INTRODUCCION

Todas las plantas tienen o deben tener programas especiales para controlar y prevenir la contaminación identificando los lugares, situaciones o materiales donde la contaminación es más probable. Las inspecciones son de tipo visual, biológico y químico para determinar donde los microorganismos pueden contaminar. Estas inspecciones son o deben ser hechas diariamente (inspección

básica) y de forma periódica (inspección completa). Visualmente se pueden ver residuos, suciedad, agua, polvo y otras fuentes de contaminación. Es por esta razón que el control microbiologico toma un papel muy importante en los procesos de una industria y en la calidad de los productos finales. En este resumen se presentan los métodos físicos y químicos mas comunes utilizados en la industria, tambien se hace un breve resumen de los antibioticos los cuales son un medio de controlar los microorganismos en el cuerpo humano, lo cual es un campo de importancia dentro de la microbiologia.

Químicamente , se realizan análisis para determinar los niveles de

conservantes, los componentes de los alimentos, etc.

Desde el punto de vista economico el control microbiologico toma un papel importante, por ejemplo en la industria alimenticia, los alimentos procesados que contienen microorganismos peligrosos deben ser destruidos. Si ya están distribuidos y puestos a la venta deben ser retirados e intervenidos. Cuando un producto es intervenido se notifica la marca, el tamaño del envase, el lote y el tipo de peligro.

Se puede prevenir el crecimiento de los microorganismos en los alimentos controlando las condiciones de almacenamiento (principalmente de temperatura y humedad) así como reduciendo el tiempo que los alimentos están en la planta hasta su procesado.

CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS: ESTERILIZACION Y DESINFECCION

I.- DEFINICIONES Y CONCEPTOS

Esterilización:

proceso de destruir los agentes infecciosos o microorganismos incluyendo sus formas de resistencia, por medio de agentes fisicos o quimicos.

Es el proceso de destruir todas las formas de vida microbiana. Por tanto, genera una situación en la que la probabilidad de que el objeto tratado contenga siquiera un superviviente es infinitamente pequeña.Así, un objeto esterilizado, en sentido microbiológico, está libre de microorganismos vivos. El único criterio válido de muerte en el caso de un microorganismo es la pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse.Eiminación de toda forma de vida, incluídas las esporas.

Desinfección:

proceso de destruir los agentes infecciosos o microorganismos pero no sus formas de resistencia, por medio de agentes fisicos o quimicos.

Sanitizacion:

proceso por el cual se destruyen los microorganismos a niveles tales que son inocuos para el proceso industrial en que se relacionan o para los seres humanos que alli operan.

Un compuesto por lo general químico que mata o interfiere con el crecimiento y actividad de los microoganismos. Se clasifica de acuerdo a su aplicación y a como actúa.

Agente antimicrobial:

es un compuesto por lo general químico que mata o interfiere con el crecimiento y actividad de los microoganismos. Se clasifica de acuerdo a su aplicación y a como actúa.

Germicida:

es un agente químico que mata los microorganismos pero no necesariamente las esporas (ej. Los bactericidas matan bacterias, los fungicidas matan hongos, los viricidas matan virus).

Agente microbiostático:

es uno que inhibe el crecimiento de los microoganismos pero no los mata (ej. bacteriostático inhibe el crecimiento bacterial).

Antisepsia:

operaciones o técnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el desarrollo de los microorganismos e incluso pueda matarlos.

Asepsia:

técnicas empleadas para impedir el acceso de microorganismos al campo de trabajo.

Antibiosis:

fenómeno biológico en el que existe una detención o destrucción del crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo.

Microbicidas:

sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las esporas de un microorganismo (bactericida, fungicida, etc.).

Microbiostáticos:

sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos (bacteriostáticos, fungistáticos, etc.).

Antisépticos:

se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

Desinfectantes:

se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

Agentes terapéuticos:

antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.

Agentes quimioterapéuticos:

sustancias químicas empleadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferación de células malignas.

Antibióticos:

sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo.

Medio de cultivo:

substrato óptimo para el mantenimiento y crecimiento de microorganismos en el laboratorio. El medio variará dependiendo del tipo de microorganismo.

Un cultivo que contiene solamente una clase de microorganismo se conoce como cultivo puro o axénico. Un cultivo que contiene más de una clase de microorganismo se conoce como cultivo mixto; en el caso especial de que contenga sólo dos clases de microorganismos, deliberadamente mantenidos en mutua asociación, se trata de un cultivo bimembre.

