la 40) (Maysa et al., 2008). Se comprobó que la adición de ácidos húmicos a la dieta
en una proporción de 60 g por tonelada (60 ppm) mejora el porcentaje de producción
de huevos, el peso del huevo y la eficiencia en la conversión de alimento (Kucukersan
et al., 2005).
El suplemento de la dieta con sustancias húmicas en periodos tardíos de la producción
de gallinas ponedoras tiene un potencial significativo por cuanto la fisiología propia de
la gallina tiende a disminuir su porcentaje de producción, esta condición la hace más
susceptible a responder positiva o negativamente frente a modificaciones dietarías o
de manejo que afecten la nutrición y/o la salud, dichas respuestas se miden en primera
instancia en términos de desempeño productivo.
Al suplementar con humatos en periodos tardíos de producción de huevo (0,1% y 0,2%
de la dieta) aunque no se afecta el consumo de alimento, la producción de huevo se
incrementa, se reduce la mortalidad y mejora la eficiencia en la conversión alimenticia
pero no mejora la calidad del huevo (Yoruk et al., 2004).
Se han probado los ácidos húmicos líquidos en el agua de bebida de gallinas
ponedoras entre las semanas 26 y 90, concluyendo que la adición de humatos líquidos
en el agua de bebida mejora los parámetros de producción eliminando los efectos
negativos de la edad y de esta manera incrementa la producción en las fases media y
tardía de las gallinas y mejora la calidad de la cáscara del huevo (Eren, Gezen, Deniz,
19
Orhan, 2008). En gallinas Isa Brown de 51 a 61 semanas, un estudio demostró que la
adición de ácidos húmicos en forma líquida a 30 ppm mejora las características de la
cáscara del huevo frente al suministro de 90 ppm, lo cual fortaleció la idea de que altos
niveles de ácidos húmicos en la dieta por sus efectos quelantes, disminuyen los
contenidos de calcio y fósforo en la sangre, la permeabilidad de las paredes celulares y
la absorción de dichos nutrientes. Sin embargo, la suplementación con 90 ppm de
ácidos húmicos aumenta el consumo de alimento, el porcentaje de producción de
huevos y el peso de los huevos aunque la conversión alimenticia no se afecta (Ergin et
al., 2009).
Adicionalmente, al combinar humatos con L-carnitina con el propósito de participar en
el metabolismo de la energía, tampoco se observaron cambios significativos en los
parámetros productivos ni hematológicos de las aves (Yalcyn et al., 2006).
Tabla 1. Cuadro comparativo sobre los estudios arriba que evalúan el efecto de la
sustancias húmicas en gallinas ponedoras.
Fuente: los autores.
2.2.3 Efecto quelante de las sustancias húmicas. Resulta oportuno resaltar que por
la naturaleza iónica negativa de los ácidos húmicos, siendo ácidos orgánicos que
Edad aves semanas
cantidad SH % Pdn
Calidad del huevo
Peso corporal Colesterol Peso Huevo
Parám hematológ Mortalidad
22-40 0,15% - - ↑ ↓ - -32-44 200 ppm ↑ ↑ - ↑ ↑36-40 60 ppm ↑ ↑36-40 0,1 y 0,2 % ↑ ↓51-61 30 ppm51-61 90 ppm ↑ ↑ -Figura 1: Suplementación de gallinas ponedoras con sustancias humicas
- No se vió afectado
Suplementacion de gallinas ponedoras con SH
↓ : disminuyó↑ : aumentó
20
pueden quelar metales catiónicos y por consiguiente tienen la habilidad de formar
complejos para disminuir la absorción o antagonizar los efectos tóxicos, su uso para
disminuir la toxicidad de metales contaminantes o la acumulación de estos en los
tejidos animales cobra importancia en la alimentación animal y en el tratamiento de
aguas contaminadas con metales pesados, los cuales generan hepatotoxicidad,
nefrotoxicidad y acumulación de dichos metales en órganos y tejidos que son
destinados al consumo humano (Husseim, Abu, Rebey Meerasahib, 2011; Janos, Hula,
Bradnová, Pilarová, Sedlbauer, 2009; Zralý, Pisariková, Trcková, Navratilová, 2008); El
suministro de ácidos húmicos a razón de 0,5 g/Kg y Plomo en la dieta, demostró el
efecto quelante con una disminución significativa de la acumulación de plomo en
hígado, riñones, músculos y huesos de broilers, en contraste con el grupo control y
sobre la acumulación de mercurio en los mismos tejidos, se disminuyó en un 4,9%
(Zralý Z, Pisariková B, Navratilová, 2008). No obstante, debido a los contenidos de
Mercurio en los ácidos húmicos (0,222 mg/Kg), los niveles de mercurio acumulado en
hígado, riñones, cerebro y músculos, aumentaron dos y tres veces excediendo los
límites permitidos (0,05 mg/Kg en muestra fresca) aunque la acumulación se redujo
significativamente frente al grupo control positivo (altas dosis de Metilmercurio) y se
redujeron los efectos adversos sobre los parámetros productivos. En este mismo
experimento el hallazgo de una mayor concentración sanguínea de Fósforo y menor
concentración de Cobre sanguíneo se atribuyó a la formación de los complejos metal-
húmicos.
Teniendo en cuenta que la exposición a iones Cadmio baja el nivel de Calcio en el
organismo causando una interrupción del metabolismo normal del Calcio (Blommfield,
2001) el uso de sustancias húmicas en la alimentación animal, protege de posibles
contaminaciones de fuentes hídricas y/o alimenticias como lo aseguran algunos
investigadores (Herzig, Navratilová, Suchy, Vecerek, Totuse, 2007) al demostrar que la
acumulación de Cadmio en tejido muscular, riñones e hígado de broilers disminuye
cuando las aves han sido suplementadas con ácidos húmicos.
21
No obstante lo anterior, suplementar con sulfato de zinc y ácido húmico al tiempo, no
genera diferencias estadísticamente significativas en depósitos de zinc a nivel de
hígado, músculos de la pierna ni riñones. Adicionalmente, el efecto quelante del ácido
húmico se refleja en la disminución del efecto antiaterogénico (evita la formación de
ateromas) que tiene el Zn en presencia de cobre y por consiguiente los niveles de
colesterol se aumentan (Herzig et al., 2009), aunque el suministro de sustancias
húmicas en la dieta con niveles normales de Iodo no tiene influencia sobre el peso de la
tiroides y por consiguiente no se comporta como bociogénico (Huanq, Lu, Tsai, Chopra,
1994).
Por otra parte y no menos importante para la industria avícola, se evaluaron
oxihumatos (ácidos húmicos a partir de carbón bituminoso) como quelantes de
aflatoxinas B1 tanto in vitro como in vivo (Van Rensburg, Badenhorst, Ghandy,
Snyman, 2010) y encontraron que in vitro los oxihumatos fueron capaces de formar
complejos con las aflatoxinas e in vivo dichos complejos se reflejaron en la inhibición de
los efectos tóxicos que la aflatoxina produce a nivel gástrico y hepático, así como
también el aumento de los valores en el hematocrito, incremento en la proteína sérica
total, mientras que las transaminasas hepáticas no presentaron cambios significativos.
Todos los reportes expuestos anteriormente, fortalecen la utilidad de los ácidos
húmicos en la alimentación de sistemas de producción avícola tanto como promotores
de crecimiento así como método preventivo para quelar sustancias químicas tóxicas
que en un momento dado contaminen el alimento o el agua de bebida de los animales
de producción siempre y cuando las sustancias húmicas no sean portadores de tóxicos.
Figura 1. Mejoras Productivas y fisiológicas de la inclusión de sustancias húmicas
reportadas en la alimentación de aves.
22
Fuente: los autores
2.3CONCLUSIONES
Aunque las sustancias húmicas no se reportan en las tablas de aditivos para el diseño
de dietas animales, los estudios demuestran que dichas sustancias tienen un potencial
significativo como promotores de crecimiento tanto en pollos de engorde como en
gallinas ponedoras, mejorando los parámetros productivos, las características de la
carcasa y de la cáscara de los huevos especialmente en las fases tardías de
producción donde uno de los principales inconvenientes es la disminución en la
producción, la fragilidad de la cáscara y por consiguiente la calidad del producto.
Teniendo en cuenta que la ganancia de peso, tasa de conversión, producción de
huevos y porcentaje de mortalidad son los parámetros productivos más importantes en
los sistemas de producción avícola y que dichos factores dependen en gran parte del
estado sanitario y la respuesta inmune de las aves, se evidencian vacíos de
conocimiento en cuanto al efecto de las sustancias húmicas sobre el sistema inmune y
sus respuestas celulares y humorales en las diferentes fases de producción, así como
otras respuestas fisiológicas que expliquen los resultados obtenidos sobre los
parámetros productivos en investigaciones previas.
23
Desde otro punto de vista, la utilización de sustancias húmicas en la dieta como
suplemento alimenticio, aporta un grano de arena en los procesos de producción
animal limpia y conservación del medio ambiente por cuanto es un producto de origen
orgánico que minimiza emisiones y uso de insumos tóxicos y que de acuerdo con el
sustrato y los mecanismos de extracción de donde provengan garantizan la calidad de
los productos de origen animal reduciendo riesgos para la salud humana.
24
3. ARTÍCULO ORIGINAL: EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE LAS
SUSTANCIAS HÚMICAS SOBRE LOS PARÁMETROS PRODUCTIVOS EN
GALLINAS PONEDORAS.
3.1 INTRODUCCIÓN
El uso indiscriminado de antibióticos como promotores de crecimiento (APC) genera
consecuencias negativas en la microbiota intestinal de los animales de producción.
Hace más de dos décadas la Unión Europea prohibió el uso de todos los antibióticos
promotores de crecimiento en las dietas para animales, trayendo consigo la
implementación de nuevas estrategias de manejo, entre las que se encuentran la
utilización de sustancias alternativas y seguras como el uso de aditivos alimentarios
naturales y terapias no medicamentosas en remplazo de los antibióticos utilizados en
producción y sanidad animal (Rosmini et al., 2004). Mediante el uso de prebióticos,
probióticos, simbióticos, entre otros, se aumenta la resistencia natural a la aparición de
enfermedades infecciosas del tracto gastrointestinal y optimizan los procesos de
digestión y absorción (Collins et al., 1999; Wondmeneh et al., 2011).
Resultados de investigación sugieren que las sustancias húmicas (SH) comerciales
pueden ser útiles para remplazar el uso de APC en pollos de engorde (Ceylan et al.,
2002). Otras investigaciones reportaron un desempeño productivo similar al usar dietas
suplementadas con humatos frente a dietas suplementadas con microorganismos
probióticos, con la suplementación de 0,1% de SH, la tasa de conversión de alimento
mejora en un 2%, frente a la suplementación con 0,2 y 0,3% de SH, aunque no se
afectan las características del desempeño ni de la carcasa pero la mortalidad de los
grupos suplementados fue del 0% en comparación con el 1,8% del grupo control (Celik
et al., 2008; Karaoglu et al., 2004; Yoruk et al., 2004).
En estudios realizados en pollos de engorde, al suplementar con 0,05, 0,1 y 0,15%,
mejoran las características de color en los muslos y pectorales, la conversión de
alimento es más eficiente y el colesterol sanguíneo y la grasa abdominal disminuyen
25
(Ergin et al., 2011). En concentraciones mayores de humatos, Rath et al. (2006)
encontraron que aunque el peso corporal disminuyó, la tasa de conversión alimenticia
mejoró y no se encontraron diferencias en la presentación de discondroplasia tibial ni
en los parámetros hematológicos ni bioquímicos, excepto en el conteo de heterófilos.
La ganancia de peso fue mayor y la conversión de alimento fue menor con el uso de
humatos sódicos, mientras que los valores más altos de calcio sérico y más bajos en
aspartato aminotransferasa (AST) fueron observados con las sustancias húmicas
naturales (Samudovska et al., 2010). Los datos de estos autores demuestran que hubo
una mejor asimilación y metabolismo del calcio dietario y una mejor estructura hepática.
