Manual JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 71 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100 Page 1 of 7www.jenabioscience.com Last update: April 7, 2015 Cat. No.Cantidad CS-401ES1 Kit Slo para usos in vitro Garanta vlida para 12 meses Conservar a 4C Introduccin y Teora de la Cristalizacin Hoyendahaydosmtodosfundamentalespara determinarlaestructuratridimensionaldeuna protena.Porunladoestlaresonanciamagntica nuclear(NMR)y,porelotro,lacristalografade rayos X. Con el mtodo NMR slo se pueden estudiar molculasconunpesomolecularaproximadode hasta25.000Da(25kDa,oaproximadamente220 aminocidos);lacristalografaderayosXesms apropiada para determinar la estructura de protenas msgrandesocomplejosmacromoleculares.Las primerasestructurasanalizadasconestemtodo fueronlamioglobina(1950)ylahemoglobina (1955),estudiosquefueronpremiadosen1962con el premio Nobel de qumica. Elprimerpasoparadeterminarunaestructurapor medio de la cristalografa y, al mismo tiempo, el ms complicado-radicaenlaobtencindecristalesde suficientetamao.Uncristalesunaestructura tridimensionalformadaporbloquesbsicos(eneste caso,molculasproteicas)dispuestosdemanera regular. Cmo podemos lograr cristales partiendo de una molcula tan compleja como es la protena?Parapasardelestadolquidoalcristalino,hayque reducirprimerolasolubilidaddelamolcula.Por reglageneral,estoentraalaformacindeuna precipitacin amorfa. Sin embargo, si las condiciones se han elegido de tal manera que en la superficie de la molcula se hallan reas complementarias entre s, sepuedendarvariacionesespecficasentrelas molculasproteicas.Silageometradeestas variaciones es favorable, se formarn cristales. Fig.1:Diagramaesquemticodefasesdeuna mezcla de protena y precipitante Enlacristalizacinsedistinguenprincipalmentedos pasos:(1)lanucleaciny(2)elcrecimientodel cristal.Ambospasostienenlugar,silascondiciones sonfavorables,enlazonasobresaturadadel diagrama de fases (ver Figura 1).Desafortunadamente,paralanucleacinserequiere ms sobresaturacin que para el crecimiento. El rea de formacin nuclear donde se da la sobresaturacin tambin se denomina zona inestable o labil, mientras queelreadecrecimientoseconocecomozona metaestable.Paralanucleacinesnecesarioquela solucin llegue a la zona labil. Sin embargo, una vez alllosncleoscrecerndemasiadorpidoylos cristalesresultantessernmuchosymuypequeos. Comonosinteresaformarcristaleslomsgrandes posibles (ca. 0,5 mm de largo) es necesario limitar la cantidad de ncleos en formacin. En el experimento, portanto,hayqueaproximarsealafasede nucleacinmuylentamente,paragarantizarquelos ncleos tengan tiempo suficiente para crecer.El paso de una solucin estable a una sobresaturada sepuederealizarfcilmentevariandolaproporcin delamezcladeprotenayprecipitanteguindose poreldiagramadefases.Paraello,sepuede aumentarlaconcentracindelaprotenaoladel precipitado.Losprocesosfsicosqueseprestanpara lograr un cambio de concentracin son la dilisis y la difusin.Ambossecaracterizanporeltransportede materia. El mtodo de difusin por vapor, ilustrado en la Figura 2, ha demostrado ser especialmente idneo para la cristalizacin.Manual JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 71 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100 Page 2 of 7www.jenabioscience.com Last update: April 7, 2015 Estemtodotambinseconocecomogotacolgante (hangingdrop).Lasolucinproteicaseencuentra enunagotasuspendidadelaparteinferiordeuna lminademicroscopio.Eltamaodelagotaoscila normalmente entre los 0,5 l y los 20l. La solucin delpocillo(ca.1ml),queseencuentraenun reservorio por debajo de la gota, posee una elevada concentracindeprecipitanteydispone,portanto, deunapresindevaporinferioraladelasolucin proteica. Duranteel experimento, el agua de la gota