UNIDAD FIJACIÓN
FORMALINA
Profesora Jimena Le Roy B.Técnica Histológica
FIJACIÓNFIJACIÓN
�� Detener los procesos de autólisis. Detener los procesos de autólisis. Especialmente la acción de proteasas y Especialmente la acción de proteasas y nucleasasnucleasas
�� Conservar la citoConservar la cito--histoarquitectura de la histoarquitectura de la �� Conservar la citoConservar la cito--histoarquitectura de la histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.muestra similar a su estado “in vivo”.
�� Preparar al tejido para los procedimientos Preparar al tejido para los procedimientos posterioresposteriores
�� Agente AntiAgente Anti--microbianomicrobiano
�� Convierte citoplasma en Convierte citoplasma en un gel insolubleun gel insoluble
�� Conserva organelosConserva organelos
��FormaldehídoFormaldehído
FijFij. No Coagulantes. No Coagulantes
�� Conserva organelosConserva organelos
�� Penetración + lenta de Penetración + lenta de medios de inclusiónmedios de inclusión
�� GlutaraldehídoGlutaraldehído
�� TetróxidoTetróxido de Osde Os
ACCIÓN EN LOS TEJIDOSACCIÓN EN LOS TEJIDOS
�� Interacción con las proteínas.Interacción con las proteínas.�� Formación de gel insoluble.Formación de gel insoluble.�� Formación de gel insoluble.Formación de gel insoluble.
�� FIJADOR FIJADOR NONO COAGULANTE COAGULANTE ((No precipita No precipita las las proteínas, proteínas, solosolo
�� las insolubiliza)las insolubiliza)
�� Más conocido de los fijadoresMás conocido de los fijadores�� Presentación comercial es en solución acuosa Presentación comercial es en solución acuosa
37% a 40% 37% a 40%
FIJACION CON FORMALDEHIDO
37% a 40% 37% a 40% �� La fijación involucra una interacción con La fijación involucra una interacción con
proteínas, específicamente con aminoácidos proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes básicos, con formación de puentes metilénicosmetilénicos..
FormaldehídoFormaldehído
�� Saturación 37Saturación 37--40%40%�� Forma de gas a Forma de gas a --21º C21º C�� Uso 10% o 4%Uso 10% o 4%�� Paraformaldehído como polímero sólido Paraformaldehído como polímero sólido �� Paraformaldehído como polímero sólido Paraformaldehído como polímero sólido �� metanol estabilizametanol estabiliza�� Sol. Acuosa tamponada pH 7.2Sol. Acuosa tamponada pH 7.2--7.47.4�� Mezclas Susa, BouinMezclas Susa, Bouin
ACCIÓN EN LOS TEJIDOSACCIÓN EN LOS TEJIDOS
�� Alta penetración, lenta fijación.Alta penetración, lenta fijación.�� Escasa acción sobre H de C.Escasa acción sobre H de C.�� Bueno para lípidos en gral.(pero no para Bueno para lípidos en gral.(pero no para
grasas neutras). grasas neutras). grasas neutras). grasas neutras). �� Contraindicaciones para técnicas Contraindicaciones para técnicas
especiales.especiales.�� Efectos sobre la coloración.Efectos sobre la coloración.�� Deterioro de la solución.Deterioro de la solución.
importantes características importantes características FormaldehídoFormaldehído
�� Saturación 37Saturación 37--40%40%�� Uso 10% o 4%Uso 10% o 4%�� Paraformaldehído Paraformaldehído
como polímero sólido como polímero sólido
�� Gas Gas --2121°°CC�� puentes de metileno puentes de metileno
con proteínascon proteínas�� estables o insolublesestables o insolublescomo polímero sólido como polímero sólido
�� metanol estabilizametanol estabiliza�� Sol. Acuosa Sol. Acuosa
tamponada pH 7.2tamponada pH 7.2--7.47.4
�� Mezclas Susa, BouinMezclas Susa, Bouin
�� estables o insolublesestables o insolubles�� Preserva lípidosPreserva lípidos�� Pobre carbohidratosPobre carbohidratos
COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIÓN (FORMALINA)SOLUCIÓN (FORMALINA)
�� Hidrato de metilenoHidrato de metileno�� Metanol 10 Metanol 10 –– 12%12%
Ácido fórmicoÁcido fórmico�� Ácido fórmicoÁcido fórmico�� ParaformaldehídoParaformaldehído
(polímero sólido del formaldehído)(polímero sólido del formaldehído)
COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIÓN (FORMALINA)EN SOLUCIÓN (FORMALINA)
�� Hidrato de metileno Compuesto activoHidrato de metileno Compuesto activo
�� Metanol 10 Metanol 10 –– 12%12%�� Metanol 10 Metanol 10 –– 12%12%�� Ácido fórmicoÁcido fórmico CompuestosCompuestos�� ParaformaldehídoParaformaldehído no deseadosno deseados(polímero sólido del (polímero sólido del formaldehídoformaldehído))
ADHESIÓN A PROTEÍNASADHESIÓN A PROTEÍNAS
�� Adhesión de hidratos de metilo a grupos Adhesión de hidratos de metilo a grupos funcionales de los aa.funcionales de los aa.
