cultivo in vitro en la erradicacion de patogenos

7/24/2019 CULTIVO IN VITRO EN LA ERRADICACION DE PATOGENOS.

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Escuela Profesional de Ingeniera Biotecnolgica UCSM

Biotecnologa Vegetal II Fase

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CULTIVO IN VITRO EN LA ERRADICACION DE

PATOGENOS

1. INTRODUCCION

Las plantas se mantienen sanas o normales cuando llevan a cabo sus funciones

fisiolgicas hasta donde les permite su potencial gentico. Las plantas presentaran

enfermedad cuando una o varias de sus funciones sean alteradas por los organismos

patgenos o por determinadas condiciones del medio.

Figura 1: Esquema en el que se muestran las funciones bsicas de una planta y la

interferencia que sobre ellas ocasionan algunos tipos comunes de enfermedades


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Las causas principales de enfermedad en las plantas son los organismos patgenos

y los factores del medio ambiente fsico.

Las clulas y los tejidos afectados de las plantas enfermas comnmente se debilitan

o destruyen a causa de los agentes que ocasionan la enfermedad, la capacidad que

tienen esas clulas y tejidos para llevar cabo sus funciones normales disminuye o se

anula por completo; como resultado la planta muere o detiene su crecimiento.

Entre las diferentes enfermedades que afectan a las plantas, las causadas por los

virus son las ms difciles de erradicar. Estos patgenos son considerados parsitos

obligatorios debido a que su multiplicacin depende del metabolismo celular del

hospedero. Esto los diferencia de otros patgenos, como bacterias, micoplasmas y

hongos, que en su multiplicacin utilizan en gran medida su propio metabolismo.

Por estas razones, y a diferencia de lo que ocurre con los insectos, nematodos ycaros, y la mayora de bacterias, micoplasmas y hongos, no pueden ser controlados

con la aplicacin de productos qumicos.

De ah que el cultivo in vitro para la erradicacin de patgenos y virus es muy

importante hasta se vuelve necesario.

2. CLASIFICACION DE LAS ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS:

Hay miles de enfermedades que afectan a las plantas cultivadas, En promedio cada

tipo de cultivo puede ser afectado por un centenar o ms enfermedades. Cada grupo

patgeno puede atacar desde una hasta varias docenas de variedades o incluso

cientos de especies vegetales.

Para facilitar el estudio de las enfermedades de las plantas es necesario agruparlas

en forma adecuada, esto es necesario para lograr la identificacin y el control

posterior de cualquier enfermedad de las plantas, el criterio ms til en la

clasificacin de una enfermedad es el tipo de agente patgeno que la ocasiona.

Esta clasificacin tiene la ventaja de que indica la causa de la enfermedad, lo cual

permite preveer su probable desarrollo y diseminacin, as como las posibles medidas

de control.

De acuerdo con lo mencionado, las enfermedades de las plantas se clasifican de la

manera siguiente:

I. ENFERMEDADES INFECCIOSAS O BIOTICAS DE LAS PLANTAS:

1. Enfermedades ocasionadas por hongos

2. Enfermedades ocasionadas por procariontes (bacterias y micoplasmas)

3.

Enfermedades ocasionadas por plantas superiores parasitas4. Enfermedades ocasionadas por virus y viroides


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Figura 2: Morfologa y divisin de algunos de los grupos de Fitopatgenos

5. Enfermedades ocasionadas por nematodos

6. Enfermedades ocasionadas por protozoarios

II.

ENFERMEDADES NO INFECCIOSAS O ABIOTICAS DE LAS PLANTAS

DEBIDO A:

1.Temperaturas muy altas o muy bajas

2. Falta o exceso de humedad en el suelo

3. Falta o exceso de luz

4. Falta de oxigeno

5. Contaminacin atmosfrica

6. Deficiencia de nutrientes

7.

Toxicidad Mineral8. Acidez o alcalinidad (pH)

9.Toxicidad de los plaguicidas

10.Prcticas agrcolas inadecuadas


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Figura 3: Esquema en el que se presentan la forma y el tamao de algunos de los

Fitopatgenos en relacin a una clula vegetal

Para el siguiente trabajo nos enfocaremos conocer un poco en las

enfermedades biticas de las plantas como son los hongos, bacterias,

micoplasmas y virus, para as poder plantear su erradicacin mediante el

cultivo in vitro, y as poder remarcar la importancia de estos para as evitar

cultivos infectados y promover la sanidad vegetal.

3. NATURALEZA DE LOS PATOGENOS

Los agentes patgenos ms comunes en las plantas son los hongos, aunque las

bacterias y los nematodos tambin son importantes. Las enfermedades causadas por

micoplasmas y virus no se registran a menudo, mayormente porque son muy difciles

de detectar.