seevaporasobrelasolucindelrecipiente.Deesta manera,laconcentracinproteicadelagota aumenta,juntoconlaconcentracindeotros materiales.Encondicionesfavorables,la cristalizacintendrlugaralcabodeunosdaso semanas.Enotraspalabras,estamosusandoun sistema (gota colgante sobre un pocillo)que se halla endesequilibriotermodinmico.Esprimordialqueel equilibrio se vaya alcanzando poco a poco. Fig.2:Elmtododegotacolganteohanging drop QuMaterialessePuedenUsarComo Precipitante?Enprincipio,sepuedeusarcualquiermaterialque puedainfluirsobrelasolubilidaddelaprotena, siemprequenoladesnaturaliceenelevadas concentraciones.Losdistintosprecipitantesusadoscomnmenteenla cristalizacin de protenas se pueden catalogar segn susefectossobrelasolucin.Porejemplo,lassales como(NH4)2SO4,NaCl,LiCl,KH2PO4,etc., cambian la carga inica de la solucin. La Figura 3 demuestra cmo vara la solubilidad de las protenas en funcin de la carga inica. Fig.3:DependenciadelasolubilidadSenfuncin de la carga inica I Elreaalaizquierdadelmximodesolubilidad proteicatambinsedenominaareadesalado (salting-in);elreaaladerecha,dedesalado (salting-out).Enlazonadesalting-inla solubilidadaumentadebidoalaelevadaconstante dielctrica de la solucin. Gracias a este aumento, las cargasdelasuperficiedelaprotenapueden interactuarmejorconsuentorno.Enlazonade salting-outlasolubilidadvuelveadescender,ya que las cargas de precipitante entran en competencia porlasmolculasdeaguaconlascargasdela superficie de la protena. Losprecipitadosorgnicoscomoelethanol,elmethanol, el propanol,el MPD (metilopentanediol) o elacetonitrilo,entreotros,disminuyenlasolubilidad proteicayaquebajanlaconstantedielctricadela solucin.Elmismoefectoprovocanlospolmeros orgnicoscomo,porejemplo,losPEGs (polietilenglicoles),quesepuedenencontrarcon diversos pesos moleculares (de 400 a 20.000 Da).Otroparmetroimportantequeinfluyeenla solubilidaddelasprotenaseselfactordepH.La solubilidadesmsbaja,porlogeneral,enelpunto isoelctricodelaprotena(IEP),puestoquealles donde la protena contiene una carga neta de cero. Manual JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 71 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100 Page 3 of 7www.jenabioscience.com Last update: April 7, 2015 Existenmuchosfactoresquepuedeninfluirenla cristalizacin,ynormalmentedisponemosdeuna cantidadreducidadeprotena;comoconsecuencia, resultaprcticamenteimposibleprobartodosycada unodelosparmetrosexistentesenelespectro.Es importante,portanto,desarrollarunaestrategiaque nospermitaobtenerresultadosrpidossingastar demasiado material. Las Propiedades de los Cristales Proteicos En principio, los cristales proteicos estn formados de igual manera que los cristales de molculas pequeas o cristales salinos, y su empaquetamiento molecular y susimetraserigenporlasmismasreglas.Sin embargo, hay algunas diferencias fundamentales que afectantantoalaspropiedadesmecnicasypticas deloscristalescomoasucomposicin.Loscristales proteicossonmuyblandosycontienennormalmente entre un30%yun 70% de agua, la mayor parte de forma relativamente desordenada dentro del cristal. Laintegridaddelcristalestdictadaporla interaccinentrelasmolculasproteicas;sin embargo,entrelasprotenasseencuentranespacios vacosdeuntamaoconsiderable,queestnllenos deaguay/omolculasamortiguadoras.Por consiguiente,lasmolculasproteicasseencuentran enunmediocasinatural,esdecir,acuoso.Su estructuraoriginal(losplieguesdelaprotena, fundamentalesparapermitirlaactividadproteica)se mantiene,algoquesepuedecomprobarpormedio detestsdeactividadenzimticarealizadasen proteinascristalizadas.Enalgunoscasos,laforma cristalinaesunaformanaturaldereserva,como ocurre por ejemplo con la insulina. El JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin Proteica Jena Bioscience ha desarrollado