Determinación de Determinación de hemoglobina Ahemoglobina A22

[Cromatografía de intercambio iónico]

IES Albaida

Fundamento

Tras realizar un hemolizado de la muestra de sangre, la hemoglobina A2 es retenida en una columna de resinas de intercambio iónico, de este modo podemos separarlas del resto de las hemoglobinas. Una vez separada, utilizando unas condiciones específicas de pH y concentración de iones, se puede cuantificar mediante lectura espectrofotométrica a 415 nm.

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Material

• Muestra: Sangre anticoagulada con EDTA (Tapón morado).• Kit comercial con microcolumnas de intercambio iónico y tampón

de elución.• Material de laboratorio: pipetas, gradillas, tubos de ensayo, etc.• Espectrofotómetro.

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TécnicaPreparamos un hemolizado de la muestra mezclando sangre con agua destilada, 50 μl de sangre y 200 μl agua destilada.

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Preparamos la columna de cromatografía:•Quitamos la pestaña inferior de cierre.•Eliminamos el tampón que lleva como conservante.•Ajustamos el disco que lleva en el interior de la columna.•Colocamos la columna en un recipiente adecuado sobre el que podamos recoger los eluidos, ej.: tubo de ensayo grande (20 ml.)

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Aplicar sobre el disco superior de la columna la cantidad que marque el protocolo del hemolizado de la muestra que hemos preparado anteriormente y dejar que penetre en la columna.

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Aplicar el tampón de elución, según marque el protocolo, hasta recoger la fracción que corresponda a la hemoglobina A2.

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Determinar espectrofotométricamente la absorbancia de la fracción correspondiente a la hemoglobina A2, ajustando la longitud de onda de la medida a 415 nm.

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Determinar espectrofotométricamente la absorbancia de la hemoglobina total. Para ello preparar un nuevo hemolizado de la muestra diluyendo sangre en agua destilada, según protocolo. La medida se realiza igualmente a 415 nm.

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Calcular la proporción de hemoglobina A2 respecto a la hemoglobina total relacionando las absorbancias respectivas.

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ConsideracionesConsideraciones

1. Mantén las reglas de bioseguridad generales; guantes, bata, etc.2. Prepara todo el equipo y material previamente.3. Comprueba las condiciones de la muestra: Identificación,

ausencia de hemólisis (el sobrenadante no debe estar rojizo), ausencia de burbujas, condiciones de conservación, etc.

4. La obtención de los eluidos es una operación relativamente lenta, por tanto no desesperes y tenlo en cuenta a la hora de programar el tiempo de la técnica.

5. Los valores normales de hemoglobina A2 van de 1,3% al 3,8%, por encima del 4% es indicativo de rasgo talasémico.

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