Otros estudios indican que las SH no generan diferencia significativa en el desempeño
de pollos broiler durante los primeros 42 días de vida ni afectan los parámetros
bioquímicos (Conteo de leucocitos, diferencial de leucocitos, transaminasas, proteína,
albumina, glucosa, BUN, Fe, Ca, P), respecto del grupo control, como tampoco se vio
afectado el peso de los órganos internos (Molleja, hígado y proventrículo). Los autores
asocian el efecto promotor de los humatos con el aumento en el desempeño
productivo, lo cual al estabilizar la flora intestinal y mejorar la utilización de nutrientes
por parte del animal, posibilita un aumento en la ganancia de peso.
En gallinas ponedoras, Yalcin et al. (2006) suplementaron con 0,15% de SH que
contenían 35% de humato sódico y 6% de ácidos fúlvicos, encontrando que el
porcentaje de producción, calidad del huevo, mortalidad y parámetros hematológicos
no presentaron diferencias estadísticas. Sin embargo, otros estudios han demostrado
que las gallinas suplementadas con humatos son significativamente más pesadas
comparadas con el grupo control (Maysa et al., 2008) y mejoran el porcentaje de
producción de huevos, el peso del huevo y la eficiencia alimenticia en los períodos
tardíos de producción (Yoruk et al., 2004; Kucukersan et al., 2005; Lipczynska-Kochany
et al., 2009).
El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la suplementación de
sustancias húmicas en dos concentraciones (0,1 y 0,2%) para determinar los posibles
cambios sobre parámetros productivos (peso de las gallinas, porcentaje de producción,
mortalidad, peso del huevo) y parámetros de calidad de los huevos (color de la yema,
26
grosor de la albúmina y de la cáscara) de gallinas ponedoras Hy line Brown en la etapa
posmuda .
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1 Condiciones experimentales.. Este estudio fue desarrollado en las instalaciones
de gallinas ponedoras enjauladas de la granja experimental de la Universidad
Cooperativa de Colombia, sede El Salado, zona norte del casco urbano del municipio
de Ibagué Tolima, Colombia (03°24″N 74°56″). La temperatura promedio del área de
estudio fue de 28,1°C registrada mediante termómetro digital de máximas y mínimas
(Brixco®). Fueron usadas 120 gallinas ponedoras Hy line brown en fase de producción
posmuda, clínicamente sanas, las cuales fueron previamente vacunadas contra
Gumboro (cepa Lukert), Bronquitis Viral infecciosa (cepa Massachussetts) y New
Castle (cepa B1) del laboratorio Laverlam. Las gallinas se mantuvieron levantadas en
piso, trasladadas a Jaula a las 16 semanas y sometidas a régimen de muda tradicional
con ayuno prolongado y suplementadas con 5 gramos de carbonato de Calcio por ave
durante el ayuno como lo sugiere el manual de producción Hy Line International (2011).
3.2.2 Sustancias húmicas.. Las sustancias húmicas sometidas al experimento
(Nutrihumic® ) se obtuvieron de la biotransformación de la cachaza, hoja y vinaza de la
producción de azúcar y alcohol, los cuales son sometidos a un proceso biotecnológico
donde se llevan hasta su último paso de transformación y estabilización de la materia
orgánica (80% de ácidos húmicos). Las sustancias húmicas son un producto que
presenta un pH de 6,4, densidad de 0,73 g/cm3, humedad máxima del 12,32% y
62,45% de cenizas. Este producto fue donado por PBA Productos Biotecnológicos S.A.
http://pba.com.co/index.php?option=com_content&view=category&id=4).
27
3.2.3 Normatividad. El experimento fue realizado bajo la normatividad tanto en
producción de animales como en bienestar de los mismos, avalado por el comité de
Bioética de la Universidad del Tolima, se tuvo en cuenta la ley 576/2000 en cuanto al
uso de animales en investigación y docencia.
3.2.4 Diseño experimental. Se realizó un experimento multivariado completamente
aleatorizado, en la cual se sustentó una mínima muestra estadística necesaria de 120
aves por fórmula de población finita y un nivel de confianza del 95%, dividas en cuatro
grupos durante 8 semanas en la fase posmuda. Hubo dos tratamientos suplementados
con sustancias húmicas (0,1 y 0,2 %), basado en trabajos de Yoruk et al. (2004) y Abo-
Egla et al. (2011). Así mismo, un grupo suplementado con Clorhidrato de Levamisol
(Levamisol oral 4%, Veterland) en el agua de bebida a una concentración de
inmunoestimulación de 0,25 mg/kg día (Soppi et al., 1979) como control positivo y un
grupo control negativo sin suplementación en la dieta. Cada tratamiento con 10
Unidades Experimentales (UE) conformada cada una por 3 gallinas ubicadas en jaulas
individuales de 20 cm x 40 cm x 30 cm, en módulo piramidal de tres niveles. En todos
los casos el agua se suministró ad libitum con bebedero automático.
El día cero para el experimento fue el primer día posmuda en el cual se inició el
consumo de alimento una vez la producción bajó al 0%.
28
3.2.5 Determinación de los parámetros productivos. El porcentaje de mortalidad se
determinó dividiendo el número de gallinas muertas entre total de gallinas que hacen
parte del grupo experimental multiplicado por 100. El porcentaje de producción se
calculó dividiendo el número de huevos producido sobre el número de huevos
esperado (teniendo en cuenta que la fisiología de la postura es cada 24-26 horas)
multiplicado por 100. Dichos datos se registraron diariamente. El consumo de alimento
se midió cada quince días al igual que la recolección de las muestras de huevos. Los
huevos recogidos se almacenaron durante 24 horas a temperatura ambiente para
medir peso del huevo con una balanza de precisión Scout® Pro SP2001, el color de la
yema se midió con el abanico de colores de Roche®, y el grosor de la cáscara y el
grosor de la albúmina se midieron con un micrómetro digital Mitutoyo® con una
precisión de 0,001 mm.
La tasa de conversión alimenticia se calculó en términos de Kg de consumo de
alimento/kg de huevo producido cada quince días.
3.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos fueron analizados mediante análisis de varianza (ANOVA) seguidos de un
test pos hoc de Tukey, posterior a la validación de la distribución normal,
homogeneidad de varianza e independencia (i.e. Shapiro Wilk, Barlet). Los datos no
paramétricos se analizaron mediante el estadístico Kruskal-Wallis y la prueba de
comparación múltiple de Dunn. Los datos fueron analizados mediante software
Graphpad Prism 5.03, estableciendo un valor p<0.05 por debajo del cual se
consideraron significativamente diferentes los valores de las variables en cada
tratamiento.
3.4 RESULTADOS
29
3.4.1 Parámetros productivos. La mortalidad observada durante el período
experimental fue baja (1,66%), se limitó a dos animales, una en el día ocho por acción
mecánica y otra en el día 22 por ovoperitonitis. En ninguno de los muestreos hubo
diferencias en el peso de las gallinas, producción de huevos, peso del huevo, consumo
de alimento ni en la tasa de conversión alimenticia entre los diferentes grupos
experimentales suplementados con SH, (P>0.05, véase Tabla 1). El peso de las
gallinas y consumo de alimento se analizó mediante ANOVA de una vía con un test pos
hoc de Tukey. La producción de huevos, peso del huevo y tasa de conversión
alimenticia se analizaron mediante el estadístico Kruskal Wallis con el test de
comparación múltiple de Dunn. Las medias y error estándar del peso de la gallina,
producción de huevos, peso del huevo, consumo de alimento y tasa de conversión
alimenticia se muestran en la tabla 1.
Tabla 2.1. Peso de las gallinas, Porcentaje de producción, peso del huevo, consumo de
alimento y tasa de conversión alimenticia con la suplementación de sustancias húmicas
Variables Tratamientos P Valor
Peso de la gallina (g)
(media±EE) T1 T2 T3 T4 ANOVA
Día 0 1564±37 1575±49 1630±41 1552±49 0,3525
Día 15 1914±52 1864±42 1916±41 1912±45 0,4192
Día 30 2010±42 1956±52 2043±34 1959±55 0,4859
Día 45 2090±38 1992±53 2048±44 1994±50 0,5826
Día 60 2090±38 2043±55 2086±49 2090±59 0,8891
Porcentaje de producción (%) K. W
Mediana
Quartiles
72.40
(68-76)
65.24
(61-68)
69.05
(67-73)
68.00
(62-69) 0,0921
Peso del huevo (g) K. W
30
Día 15, Mediana
Quartiles
67.55
(63-69)
66.70
(63-70)
66.70
(63-72)
68.15
(66-70) 0,8401
Día 30, Mediana
Quartiles
70.80
(56-76)
66.35
(65-71)
67.10
(67-72)
69.15
(67-73) 0,6827
Día 45, Mediana
Quartiles
66.00
(62-71)
76.60
(65-81)
67.75
(65-71)
64.30
(57-69) 0,1888
Día 60, Mediana
Quartiles
70.25
(63-74)
63.15
(61-76)
63.85
(62-67)
64.60
(55-69) 0,5643
Consumo de
alimento (g) ANOVA
Media 106,8 99,44 105,7 105,5 0,2847
E E 3,2 3,7 2,5 3,0
Tasa de Conversión alimenticia K. W
Mediana
Quartiles
1.6
(1.5-1.8)
1.4
(1.3-1.7)
1.6
(1.5-1.7)
1.6
(1.5-1.8)
0,0565
T1: 0,1 SH%, T2: 0,2SH% T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento.
K.W: Kruskal Wallis. Letras diferentes indican diferencia estadística (p<0.05)
3.4.2 Parámetros de calidad del huevo
Tabla 2.2. Grosor de la cáscara, grosor de la albúmina y color de la yema de huevos de
gallinas suplementadas con SH
Variable Tratamientos P Valor
Día 30 Día 30 Día 30 Día 30 K. W
Grosor de la cáscara
(mm)
Día 15 0,39
(0,38-0,41)
0,39
(0,39-0,42)
0,38
(0,36-0,40)
0,37
(0,36-0,41) 0,3631
31
Día 30 0,46 ab
(0,43-0,61)
0,61ab
(0,54-0,62)
0,33 c
(0,31-0,41)
0,38 bc
(0,35-0,42) 0.0015**
Día 45 0,42
(0,42-0,47)
0,40
(0,38-0,45)
0,42
(0,41-0,55)
0,39
(0,36-0,59) 0.4146
Día 60 0.44 a
(0,40-0,48)
0.4 ab
(0,38-0,43)
0,30 b
(0,28-0,35)
0.31 b
(0,20-0,35) 0.0007***
Grosor de la albúmina
(mm) K. W
Día 15 10,1
(8,3-10,2)
11,2
(9,1-12,5)
9,5
(9-11,5)
9,47
(8,2-10.1)
0,3735
Día 30 5,1
(4,4-6,1)
8,2
(6,9-9,3)
6,9
(5,4-9,9)
5,7
(3,7-9,3)
0,3291
Día 45 7,7
(6-8,5)
6,4
(4,9-7,2)
5,2
(4,8-6,9)
5,3
(5,1-6,9)
0,3615
Día 60 9,1 a
(8,5-10,9)
5,1 b
(4,8-5,4)
6.4 ab
(5,7-8,5)
4,5 b
(3,4-5)
0,0007***
Valores de las medianas y el rango de quartiles de 120 gallinas. T1: 0,1 SH%, T2:
0,2SH% T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento. Letras diferentes
indican diferencia estadística (p<0,05)
El grosor de la cáscara no presentó diferencias significativas entre los tratamientos al
día 15 ni al día 45 de suplementación con SH (p>0,05). No obstante, al día 30 y 60 los
huevos de las gallinas suplementadas con SH presentaron mayor grosor de la cáscara
comparados con aquellos no suplementados (p<0,05). (Figura 1)
32
Figura 2.1. Efecto de la suplementación con SH sobre el grosor de la cáscara de
gallinas ponedoras en diferentes tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%, T2: 0,2%
T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento, el día 15 (A), 30(B), 45 (C) y 60 (D).
Las letras diferentes indican diferencias significativas, p<0,05. Test Kruskal Wallis, pos
hoc test de Dunn.