este Kit de Iniciacin alaCristalizacinProteica,quecontienetodoel materialnecesarioparaaveriguar,partiendodeuna protenaejemplo(lisozimadeclaradehuevo)cmo sevadesarrollandolacristalizacinenfuncindel pH, con NaCl como precipitante. Para ello, el pH se modificapocoapoco,mientrassevavariandopor faseslaconcentracindelprecipitante.ElKit, adems,incluyetodoslosmaterialesparacristalizar lisozima por medio del mtodo batch. Para ello, la solucindecristalizacinylasolucinproteicase mezclanalmismotiempo,lograndocristalessin difusin por vapor y sin equilibrar la concentracin de proteina y precipitante. El Kit Incluye: 1.2placas24-wellSuperClearTMparala cristalizacin segn el mtodo de gota colgante 2.1jeringacon5mldegrasadesiliconapara sellar los pocillos 3.100lminasparalacristalizacinporgota colgante 4.1 porta objeto 5.20 ml de NaCl, 20% (m/v) 6.4 dosis de 3 ml de 250 mM de acetato de sodio como tampn, con un pH de 4,0; 4,4; 4,8 y 5,2 cada una 7.200ldesolucindelisozimaenagua(20 mg/ml)8.1mldesolucindecristalizacinparala cristalizacin por mtodo batch (30% (m/v) de PEG5000-MME,1MdeNaCl,50mMde acetato de sodio con un pH de 4,4) OtrosMaterialesNecesariosnoIncluidosen este Kit: 1.PipetasEppendorfosimilares,concapacidad para abarcar de 1 a 500 l 2.Puntas de pipeta del tamao correspondiente 3.Agua destilada o desionizada 4.Una pinza 5.Unahabitacinconunatemperaturaconstante (2022 C) 6.Unmicroscopioconunpoderdeamplificacin de 50-100 para examinar los cristales Realizacin del Experimento Segn el Mtodo de Gota Colgante Enelexperimentoporgotacolganteohanging drop (Figura 2), la lisozima se cristaliza equilibrando lagotadeprotenadiluidaenlasolucinde cristalizacinconlasolucindecristalizacin contenidaenelpocillo,pormediodeunaplacade cristalizacinsellada.Paraelloseutilizaunsistema Manual JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 71 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100 Page 4 of 7www.jenabioscience.com Last update: April 7, 2015 de acetato de sodio/NaCl, teniendo en cuenta que la cristalizacin depende en gran parte del valor de pH deltampnylaconcentracindeNaCl.Eltestse realiza con un pH de entre 4,0 y 5,2 en combinacin con una concentracin de NaCl de entre 4% y 9%. Desarrollo del Experimento: 1.Aplicargrasadesiliconaenlospocillosde cristalizacin: usando la jeringa incluida en el kit, esparcir uniformemente la grasa de silicona sobre los bordes circulares del pocillos de cristalizacin. Nodebenaparecerirregularidadesenelfilo engrasadonihilossobrelacavidaddel recipiente. 2.Pipetarlasolucinenelpocillosiguiendoel esquemadelaFigura4:elvolumentotalpor pocillodebeser1ml,ylaconcentracinde tampntrassermezcladoconelprecipitantey conaguadebeser50mM.Atencin:antesde empezarapipetar,asegurarsedequeelplaca estcolocadocorrectamente,sirvindosecomo orientacin de las lneas (A-D)y las columnas (1-6). 3.Pipetar la gota para la cristalizacin: pipetar 1 l de solucin proteica y 1 l de solucin del pocillo enunalminacircular.Pipetarcadalnea(A-D) porseparado.Primerosecolocaunagotadela solucinproteicaenunalmina.Despus,se aplicaconcuidadolasolucindelpocillosobre cadagota.Paraello,colocarlapuntadela pipetaconprecaucinsobrelasuperficiedela gotadeprotenayliberar1ldesolucindel pocillo sin que aparezcan burbujas sobre la gota. Antesdepipetarunagotanuevahayque cambiar la punta de la pipeta. 