Aislamiento:

es la separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) bajo condiciones de laboratorio.

II. MUERTE DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS Y CURVAS DE SUPERVIVENCIA

Criterio de muerte de un microorganismo:

pérdida irreversible de la capacidad de reproducción en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de los microorganismos) se utilizan técnicas que descubran a los sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de reproducirse están muertos. Esto se determina generalmente mediante métodos cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman colonias.

Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la cinética de la muerte es casi siempre exponencial ya que el número de supervivientes disminuye de forma geométrica con el tiempo. Si representamos gráficamente el logaritmo del número de supervivientes frente al tiempo se obtiene una línea recta cuya pendiente negativa define la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice sólamente que fracción de la población inicial sobrevive a un determinado período de tratamiento. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer además el tamaño inicial de la población. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilización hay que tener en

consideración dos factores: la tasa de mortalidad y el tamaño de la población inicial. En la práctica de la esterilización la población microbiana que ha de ser destruida es mixta. Como los microorganismos difieren ampliamente en su resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamaño de la población inicial y la tasa de mortalidad de los miembros más resistentes de la población mixta. Para asegurar la fiabilidad de los métodos de esterilización se utilizan suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de esterilización se diseñan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

Fundamentos del control de los microorganismos

Las razones principales para controlar los microorganismos son: prevenir la transmisión de enfermedades, evitar el deterioro de los alimentos y evitar la contaminación tanto en procesos industriales que requieran cultivos puros, como en laboratorios de diagnóstico o investigación.

III. CONDICIONES QUE INFLUYEN EN LA ACCION ANTIMICROBIANA

Concentración del agente químico

Intensidad del agente físico- cuanto más intenso es el agente físico (calor o radiación ) mas rápidamente mata a los micoorganismos.

Tiempo de exposición- a mayor tiempo de exposición, mayor es el número de organismos destruídos.

Temperatura a mayor temperatura se acelera la destrucción de los organismos.

Número de organismos- mientras mayor sea la población microbiana, más tiempo se requeire para matarla

Clase de organismo las células vegetativas son más suceptibles que la esporas.

Estado fisiológico de las células mientras más viejas sean las células, más rápido se destruyen.

Ambiente: El calor es más eficaz en un medio ácido que en uno alcalino.

La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetración del agente.

Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia térmica de los organismos.

La presencia de materia orgánica extraña reduce notablemente la eficacia de los agentes químicos antimicrobianos por inactivar éstos o proteger al microorganismo.

IV.- AGENTES ESTERILIZANTES FISICOS

1.- Altas Temperaturas

La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los métodos más efectivos para destruir microorganismos. Hay que distinguir entre calor húmedo y calor seco. El húmedo mata los microorganismos porque coagula sus proteínas siendo más rápido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes químicos. La acción letal del calor es una relación de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120° C en calor húmedo, mientras que se necesitan alrededor de 2 horas de exposición al calor seco para obtener los mismos resultados.

A.- Esterilización por calor húmedo: (se utiliza para soluciones acuosas)

Autoclave:

El calor en la forma de vapor a saturación y a presión es el agente más práctico para esterilizar ya que el vapor a presión proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullición. El aparato utilizado se llama autoclave (una olla que regula la presión interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión atmosférica lo

cual corresponde a una temperatura de 120° C. El tiempo de exposición depende del volumen del líquido, de tal manera que para volúmenes pequeños (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120° C; si los volúmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microorganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor empleándose en estos casos otros métodos de esterilización.

Tindalización: Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por

encima de 100° C sin que resulten dañadas. Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100° C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos períodos de incubación. Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de incubación y en la siguiente exposición al calor las células vegetativas son destruidas.

Pasteurización: La leche, nata y ciertas bebidas alcohólicas (cerveza y vino) se

someten a tratamientos de calor controlado que sólo matan a ciertos tipos de microorganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estéril. La temperatura seleccionada para la pasteurización se basa en el tiempo térmico mortal de microorganismos patógenos (es el tiempo más corto necesario para matar una suspensión de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los microorganismos patógenos más resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a 60° C. Posteriormente se descubrió que Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es más resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurización de la leche se realiza a 62,8° C durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente superior, 71,7° C durante 15 segundos (Flash-Pasteurización).