T1 T2 T3 T4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Tratamientos
abab
c bc
mm
T1 T2 T3 T4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Tratamientos
mm
T1 T2 T3 T4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Tratamientos
mm
T1 T2 T3 T4
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Tratamientos
a abb b
mm
Fuente: Los autores
El grosor de la albúmina no presentó diferencia significativa entre los grupos los días
15, 30 y 45 del experimento (p>0.05). Sin embargo, al día 60, el grosor de la albúmina
de los huevos de gallinas suplementadas con sustancias húmicas al 0,1% fue
significativamente mayor que los huevos de las gallinas suplementadas con 0,2% de
SH y que el grupo control negativo (p<0.05) (figura 7). Las medias y error estándar (E
E) del grosor de la cáscara de la albúmina y del color de la yema se muestran en la
tabla 2.
C
BA
D
33
Figura 2.2 Efecto de la suplementación con SH sobre el grosor de la albúmina de
huevos de gallinas ponedoras en diferentes tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%,
T2: 0,2% T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento, el día 15 (A), 30(B), 45 (C) y
60 (D). Las letras diferentes indican diferencias significativas p<0,05
T1 T2 T3 T4
0
5
10
15
Tratamientos
mm
T1 T2 T3 T4
0
5
10
15
Tratamientos
mm
T1 T2 T3 T4
0
5
10
15
Tratamientos
mm
T1 T2 T3 T4
0
5
10
15
a
bab
b
Tratamientos
mm
Fuente: Los autores
En las muestras de huevos tomadas el día 15, 30 y 60 no hubo correlación (p>0,05)
entre la suplementación con SH de la dieta de gallinas ponedoras y el incremento de
color en la yema de los huevos mediante el test de Fisher. En el día 45 se encontró
correlación entre las variables evaluadas (p=0,027). (Tabla 3, Figura 3)
Tabla 2.3. Color de la yema de huevos de gallinas suplementadas con SH.
Color de la yema
(frecuencia) Con SH Sin SH
Test de
Fisher
Día 15 P 6 1 0,0686
A
C D
34
I 6 10
Día 30 P
I
6
6
1
10 0,0686
Día 45 P
I
7
5
1
10 0,0272*
Día 60 P
I
5
7
5
6 1
P: coloración pálida de las yemas, I: Coloración intensa de la yemas, Con SH:
suplementado con sustancias húmicas, Sin H: Sin suplementación con
sustancias húmicas. *correlación entre las variables (p<0,05)
Figura 2.3. Efecto de la suplementación con SH sobre el color de la yema de huevos
de gallinas ponedoras suplementadas con SH respecto a las que no recibieron SH
analizado mediante test de Fisher. Corresponde al color de la yema en los días 15 (A),
30(B), 45 (C) y 60 (D) de suplementación en la etapa posmuda.
Fuente: Los autores
3.5 DISCUSIÓN
De acuerdo con los resultados arrojados en esta investigación la suplementación con
las sustancias húmicas del experimento no tiene influencia sobre la recuperación del
0
2
4
6
8
10
Con SH
Sin SH
coloración pálida
coloración intensa
0
2
4
6
8
10
Con SH
Sin SH
Coloración pálida
Coloración intensa
C
A
35
Efecto de la suplementación con SH sobre el color de la yema de huevos
suplementadas con SH respecto a las que no recibieron SH
analizado mediante test de Fisher. Corresponde al color de la yema en los días 15 (A),
30(B), 45 (C) y 60 (D) de suplementación en la etapa posmuda.
De acuerdo con los resultados arrojados en esta investigación la suplementación con
las sustancias húmicas del experimento no tiene influencia sobre la recuperación del
coloración pálida
coloración intensa
0
2
4
6
8
10
Con SH
Sin SH
coloración pálida
coloración intensa
Coloración pálida
Coloración intensa
0
2
4
6
8
10
Con SH
Sin SH
Coloración pálida
Coloración intensa
D
B
Efecto de la suplementación con SH sobre el color de la yema de huevos
suplementadas con SH respecto a las que no recibieron SH
analizado mediante test de Fisher. Corresponde al color de la yema en los días 15 (A),
De acuerdo con los resultados arrojados en esta investigación la suplementación con
las sustancias húmicas del experimento no tiene influencia sobre la recuperación del
36
peso de las gallinas Hy Line Brown en la etapa de pos muda, así como tampoco afectó
los parámetros de producción ni el peso del huevo en la etapa de posmuda. Estos
resultados coinciden con lo encontrado por Maysa et al. (2008), pero difieren de lo
señalado por Kukukersan et al. (2008) y Abo-Egla et al. (2011), quienes encontraron
mejores respuestas productivas con 0.1 y 0.2 % de suplementación de SH en la dieta
de gallinas ponedoras. De la misma manera como lo indicaron previos estudios, las
causas de muerte presentadas durante el experimento fueron esporádicas y ajenas al
mismo (Ozturk et al., 2009 y Rath et al., 2006).
Considerando que por la dinámica fisiológica del oviducto, las características del huevo
como el grosor de la albúmina y de la cáscara disminuyen dependiendo entre otras
razones, de la edad de las gallinas (Williams, 1992), los resultados obtenidos en este
estudio coinciden con los reportados por Ergin et al., (2009) y Abo-egla et al., (2011)
revelando que al suplementar con SH, al día 60 de la posmuda no disminuye
significativamente el grosor de la cáscara ni de la albúmina como sucede en el grupo
control, esto sin afectar el porcentaje de producción, resultados que permiten inferir que
por la naturaleza de la estructura molecular aniónica de las SH, éstas interfieren en el
metabolismo del Ca y/o P a nivel reproductivo, aunque no es claro que tenga influencia
sobre el proceso fisiológico de la mineralización de la cáscara. Con base en lo anterior,
es pertinente evaluar los niveles de calcio sérico suplementando con 0,1 y 0,2% de SH
y relacionarlo con la mineralización de las tibias (longitud y ancho de las tibias y
contenido de cenizas) y mineralización de la cáscara (Cornejo et al., 2005).
Teniendo en cuenta que en la comercialización del huevo el color de la yema es un
factor importante para los consumidores que lo relacionan con la calidad del mismo y
que según los resultados de Hammershoj et al., (2010) el color de la yema es un
indicador directo de la cantidad de carotenos que la componen, con los resultados de
esta investigación se infiere que las SH no interfieren con el metabolismo de los
carotenos puesto que la coloración de la yema de los huevos no se altera
significativamente durante la posmuda.
Finalmente, es posible afirmar que la suplementación con SH en los niveles de
suplementación evaluados en el presente trabajo no afectan los parámetros
37
productivos de gallinas en fase de posmuda de la línea Hy Line Brown. Sin embargo,
en el día 60 del experimento (período medio de la posmuda) se observaron cambios
significativos en algunas características de calidad de los huevos como el grosor de la
cáscara y el grosor de la albúmina.
38
4. ARTÍCULO ORIGINAL: EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON SUSTANCIAS
HÚMICAS SOBRE ALGUNOS PARÁMETROS DE INMUNIDAD INNATA EN
GALLINAS PONEDORAS EN FASE POSMUDA
4.1 INTRODUCCION
Los mecanismos de la respuesta inmune, innata o adaptativa durante una infección
compiten con la producción por los recursos en el gasto metabólico (Halliwell y
Gorman, 1992). Por eso se hace imperante la búsqueda de alternativas para estimular
eficientemente las respuestas inmunológicas ante la presencia de patógenos,
minimizando los efectos negativos desde el punto de vista económico, productivo y
medioambiental.
La respuesta inmune innata de las aves puede ser estimulada por el suministro de
sustancias como probióticos, vitamina E, virus e incluso vacunas vivas o subunidades
vacunales (Foster et al., 2012). Adicionalmente, se ha demostrado que el uso de
algunas sustancias inmunomoduladoras, sintéticas como el levamisol o naturales como
sustancias orgánicas, pueden incrementar la resistencia natural a enfermedades
infecciosas del tracto gastrointestinal y optimizan los procesos de digestión y absorción
(Wondmeneh et al., 2011; Collins et al., 1999). Entre las alternativas potenciales para el
mejoramiento del desempeño de diversos procesos biológicos se encuentran las
sustancias húmicas (SH).
Las SH son el producto final de la biotransformación de la materia orgánica, entre las
cuales las más comunes son los ácidos húmicos, fúlvicos y húmicomelánicos (Vlcovà.,
2009). Aunque estas sustancias no se reportan en las tablas de aditivos para el diseño
de dietas animales, algunos estudios demuestran que éstas tienen un importante
potencial como promotores de crecimiento en pollos de engorde y en gallinas
ponedoras (Ceylan y Cifty., 2002). Este hecho podría mejorar el desempeño productivo,
las características de la carcasa y de la calidad de los huevos. Lo anterior puede ser
observado, incluso, en la etapa final del ciclo productivo donde fisiológicamente se
39
genera una disminución en la producción y en la calidad del producto (Eren et al. 2008;
Lipczynska-Kochany et al. 2009; Ergin et al. 2011).
En la industria avícola existen diferentes métodos para extender la vida productiva de
las gallinas ponedoras, siendo común la inducción de la muda (El-Deek y Al-harthi,
2004). El más común de estos métodos es el programa de muda convencional
mediante ayuno prolongado con pérdida de peso que las lleve al peso obtenido a las 18
semanas de vida. Después de un cese total de la producción de huevos durante al
menos 2 semanas se logra una mejor producción, ya que se mejora el porcentaje de
postura, la calidad del huevo y de la cáscara (Alodan et al., 1999; Hassanien, 2011, Hy
line Brown, 2011). No obstante, bajo estas condiciones disminuye significativamente la
fertilidad y la eclosionabilidad en gallinas reproductoras (Tega y Ibrahim, 2010).
Se ha reportado que la naturaleza estresante de la muda afecta negativamente la
respuesta inmune y, en contraposición, la respuesta inmune afecta negativamente la
muda (Moreno y Rueda, 2010). Akram et al. (2002) hallaron que los niveles de
corticoides adrenales plasmáticos se incrementan significativamente durante la muda,
por lo cual se afecta el sistema inmune disminuyendo el conteo total de leucocitos.
Por su parte, la tasa de heterófilos/linfocitos (H/L), que es un indicativo de niveles de
estrés, aumenta significativamente en el pico de producción posmuda (Alodan y
Mashaly, 1999; Davis et al., 2000). De la misma forma, disminuye el número de
leucocitos circulatorios y leucocitos esplénicos (Holt y Porter, 1992) y los niveles de
corticosterona durante la muda son más bajos.
También es de resaltar que los parámetros productivos de las aves dependen de
factores tales como el estado nutricional, estado sanitario y el desempeño
inmunológico. No obstante, a pesar de existir reportes acerca del efecto de las SH
sobre algunos parámetros productivos, existen vacíos acerca del efecto sobre la
respuesta inmune en las diferentes fases de producción. La presente investigación
evaluó el efecto de la suplementación de la dieta con 0,1 y 0,2% de ácidos húmicos
sobre algunos parámetros de la inmunidad innata (actividad bactericida del suero,
índice fagocítico, aglutinación bacteriana, explosión respiratoria, actividad de la
lisozima) en gallinas ponedoras comerciales en la fase de posmuda.
40
4.2 METODOLOGÍA
4.2.1 Condiciones experimentales: Este estudio fue realizado en las instalaciones de
gallinas ponedoras enjauladas de la granja experimental de la Universidad Cooperativa
de Colombia, sede El Salado, Ibagué, Colombia, 03°24″N74°56″. La temperatura
promedio del área de estudio fue de 28,2°C.
De acuerdo con la fórmula de poblaciones finitas se tomaron 120 gallinas ponedoras
Hy line brown en fase de producción posmuda, clínicamente sanas, las cuales se
vacunaron previamente contra Gumboro (cepa Lukert), Bronquitis Viral infecciosa (cepa
Massachussetts) y New Castle (cepa B1) del laboratorio Laverlam. Las gallinas se
mantuvieron levantadas en piso, trasladadas a Jaula a las 16 semanas y sometidas a
régimen de muda tradicional con ayuno prolongado durante 12 días y suplementadas
con 5 gramos de carbonato de Calcio por ave durante el ayuno, como lo sugiere el
manual de producción Hy Line International (2011).
