dr. mariano e. fernández-miyakawa

Diagnóstico, prevención y control de las enfermedades clostridiales

entéricas.

Dr. Mariano E. Fernández-Miyakawa

Investigador CONICET Instituto de Patobiología

Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA)

Lineas de trabajo:

Patogénesis

• Absorción intestinal de toxinas

• ETX sistema nervioso central: comportamiento

• Diagnostico

• Mejoramiento del diagnostico

• Bacteriología

• Medidas preventivas

Anaerobios

Importantes fallas en el diagnostico de las enfermedades producidas por anaerobios en

veterinaria.

Características a resaltar:

•Los clostridios son bacterias anaeróbicas.

•Diferentes tipos de toxinas son las responsables de los síntomas clínicos y los cambios observados.

•Las enfermedades generalmente son de curso rápido y ocurren en forma de brotes, aunque bajo ciertas condiciones pueden producir también, muertes en forma de goteo.

•Los brotes una vez iniciados son prácticamente imposibles de detener, por lo que el enfoque sanitario de estas enfermedades debe apuntar siempre a la prevención de las mismas.

•La escasa difusión de información sobre las enfermedades clostridiales ha llevado a que frecuentemente se confundan los signos de una enfermedad clostridial con otra, a no interpretar correctamente los procesos que están involucrados en el desarrollo de las mismas y finalmente llegarse a diagnósticos erróneos.

Grupo de enfermedades:

•Histotoxicas

•Intestinales

Gangrena gaseosa

Principales características: •Es de origen exógeno, proviene del medio ambiente. •Las heridas de esquila, descole, castración e inyección de productos veterinarios son la puerta de entrada más común. •Evolucionan en el tejido subcutáneo aunque frecuentemente la masa muscular también se halla afectada, produciendo luego septicemia, shock toxi-infeccioso y muerte del animal. Signos clínicos: Decaimiento y claudicación de alguno de los miembros son los signos más tempranos. Luego es posible detectar edema y enfisema subcutáneo, coloración rojiza de la piel, fiebre, postración y muerte aguda.

Clostridium septicum, Clostridium novyi Tipo A, Clostridium novyi Tipo B, Clostridium perfringens, Clostridium chauvoei, Clostridium histoliticum y Clostridium sordelli.

Mancha Clostridium chauvoei.

Principales características: •Infección endógena (ya presente en la musculatura del animal ) •Crecimiento rapido del animal y traumatismo muscular son posibles factores esencadenantes. •Bovinos jóvenes hasta los 2 años de edad son los más frecuentemente afectados. Signos clínicos: Decaímiento, tumefacción en áreas afectadas, estado depresivo; los animales tienden a apartarse del rodeo, fiebre y muerte aguda.

Hemoglobinuria bacilar Clostridium novyi Tipo D

Principales características: Es una infección endógena condicionada por factores predisponentes tales como las lesiones producidas por larvas migrantes de Fasciola hepatica, alteraciones metabólicas del hígado, preñez avanzada, etc, que van a producir las condiciones adecuadas de anaerobiosis en el parénquima hepático para el desarrollo de las bacterias y la producción de sus toxinas.

Signos clínicos: Los animales están deprimidos, apartados del rodeo, con la orina teñida de rojo (hemoglobinuria), ictericia visible en la mucosa ocular, fiebre, diarrea que a veces también está teñida de rojo, signos neurológicos y muerte aguda.

Tétanos Clostridium tetani

Principales características: Contractura permanente de la musculatura. La enfermedad se origina a partir de heridas de castración, descole y esquila contaminadas con el Clostridio. La multiplicación del Cl. tetani en la herida es rápida y produce toxina la cual actúa sobre el sistema nervioso central. Afecta a equinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos y humanos. Signos clínicos: Hay rigidez y temblores musculares, trismus, prolapso del tercer párpado, respuesta exagerada a estímulos, congestión de mucosa ocular, meteorismo secundario, posición en caballete, postración, opistótonos y muerte.