4.Taparlosrecipientes:conayudadeunapinza, cogerlaslminas,darleslavuelta cuidadosamenteconlagotahaciaabajoy colocarlassobrelospocillos.Acontinuacin, presionarligeramenteparaquelagrasade silicona cierre hermticamente el pocillo.Conservarlasplacaspreparadasenunahabitacin conunatemperaturaconstante(20-22C).Para examinarlagotabajoelmicroscopioes recomendable quitarles la tapa a la placa. Se deben tomarprecaucionesparanoensuciarelobjetivodel microscopioconlagrasa.Asegresedeobservar todalaprofundidaddelagotadeprotenaenel microscopio.Laluzpolarizadasepuedeaplicar tambin a fin de distinguir entre precipitado amorfo y material cristalino, ya que los cristales son capaces de polarizar la luz transmitida. LaFigura5muestraelaspectodelagotade cristalizacinatravsdelmicroscopio(factorde amplificacinde40)alcabode20horas.Las coordinadas(A-D,1-6)sonlasmismasquefiguran sobre la placa de cristalizacin. Sepuedeobservarclaramentequeelnmerode cristalesaumentacuantomselevadaseala concentracindeNaCl.Lacalidadptimade cristalessealcanzacuandolasaturacinsalinaes ligeramenteinferioralamxima,comoindicael diagramadefasesdelaFigura1(params informacin,vanselosprocesosdenucleaciny crecimientodecristalesenlaintroduccindeeste manual).Porcontraste,laformacindencleos decrece conforme aumenta el pH del tampn, dando comoresultadomenoscristalescuantomsaltoesel pH. Desarrollo del Experimento Segn el Mtodo Batch Para un experimento tipo batch hay que pipetar, de manerasimilaralmtodohangingdrop,unagota de la solucin de cristalizacin junto con una gota de solucinproteicaenunalmina.Enestecaso,sin embargo,lacomposicindelasolucinde cristalizacinhasidooptimizadadetalmaneraque lacristalizacindelaprotenaocurre inmediatamente. Despus de unos 20 minutos, se pueden apreciar con elmicroscopiolosprimeroscristales,queenel transcursodepocosminutosirncreciendocon rapidez.Deestemodo,sepuedenobtenercristales delisozimamsrpidoqueconelmtododegota colgante. Manual JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 71 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100 Page 5 of 7www.jenabioscience.com Last update: April 7, 2015 Desarrollo del Experimento: 1.Pipetar la solucin precipitante: pipetar 4 l de la solucindecristalizacinenlalminadel microscopio. 2.Pipetarlasolucinproteica:pipetar2lde solucin proteica sobre la gota de buffer. Observe la gota en el microscopio. Se pueden variar las proporciones de buffer y protena, lo que afectar lavelocidaddecrecimientodeloscristalesyel nmero total de cristales formados. Agradecimientos DamosgraciasaDr.ManfredWeisscomoautorde la idea original y por su asistencia en la organizacin de este kit. Gran parte de este manual est basado en lasinstruccionesparaexperimentosproporcionadas por Dr. Weiss. Derechos de Autor Todaslasfigurasincluidasenestemanualson propiedadregistradadeDr.ManfredS.Weiss. Todoslosderechosdelasilustracionespertenecena su autor. Seprohibelareproduccintotaloparcialdeeste manualsinlaautorizacinexpresayporescritode Jena Bioscience GmbH. Manual JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 71 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100 Page 6 of 7 www.jenabioscience.com Last update: April7, 2015 20 % NaCl 4 %5 % 6 % 7 %8 % 9 % Fig. 4: Esquema para pipetar segn el mtodo de gota colgante 250 mM Acetato de Sodio 200 l 600 l 200l 200 l 600 l 200l 200 l 600 l 200l 200 l 600 l 200l 250 l 550 l 200l 250 l 550 l 200l 250 l 550 l 200l 250 l 550 l 200l 300 l 500 l 200l 300 l 500 l 200l 300 l 500 l 200l 300 l 500 l 200l 350 l 450 l 200l 350 l 450 l 200l 350 l 450 l 200l 350 l 450 l 200l 400 l 400 l 200l 450 l 350 l 200l 400 l 400 l 200l 400 l 400 l 200l 400 l 400 l 200l 450 l 350 l 200l 450 l 350 l 200l 450 l 350 l 200l 50 mM pH 4,0 50 mM pH 4,4 50 mM pH 4,8 50 mM pH 5,2 Concentracin final 20 % de NaCl 250 mM de Acetato de Sodio Agua Destilada Manual JBS Kit de Iniciacin a la Cristalizacin de Protenas Jena Bioscience GmbH | Lbstedter Str. 71 | 07749 Jena, Germany | Tel.:+49-3641-6285 000 | Fax:+49-3641-6285 100 Page 7 of 7 www.jenabioscience.com Last update: April7, 2015 Fig. 5: Aspecto del experimento segn el mtodo de goteo despus de 20 horas (ampliacin de 40x) A2CB3D4 1 5 6