El tamao relativo de los patgenos vegetales ya mencionados vara mucho.

Entre los patgenos vegetales los nematodos son los ms grandes y pueden

ser observados fcilmente con un microscopio estereoscpico.

Los virus y viroides son los ms pequeos y se requiere de un microscopio

electrnico para su observacin.


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La ocurrencia de una enfermedad no solo depende de la presencia del hospedante y

del patgeno. Las condiciones ambientales, especialmente la humedad y la

temperatura, juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad.

As una enfermedad puede definirse como un producto de la interaccin delhospedante, el patgeno y el ambiente. Este concepto de una enfermedad es conocido

como el tringulo de la enfermedad.

La distribucin de los diferentes patgenos dentro de la planta enferme varia tambin

mucho.

Pseudomonas solanacearum, el virus del enrollamiento de la hoja de la papa y los

micoplasmas estn restringidos al tejido vascular de una planta.

Erwinia carotovoray el virus X de la papa, invaden tanto el tejido vascular como

el resto de los tejidos de la planta.

No todas las clulas en una planta enferma se encuentran infectadas con

patgenos. Los tejidos meristematicos de la raz y brotes terminales de una planta

infectada estn, algunas veces, libres de virus.

En algunas ocasiones, tal como sucede en la papa con el PVX y el TRV (Tobacco

Rattle Virus), solamente la cpula y los primeros primordios foliares se

encuentran libres de virus. Se desconoce la razn exacta de este problema; sin

embargo, se cree que uno ms de los siguientes factores podran ser

responsables de ello:

Alta actividad metablica: Los virus se multiplican acompaando el

curso del metabolismo del husped. Debido y la gran actividad metablica

en las clulas meristemticas del husped, los virus no pueden tornar el

control de la maquinaria biosinttica del mismo.

Carencia de tejido vascular: Los virus se diseminan rpidamente y travsdel sistema vascular. Los virus que se ubican tan solo en el floema (PLRV)

no pueden invadir los tejidos meristemticos debido y la ausencia de

diferenciacin celular. En esta zona meristemtica, los virus que infectan

los tejidos no vasculares se diseminan de clula y clula y travs de los

conductos intercelulares (plasmodesmos). Este es un proceso lento por lo

que resulta relativamente difcil que los virus infecten en su totalidad y las

clulas que vienen dividindose rpidamente.


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Figura 4: Ciclo de reproduccin de hongos Ascomycetes

Alta concentracin de auxinas: Lostejidos meristemticos de las

plantas tienen una concentracin ms alta de auxinas que los tejidos de

otras partes de las mismas. Algunos autores indican que estas auxinas

inhiben y multiplicacin de los virus.

4. PATOGENOS QUE ATACAN LOS CULTIVOS

I. HONGOS:

Son organismos pequeos, generalmente microscpicos, que se reproducen

principalmente a travs de esporas. Las esporas son el equivalente a las

semillas en las plantas. La mayora de los hongos tiene un cuerpo vegetativo

filamentoso llamado micelio. El micelio da a los hongos una apariencia

algodonosa. sta es una caracterstica utilizada en el campo para distinguirlas enfermedades causadas por hongos de aquellas causadas por bacterias.

Se nombran los distintos grupos de hongos, con sus respectivos ejemplos,

para enfatizar que no todos los hongos son controlados por la totalidad de los

fungicidas, sino que es indispensable conocer el grupo de hongo al que

pertenece una enfermedad en particular para poder seleccionar y utilizar el

fungicida apropiado para su control qumico. Los principales hongos

fitopatgenos estn agrupados en las siguientes clases:

Ascomycetes: Pudricin del tallo o cncer (Ceratocystis sp.), mildiu

polvoso o blanco (Erysiphe sp.), sigatoka o mancha foliar del pltano

(Mycosphaerel/a sp.).


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Figura 7: Ciclo de reproduccin de hongos Deuteromycetes

Deuteromycetes: Tizn temprano (Alternara solant), moho gris

(Botrytis sp.), Antracnosis (Colletotrichum sp.), Fusarium

(Fusarium sp.).

Sobrevivencia de los hongos fitopatgenos:

Los hongos pueden sobrevivir entre ciclos agrcolas como: micelio, esclerocios

(masas compactas de hifas), clamidiosporas (esporas endurecidas) y esporas

sobre tejidos infectados, hojas y frutos cados, en rastrojos de cultivos, en el suelo

y dentro o sobre semillas y material vegetativo. Por ejemplo, el hongo Fusarium

oxysporum f.sp. lycopersici, organismo causal del marchitamiento por fusarium

en tomate, puede producir clamidiosporas para sobrevivir por mucho tiempo en

el suelo.