Botulismo Clostridium botulinum Tipos C y D

Principales características: Enfermedad caracterizada por parálisis flácida. En los bovinos la afección se manifiesta en forma endémica en regiones con acentuada carencia de fósforo como en la Región Mesopotámica. Los animales procuran suplir esta deficiencia a través de la ingestión de huesos (osteofagia), constituyendo éste, el principal vehículo para el ingreso de la toxina pre-formada y la ocurrencia de la enfermedad. Las especies más afectadas son bovinos y secundariamente equinos, porcinos y ovinos. Signos clínicos: Hay incoordinación del tren posterior, ausencia de estímulos, parálisis deglutoria y lingual,

Enterotoxemia Clostridium perfringens

Principales características: •La bacteria esta presente en el tubo digestivo. •Se multiplican y comienzan a producir toxinas bajo condiciones favorables en el intestino,y desencadenan la enfermedad. •Ocurre por cambios brusco sen la dieta, generalmente al pasar de una alimentación pobre a una de mejor calidad, un alto nivel de parasitismo intestinal por tenias y sobredosificación con productos farmacéuticos. Signos clínicos: Si bien la enfermedad es generalmente de curso sobreagudo se puede notar decaimiento, fiebre, incoordinación, diarrea, convulsiones y finalmente la muerte.

1.- Recolección de información: cambios de potrero o de alimentación de los animales, si hubo actividades con los animales tales como arreos, esquila, castración, señalada, encierro en corrales, aplicación de vacunas, de otros productos veterinarios inyectables o por boca, etc. 2.- Revisar la mayor cantidad posible de animales enfermos y comparar con animales sanos en búsqueda de síntomas típicos y de posibles lesiones en el cuero cuando se sospeche de infecciones exógenas. 3.- Realizar la mayor cantidad posible de necropsias, aunque los animales estén en avanzado estado de descomposición y tomar muestras de animales muertos, aunque lo mejor es poder hacerlo de un animal sacrificado. 4.- Tomar la mayor cantidad de muestras posibles que puedan ayudar al diagnóstico. Ello incluye microbiología, histopatología, improntas para tinciones de rutina e inmunofluorescencia, orina y sangre para bioquímica clínica, etc. Luego con el personal del laboratorio se determinará que muestras vale la pena procesar y cuales no.

DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES CLOSTRIDIALES

Es dificultoso debido a que: 1) Sintomatologías parecidas entre sí.

2) Rápida putrefacción 3) Aislamiento del clostridio no confirma el diagnóstico, sino que hay que detectar también su toxina. 4) Habitantes del organismo animal en condiciones normales. Recordar que los clostridios son bacterias difíciles de cultivar, por su condición de anaeróbicas. Por ello debemos valernos de todos los medios técnicos que estén a nuestro alcance para intentar llegar a un diagnóstico correcto.

DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES CLOSTRIDIALES ENTERICAS

Diagnóstico

Para el diagnóstico de laboratorio las muestras a remitir varían según la enfermedad que se

presuma.

La mayoría de las enfermedades entéricas clostridiales más

importantes ocurren por alguno de los 5 toxinotipos de C.

perfringens.

Toxinotipo Toxinas

tipificantes

Genotipos (toxinas) Enfermedades

α β ε ι Humanos Animales

A + - - - plc

plc, cpe

plc, cpb2

plc, cpb2, cpe

plc, ¿?, netb

Gangrena

Enfermedad GI

(intoxicación alimentaria,

diarrea por antibióticos,

diarrea esporádica)

Diarrea (perros, cerdos,

etc.)

Enteritis necrótica (pollos)

B + + + - plc, cpb, etx

plc, cpb, etx, cpb2

Disentería (corderos)

Enterotoxemia (ovejas)

C + + - - plc, cpb

plc, cpb, cpb2

plc, cpb, cpb2, cpe

plc, cpb2, cpe

Enteritis necroticans (pigbel) Enteritis necrótica (cerdos,

potrillos, etc)

D + - + - plc, etx

plc, etx, cpb2

plc, etx, cpb2, cpe

plc, etx, cpb

Enteritis necrótica (cabras,

ovejas, etc)

E + - - + plc, iap/ibp, cpe

plc, iap/ibp, cpe, cpb

Enterotoxemia (vacas y

conejos)

Genes plc: alfa cpb: beta etx: epsilon

iap/ibp: iota cpe: enterotoxina netb: NetB

Clasificación de C. perfringens basada en toxinas “mayores” VARIABILIDAD TOXICOGENICA DE C. PERFRINGENS

Principios generales para el éxito del cultivo: 1. Apropiada colección y transporte 2. Procesamiento de la muestra con la mínima exposición al oxígeno 3. Medio de cultivo fresco o prerreducido. 4. Uso de un sistema anaeróbico adecuado.