B.- Esterilización por calor seco: (se utiliza para materiales sólidos estables al calor)

Horno Pasteur:

El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno Pasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposición a 160° C.

Incineración:

La destrucción de los microorganismos por incineración es una práctica rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineración también se utiliza en la eliminación de residuos hospitalarios.

2.- Bajas Temperaturas

En general, el metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas por debajo de 0° C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo. Esta circunstancia es aprovechada por los microbiólogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.

3.- Radiaciones

A.- Radiaciones ionizantes

Rayos gamma:

Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por ciertos isótopos radiactivos como es el Co60 pero son difíciles de controlar ya que este isótopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y después esterilizar.

Rayos catódicos (Radiación con haz de electrones):

Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar después de empacado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente.

B.- Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta:

La porción ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la población microbiana en quirófanos, cuartos de llenado asépticos en la industria farmacéutica y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruídos.

4.- Presión osmóticaLa pared celular de las bacterias las protege de cambios en la presión osmótica del medio.Sin embargo si la presión osmótica externa es alta el organismo puede morir. Altas concentraciones de sal interrumpen los procesos de transporte a través de la membrana y desnaturalizan las proteínas

5.- Ondas ultrasónicas (sonicación)En general, los microorganismos suspendidos en un líquido y

sometidos a la acción de ondas ultrasónicas de altas intensidades (20,000 ciclos/seg.) durante cierto tiempo se destruyen porque se rompe la pared celular y se pierde el contenido de la célula.

6.- Filtración Algunos materiales como los líquidos biológicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos) son termolábiles. Otros agentes físicos como las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprácticos para esterilizarlos, por lo que se recurre a la filtración a través de filtros capaces de retener los microorganismos. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes del poro durante su paso a través del filtro debido a la carga eléctrica del filtro y de los microorganismos. Debido al pequeño tamaño de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan libre de bacterias una solución, se van a eliminar también los virus.

A.- Filtros de membrana Los filtros de membranas son discos de ésteres de celulosa con poros tan pequeños que previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamaño de poro. Estos filtros son desechables. Además de utilizarse en la esterilización de líquidos se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua.

B.- Filtros HEPA Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) está compuesto por pliegues de acetato de celulosa que retienen las partículas (incluídos los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.

7.- Desecación La desecación de las células vegetativas microbianas paraliza su

actividad metabólica. Este proceso físico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la refrigeración. El tiempo de supervivencia de los microorganismos después de desecados depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son más susceptibles a la desecación que los cocos Gram (+). Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecación pudiendo permanecer viables indefinidamente.

V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS

1.- Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente químico esterilizante es que sea volátil así como tóxico para los microorganismos, de manera que pueda ser fácilmente eliminado del objeto esterilizado después del tratamiento. Normalmente se utiliza el óxido de etileno, un líquido que hierve a 10,7° C. Se usa en la industria para la esterilización de placas Petri, jeringas y otros objetos de plástico que se funden a temperaturas superiores a los 100° C. Debido a su alto poder de penetración estos objetos se empaquetan primero y después se esterilizan. El óxido de etileno actúa inactivando enzimas y otras proteínas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reacción llamada alquilación (R-S-CH2CH2O-H).

2.- Glutaraldehido:

Una solución acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, células vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urológicos y ópticos.

VI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

Esterilización:

es el proceso de destrucción de todas las formas de vida microbiana.

Desinfección: es el proceso de destrucción de los agentes infecciosos.

Desinfectantes:

son aquellas sustancias químicas que matan las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de los microorganismos patógenos. Se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

Ningún agente químico antimicrobiano sólo es el mejor o ideal para uno o todos los propósitos. Existen diferencias en sus mecanismos de acción y muchos tipos de células microbianas que pueden ser destruídas. No obstante, existen una serie de características que debe de tener un buen desinfectante, y son las siguientes:

- Actividad antimicrobiana: el primer requerimiento es la capacidad de la sustancia para matar microorganismos. Así, la sustancia química a baja

concentración deberá tener un amplio espectro de actividad antimicrobiana.

- Solubilidad: la sustancia deberá ser soluble en agua y/u otros disolventes en la medida necesaria para un uso eficaz.

- Estabilidad: los cambios en la restbilidad de la sustancia deberán ser mínimos y no afectar considerablemente la acción germicida.

- No deberá ser tóxica para el hombre u otros animales: de manera ideal, la sustancia deberá ser letal para los microorganismos y no para el hombre u otros animales.