�� ReversiblesReversibles�� Fijación inicial: 12Fijación inicial: 12--24 hrs24 hrs�� Fijación inicial: 12Fijación inicial: 12--24 hrs24 hrs�� N terminal de la lisina.N terminal de la lisina.
NH2 + HOCH2OH PROTEÍNA
CH2OH
+ H2OHPROTEÍNA
H 2 C O + HOCH3 H2C
OH
FORMALINA modo de acción
O CH3formalina metanol
hemiacetal
Hidrato de metileno
FORMALDEHÍDOFORMALDEHÍDO
C OH
HEn solución acuosa:En solución acuosa:
C
H
H
O + O
H H
H
H
C O + O
HH
CH
H
O H
O H
FORMOL AGUA HIDRATO DE METILENO
PUENTES METILÉNICOSPUENTES METILÉNICOS�� Formación de puentes cruzados entre Formación de puentes cruzados entre
componentes de una proteína o entre componentes de una proteína o entre moléculas de 2 proteínas.moléculas de 2 proteínas.
�� Unión química estable.Unión química estable.�� Unión química estable.Unión química estable.�� Fijación completa: 1Fijación completa: 1--2 semanas2 semanas
PenetraciónPenetraciónHidrato deHidrato de Reacción Reacción MetilenoMetileno con gruposcon grupos
NHNH
FIJACION CON FORMALINA
NHNH22
Formación deFormación dePuentesPuentes ReacciónReacciónmetilénicosmetilénicos entre NHentre NH22
metiladosmetilados
PROTEÍNACH2OH + H
PUENTES METILÉNICOSPUENTES METILÉNICOS
PROTEÍNA
PROTEÍNAPROTEÍNA CH2 + H2O
Formación de puentes de metileno entre el grupo hidroximetilo y grupos funcionales de
moléculas de otras proteínas.
FORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINA
Equilibrio de la soluciónEquilibrio de la solución
Tiempo/ pHTiempo/ pH
CompuestoCompuesto Compuestos Compuestos activo no deseados activo no deseados
PUENTES METILÉNICOS
Proteína + formalina + H proteína proteína proteína + H OCProteína + formalina + H proteína proteína proteína + H2OC
H2
PUENTES METILÉNICOS
Proteína + formalina + H proteína proteína proteína + H OCProteína + formalina + H proteína proteína proteína + H2OC
H2
La fijación involucra una interacción con proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.
grupos afectados en la fijación de grupos afectados en la fijación de proteínas:proteínas:
AminoAminoIminoIminoPéptidoPéptidoPéptidoPéptidoGuanidiloGuanidiloHidroxiloHidroxiloCarboxiloCarboxiloSHSHAnillos aromáticosAnillos aromáticos
PUENTES METILÉNICOS
•SON MUY ESTABLES
•RESPONSABLES DE LA FIJACIÓN DE LAS PROTEÍNAS•(cross linking)•(cross linking)
•Son reacciones lentas
•Se acepta que llegan a un medio aceptable a las 12 a 24 horas
•Excepto para tejido nervioso
Formación de puentes de metileno entre moléculas
de la misma proteína
PUENTES METILÉNICOSPUENTES METILÉNICOS
metileno entre moléculas de la misma proteína
Los puentes de metileno pueden formarse Los puentes de metileno pueden formarse entre dos grupos similares:entre dos grupos similares:
NH2 NH2 NH2NH2
o o grupos distintos:grupos distintos:
NH2 (CONH) péptidoNH2 (CONH) péptido
La molécula de Metilen glicol se una a LISINA
PROTEÍNA NH2 + HOCH2OH PROTEÍNA N + H2O
H
PROTEÍNA NH2 + HOCH2OH PROTEÍNA N + H2O
CH2OH
ARGININA. CISTEINA, SERINA, etc (ver pág 21 J.A. KIERNAN
Aunque los aldehídos puros nopueden tomar parte en puentes de hidrógeno entre sí,tienen pares de electrones no compartidos y pueden formar puentes de hidrógenos con otros compuestos que tengan enlaces compuestos que tengan enlaces
O – H y N – H.
Gracias a tales puentes de hidrógeno, los aldehídos son buenos solventesde sustancias polares, como por ejemplo de los alcoholes,también son muy solubles en agua.