Causas de error en la investigación de anaerobios en el laboratorio: 1. Aceptación para cultivo de muestras no recomendadas para anaerobios. 2. Falla en excluir flora normal durante la colección. 3. No evitar la entrada de aire durante la colección y transporte de la muestra. 4. Falla en los catalizadores e indicador. 5. No mantener los cultivos anaerobios en incubación por más tiempo.

Sistemas para el cultivo de anaerobios: Los anaerobios pueden crecer en las placas de agar en una atmósfera sin O 2, generalmente N 2 al 80%, CO 2 al 10% e H 2 al 10%. El CO 2 estimula el crecimiento y el H 2 combinado con O 2 , que pueda estar presente, sirven para mantener las condiciones anaerobias.

Algunos sistemas para el cultivo de anaerobios son:

•Técnica de jarra anaeróbica •Técnica de cámaras de anaerobios •Medios Pre-reducidos

+API + secuenciacion 16S

Como se procede con una muestra sospechosa para aislamiento de anaerobios?

Tratamiento de muestras y aislamiientos de C. perfringens no son tan exigentes como otros anaerobios…

La historia, signos clínicos y cambios visibles son útiles en establecer un caso presuntivo de enterotxemia clostridial, pero la confirmación

requiere pruebas de laboratorio…

(HASTA EN LOS CASOS MAS OBVIOS!!!)

VERDADES SOBRE LAS ENFERMEDADES CLOSTRIDIALES

Que hallazgo es altamente sugestivo para el diagnostico, en forma general ?

1) La cuantificación de las colonias podría ser útil: 104-107 UFC/gr. contenido intestinal.

Pero ojo! C. perfringens es una habitante normal del intestino, por lo tanto su mero aislamiento no es de valor diagnostico. Si no se encuentran en estos valores, tampoco se

podría descartar su participación.

Tipificación de cepas.

Las pruebas con animales de laboratorio para toxinotipificar han sido reemplazadas por Multiplex PCR. La correcta tipificación esta basada en la estabilidad de los plásmidos, aunque se asume normalmente que los plásmidos son inestables. La información disponible sobre la estabilidad de los plásmidos es escasa pero diferentes publicaciones sugieren la estabilidad al menos a corto plazo.


M-PCR reemplaza la serotipicacion en ratones

2) Detección de toxinas en contenido.

Técnicas para detectar toxinas:

• Seroneutralización en ratón • ELISAs • Aglutinación en látex • Inmunoelectroforesis • Diversas técnicas de bloteo • Ensayos de actividad biológica: celulas, PLC.

Ojo de vuelta! Hay que tener en cuenta que es posible encontrar toxina en animales “sanos” y es

necesario considerar la sensibilidad a la degradación. Y OTRAS TOXINAS?

Que otro hallazgo es altamente sugestivo para el diagnostico, en forma general ?


ELISA COMERCIAL, ALTERNATIVAMENTE UN HECHO EN CASA…

Mas allá del diagnóstico de rutina…

Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)

Multi Locus Sequence Typing (MLST)

Muestra Condición de envío Prueba Significancia diagnostica

Cerebro Formol Histopatología Confirmatorio (tipo D)

Colon Formol Histopatología Fuertemente sugestivo (tipo

D)

Extendido de

mucosa de

intestino

delgado

Secado, Tº ambiente Tinción de Gram Sugestivo

Contenido

intestinal

Refrigerado/

Congelado

Refrigerado/Tª amb.(?)

Detección de

toxinas

Cultivo-PCR

Confirmatorio (beta, epsilon,

iota)

Posible (A)

Confirmatorio (B, C, D)

ENVIO DE MUESTRAS

Prevención y control

Las enfermedades clostridiales del intestino se producen por…

Sobrecremiento de C. perfringens y producción de toxinas

“…el enfoque sanitario de estas enfermedades debe apuntar siempre a la prevención de las mismas”

Si creció demasiado (por lo que produjo demasiadas toxinas),

nuestras posibles salvaciones son la suerte, la vacunación previa, o…

rezar.

Evidencia de un peligro siempre presente:

VACUNAS: FALLAS DE LA RESPUESTA INMUNE

• Inmunidad pasiva calostral.

• Etapa negativa de vacunación

• Enfermedad.