- Homogeneidad: la preparación deberá ser uniforme en su composición de manera que los ingredientes activos se encuentren en cada aplicación.

- No deberá reaccionar con material orgánico extraño: muchos desinfectantes tienen afinidad por las proteínas y otros materiales orgánicos. Cuando se usan estos desinfectantes en situaciones en las que además de bacterias hay cantidades considerables de material orgánico, muy poco desinfectante estará disponible para actuar contra los microorganismos.

- Toxicidad para los microorganismos a la temperatura del ambiente donde se usará.

- Capacidad de penetración: a menos que la sustancia pueda penetrar a través de las superficies, su acción germicida se limitará al sitio de aplicación.

- No deberá corroer ni teñir.

- Propiedad desodorante: es deseable que tenga atributos desodorantes, así como desinfectantes. Lo ideal es que el desinfectante tenga por sí mismo olor agradable o sea inodoro.

- Capacidad detergente: un desinffectante que a la vez sea detergente (agente limpiador) aumentará la eficacia del desinfectante.

- Disponibilidad: el compuesto deberá estar dispnible en grandes cantidades y a precio razonable.

Antisépticos:

son aquellas sustancias químicas que previenen el crecimiento o acción de los microorganismos ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo. A.- INORGANICOS

1.- Metales:

Los más efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc. Actúan inactivando las proteínas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se emplean como antisépticos en heridas superficiales de la piel y mucosas están el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados como antisépticos está el nitrato de plata (AgNO3) que en solución al 1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonocócicas en los ojos de los recién nacidos aunque actualmente se está reemplazando por antibióticos como la penicilina. Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. También es fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fúngicas de plantas (Mezcla Bordolesa). Los compuestos de zinc también son fungicidas por lo que se utilizan para tratar el pié de atleta.

2.- Acidos y álcalis:

Actúan alterando la permeabilidad y coagulando las proteínas. En general los ácidos son más eficaces que los álcalis. Dentro de estos compuestos se encuentran el sulfúrico (H2SO4), nítrico (HNO3), hidróxido sódico (NaOH) e hidróxido potásico (KOH). Tienen aplicación limitada debido a su naturaleza cáustica y corrosiva. Aún así el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera.

3.- Compuestos inorgánicos oxidantes:

actúan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volúmenes) se utiliza como antiséptico en pequeñas heridas de la piel.

4.- Halógenos:

Los halógenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos antimicrobianos. Los halógenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los

componentes vitales de las células microbianas.

Cloro:

La muerte de los microorganismos por acción del cloro se debe en parte a la combinación directa del cloro con las proteínas de las membranas celulares y los enzimas. Así mismo en presencia de agua desprende oxígeno naciente (O) que oxida la materia orgánica:

Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (ácido hipocloroso)

HClO ----------------> HCl + O (oxígeno naciente)

El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfección del agua de bebida y piscinas. El hipoclorito sódico (lejía) al 1% se puede utilizar como desinfectante doméstico.

Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su acción

antimicrobiana es debido a su acción oxidante. Además la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el aminoácido tirosina resulta en la inactivación de enzimas y otras proteínas. El iodo se puede utilizar como antiséptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solución alcohólica (tintura) de iodo (I2) más ioduro potásico (KI) o ioduro sódico (NaI). ii) iodóforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actúan como agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinil pirrolidona (PVP). Los iodóforos tienen la ventaja de que no tiñen la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel así como en la desinfección de pequeñas cantidades de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire. B.- ORGANICOS

1.- Alcoholes:

El alcohol metílico (1C) es menos bactericida que el etílico (2C) y además es altamente tóxico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior al del propílico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas,

disolviendo las capas lipídicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usa como antiséptico de la piel y como desinfectante en los termómetros clínicos orales y algunos instrumentos quirúrgicos.

2.- Fenol y compuestos fenólicos:

Una solución acuosa al 5% de fenol mata rápidamente a las células vegetativas de los microorganismos. Sin embargo, las esporas son mucho más resistentes al fenol. Debido a que el fenol es tóxico y tiene un olor desagradable ya casi no se usa como desinfectante o antiséptico, siendo reemplazado por compuestos fenólicos que son sustancias derivadas del fenol menos tóxicas y más activas frente a los microorganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenólicos que se utiliza para desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y compuestos fenólicos actúan alterando la permeabilidad de la membrana citoplásmica así como desnaturalizando proteínas.