LaLa únicaúnica reacciónreacción irreversibleirreversible alal fijarfijar conconformalinaformalina eses lala queque tienetiene lugarlugar concon elelhidrógenohidrógeno aromáticoaromático enen elel triptofanotriptofano,,fenilalaninafenilalanina,, tirosinatirosina ee histidinahistidina..
EstaEsta reacciónreacción ocurreocurre muymuy lentamentelentamente yy sesesiguesigue aa menudomenudo porpor condensacióncondensación concon otrootrogrupogrupo reactivoreactivo parapara formarformar puentepuente dedemetilenometileno..
ALMACENAMIENTOALMACENAMIENTO
Cuando la formalina se guarda ocurren Cuando la formalina se guarda ocurren ciertas reacciones o procesos que ciertas reacciones o procesos que provocarán el deterioro de esta solución :provocarán el deterioro de esta solución :
a) a) PrecipitaciónPrecipitaciónb) b) AcidificaciónAcidificación
El formol y el paraformol coexisten en las soluciones límpidas,bajo la influencia del frío o por otras causas, se polimerizany dan trioximetileno, insoluble, que forma un precipitado blanco.
ACIDIFICACIÓNACIDIFICACIÓNLa reacción de moléculas de un aldehído con un La reacción de moléculas de un aldehído con un
equivalente de una base fuerte puede dar equivalente de una base fuerte puede dar como resultado un mol de alcohol y otro de la como resultado un mol de alcohol y otro de la
sal del ácido carboxílico.sal del ácido carboxílico.
2 R-CHO + NAOH R-COO- NA+ + R-CH2OH
La acidificación de la formalina afecta en La acidificación de la formalina afecta en gran medida la fijación y los procesos gran medida la fijación y los procesos ulteriores como la coloración.ulteriores como la coloración.
ACIDIFICACIÓNACIDIFICACIÓN
ulteriores como la coloración.ulteriores como la coloración.-- Pigmentos por oxidación de Pigmentos por oxidación de hemoglobinahemoglobina
-- Disminución de la tinción Disminución de la tinción basófilabasófila de los núcleosde los núcleos
Para inhibir este proceso la solución comercial Para inhibir este proceso la solución comercial viene con Metanol al 10% v/vviene con Metanol al 10% v/v
CH
HO + CH
H
H
OH CH
HO + H
H
H
C OH
H H
FORMOL
HIDRATO DE METILENO
CH
H
OH
C OH
H
H
METILAL
PRECIPITACIÓNPRECIPITACIÓN
La unión de hidratos de metileno formarán La unión de hidratos de metileno formarán polímeros solubles denominados polímeros solubles denominados paraformaldehídoparaformaldehído (2 (2 –– 8 monómeros8 monómeros).).
HO CH2 O H + H O CH2 O H HO
CH2
O
CH2
O H
+ H O H
HIDRATO DE METILENO
HIDRATO DE METILENO
PARAFORMALDEHÍDO AGUA
PRECIPITADOS DE FORMALINA:
Son gránulos de color negruzco
Producidos por la hemateína
Por degradación de la hemoglobina
¿QUÉ ORGANOS O TEJIDOS?
FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO
Solución de fijaciónSolución de fijación::
�� Se debe utilizar en sus condiciones mas Se debe utilizar en sus condiciones mas �� Se debe utilizar en sus condiciones mas Se debe utilizar en sus condiciones mas establesestables�� Neutralizada con carbonato de calcioNeutralizada con carbonato de calcio�� Tamponada en bufferTamponada en buffer�� Suero fisiológicoSuero fisiológico
FORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINAFORMALINA
Equilibrio de la soluciónEquilibrio de la solución
Tiempo/ pHTiempo/ pH
CompuestoCompuesto Compuestos Compuestos activo no deseadosactivo no deseados
FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO
�� Temperatura / Tiempo de fijaciónTemperatura / Tiempo de fijación::�� T. A. T. A. 6 6 –– 24 hrs24 hrs�� 44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs
�� Tamaño de la muestraTamaño de la muestra::
�� 10 x 10 x 5 mm10 x 10 x 5 mm
FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO
�� Temperatura / Tiempo de fijaciónTemperatura / Tiempo de fijación::
�� T. A. T. A. 6 6 –– 24 hrs24 hrs
44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs�� 44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs
FIJACION CON FORMALDEHIDOFIJACION CON FORMALDEHIDO
�� Temperatura / Tiempo de fijaciónTemperatura / Tiempo de fijación::�� T. A. T. A. 6 6 –– 24 hrs24 hrs�� 44°° CC 24 24 –– 72 hrs72 hrs