• Stress: clima-debilidad-fatiga

• Traumatismos: destete, castración etc

• Estado nutricional

• Falla de la vacuna

Falla de la vacuna

• Mala conservación

• Vencimiento

• Cepa inadecuada

• Contaminación e impurezas

• Desinfectante en instrumental

• Diluyente inadecuado

• Antibiótico

• Dosis y vía administración

Elegir vacunas de probada calidad y respetar las recomendaciones de los esquemas de vacunación

“la toxina Beta 2 es sospechada de ser responsable de al menos enterotoxemia y enteritis en rumiantes y aves,

basados en datos aportados por la epidemiología y la astrología”

MITOS SOBRE LAS ENFERMEDADES CLOSTRIDIALES

…“Las enfermedades clostridiales del intestino son usualmente llamadas enterotoxemias…//…aunque las enfermedades sistémicas por C. perfringens tipo D y hemolíticas por C. perfringens tipo A son verdaderas enterotoxemias, en general el resto son eventos locales”

“El aislamiento de C. perfringens tipo C, B, D o E de contenido intestinal confirma la infección”


“La identificación de los genes de las toxinas en materia fecal son útiles en establecer el diagnóstico” “Las cepas pueden ser erróneamente tipificadas por la inestabilidad de los plásmidos” “Que se encuentren los genes de las toxinas por PCR no significa que la toxina se secrete”


“El edema perivascular en cerebro y la encefalomalacia simétrica focal son confirmatorios de enterotoxemia tipo D” “la enterotoxemia tipo D o ‘riñon pulposo’ produce daño histológico en riñón y el famoso “riñón pulposo” ” “No existe evidencia sobre la enterotoxemia tipo D en ganado bovino” “El agregado de cloroformo preserva la muestra para su posterior análisis” desde 1932!!!!!!!! (1965 Niilo ve que no).


“Es necesario conservar en frío la muestra de un

caso sospechoso de enterotoxemia”


Sobrevida

Min./Max. Tº crecimiento

J. Li and B.A. McClane, 2006


http://aem.asm.org/content/vol72/issue7/images/large/zam0070668950006.jpeg

Es necesario conservar la muestra de un caso sospechoso de enterotoxemia

en frío??

Depende…

“El envío de cualquier fluido corporal es útil para la detección de toxina epsilon”


C. perfringens Tipo A:

Produce toxina alfa

Es muy común.

Produce gangrena gaseosa.

Síndromes alimentarios:

Enteritis en potrillos

Enterocolitis en caballos

Enterocolitis necrotizante en cerdos neonatales.

Enteritis necrótica en pollos.

Enterotoxemia y enteritis hemorrágica en corderos y terneros recién nacidos.


Muy probablemente sea la causa mas común de enteritis hemorrágica clostridial en rumiantes neonatos.

C. perfringens tipo A en ganado bovino:


C. perfringens tipo A en ganado bovino:

Los terneros afectados pueden mostrar: Timpanismo, abomasitis hemorrágica y ulceración del abomaso Diarrea en varios grados Debilidad Coma Muerte súbita Se ha asociado con daño hemorrágico en intestino delgado y grueso (enteritis necrótica hemorrágica).

Los aspectos etiológicos (además de C.p.) son poco claros.

El diagnostico es muy dificultoso: mas aun que los otros tipos, se debe analizar la clínica, lesiones tisulares y resultados de cultivo, en conjunto.

“la toxina alfa de C. perfringens (tipo A) produce abomasitis hemorrágica, “enterotoxemia” y otras

enfermedades en el ganado y las aves”

“el aislamiento de C. perfringens tipo A en un caso clínico sugiere su participación en la enfermedad”

“las vacunas comerciales con toxoide alfa protege

contra las enfermedades asociadas al tipo A”


Nuevos enfoques

Planetario, Buenos Aires

Posibles mejoras en la alimentación: sistemas intensivos

El agregado de taninos en las raciones de alimento se usa para reducir la solubilidad y fermentación ruminal de las proteínas (Bypass proteico). Determinados tipos de taninos son útiles para esto.

Podría ser útil en el manejo de las enfermedades clostridiales?

Los taninos tendrían la capacidad de prevenir el inicio de las enfermedades clostridiales del intestino, por un lado

evitando el sobrecrecimiento de Clostridium spp. y por otro, neutralizando

la actividad de sus toxinas.

Plantas autoctonas: extractos vegetales

Manejo

Alimentación

Vacunación

(e internet)

Recuerden:

MUCHAS GRACIAS!!!

dr. mariano e. fernández-miyakawa

Documents