VII.- EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

Para el estudio de los microorganismos es necesario cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para ello hay que conocer los nutrientes y condiciones físicas que requieren, información que disponemos tras investigaciones extensas y con las que se han desarrollado numerosos medios de cultivo.

Condiciones generales de un medio de cultivo:

- presentar todos los elementos necesarios y en sus proporciones/cantidades necesarias.- pH adecuado.- condiciones osmóticas adecuadas.- debe de ser estéril y preservado de cualquier contaminación.- medio fresco (ya que se desecan y pierden humedad, concentrándose el resto de componentes).

Componentes de los medios de cultivo:- Agua

- Extracto de levadura:

fuente rica en vitaminas B; también contiene nitrógeno orgánico y compuestos de carbono.

- Peptonas:

es el producto que resulta de la digestión de materiales proteicos. Constituye una fuente principal de nitrógeno orgánico; contiene también algunas vitaminas, y a veces carbohidratos. Distinguimos dos tipos, dependiendo del tipo de digestión que hayan sufrido:

- Hidrólisis química (ácida o alcalina)- Hidrólisis enzimática

- Infusiones y extractos:

contienen las sustancias solubles en agua de tejidos animales (carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados, vitaminas solubles en agua y sales). Mientras que un caldo se obtiene por ebullición de los tejidos, una infusión implica un "colado" del líquido obtenido. Un extracto es un concentrado de un caldo.

- Azúcares:

actuarán como fuente de energía (cuando su proporción es de 1 g/l) o como substrato de prueba (1-2%)

- Sales minerales:

podemos distinguir dos tipos, atendiendo a la función que desempeñan. Estos son:

Sales para el mantenimiento de la presión osmótica (NaCl).Tampones: carbonatos y fosfatos (este ultimo más eficaz).

- Indicadores de pH:

son sustancias que cambian de color cuando el medio alcanza algún valor determinado de pH. Los más utilizados son:

-Azul de timol (Rojo 1,2 Azul 2,8 Amarillo)- Púrpura bromocresol (Amarillo 5,2 Anaranjado 6,8 Púrpura)- Azul de bromotimol (Amarillo 6,0 Verde 7,6 Azul)- Rojo fenol (Amarillo 6,8 Rojo claro 8,4 Rojo cereza)

- Rojo neutro (Rojo intenso 6,8 Rojo 8,0 Amarillo)- Azul de bromofenol, rojo de metilo, rojo de cresol, fenolftaleina, etc...

- Indicadores REDOX:

son sustancias que cambian de color cuando se producen este tipo de reacciones. Distinguimos:

Azul de metileno (azul-incoloro)Cloruro de trifenil (incoloro-rojo)

- Agentes selectivos:

son sustancias que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos en decrimento de otros. Encontramos varios tipos:

- Colorantes (antimetabolitos): cristal violeta, verde brillante, etc...- Azida sódica: inhibe el metabolismo aerobio (inhibe la cadena respiratoria); esto afecta principalmente a bacterias Gram negativas.- Sales biliares y detergentes: son agentes tensoactivos, depresores de la tensión superficial. En este caso son las bacterias Gram negativas las que resisten más su acción.- Cloruro sódico: a elevadas concentraciones son perjudiciales para aquellos microorganismos no halófilos.- pH: cada tipo de microorganismo tiene su rango de pH óptimo y sus valores críticos.- Antimicrobianos: sustancias capaces de matar a microorganismos.

- Suplementos (factores de crecimiento):

consiste en uno o mas compuestos orgánicos que un microorganismo requiere como precursor o como constituyente de su material orgánico celular, pero que no puede sintetizar a partir de fuentes de carbono más sencillas, y debe ser administrado como nutriente. Hay tres clases: aminoácidos, pirimidinas y vitaminas.

- Agentes solidificantes: permiten solidificar un medio previamente líquido. Pueden ser

de:

- agar-agar (a partir de 10-14 g/l es un medio de cultivo sólido; para valores inferiores, medios semisólidos).- gel de sílice- geles poliacrílicos

- Agentes reductores:

estos disminuyen el contenido de O2, obteniéndose así un ambiente de anaerobiosis. Los más usados son:

- Ácido ascórbico- Tioglicolato sódico- Ácido tiomálico- Cisteina

- Agentes quelantes:

son agentes que forman complejos solubles con los metales, impidiendo así que estos formen un complejo insoluble con los fosfatos. El más utilizado es el EDTA (ácido etilendiamino tetraacético).