�� Tamaño de la muestraTamaño de la muestra::�� Tamaño de la muestraTamaño de la muestra::�� 10 x 10 x 5 mm10 x 10 x 5 mm
�� Volumen de fijadorVolumen de fijador::�� 20 20 –– 30 veces el volumen de la muestra30 veces el volumen de la muestra
Fijadores a base de formol
Formol neutro
Formol buffer
Histología en general
Estudios histológicos
Sistema nerviosoFormol buffer
Formol alcalino
Formol Ca etc
Impregnaciones argénticas
Tejido óseo
Identificación de fosfolípidos
proteínas
�� Es una formalina que sigue el mismo principio Es una formalina que sigue el mismo principio de la F. Neutrade la F. Neutra
�� El compuesto que mantiene el pH será un El compuesto que mantiene el pH será un Buffer: Fosfato disódico, Fosfato monobásico Buffer: Fosfato disódico, Fosfato monobásico Acetato de Calcio, etc..Acetato de Calcio, etc..El Amortiguador al tamponar genera una El Amortiguador al tamponar genera una
FORMALINA AMORTIGUADAFORMALINA AMORTIGUADAFORMALINA AMORTIGUADAFORMALINA AMORTIGUADA
Acetato de Calcio, etc..Acetato de Calcio, etc..�� El Amortiguador al tamponar genera una El Amortiguador al tamponar genera una
solución tendiente al equilibrio de la solución solución tendiente al equilibrio de la solución pudiendo esta última ser variadapudiendo esta última ser variada
�� Este dependerá de las necesidades del tejido v/s Este dependerá de las necesidades del tejido v/s los recursos del laboratoriolos recursos del laboratorio
FORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRAFORMALINA NEUTRA
�� Formalina + una sal :Formalina + una sal :�� Carbonato de calcioCarbonato de calcio�� Mantiene un pH cercano a el de los tejidos entre Mantiene un pH cercano a el de los tejidos entre
6,3 a 76,3 a 76,3 a 76,3 a 7�� Evita la acidificación por almacenamientoEvita la acidificación por almacenamiento�� Genera una solución invariable y lista para fijarGenera una solución invariable y lista para fijar�� Bajo CostoBajo Costo
FORMALINA BUFFER ( pH 7 )FORMALINA BUFFER ( pH 7 )FORMALINA BUFFER ( pH 7 )FORMALINA BUFFER ( pH 7 )
Formaldehido al 37%………………………100 cc.Agua destilada …………………………… 900 cc.Agua destilada …………………………… 900 cc.Fosfato monobásico ( Na2PO4 x H2O ).. 4 grs.Fosfato disódico ( Na2HPO4 )……….…. 6,5 grs.
Formol sucrosa tamponado
Histología en general
Excelente conservador de estructuras finasExcelente conservador de estructuras finas
Para comparaciones con microscopio electrónica
Sin contra indicaciones
Formol alcohólico Formol acetato de calcio
Histología de mucopolisacáridosHistología de mucopolisacáridos
Histología de fosfolípidos
contrindicaciones Identificación de calcio
Teóricamente el formaldehído es un no-electrolito,incapaz de formar sales, pero sí de formar compuestos de adición.
El formol solo, puro o diluido es un mal fijador,
MEZCLAS FIJADORAS
BOUIN
El formol solo, puro o diluido es un mal fijador,produce hinchamiento de los tejidos y vacuoliza las célulaso bien les da un aspecto de sobrefijadosdisminuye los contrastes entre citoplasma y núcleo.
La adición de ácido acético, corrige el defecto del formol y aumenta notablemente la coloreabilidad del núcleo.
Derivados de la Formalina o Derivados de la Formalina o pertenecientes a la misma Familia:pertenecientes a la misma Familia:
�� ParaformaldehídoParaformaldehído�� ParaformaldehídoParaformaldehído
�� GlutaraldehídoGlutaraldehído
polímero sólido de formaldehído, produce una fijación suave y paulatina alteran muy poco las estructuras celularesuso al 4 % en PBS Se disuelve muy mal en soluciones acuosas
calentarlo a 60º durante media hora en agitación
PARAFORMALDEHIDO
en agitaciónmuy inestablesolo dura un mes a 4º
Las soluciones stock deben almacenarse a -20 durant e máximo de un año, se descongelan inmediatamente antes de usar.
Efectos a bajas concentracionesde Formaldehído
Dermatitis, tos Disminución de la capacidad pulmonarromadizo, dolor de garganta, dificultad para dormir,romadizo, dolor de garganta, dificultad para dormir,
• dolor de cabeza, • fatiga, dificultades respiratorias, • sinusitis, dolor de cuello, náuseas frecuentes • bronquitis.
LAGO RUPANCO - PUNTIAGUDO