4.2.2 Normatividad. El experimento fue realizado bajo la normatividad tanto en
producción animal como en bienestar de los mismos, avalado por el comité de Bioética
de la Universidad del Tolima adscrito al comité central de investigaciones. Para el
desarrollo de este proyecto se solicitó la autorización correspondiente al Comité de
ética de Investigaciones de la Universidad del Tolima, fundamentado en la aplicación
de las 3 R´s de Russel y Burch (Egerszegi- Obrist, 2005), en la cual se sustentó una
mínima muestra estadística necesaria de aves (120 aves) con un 95% de confianza y
se realizó un procedimiento de cría y toma de muestras refinado con personal experto
que minimice el estrés ocasionado por el experimento. Adicionalmente se tuvo en
cuenta la ley 576/2000 en el Título III capítulo 5 donde se refiere a la ética en la
investigación científica, publicación de trabajos y propiedad intelectual y en el capítulo 6
donde se refiere al uso de animales en investigación docencia y recreación.
41
4.2.3 Sustancias húmicas. Las sustancias húmicas sometidas al experimento se
obtuvieron de la biotransformación de la cachaza, hoja y vinaza de la producción de
azúcar y alcohol. Estos insumos se sometieron a un proceso biotecnológico de
transformación y estabilización de la materia orgánica (80% de ácidos húmicos),
obteniendo un pH de 6.4, densidad de 0,73g/cm3, humedad máxima de 12,32% y
62,45% de cenizas. Este producto fue suministrado por el ingenio PBA Productos
Biotecnológicos
http://pba.com.co/index.php?option=com_content&view=category&id=4)
4.2.4 Diseño experimental. Fue realizado un diseño completamente al azar donde 120
gallinas se distribuyeron en cuatro grupos durante ocho semanas en la fase posmuda.
Dos tratamientos suplementados con sustancias húmicas (0,1 y 0,2 %), según Yoruk et
al. (2004) y Abo-Egla et al. (2011). Un grupo control positivo suplementado con
levamisol (Clorhidrato de levamisol al 4%) en el agua de bebida a una concentración de
0,25 mg/kg día (Soppi et al., 1979) y un grupo control negativo sin suplementación en la
dieta. En cada tratamiento hubo 10 unidades experimentales (UE) conformadas cada
una por 3 gallinas ubicadas en jaulas individuales de 20 cm x 40 cm x 30 cm, en
módulo piramidal de tres niveles. En todos los casos el agua se suministró ad libitum
con bebedero automático.
El día cero para el experimento fue el primer día posmuda en el cual se inició el
consumo de alimento una vez la producción bajó al 0%. Las muestras sanguíneas para
realizar las correspondientes pruebas hematológicas y de inmunidad innata se tomaron
en el día 8, 30 y 60 del experimento.
42
4.2.5 Colecta de muestras. Las gallinas fueron inmovilizadas por personal capacitado
para obtener las muestras sanguíneas mediante punción en la vena metatarsiana,
previa desinfección del área con alcohol etílico al 70%. Para ello, se utilizaron jeringas
estériles desechables de 1 ml, 27 G x ½. La colecta se realizó en microtubos de 1,5 ml
con EDTA (0,3 ml) y microtubos secos (0,7 ml). De la sangre colectada en los
microtubos con EDTA se llenó un microcapilar para medir el hematocrito, se evaluó la
respuesta del índice fagocítico y de la explosión respiratoria de las células sanguíneas
blancas. La sangre colectada en los microtubos secos se centrifugó a 5000 g durante 5
minutos, se extrajo el suero sanguíneo agrupándose según cada unidad experimental
para evaluar la actividad bactericida, de la lisozima y la aglutinación bacteriana.
Una vez tomada la muestra de sangre sin anticoagulante, 50 µL de sangre fueron
utilizados para un extendido en lámina portaobjetos, el cual fue teñido mediante kit
Hemacolor® (Merck, USA). Seguidamente, mediante un microscopio de luz Olympus®
modelo CX21 se realizó la lectura de cantidad de heterófilos y de linfocitos para
calcular la tasa Heterófilos/Linfocitos
4.2.6 Determinación del hematocrito. El volumen de empaquetamiento celular
(hematocrito) se obtuvo mediante la técnica de microhematocrito, a través de la
centrifugación a 2.000 g durante 5 minutos de un tubo capilar para microhematocrito
heparinizado y posteriormente se realiza la lectura (Campbell., 2004).
43
4.2.7. Prueba de actividad fagocitaria. La sangre entera fue mantenida a temperatura
ambiente y diluida 1:20 en Solución Salina balanceada de Hanks® referencia 14175079
(Gibco/Invitrogen) con 1% de NaCl. Luego, 60 µl de la dilución fueron depositados en
un portaobjetos con cámara (Lab-TekII Chamber Slide®, 8 wells), adicionándose 250 µl
de una suspensión de E. coli de origen aviar a una densidad óptica de 0,80 (1 x 108
UFC). El micropreparado se hizo por duplicado y fue incubado durante 15 minutos a
40,5ºC. El proceso de fagocitosis fue detenido mediante enfriamiento de las láminas
sobre hielo según lo descrito por Miller et al. (2007). Se realizó un lavado con Solución
Salina balanceada de Hanks® en cada cámara, luego fueron fijadas con 300 µl de
Metanol (99.9% de pureza) sobre hielo durante 5 minutos, se realizó tinción con
Hemacolor® y se contaron al menos 100 células por cámara, según lo sugerido por
Millet et al. (2007). Los resultados se interpretaron como el índice fagocítico (IF):
Porcentaje de heterófilos que contiene bacterias X el número promedio de bacterias
que han sido ingeridas por los heterófilos (Wells et al., 1998).
4.2.8 Prueba de explosión respiratoria. Se realizó siguiendo la técnica
espectrofotométrica descrita en el procedimiento operativo estándar (Mohanty y
Sahoo., 2010), en la cual se dispusieron de 50 µl de sangre en un vial con 50 µl de
Nitroblue tetrazolium (NBT Tablet® referencia N5514) al 0.2% y se incubó durante 30
minutos a 25ºC. Luego se adicionó 1 ml de NN-dimetil formamida al 99.8% referencia
161785 para solubilizar el formazán reducido y esta mezcla se centrifugó a 2000 g
durante 5 minutos. Se tomaron 200 µl del sobrenadante por duplicado y se depositó en
una placa multipozos de fondo en U para la lectura de la densidad óptica mediante
lector de placas de ELISA (ELx800 Biotek®) a 650 nm. Como blanco se utilizaron 200
µl de NN-dimetil formamida® .
44
4.2.9 Prueba de actividad de la lisozima. Para esta prueba, se preparó una suspensión
bacteriana de Micrococcus luteus (lisodeikticus) ATCC 4698 referencia M3770 (Sigma)
a una densidad óptica de 0,60 (1. X 108 UFC). En una placa multipozos de 96 pozos se
colocaron 20 µL de suero sanguíneo provenientes del pool de cada unidad
experimental y se adicionaron 180 µl de la suspensión. Se realizó la lectura en un
espectrofotómetro con filtro de 650 nm y se repitió a los 10 minutos de incubación a
temperatura ambiente (Millet et al., 2007)
4.2.10 Prueba de aglutinación bacteriana. Se realizó un serial de dilución 1:2 con 25 µl
de suero sanguíneo a igual volumen de PBS y se adicionó 25 µl de solución de E. coli
(108 células/ml) previamente inactivada con formalina en placa multipozos de fondo en
U. Las placas se incubaron en el transcurso de la noche a temperatura ambiente y los
títulos se calcularon como el recíproco de la dilución de suero que presentó la más alta
aglutinación completa de las células bacterianas (Behera et al., 2010).
4.2.11 Prueba de actividad bactericida del suero. Esta prueba fue realizada mediante la
técnica descrita por Low y Sin (1996), en la cual se colectó la sangre sin anticoagulante
manteniéndola a temperatura ambiente durante una hora. Luego se centrifugó a 2500 g
por 5 minutos y se recolectó el suero con una micropipeta. Con una suspensión de E
coli en agua destilada estéril o PBS, se diluyó 1:10, 3 veces en forma seriada.
Se incubaron 2 µl del diluido de la suspensión de la bacteria con 20 µl del suero en un
vial por 1 hora a 37°C. Para el grupo control se usó PBS en remplazo de suero
sanguíneo. Se sembró masivamente en Tripticasa Soya Agar (TSA), y se incubó a
37°C durante 24 horas, posterior a lo cual se llevó a cabo el conteo de UFC.
4.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las variables de respuestas fueron analizadas dependiendo del cumplimiento de los
supuestos estadísticos y sometidas a un análisis de varianza ANOVA seguido por el
test pos hoc de Tukey. Los datos no paramétricos se analizaron mediante el estadístico
Kruskal-Wallis y la prueba de comparación múltiple de Dunn. Estos análisis fueron
45
realizados mediante software Graphpad Prism 5,03 estableciendo un valor p<0.05 por
debajo del cual se consideraron significativamente diferentes los valores de las
variables en cada tratamiento.
4.4 RESULTADOS
Parámetros hematológicos. Los resultados del hematocrito y de la tasa
Heterófilo/Linfocitos se analizaron mediante test de Kruskal Wallis. Al día 8 de
suplementación, las gallinas suplementadas con SH (29.6±0,5, 28,3±0,6) presentaron
diferencia significativa (p<0,05) en el hematocrito con respecto al hematocrito de las
gallinas que no recibieron suplementación (29y 28). El día 30, los grupos
suplementados con SH y Levamisol presentaron un valor de hematocrito (30, 30 y 28)
superior al que presentó el grupo no suplementado (p<0,05) y el día 60 los grupos
control positivo y negativo (26y 26) presentaron un hematocrito menor que los grupos
suplementados (31 y 30) con SH (Figura 1). Los datos de las medinas y los rangos de
quartiles del hematocrito y de la tasa Heterófilos/Linfocitos se presentan en la tabla 1
Tabla 3.1. Hematocrito y tasa heterófilos/linfocitos de gallinas suplementadas con
sustancias húmicas.
Variable Tratamiento K-W
T1 T2 T3 T4 P valor
Hematocrito
Día 8 29a
(28-32)
28ab
(26-31)
28b
(24-30)
27,5ab
(24-31)
0,0216*
Día 30 30a
(28-32)
30a
(29-30)
28a
(26-30)
26b
(26-28)
0,0001***
Día 60 31
(30-32)
30
(27-31)
26
(25-28)
26
(24-28)
0,0001***
Tasa
Heterófilo/Linfocito
Día 8 0,30bc 0,40a 0,36ab 0,19c 0,0252*
46
(0,25-0,42) (0,30-0,52) (0,28-0,52) (0,13-0,28)
Día 30 0,47b
(0,34-0,64)
0,68b
(0,48-0,85)
0,61b
(0,38-0,86)
1,02a
(0,74-1,42)
0,0001***
Día 60 0,33b
(0,19-0,41)
0,26b
(0,20-0,39)
0,30b
(0,20-0,41)
0,62a
(0,43-0,74)
0,0001***
Valores de las medianas y rango de quartiles de 120 gallinas. T1: 0,1 SH%,
T2: 0,2SH% T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento. Letras diferentes
indican diferencia estadística (p<0,05)
Figura 3.1. Efecto de la suplementación con SH (%) sobre el hematocrito en diferentes
tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%, T2: 0,2%, T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4:
sin suplemento, el día 8 (A), 30(B) y 60 (C). Las letras diferentes indican diferencias
estadísticas (p<0,05).
T1 T2 T3 T4
0
10
20
30
40
a ab b ab
Tratamientos
Po
rcen
taje
T1 T2 T3 T4
0
10
20
30
40a a a b
Tratamientos
Po
rcen
taje
T1 T2 T3 T4
0
10
20
30
40
Tratamientos
Po
rcen
taje
Fuente: Los autores
Al día 8 de suplementación con SH, el grupo suplementado con 0,1% de SH y el grupo
sin suplemento presentaron una tasa H/L significativamente menor que los demás
A B
C
47
grupos (p<0,05). En el día 30 y 60, los grupos suplementados presentaron una tasa H/L
significativamente menor que los demás grupos (p<0,05) y el grupo control presentó la
tasa H/L significativamente mayor que los demás grupos (figura 2).