Clasificación de los medios de cultivo: atiende a distintos criterios. Estos son:

- Composición química:

- Definidos o sintéticos- Indefinidos o complejos

- Origen de sus componentes:

- Artificiales- Naturales- Mixtos

- Estado físico:

- Sólidos: rebanadas de pan, etc... - Líquidos (caldos): caldo nutritivo, leche desnatada, etc...- Semisólidos: con pequeñas cantidades de agar (consistencia de "natilla")- Sólidos reversibles a líquidos: agar nutritivo.

- Uso o aplicación:

- Comunes- Especiales:

- Medios enriquecidos: adición de componentes, como sangre, suero, etc..., para proporcionar sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de los heterótrofos exigentes.- Medios selectivos: medio con ciertas sustancias químicas específicas que no permitirán el desarrollo de un grupo de bacterias, sin inhibir a su vez el crecimiento de otros grupos.- Medios diferenciales: ciertos reactivos o sustancia químicas que dan lugar a determinado tipo de crecimiento bacteriano o cambios para diferenciar las bacterias.- Medios de prueba: para el ensayo de vitaminas, aminoácidos y antibióticos se utilizan medios de composición experimental. También se utiliza este tipo de medio para probar desinfectantes.- Medios para recuento: utilizado para el recuento de microorganismos en una muestra.- Medios de caracterización bacteriana: para determinar el tipo de crecimiento producido por los organismos y la capacidad de la bacteria para producir cambios químicos.- Medios de mantenimiento: para conservar al microorganismo durante un elevado tiempo sin dañar su estructura.

Un medio de cultivo ha de estar libre de microorganismos (solo queremos aquellos que vamos a estudiar). Por ello se debe de utilizar material y componentes esterilizados.

1.- Técnica de dilución en tubo:

Primero se realizan diferentes diluciones del agente químico. El mismo volumen de cada dilución se dispensa en tubos estériles. A cada tubo se le añade la misma cantidad de una suspensión del microorganismo utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alícuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo.

Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo utilizado como prueba durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo mediante la aparición de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilución a la cual ese agente químico mata

al microorganismo utilizado como prueba cuando este microorganismo es expuesto al agente químico durante ese período de tiempo.

2.- Técnica de la placa de agar:

Se inocula una placa que contenga medio de cultivo sólido con el microorganismo utilizado como prueba. El agente químico se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibición (crecimiento -) alrededor del agente químico. Una modificación de esta técnica es la incorporación del agente químico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano.

3.- Técnica del coeficiente fenólico:

Es una técnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder desinfectante de un agente químico frente al del fenol. Es una modificación de la técnica de dilución en tubo tal como se describe a continuación: (i) Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como prueba (cepas específicas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una alícuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estéril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microorganismo (aparición de turbidez). (vi) La mayor dilución del desinfectante que mate a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilución mayor de fenol que dé los mismos resultados. El número obtenido es el coeficiente fenólico de ese desinfectante.

4. TECNOLOGIA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO

BetzDearborn ha elaborado un sistema para medir de control microbiológico, denominado BioscanTM2, que consigue eliminar el periodo de incubación que requieren los métodos de cultivo tradicionales. Funciona midiendo la luz que se produce cuando los reactivos enzimáticos reaccionan con el ATP del microorganismo, sustancia que se encuentra en todas las células vivas. Se dispone de resultados inmediatos en campo que indican la población microbiológica total de bacterias aeróbicas y

anaeróbicas, hongos, levaduras, algas y protozoos. Como resultado, se pueden reducir los costes de limpieza y de mantenimiento, disminuir el número de paros no programados y mejorar considerablemente la productividad.

VIII.- ANTIBIOTICOS

1.- Determinación del espectro de acción de un antibiótico:

Los antibióticos son una clase especial de agentes quimioterapeuticos, obtenidos generalmente de organismos vivos. La palabra antibiótico se refiere a un producto metabólico de un organismo que es perjudicial o inhibitorio, en muy pequeñas cantidades para otros microorganismos. Para que un antibiótico sea útil como agente quimioterapéutico debe reunir las siguientes cualidades:

- Amplio espectro de acción: debe ser capaz de destruir o inhibir muchas especies de microorganismos patógenos.

- Impedir la aparición rápida de formas resistentes del parásito.

- No debe producir efectos secundarios: reacciones de sensibilidad o alergia, daño al sistema nervioso o irritación de los riñones y conducto gastrointestinal son posibles efectos colaterales indeseables en el huesped.

- No debe eliminar la flora microbiana normal del huesped.

2.- Pruebas de susceptibilidad (antibiograma):La susceptibilidad de un microorganismo a un antibiótico y a otros agentes quimicoterapeuticos se determina por las técnicas de dilución en tubo o por la del disco en placa.-. Método de disco en placa de agar (difusión en disco):

Este método es el que se usa comúnmente para determinar la susceptibilidad de los microorganismos a los agentes quimioterapéuticos. Se colocan pequeños discos de papel impregnados con cantidades conocidas del agente (disponibles en el comercio) sobre la superficie de una placa sembrada (cesped bacteriano). Ocurren, pues, dos procesos: el microorganismo empieza a crecer y el antibiótico difunde, de tal forma que alrededor del disco hay un gradiente de concentación de antibiótico.Después de la incubación se examina la placa buscando zonas de inhibición del desarrollo alrededor de los discos (halo de inhibición). Una zona de inhibición (área clara) alrededor del disco indica que el organismo fue inhibido por el agente difundido en el agar desde el disco. El diámetro del halo nos indica si la bacteria es resistente "R", presenta resistencia intermedia "I", o es sensible al antibiótico "S".

Factores que influyen en el resultado:

a) Tipo de medio de cultivo: para que no influya, se usa siempre "Agar Mueller-Hinton". Si hay que suplementar este hay que realizar un control utilizando una cepa de referencia para ver si el suplemento provoca cambios. Se prueba con las siguientes cepas de referencia:

Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomona aeruginosa

Si los halos no son iguales a los definidos, entonces el suplemento está provocando cambios en el resultado.

b) Volumen del medio de cultivo: el antibiótico no solo difunde en superficie, sino también en profundidad. Por ello también se estandariza la altura de cepa de agar, y este es de 4 mm.

c) Carga o concentración de antibiótico en los discos: la cantidad de antibiótico vendrá expresado en mg o U.I. Los discos han de conservarse entre 4ºC - 8ºC, y una vez que vayan a ser utilizados hay que dejar que se estabilicen a temperatura ambiente.

d) Inóculo y siembra: el inóculo también influye (cuantas más bacterias, el halo será de menor tamaño). El número de células que se deben de poner en una placa se estandariza mediante la "escala de MacFarland". Se ajusta la turbidez a 0'5 de escala MF (cuando este número es mayor mas concetración de sal de bario tiene la escala). En cuanto a la forma de

sembrar: hay que conseguir un cesped homogeneo. Para ello sembramos pasando un bastoncillo impregnado con la bacteria en primer lugar en un sentido, se gira 60º y se hacen estrías cruzando las anteriores. Repetimos el giro y la siembra. Finalmente inoculamos el borde de la placa.Colocación de los discos: con unas pinzas flameadas con alcohol ponemos los discos en la placa, procurando ponerlos separados unos de otros y del borde de la placa. Los discos han de ir sobre el agar (damos un golpe suave). Pasados 15 minutos invertimos la placa e incubamos.El método del disco único para cada antibiótico es la prueba de susceptibilidad recomendada usualmente por la FDA de Estados Unidos (Administración de alimentos y drogas)

- Técnica de dilución en tubo:

Consiste en lo siguiente: en una serie de tubos que contienen el medio de cultivo adecuado y sembrados con el organismo que se prueba, se ponen cantidades crecientes del antibiótico que se estudia. Después de la incubación se determina la concentración de la droga necesaria para inhibir el desarrollo del organismo que se prueba por la falta de desarrollo.