Figura 3.2. Efecto de la suplementación con SH (%) sobre la tasa heterófilos/linfocitos
(H/L) en diferentes tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%, T2: 0,2%, T3: 0,25 mg/kg
de levamisol, T4: sin suplemento, el día 8 (A), 30(B) y 60 (C). Las letras diferentes
indican diferencias estadísticas (p<0,05).
T1 T2 T3 T4
0.0
0.5
1.0
1.5
abc
abc
Tratamientos
Tas
a H
/L
T1 T2 T3 T4
0.0
0.5
1.0
1.5a
bb
b
Tratamientos
Tas
a H
/L
T1 T2 T3 T4
0.0
0.5
1.0
1.5
b b b
a
Tratamientos
Tas
a H
/L
Fuente: Los autores
Parámetros de inmunidad innata. En el octavo día del experimento, las gallinas
suplementadas con 0,1% presentaron mejor IF (71.75) que los demás grupos (55,5,
38,8 y 38,7 respectivamente) (Figura 3). En el día 30, la suplementación con SH al 0,1
y 0,2% generó un IF estadísticamente mayor (p<0,05) que los grupos no
A B
C
48
suplementados. Al día 30, el IF de los grupos suplementados con SH disminuyó (36,8 y
36,9) pero en comparación con los grupos no suplementados con SH (3,9 y 24,5) los
cuales presentaron un IF estadísticamente mayor (p<0,05). En el tratamiento 1 se notó
visiblemente que el IF disminuyó con el tiempo, así el octavo día de suplementación
presentó el mayor IF (71,75) mientras que el día 30 y 60 disminuyó a 36,8 y 36,1
respectivamente (Tabla 2).
Tabla 3.2. Índice fagocítico, explosión respiratoria, actividad bactericida del suero y
aglutinación bacteriana de gallinas suplementadas con SH.
Variables Tratamientos K. W
T1 T2 T3 T4 P valor
Índice Fagocítico
Día 8 71,75ª
(60-80)
55,5b
(49-61)
38,8c
(35-43)
38,7c
(33-41)
0,0001***
Día 30 36,8a
(34-41)
36,9a
(33-40)
31,9b
(26-36)
24,5c
(21-27)
0,004**
Día 60 36,1a
(30-41)
43,9b
(37-49)
46,5bc
(40-54)
51c
(44-58)
0,0001***
Explosión respiratoria
Día 8 0,14c
(0,11-0,16)
0,16bc
(0,12-0,17)
0,18a
(0,16-0,19)
0,16b
(0,13-0,18)
0,0001***
Día 30 0,12 ab
(0,10-0,14)
0,14a
(0,12-0,15)
0,12b
(0,10-0,13)
0,12b
(0,10-0,13)
0,0023**
Día 60 0,14
(0,12-0,15)
0,14
(0,12-0,15)
0,14
(0,12-0,15)
0,14
(0,12-0,15)
0,9672
Actividad Bactericida del Suero
Día 8 115ab
(107-119)
98.5c
(94-105)
117,5a
(112-123)
98,5c
(95-104) 0,0001***
Día 30 117a 110ab 100bc 93c 0,0002***
49
(106-121) (102-119) (88-117) (84-107)
Día 60 99,5
(80-117)
91
(81-111)
77 (58-
105)
90
(79-101) 0,07
Aglutinación bacteriana
Día 8 32a
(32-64)
32ab
(32-32)
16bc
(8-32)
16c
(8-32) 0,0001***
Día 30 32a
(32-64)
48ab
(16-64)
16c
(8-16)
16bc
(16-16) 0,0001***
Día 60 64a
(64-128)
48ab
(32-64)
32b
(16-32)
16c
(16-16) 0,0001***
Valores de las medianas y rangos de quartiles de 120 gallinas. T1: 0,1 SH%, T2:
0,2SH% T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento. Letras diferentes
indican diferencia estadística (p<0.05) **p<0,01
Figura 3.3. Efecto de la suplementación con SH (%) sobre el índice fagocítico (IF) en
diferentes tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%, T2: 0,2%, T3: 0,25 mg/kg de
levamisol, T4: sin suplemento, día 8 (A), 30 (B) y 60 (C). Las letras diferentes indican
diferencias estadísticas (p<0,05).
50
T1 T2 T3 T4
0
20
40
60
80a
b
c c
Tratamientos
I F
T1 T2 T3 T4
0
20
40
60
80
a ab
c
Tratamientos
I F
T1 T2 T3 T4
0
20
40
60
80
ab
bcc
Tratamientos
I F
Fuente: Los autores.
La explosión respiratoria se analizó mediante test de Kruskal Wallis. La suplementación
con 0,1% de SH presentó menor explosión respiratoria (0,14) que el grupo
suplementado con Levamisol (0,18) en el día ocho (p<0,05), y que el grupo control
negativo (0,16), En el día 30 del experimento, los grupos suplementados con 0,2% de
SH presentaron valores de explosión respiratoria mayores que los no suplementados y
en el día 60 no hubo diferencias significativas (p<0,05). Los datos se presentan en la
tabla 2.
Figura 3.4. Efecto de la suplementación con SH sobre la explosión respiratoria
mediante test de Kruskal Wallis en diferentes tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%,
T2: 0,2%, T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento, día 8 (A), 30 (B) y 60 (C).
Las letras diferentes indican diferencias estadísticas (p<0,05).
A B
C
51
T1 T2 T3 T4
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20 a bbc
c
Tratamientos
DO
T1 T2 T3 T4
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
aabb b
Tratamientos
DO
T1 T2 T3 T4
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Tratamientos
DO
Fuente: Lo autores
La suplementación con 0,1% de SH presentó una ABS significativamente mayor que el
grupo suplementado con 0,2% y que el grupo no suplementado en el día octavo
(p<0,05). El día 30, la suplementación con sustancias húmicas presentó una ABS
significativamente mayor que los grupos no suplementados (p<0,05).
La actividad bactericida del suero aumentó el día 30 (p<0,05) y permaneció al mismo
nivel el día 60, en el cual no se presentaron diferencias entre grupos (p>0,05) (Figura
3.5)
Figura 3.5. Efecto de la suplementación con SH sobre la actividad bactericida del suero en diferentes tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%, T2: 0,2%, T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4: sin suplemento, el día 8 (A), 30 (B) y 60 (C). Las letras diferentes indican diferencias estadísticas (p<0,05)
A B
C
52
Día 8
T1 T2 T3 T4
0
50
100
150
ab
a
b
Tratamientos
UF
C
Dia 30
T1 T2 T3 T4
0
50
100
150 a ab bc c
Tratamientos
UF
C
Día 60
T1 T2 T3 T4
0
50
100
150
Tratamientos
UF
C
Fuente: los autores
El día 8, la aglutinación bacteriana fue más alta en los grupos suplementados con 0,1%
de SH que en los demás grupos (p<0,05).
En los días 30 y 60 se evidenció que la suplementación con sustancias húmicas mejora
significativamente la actividad de la aglutinación bacteriana (p<0,05)
Figura 3.6. Efecto de la suplementación con SH sobre la aglutinación bacteriana en
diferentes tratamientos (T1, T2, T3 y T4). T1: 0,1%, T2: 0,2%, T3: 0,25 mg/kg de
levamisol, T4: sin suplemento, el día 8 (A), 30 (B) y 60 (C). Las letras diferentes indican
diferencias estadísticas (p<0,05)
A B
C
53
Día 8
T1 T2 T3 T4
0
20
40
60 a
ab bc
c
Tratamientos
Rec
ípro
co d
e la
dilu
ció
n
Día 30
T1 T2 T3 T4
0
20
40
60
80 a ab
cbc
Tratamientos
Rec
ípro
co d
e la
dilu
ció
n
Día 60
T1 T2 T3 T4
0
20
40
60
80
100a
abb
c
Tratamientos
Rec
ípro
co d
e la
dilu
ció
n
Fuente: los autores
El día 30 del experimento, no se encontró diferencia significativa de la actividad de la
lisozima entre los tratamientos cuando se analizó la diferencia de DO con respecto al
control negativo mediante test de Kruskal Wallis y pos hoc test de Dunn (p>0,05). El día
60, el grupo de gallinas suplementadas con 0,1% de SH presentó una mayor diferencia
en la DO con respecto al control negativo en comparación con el grupo suplementado
con 0,2% se SH (p<0,05) (Tabla 3)
Tabla 3.3. Diferencia de la actividad de la Lisozima con respecto al control negativo de
gallinas suplementadas con SH
Tratamientos KW
T1 T2 T3 P valor
Día 8 -0,001b
(-0,001-0,002)
-0,002b
(0,014-0,002)
0,004a
(0,004-0,002)
0,01**
A B
C
54
Día 30 0,001
(0,001-0,004)
0,001
(0,002-0,002)
0,002
(0,001-0,003)
0,848
Día 60 0,001a
(0,001-0,003)
-0,003b
(0,001-0,008)
0,001a
(0,003-0,004)
0,01**
Valores de la diferencia de las medianas y el rango en quartiles con
respecto al grupo control negativo de 120 gallinas mediante Kruskal
Wallis. T1: 0,1 SH%, T2: 0,2SH% T3: 0,25 mg/kg de levamisol, T4:
sin suplemento. Letras diferentes indican diferencia estadística
(p<0,05). **(p<0,01)
4.5 DISCUSIÓN
Considerando que la etapa de muda mediante ayuno prolongado de las gallinas
ponedoras genera un desafío nutricional durante y posterior a dicha práctica y por
consiguiente el incremento en la producción durante la etapa temprana de la posmuda
compite con la recuperación de las condiciones fisiológicas, los datos obtenidos en el
presente trabajo demuestran que el suplemento con SH durante la etapa posmuda
incrementa significativamente el hematocrito al día 30 en las gallinas ponedoras, lo
cual, de acuerdo con los reportes de Sandoval et al. (2003), puede estar relacionado
con una respuesta a menor nivel de estrés asociado con los resultados obtenidos en la
tasa H/L, no obstante, Van Resburg et al. (2006) indicaron que al suplementar con
3.5% de Oxihumatos en pollos desafiados con aflatoxinas, al cabo de 30 dias no
presentaron diferencias significativas en el hematocrito.
Según los estudios de Sandoval et al (2003), la tasa H/L es un indicador de estrés
agudo. Los resultados del presente estudio demuestran que suplementando con SH,
en el día 30 y 60 pos muda la tasa H/L disminuye, lo cual infiere que las SH tuvieron
influencia sobre el estrés nutricional que las gallinas del experimento afrontaron durante
la muda y la posmuda y de esta manera la dinámica de la tasa H/L respondió
disminuyendo, resultados que se comparan con los reportes de Ajakaiye et al. (2010)
cuando suplementaron con vitamina E y vitamina C gallinas ponedoras estresadas por
55
transporte y encontraron que en el estadío agudo del estrés por efecto de la
suplementación se disminuyó la tasa H/L.
De la misma manera, los hallazgos en este experimento al día 30 y 60 coinciden con
las investigaciones de Rath et al. (2006), quienes afirman que en la cuarta y quinta
semana de suplementación con 0,5 y 1% de SH, la tasa H/L fue significativamente
menor. De esta forma se entiende que las SH disminuyen el estrés en la fase media de
la posmuda, cuando han llegado a su máximo nivel de producción. Así, Shini et al.
(2008) demostraron que niveles elevados de corticosterona y lipopolisacáridos (LPS)
estimulan el incremento de los heterófilos inmaduros de la médula ósea y sangre
periférica, por lo cual la tasa H/L se aumenta en presencia de factores predisponentes
de estrés, tal como se evidencia en este trabajo cuando se evalúa la Tasa H/L una vez
han sido sometidas las gallinas a la práctica estresante nutricional de la muda forzada
por ayuno prolongado.
Los heterófilos son células fagocíticas y microbicidas que dependen primariamente de
mecanismos no oxidativos para la actividad antimicrobiana, ya que no contienen
catalasa, ni mieloperoxidasa. Esto hace que la producción de peróxido de hidrógeno
sea mucho menor que en los neutrófilos de los mamíferos (Harmon, 1998).