3.- Conjugación bacteriana:

La conjugación es un proceso mediante el cual ciertas células bacterianas transfieren DNA a una segunda célula con la que entran en contacto. La capacidad para transferir DNA por conjugación depende de la presencia de una entidad citoplasmática denominada factor de fertilidad o F. Las células portadoras de F se conocen como F+, y las células que no contienen F se conocen como F-. El factor F se trata de un pequeño elemento circular que funciona como un minicromosoma (contiene aprox. 100 genes). Las células portadoras de F producen pili ( pilus en singular), que son pequeños túbulos proteicos que permiten a las células F+ adherirse y mantener contacto con las células F-. La transferencia del factor F se produce siempre (logicamente) de las células F+ a las células F-. Existen las denominadas "cepas de alta frecuencia de recombinación" (Hfr). Esto ocurre cuando, ocasionalmente, F deja el citoplasma y se integra en el cromosoma de la célula hospedadora.Los pili o fimbrias son muy lábiles, con lo cual es muy dificil que se transfiera todo el factor F (que para Escherichia coli requiere un tiempo de 60-90 minutos). Ademas, la transferencia del "cromosoma" se realiza por un punto concreto de inicio. Por tanto, la distancia y el orden de entrada de los genes se puede conocer por métodos como conjugación interrumpida

(se recogen muestras a intervalos de tiempo concretos después de realizar la mezcla) o por frecuencia de recombinación.

4.- Aglutinación bacteriana:

Los anticuerpos son sustancias específicas formadas por el cuerpo en respuesta a un estímulos antigénico. Quimicamente son proteinas. Estas se unen especificamente a un antígeno (la sustancia que cuando se introduce en el cuerpo origina la producción de los anticuerpos), formanto un entramado o "rejilla" de antígenos y anticuerpos, que son visibles a simple vista como grumos.

Esta propiedad se utiliza para determinar si un microorganismo problema es o nó la especie que estamos buscando mediante la aplicación de anticuerpos específicos para esa especie o, a partir de una especie ya conocida, determinar si en un suero problema existen o no anticuerpos específicos para ese microorganismo. La proporción adecuada para que los grumos sean visibles es la que se señala en la siguiente gráfica como "región de equivalencia":

Y = AglutinaciónX = [Antígeno]

La reacción de aglutinación se lleva a cabo de la siguiente forma: en un portaobjetos se ponen dos gotas (5ml) separadas de una suspensión bacteriana. En una de las gotas se añade 5ml de antisuero, y en la otra, 5ml de PBS (tampón fosfato salino), y mezclamos con un palillo de dientes. Los resultados posibles son los siguientes:

- Si solo aparecen grumos en la gota con antisuero: la bacteria tiene el antígeno para ese anticuerpo.- Si no aparecen grumos en ambas gotas: la bacteria no tiene el

antígeno específico de ese anticuerpo.- Si aparecen grumos en ambas gotas: la prueba no puede leerse (los grumos no se forman por la unión antígeno-anticuerpo).

CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS: ESTERILIZACION Y DESINFECCION

I.- DEFINICIONES Y CONCEPTOS

II.- MUERTE DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS Y CURVAS DE SUPERVIVENCIA.

III.- CONDICIONES QUE INFLUYEN EN LA ACCION ANTIMICROBIANA

IV.- AGENTES ESTERILIZANTES FISICOS

1.- Altas Temperaturas

A.- Esterilización por calor húmedo

Autoclave

Tindalización

Pasteurización

B.- Esterilización por calor seco

Horno Pasteur

Incineración

2.- Bajas Temperaturas

3.- Presion Osmotica

4.- Ondas Ultrasonicas

5.- Radiaciones

A.- Radiaciones ionizantes

B.- Radiaciones no ionizantes

6.- Filtración

A.- Filtros de membranaB.- Filtros HEPA

7.- Desecación

V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS

1.- Oxido de etileno

2.- Glutaraldehido

VI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

A.- Inorgánicos

1.- Metales

2.- Acidos y álcalis

3.- Compuestos inorgánicos oxidantes

4.- Halógenos

B.- Orgánicos

1.- Alcoholes

2.- Fenol y compuestos fenólicos

VII.- ACCION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS

DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

1.- Técnica de dilución en tubo

2.- Técnica de la placa de agar

3.- Técnica del coeficiente fenólico

VIII.- ANTIBIOTICOS.

1.- Determinacion del espectro de accion de un antibiotico.

2.- Pruebas de susceptibilidad.

3.- Conjugacion bacteriana.

4.- Aglutinacion bacteriana.

BIBLIOGRAFIA

1. http://www.atl-gestion.com/Asepsia y desinfeccion.htm

2. http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/entrada.html

3. http://edicion-micro.usal.es/Web/haccp99/Unidades/CURSO/UNI_04/images/4010201.gif

4. http://www.encolombia.com/orto12398contenido.htm

5. http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema08.html#anchor171586

6. http://orbita.starmedia.com/~sohail/micro1.htm