Adicionalmente, es conocido que los macrófagos son capaces de atrapar antígenos
foráneos e iniciar la fase adaptativa de la respuesta inmune (Lim et al., 2004). En el
presente estudio se encontró que las SH mejoran el IF en el día 8 y 30 de la fase
posmuda, pero al día 60 es incluso menor que los grupos no suplementados, por lo
cual se deduce que el aumento en la actividad fagocítica generado por las SH en la
etapa temprana de la posmuda tiene un límite de funcionalidad estimulatoria y por
razones desconocidas los fagocitos no recuperan pronto su natural actividad, por
consiguiente al día 60 se refleja en la diferencia significativa con respecto al grupo
control.
Comparando los resultados expuestos anteriormente, Engstad et al. (2002)
demostraron que los leucocitos de humanos incrementan su actividad inmunológica
con β-glucanos, no obstante, Chuamittri et al. (2011) demostraron que el índice
56
fagocítico y actividad bactericida de heterófilos no presentaron diferencia significativa
entre los tratados con β-glucanos, ácido ascórbico y los no tratados mientras que en
murinos la fagocitosis de macrófagos es incrementada por Panax Ginseg y otros
inmunomoduladores (Jiao et al., 2012).
Por otro lado, reportes demuestran que la actividad fagocítica es influenciada por la
genética. Swaggerty et al. (2003) compararon la actividad fagocítica y bactericida de
heterófilos de pollos de emplume rápido y emplume lento. Los autores demostraron
que los pollos de emplume rápido presentaron mayor índice fagocítico y mayor
actividad bactericida. Por tal motivo se sugiere realizar estudios que permitan visualizar
la diferencia del efecto de las SH en la respuesta inmune, de acuerdo a diferentes
líneas genéticas de pollo de engorde y producción de huevo respectivamente.
La actividad de la Lisozima demostró mejorar significativamente el día 60 con una
suplementación de 0,1% de SH. De acuerdo con Li et al. (2006), en la naturaleza el
huevo es el recurso más rico en Lisozima. De ahí que es pertinente estudiar si el
aumento en el grosor de la albúmina del huevo tiene relación con un aumento en la
proporción de Lisozima y a su vez con la inmunidad transferida en el huevo a nivel de
reproductoras.
El suero sanguíneo de las gallinas suplementadas con SH presentó una mayor
aglutinación bacteriana durante todo el tiempo del experimento incluso superando el
grupo control positivo, sin embargo de este tema no se encuentran publicaciones sobre
resultados previos.
Los resultados de la prueba de explosión respiratoria demostraron que al día 30 de la
posmuda las gallinas suplementadas con SH presentaban una mayor producción de
hidrogeniones. Estos datos concuerdan con Ibuki et al. (2011), quienes encontraron
que los macrófagos de pollo HD11 tratados in vitro con manobiosa incrementan la
producción de peróxido de hidrógeno comparado con macrófagos no tratados.
Igualmente, Babu et al. (2006) desafiaron macrófagos HD11 con Salmonella enteritidis
y encontraron que la producción de Ión superóxido era mayor que en los macrófagos
de origen murino.
57
A pesar que la muda forzada se realiza en la práctica de sistemas de producción para
prolongar la vida productiva de las gallinas, para mejorar los parámetros productivos y
de calidad de los huevos, se ha evidenciado que en la etapa posmuda se altera la
relación entre los patógenos y el hospedador (Golden et al. 2008) y por consiguiente
los huevos producidos en el período temprano de la posmuda representan un mayor
riesgo de contaminación para el consumo humano aumentándose el porcentaje de
huevos contaminados con Salmonella (Woodward et al. 2005); Los resultados
mostrados en esta investigación demuestran que suplementando las gallinas
ponedoras en la fase posmuda se generan incrementos significativos en el IF,
actividad de la lisozima y actividad bactericida del suero durante la etapa temprana de
la posmuda (día 8 y 30), mientras que con la misma suplementación en la etapa media
de la posmuda (día 60) disminuye el efecto de algunos parámetros inmunológicos
como IF, explosión respiratoria y actividad de la lisozima, no obstante la aglutinación
bacteriana y el hematocrito incrementan con respecto al control.
En conclusión, los parámetros inmunológicos evaluados en la presente investigación
indican que la suplementación de gallinas ponedoras durante la fase de posmuda con
SH provenientes de la biotransformación de la cachaza, hoja y vinaza de caña de
azúcar pueden actuar como estimulantes los parámetros hematológicos evaluados y
algunos parámetros de la inmunidad innata en gallinas ponedoras particularmente en
la etapa temprana de dicha fase.
58
5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES GENERALES
La suplementación con SH no presentó efecto frente a los parámetros de producción
de gallinas en la etapa de posmuda, ni afectó el peso del huevo, resultados que
coinciden con lo evidenciado por Maysa et al. (2008), pero diferentes de los publicados
por Kukukersan et al. (2008) y Abo-Egla et al. (2011) quienes encontraron mejores
respuestas productivas con 0.1 y 0.2 % de suplementación de SH en la dieta de
gallinas ponedoras. La mortalidad que se presentó no fue apreciable, en el grupo1 el
día 8 se murió una gallina por acción mecánica con la Jaula y el día 22 en el grupo 4 se
murió una gallina por ovoperitonitis, causas de muerte esporádica que no se relacionan
con el experimento, estos resultados coinciden con las publicaciones de Ozturk et al.
(2009) y Rath et al. 2006.
La tendencia indica que a menor porcentaje de suplementación, mayor el grosor de la
cáscara y de la albúmina como lo evidenciaron Ergin et al. (2009), efecto atribuido a los
efectos quelantes catiónicos de las SH. La suplementación con SH a mediano plazo
aumenta el grosor de la cáscara tal como lo publicaron Ergin et al. (2009) y Abo-egla et
al. (2011) resultados que infieren que por la naturaleza de la estructura molecular
aniónica de las SH, éstas interfieren en el metabolismo del Ca y/o P a nivel
reproductivo, aunque no es claro si tenga influencia sobre el proceso fisiológico de la
mineralización de la cáscara. Con base en lo anterior, es de considerar que convendría
evaluar niveles de calcio sérico suplementando con 0,1 y 0,2% de SH y relacionarlo
con la mineralización de las Tibias (longitud y ancho de las tibias y contenido de
cenizas) y mineralización de la cáscara (Cornejo et al., 2005).
Bajo los mismos conceptos se sugiere evaluar la relación de la suplementación con SH
frente a la proporción de huevos rotos, lo cual se reflejaría evidentemente en el
aspecto financiero de un sistema de producción avícola.
Esta investigación reveló que suplementar con SH incrementa significativamente el
Hematocrito en las gallinas ponedoras en el inicio de la fase Pos muda, lo cual de
59
acuerdo con los reportes de Sandoval et al. (2003) puede estar relacionado con
menor nivel de estrés asociado a los resultados de la tasa H/L, pero en desacuerdo con
Van resburg et al. (2006) quienes suplementaron con 3.5% de Oxihumatos a pollos
desafiados con aflatoxinas y no encontraron diferencia significativa en el hematocrito.
Según los estudios de Sandoval et al. (2003), la tasa H/L es un indicador de estrés
agudo. Los resultados de esta investigación demuestran que a partir de los 30 días la
tasa H/L se disminuye con la suplementación de SH y levamisol, resultados que
coinciden con las investigaciones de Rath et al. (2006) quienes afirman que en la
cuarta y quinta semana de suplementación con 0,5 y 1% de SH, la tasa H/L fue
significativamente menor por lo que se infiere que las SH disminuyen el estrés en la
fase media y tardía de la posmuda, cuando han llegado a su máximo nivel de
producción. Como confirmación de esta interpretación Shini et al. (2008) demostraron
que niveles elevados de corticosterona y LPS estimulan el incremento de los heterófilos
inmaduros de la médula ósea y sangre periférica, por lo cual la tasa H/L se aumenta en
presencia de factores predisponentes de estrés.
Teniendo en cuenta que en el mercadeo del huevo, el color de la yema es un factor
clave para algunos consumidores que lo relacionan con la calidad del mismo y que
según los resultados de Hammershoj et al. (2010) el color de la yema es un indicador
directo de la cantidad de carotenos que la componen, se avaluó el color de la yema
encontrándose que no existen diferencias significativas cuando se suplementa con SH
y de esa manera se concluye que las SH no interfiere con el metabolismo de los
carotenos.
Es conocido que los macrófagos son capaces de atrapar antígenos foráneos e iniciar
la fase adaptativa de la respuesta inmune (Lim et al., 2004). Diferentes investigaciones
han demostrado que la eficiencia funcional in vitro de los heterófilos es genéticamente
controlada (Cunegundes et al., 2011; li et al., 2008). Al comparar la actividad fagocítica
y actividad bactericida de heterófilos de pollos de emplume rápido y emplume lento, los
heterófilos provenientes de pollos de emplume rápido presentaron mayor índice
60
fagocítico y mayor actividad bactericida (Swaggerty et al., 2003), por lo cual se sugiere
realizar estudios que permitan visualizar la diferencia del efecto de las SH en la
respuesta inmune de acuerdo a diferentes líneas genéticas de pollo de engorde y
producción de huevo respectivamente.
De otra manera, Engstad et al. (2002) demostraron que los leucocitos de humanos
incrementan su actividad inmunológica con β glucanos, mientras que Chuamittri et al.
(2011) demostraron que el índice fagocítico y actividad bactericida de heterófilos no
presentaron diferencia significativa entre los tratados con β- glucanos, ácido
ascórbico y los no tratados mientras que en murinos la fagocitosis de macrófagos es
incrementada por Panax Ginseg y otros inmunomoduladores (Jiao et al., 2012).
Nuestros resultados revelan que las SH mejoran el IF durante el primer mes de la fase
de posmuda, pero al día 60 es incluso menor que los grupos no suplementados.
La estimulación de la actividad de la lisozima por la suplementación con SH se
presentó en la etapa temprana de la posmuda pero no a los 60 días.
La suplementación con SH al 0,1% y con levamisol aumenta significativamente el
grosor de la albúmina lo cual se relaciona con el incremento de la lisozima sérica en el
día 60. Teniendo en cuenta que de acuerdo con la publicación de Li et al., (2006) en la
naturaleza el huevo es el recurso más rico en Lisozima, convendría estudiar si el
aumento en el grosor de la albúmina tiene relación con un aumento en la proporción de
Lisozima y a su vez con la inmunidad transferida en el huevo a nivel de reproductoras.
Aunque el levamisol produce efectos positivos en varios de los procesos inmunológicos
estudiados en esta investigación, los resultados demuestran en contraste, que no
estimula significativamente la aglutinación bacteriana.
La estimulación de la actividad bactericida del suero es a mediano plazo.
Los resultados de explosión respiratoria demostraron que al día 30 las gallinas
suplementadas con SH presentaban una mayor explosión respiratoria, lo cual se
relaciona con la publicación de Ibuki et al, (2011) quienes encontraron que los
61
macrófagos HD11 tratados in vitro con manobiosa incrementan la producción de
peróxido de hidrógeno comparado con macrófagos no tratados y con Babu et al, (2006)
cuando desafiaron macrófagos HD11 con Salmonella enteritidis y encontraron que la
producción de Ion superóxido era mayor que en los macrófagos de origen murino.
Al día 60 de la suplementación algunas variables inmunológicas evaluadas tal como la
explosión respiratoria, actividad bactericida del suero y actividad de la lisozima no
respondieron eficientemente a la estimulación con SH ni con el levamisol, por lo que se
infiere una disminución de la estimulación inmunológica con el paso del tiempo.
Se sugiere investigar el efecto de las SH sobre la respuesta inmune en diferentes
edades, realizar estudios del efecto de las SH sobre expresión de genes tales como
iNOS, NOX-1, NRAMP1 entre otros, medir el desempeño inmunológico de las SH
frente a desafíos con agentes patógenos de la misma manera como se demostró que
en pollos el ácido ascórbico incrementa la resistencia a desafíos in vivo (Andreasen
and Frank, 1999)
La suplementación con SH en los niveles de inclusión evaluados en el presente trabajo
no afectan los parámetros productivos de gallinas en fase de posmuda de la línea Hy
Line Brown, lo cual indica que los costos metabólicos del aumento en los paramétros
de inmunidad innata que se evaluaron en este trabajo, no afectaron la producción.
Adicionalmente, los parámetros inmunológicos evaluados en esta investigación revelan
que las SH provenientes de la biotransformación de la cachaza, hoja y vinaza de caña
de azúcar pueden actuar como estimulantes de la inmunidad innata especialmente en
la etapa temprana de la fase pos muda generando incrementos significativos en el IF,
actividad de la lisozima y actividad bactericida del suero, mientras que a los 60 días se
disminuye el efecto de algunos parámetros inmunológicos como IF, explosión
respiratoria y actividad de la lisozima, no obstante otros parámetros como la
aglutinación bacteriana, el hematocrito y el grosor de la cáscara se incrementan.
Desde otro punto de vista, el uso de SH en la dieta de gallinas ponedoras como
suplemento alimenticio, puede representar además de un estimulante de la inmunidad
62
del animal, un aporte en los procesos de producción avícola limpia y conservación del
medio ambiente por cuanto es un producto de origen orgánico que al estimular el
sistema inmune sin afectar negativamente la producción, puede convertirse en una
alternativa eficiente para reemplazar los antibióticos promotores de crecimiento y de
esta manera se garantiza la calidad de los huevos reduciendo riesgos para la salud
humana.
63
6. REFERENCIAS
Abo Egla, E.; El-Samra, H.; Ismail, F.; Abd-El ghany, F.; & Assar, M. (2011). Effect of
humic acid and BIOMOS supplementation on egg production and quality parameters in
local hens. Journal Animal and Poultry Production. 2 (4). 55-63.
Akram M.; Zia-ur-rahman, C.; Kim, S. (2002). Effect on the induced molting on the
relative weights and hormone levels of thyroid, ovary and adrenal glands in spent laying
hens. Korean Journal Poultry Science. 29, 243-247.
Aksu, M.; Karaoglu, M.; Kaya, M.; Esenbuga. N. & Macit, M. (2005). Effect of dietary
humate on the pH, TBARS and microbiological propierties of vacuum and aerobic
packed breast and drumstick meats of broilers. J Sci Food Agric. 5 (85), 1485-1491.
Alodan, M. & Mashaly, M. (1999). Effect and induced molting in laying hens on
production and immune parameters. Poultry Science. 78, 171-177.
Andreasen, C.B. & Frank, D.E., (1999). The effects of ascorbic acid on in vitro
heterophil function. Avian Dis. 43, 656–663.
Arce, A.; Rosas, A. & Rodriguez, L. (2007). Prácticas de inmunología general aplicada y
veterinaria. Ed. El manual Moderno. Bogotá D.C.
Babu, U.; Gaines, D.; Lillehoj, H.& Rayburn, R. (2006). Differential reactive oxygen and
nitrogen production and clearance of salmonella serovars by chicken and mouse
Macrophagues. Developmental and Comparative Immunology. 30. 942-953
Behera, T.; Nanda, T.; Mohanty, C.; Mohapatra, D.; Swain, P.; Das, B.; et al. (2010).
Parenteral immunization of fish, Labeo rohita whit poly D L- lactide Co- glycolic
acid(PLGA) encapsulated antigen microparticles promotes innate and adaptive immune
responses. Fish and Shellfish Immunology. 28. 320-325.
Bell D. (2003). Historical and current molting practices in the U.S. egg industry. Poultry
Science. 82, 965-970.
Blommfield, M. (2001). Química de los organismos vivos. México. Editorial Limsa S.A.
ISBN: 968-18-3984-6.
Brighenti, C.; Reis, E. &, Reis C. (2010). Características físico-químicas de ácidos
húmicos em diferentes etapas da vermicompostagem. Eclética Química. 35 (3), 69.82.
64
Cammarota, M.; De Rosa, M.; Stellavato, A.; Lamberti; M, Marzaioli, I. & Giuliano, M.
(2009). In vitro evaluation of Lactobacillus plantarum DSMZ 12028 as a probiotic:
emphasis on innate immunity. International Journal of Food Microbiology. 135. 90-98.
Campbell, T. (2004). Hematology of Birds. In: Thrall, M.A. Veterinary Hematology and
Clinical Chemistry. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. 225-258.
Canellas, L.; Moraes, A.; Rumjanek, V.; García, M.; Guridi, F.; Santos, G. & Velloso, A,
Braz-Filho R. (2002). Structural features of humic acids isolated from soils amended
with urban organic residues: an elemental composition, 13 C NMR, and Pi GC/MS
analysis. Revista Brasileira . Ciencia do Solo. 26 (2), 333-341.
Celyk K,Uzatici A, Akin A. (2008). Effects of dietary humic and Saccharomyces
cerevisiae on performance and biochemical parameters of broiler chickens. Asian J
Anim Vet Adv. 3 (5), 344-350.
Ceylan, N. & Ciftcy, I. (2002). The effects of some alternative feed additives for
antibiotic growth promoters on the performance and gut microflora of broiler chicks.
Turkey Journal Veterinary Animal Science. 27, 727-733.
Chuammitri, P.; Redmond, S.; Kimura, K.; Andreasen, C; Lamont, S. & Palic, D. (2011).
Heterophil functional responses to dietary immunomodulators vary in genetically distinct
chicken lines. Veterinary immunology and immunopathology. 142. 219-227.
Collins, D. & Gibson, G. (1999). Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for
modulating the microbial ecology of the gut. Journal Clinical Nutrition, 69, 1025S-7S.
Cornejo, S.; Pokniak, J; González, J; Salazar, J; Contreras, E. (2005). Evaluación de
un fosfato dicálcico importado en dietas de pollos broiler. Archivos Médicos
Veterinarios. 37 (2), 125-132.
Cunegundes, M.; Costilla, L.; Rezzende, M.; Gomes, S. & Damatta, M. (2011).
Macrophages from chickens selected for high antibody response produced more nitric
oxide and have greater phagocytic capacity. Veterinary Immunology and
Immunopathology. 140. 317-322
Cusack, P. (2008). Effects of a dietary complex of humic and fulvic acids on the health
and production of feed lot cattle destined for the Australian domestic market. Australian
Veterinary Journal 86, 46-49.
65
Davis, G.; Anderson K.; & Carroll A. (2000). The effects on long-term caging and molt of
single comb white Leghorn hens on heterophil to lymphocyte ratios, corticosterone and
thyroid hormones. Poultry Science. 79, 514-518.
Egerszegi- Obrist. (2005). Good science with less animal experimentation. Replace,
reduce, refine. 3 R research foundationFoundation. 36 p.
El-Deek, A & Al-harthi M. (2004). Post molt performance parameters of broiler breeder
hens associated with molt induced by feed restriction, high dietary zinc and fasting.
International Journal of Poultry Science. 3 (7), 456-462.
Engstad, C.S.; Engstad, R.E.; Olsen, J.-O. & Osterud, B. (2002). The effect of soluble -
1,3-glucan and lipopolysaccharide on cytokine production and coagulation activation in
whole blood. International Journal Immunopharmacol. 2, 1585–1597.
Eren, M.; Gezen, S.; Deniz, G. & Orhan, F. (2008). Effects of liquid humate
supplemented to drinking water on the performance and eggshell quality of hens in
different laying periods. Revue. Medicine veterinaire. 159 (2), 91-95.
Ergin, O.; Isa, C.; Nuh, O. & Guray, E. (2009). Effects of dietary humic substances on
egg production and egg shell quality of hens after peak laying period. African Journal of
Biotechnology, 8 (6), 1155-1159.
Ergin, O.; Ocak, N.; Turan, A.; Erener, G.; Altop, A. & Cankaya, S. (2011). Performance,
Carcass, gastrointestinal tract and meat quality traits and selected blood parameters of
broilers fed diets supplemented with humic substances. Journal Science Food
Agriculture, 92, 59-65.
European union register of feed additives pursuant to regulation EC No 1831/2003.
139th edition. Published 20.03.2012.
Foster, N.; Berndt, A.; Lalmanach, A.; Methner, U.; Pascquali. P.; Rychlich, I.; et al.
(2012). Research in Veterinary Science. 93, 7-12.
Fundacionfedna.org. Tablas FEDNA. Fundación española para el desarrollo de la
nutrición animal.2010.
Galip, N.; Polat, U. & Biricik, H. (2010). Effects of supplemental humic acid on ruminal
fermentation and blood variables in rams. Italian Journal of Animal Science. 9.
Griban, VG. (1990). Energy exchange and productivity of cattle given sodium humate in
their diets. Sel’skokhozyaistvennaya Biologiya 6, 106–112. (abstract)
66
Gutierrez, J. (2010). Inmunología veterinaria. Ed. Manual moderno, S.A. México.
Halliwell, R. & Gorman N. (1992). Inmunología clínica veterinaria. Ed Acribia S.A.
Zaragoza España.
Hammershøj, M.; Kidmose, U. & Steenfeldt S. (2010). Deposition of carotenoids in egg
yolk by short-term supplement of coloured carrot (Daucus carota) varieties as forage
material for egg-laying hens. Journal Science Food Agriculture. 90, 1173-1171.
Harmon, B. (1998). Avian heterophils in inflammation and disease resistance. Poultry
Science. 77. 972-977.
Hassanien, H. (2011). Effect of force molting programs on egg production and quality of
laying hens. Asian Journal of Poultry Science. 5 (1), 13-20.
Herzig, I.; Navratilová, M.; Suchy, P.; Vecerek, V. & Totusek, J. (2007). Model trial
investigating retention in selected tissues using broiler chicken fed cadmium and humic
acid. Veterinarni Medicina UZPI. 52 (4), 162-168.
Herzig, I.; Navratilová, M.; Totusek, J.; Suchý, P.; Vecereck, V.; Blajová, J. & Zralý, Z.
(2009). The effect of humic acid on zinc accumulation in chicken broiler tissues. Journal
Animal Science, 54 (3), 121-127.
Holt P. & Porter S. (1992). Effect of induced molting on immune response of hens.
Poultry Science. 33, 165-175.
Huanq, T.; Lu, F.; Tsai, C. & Chopra, I. (1994). Effect of humic acids on thyroidal
function. Journal Endocrinology Invest. 17 (10), 787-791.
Husseim, H.; Abu, Z.; Rebey, E. & Meerasahib, M. (2011). Environmental assessment
of ground water pollution by heavy metals and bioaccumulation of mercury residues in
chicken tissues. African Journal of Biotechnology. 10 (71), 16089-16100.
Hy Line International. (2011). Manual de estándares de rendimiento.
Ibuki, M.; Kovacs-Nolan, J.; Fukui, K.; Kanatani, H. & Mine, Y. (2011). Β 1-4
mannobiose enhances Salmonella Killing activity and activate innate immune responses
in chicken macrophagues. Veterinary Immunology and Immunopathology. 139. 289-
295.
Islam, K.; Schuhmacher, A. & Gropp, J. (2005). Humic acid substances in animal
agriculture. Pakistan Journal of Nutrition. 4 (3), 126-134.
67
Janos, P.; Hula, V.; Bradnová, P.; Pilarová, V. & Sedlbauer, J. (2009).
Chemosphere.75 (6), 732-738.
Ji, F.; Mc Glone, J.; Kim, S. (2012). Effects of dietary humic substances on pig growth
performance, carcass characteristics and ammonia emission. Journal of Animal
Science. 84 (9), 2482-2490.
Jiao, l.; Wank, D.; Zhang, X.; Li, B.; Zhao, H. & Liu, S. (2012). Characterization and
immunostimulating effects on murine peritoneal of oligosaccharide isolated from Panax
ginseng C.A Meyer. Journal of ethnopharmacology. 144. 490-496.
Karaoglu, M.; Macit, M.; Esenbuga, N.; Durdag, H.; Turgut, L. & BIlgin, C. (2004). Effect
of supplemental humate at different levels on the growth performance, slaughter and
carcass traits of broilers. International Journal of Poultry Science. 3 (6), 406-410.
Kaya, C. & Tuncer, S. (2009). The effects of humates on fattening performance, carcass
quality and some blood parameters of broilers. Journal of Animal and Veterinary
Advances. 8 (2), 281-284.
Kucukersan, S.; Kucukersan, K.; Colpan, I.; Goncuoglu, E.; Reisly, Z. & Yesilbag, D.
(2005). The effects of humic acid on egg production and egg traits of laying hen.
Veterinary Medicine. 50 (9), 406-410
Laub R. (1998).The chemically induced inhibition of HSV infection. Laub Biochem corp.
www.laubiochem.com http://www.laubiochem.com/.
Leshchinsky, T & Klasing, K. (2001). Relatioship between the level of dietary of vitamin
E and the immune response of broiler chickens. Poultry Science. 80. 1590-1599.
Li, B.; Huang, SM. & Paskewitz, M. (2006). Hen egg white lysozyme as an inhibitor of
mushroom tyrosinase. FEBS Letter., 580: 1877-1882.
Li, H.; Zhang, H.; Ning, Z.H.; Deng, X.M. & Lian, Z.X.; Li, N. (2008). Effect of selection
for phagocytosis in dwarf chickens on immune and reproductive characters. Poultry.
Science. 87, 41–49.
Lipczynska-Kochany, E.; & Kochany, J. (2009) Effect of humate on biological treatment
of wastewater containing heavy metals. Chemosphere. 77 (2), 279-284.
Lim, T.S.; Na, K.; Choi, E.M.; Chung, J.Y. & Hwang, J.K. (2004). Immunomodulating
activities of polysaccharides isolated from Panax ginseng. Journal.of Medicinal Food. 7,
1–6
68
Loon, D.; Hangalapura, B.; Reilingh, G.; Nieuwland, M.; Kemp, B. & Parmentier, H.
(2004). Livestock Production Science. 85. 139-150.
Lotosh, T. (1991). Experimental basic and prospects for the use of humic acid
preparations from peat in medicine and agriculture production. Nauchnye Doki Vyss
Shkoly Biol. Nauki. 10. 99-103.
Mansur, S.; Zia, R.; Sajjad, R. & Ijaz, H. (2007). Dinamics of innate immune response in
Gallus domesticus using two methods of induced molting. Veterinary Immunology and
Immunopathology. 120, 106-114.
Matos, G. & Arruda, M. (2003). Vermicompost as natural adsorbent for removel metal
ions from laboratory effluents. Process Biochemistry. 39 (1), 81-88.
Maysa, H. &Sheikh, A. (2008). The effect of dietary humic acid supplementation on
some productive and physiological traits of laying hens. Egypt Poultry Science. 28 (4),
1043-1058.
McCowan, B.; Schrader, J.; DiLorenzo, A.; Cardona, C. & Klingbord D. (2006). Effect of
induced molting on the well being of egg laying hens. Journal of Applied Animal Welfare
Science. 9 (1), 9-23.
McMurphy, CP.; Duff, GC.; Sanders, SR.; Cuneo, SP. & Chirase, N. (2011) Effects of
supplementing humates on rumen fermentation in Holstein steers. S. African Journal of
Animal Science 41 (2), 134-140.
Millet, S.; Bennett, J.; Lee, K.; Hau, M. & Klasing, K. (2007). Quantifying and comparing
constitutive across avian species. Developmental & comparative immunology. 31, 188-
201.
Molino, A.; Garcia, E.; Berto, D.; Pelicia, K.; Silva, A. & Vercese, F. (2009). The effects
of alternative forced- molting methods on the performance and egg quality of
commercial layers. Revista Brasileira de Ciencia Avícola. 2, 109-113.
Moreno-Rueda, G. (2010). Experimental test of a trade of between moult and immune
response in house sparrows Passer domesticus. Journal of evolutionary Biology. 23,
2229-2237.
Naudé, P.; Cromarty, A.; & Van Rensburg, C. (2010). Potassium humate inhibits
carrageenan-induced pawo edema and a graft-versus-host reaction in rats.
Inflammopharmacology. 18 (1), 33-39.
69
Ozturk, E.; Ocak, N.; Coskun, I.; Turjan, S. & Erener, G. (2009). Effect of humic
substances supplementation provided through drinking water on performance, carcass
traits and meat quality of broilers. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition.
94, 78-85.
Pasqualoto, L.; Lópes, F.; Okorokova-Facanha. & Rocha, A. (2002). Humic acids
isolated fron earthworm compost enhance root elongation, lateral root emergence and
plasma membrane H†-ATPase activity in maize roots. Plant Physiology. 140. 1951-
1957.
Patti, A.; Rose, M.; Little, K.; Jackson, R. & Cavagnaro, T. (2013). A meta-analysis of
plant-growth response to humic substance applications. Geophysical Research
Abstracts 15: 12892.
Pereira, M. & Arruda, M. (2003). Vermicompost as natural adsorbent material:
characterization and potentialities for cadmium adsorption. Journal Brazilian Chemical
Society. 14.1
Pires, D.; Malheiros, E. & Boleli, I. (2007). Influence of Sex, Age, and Fasting on Blood
Parameters and Body, Bursa, Spleen and Yolk Sac Weights of Broiler Chicks. Brazilian
Journal of Poultry Science. 9 (4), 221-228.
Quershi, M. (1998). Role of macrophagues in avian health and disease. Poultry
Science. 77. 978-982.
Rath, N.; Huff, W. & Huff, G. (2006). Effects of humic acid on broiler chickens. Poultry
Science. 85. 410-414.
Rocha, J.; Rosa, A. & Furlan, M. (1998). An alternative Methodology for the extraction
of humic substances from organic soils. Journal Brazilian Chemical Society. 9 (1), 51-
56.
Rodriguez, T.; Venegas, J.; Angoa, M. & Montañez. J. (2010). Extracción secuencial y
caracterización fisicoquímica de ácidos húmicos en diferentes compost y el efecto
sobre trigo. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas. 1 (2), 132-146.
Romero, L.; Strochlik, D. & Wingfield, J. (2005). Corticosterone inhibits feather growth:
potential mechanism explaining seasonaldown regulation of corticosterone during molt.
Comparative biochemistry and Physiology. 142 (1), 65-73.
70
Rosmini, M.; Sequeira, G.; Guerrero, L.; Marti, L.; Dalla, R.; Frizzo, L. & Bonazza, J.
(2004). Producción de Prebióticos para animales de abasto: importancia del uso de la
microbiota intestinal indígena. Revista Mexicana de Ingeniería Química, 3 (2), 181-191.
Sabi, R.; Very, P. & Van Rensburg C. (2011). Carbohydrate-derived fulvic acid
(CHD_FA) inhibits carrageenan-induced inflammation and enhances wound healing:
efficcacy and toxicity study in rats. Drug Development Research. 73 (1),18-23.
Samudovska, A. & Demeterová, M. (2010). Effect of diet supplement with natural humic
compounds and sodium humate on performance and selected metabolic variables in
broiler chickens. Acta Vet BRNO. 79. 385-393.
Sandoval, G.; Terraes, J.; Revidatti, F.; Fernández, R.; Gauna, C. & Martín G. (2003).
Hematocrito, relación heterófilo linfocito e inmovilidad tónica en pollos con estrés psico-
fisico crónico criados en jaulas. Comunicaciones científicas y tecnológicas. V.026.
Schuldt, M. (2006). Lombricultura teoría y práctica. ISBN: 84-8476-296-3. Madrid.
Ediciones Mundi prensa.
Shi, Y.; Parker, DB.; Cole, NA.; Auvermann, BW. & Mehlhorn, JE. (2001) Surface
amendments to minimize ammonia emissions from beef cattle feedlots. Transition
American Society Agriculture Engineer. 44, 677–682.
Shini, S.; Kaiser, P.; Shini, A. & Bryden, W. (2008). Biological response of chickens
(Gallus gallus domesticus) induced by corticosterone and a bacterial endotoxin.
Comparative biochemistry and physiology part B, 149. 324-333.
Simpson, A. (2002). Determining the molecular weigth, aggregation, structures, and
interactions of natural organic matter using diffusion ordered spectroscopy. Magnetic
Resonance in Chemistry. 40. S72-S82.
Soppi, E.; Lassila, O.; Viljanen, M.; Lehtonen, O. & Eskola, J. (1979). In vivo Effect of
Levamisol on cellular and humoral immunity in normal chickens. Clinical Experiment
Immunologic. 38, 609-614.
Swaggerty, C.; Pevzner, I.; Ferro, P.; Crippen, T. & Kogut, M. (2003). Association
between in vitro heterophil functionn and the feathering gene in commercial broiler
chickens. Avian Pathology. 32 (5), 433-438.
Tega E. & Ibrahim T. (2010). Effect of induced molting on fertility and hatchability
chickens. Continental Journal of Animal and Veterinary Research. 2. 31-34.
71
Van Rensburg, C.; Badenhorst, B.; Ghandy. J. & Snyman, J. (2010). Potassium
humates reduces inflammation and clinically improves the outcomes of patients with
osteoarthritis of the knee. Open Conference Process Journal. 9 (1):69-74.
Van Rensburg, J.; Van Rensburg, C. & Van Rissen, J. (2006). In vitro and in vivo
assessment of humic acid as an aflatoxinbinder in broiler chickens. Poultry Science. 85.
1576-1583.
Van Stempvoort, D.; Lesage, S. & Steer, H. (2003). Binding of hydrophobic organic
contaminants to humalite derived aqueous humic products, whit implication for
remediations. Water Quaity. Research Journal of Canada. 38. 2, 267-281.
Váradyová, Z.; Kišidayová, S. & Jalč D. (2009). Effect of humic acid on fermentation
and ciliate protozoan population in rumen fluid of sheep in vitro. Journal Science Food
Agriculture. 89: 1936–1941
Vlcová, Z. (2009a). Chemical and physical transformations of humic acids. Tesis
doctoral. Faculty of chemistry, Institute of physical and applied chemistry. BRNO
University of Technology.
Vlcová, Z.; Grasset, L.; Antosová, B.; Pekar, M. & Kucerik, J. (2009b). Lignite
pretreatment and its effect on bio stimulative propierties of respective lignite humic
acids. Soil Biology & Biochemistry. 41. 1894-1901.
Wang, Q.; Chen, Y.; Yoo, J.; Kim, H.; Cho, J. & Kim, I. (2008). Effect of supplemental
humic substances on growth performance, blood characteristics and meat quality in
finishing pigs. Livestock Science. 117, 270-274.
Wells, L.; Lowry, V.; Deloach, J. & Kogut M. (1998). Age dependent phagocytosis and
bactericidal activities of the chicken heterophil. Developmental and comparative
immunology. 22. (1), 103-109
Wigley, P.; Hulme, S. & Barrow, P. (1999). Phagocytic and oxidative burst activity of
chicken thrombocytes to salmonella, Escherichia coli and other bacteria. Avian
Pathology. 28. (6). 567-572.
Wondmeneh, E.; Getachew, T. & Dessie, T. (2011). Effect of Effective Microorganisms
(EM®) on the growth parameters of fayoumi and Horro chicken. International. Journal of
Poultry Science. 10 (3), 185-188.
72
Yalcin, S.; Ergun, A.; Ozsoy, B.; Yalcin, S.; Erol, H. & Onbasilar, I. (2006). The effect of
dietary supplementation of L- carnitin and humic substances on performance, egg trait
and blood parameters in laying hens. Journal Animal Science. 19. (10), 1478-1483.
Yoruk, M.; Gul, M.; Hayirly, A. & Macit, M. (2004). The effects of supplementation of
humate and probiotics on egg production and quality parameters during the late laying
period in hens. Poultry Science. 83. 84-88.
Zoth, S.; Carballeda, J.; Gómez, E.; Gravisaco, M.; Carrillo, E. & Berinstein, A. (2012).
Modulation of innate immunity in chickens induced by in vivo administration of
baculovirus. Veterinary Immunology and Immunopathology. 145. 241-247.
Zralý, Z.; Pisariková, B.; Trcková, M. & Navratilová, M. (2008). Effect of humid acid on
lead accumulation in chicken organs and muscles. Acta Vet BRNO. 77, 439-445.
Zralý, Z; Pisariková, B. & Navratilová, M. (2008b). Effect of humic acidon mercury
accumulation in chicken organs and muscles tissues. Czech Journal Animal Science.
53 (11), 472-478.
Zralý, Z.; Pisariková, B.; Trcková, M. & Navratilová, M. (2008a). Effect of humid acid on
lead accumulation in chicken organs and muscles. Acta Vet BRNO 77. 439-445.