Origen y diseminacin de las enfermedades causadas por hongos:

Las enfermedades no son de aparicin espontnea sino que tienen fuente de

origen (hospederos alternos, material infectado en descomposicin, esporas

latentes en el suelo, etc.). Debido a que las esporas de hongos son muy pequeas

y livianas. stas pueden diseminarse por:

o El viento.

o

El agua (salpique por lluvia, riego por aspersin o escorrentas).o Los organismos pequeos como insectos y caros.


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o El movimiento de gente, maquinaria o animales.

o Rango de hospederos de los hongos fitopatgenos

Los hongos que atacan el follaje suelen tener un estrecho rango de hospederos,

generalmente comprendido dentro de una sola familia botnica de plantas;mientras que los que atacan races o frutos suelen tener amplio rango de

hospederos. As, el tizn tardo de tomate o papa (Phytophthora infestans) es

especfico de las solanceas y no afecta cucrbitas (meln, sanda o pepino),

crucferas (repollo, brcoli, coliflor, etc.), ni otras hojas anchas u hojas

angostas (maz, sorgo o caa de azcar) cultivadas. Por el contrario, los hongos

que atacan races, como Fusarium, Pythium, y Rhizoctonia, suelen atacar un

amplio rango de hospederos: cucrbitas, solanceas, crucferas y compuestas,

los hospederos estn comprendidos dentro de grupos especficos de plantas

(hojas anchas en este caso).

Enfermedades y sntomas comunes mostrados por las plantas atacadas por

hongos:

o Tizones. Empardecimiento general y extremadamente rpido de las hojas,

ramas y rganos florales de una planta, que dan como resultado la muerte

de esos rganos.

o

Pata seca o mal del talluelo. Muerte rpida y colapso de plantas muyjvenes que se cultivan en el campo o almcigo.

o Antracnosis. Lesin que se asemeja a una ulcera profunda y se produce

en todos los rganos de la planta.

o Marchitamiento. Las plantas pierden su turgencia.

o Roya. Lesiones pequeas de coloracin amarillenta o rojiza que aparecen

sobre las hojas o tallos de las plantas.

o

Mildi. Zonas necrticas que por lo comn se cubren con el micelio y los

cuerpos fructferos del hongo.

II.

VIRUS FITOPATGENOS

Los virus no tienen rganos reproductivos, sino que utilizan a las plantas que

infectan para replicarse. Los virus tienen una estructura sencilla compuesta

nicamente de cido nuclico (ADN o ARN) y una capa proteica, y son tan

pequeos que no pueden ser vistos utilizando microscopios convencionales.

Las caractersticas ms importantes de los virus son las siguientes:


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Los virus son tan pequeos que se necesitan tcnicas especiales

para su deteccin.

Para el diagnstico de los virus se necesitan mtodos de anlisis de

laboratorio de mayor sensibilidad (anlisis ELISA, PCR y de inoculacin

de plantas sensibles a determinados virus) que los utilizados con otros

tito patgenos como bacterias y hongos.

Los virus pueden ser de transmisin mecnica o necesitar vectores

para su diseminacin y transmisin.

Los virus no pueden moverse y/o penetrar tejido de una planta por s

solos, por lo que necesitan de un vector que los transporte o disemine.

Los insectos son los vectores de virus ms importantes y, entre ellos,los fidos son responsables de la transmisin de alrededor del 60% de

todos los virus de plantas transmitidos por insectos.

Los virus pueden ser de transmisin mecnica o necesitar vectores

para su diseminacin y transmisin.

Los virus no pueden moverse y/o penetrar tejido de una planta por s

solos, por lo que necesitan de un vector que los transporte o disemine.

Los insectos son los vectores de virus ms importantes y, entre ellos,los fidos son responsables de la transmisin de alrededor del 60% de

todos los virus de plantas transmitidos por insectos. Los animales y el

hombre transmiten virus mecnicamente (por contacto y uso de

herramientas). El material vegetativo obtenido de plantas enfermas

(esquejes, injertos, cormos, rizomas) y utilizados para reproduccin de

plantas es un medio muy comn y efectivo para la transmisin de virus.

Los virus son parsitos obligados.

Para multiplicarse o sobrevivir necesitan de un hospedero vivo. Los

virus que necesitan de un vector sobreviven nicamente en plantas

infectadas o en sus respectivos vectores mientras stos vivan o

permanezcan infectados (mosca blanca o thrips), pero no pueden

sobrevivir en material vegetal muerto. Esto implica que la eliminacin

de plantas con virus de transmisin por vector dentro de una

plantacin no necesita de arreglos especiales como el uso dedesinfectantes, la quema o entierro de plantas virticas.


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En contraste, los virus de transmisin mecnica son muy estables y

pueden sobrevivir, aunque sin reproducirse, fuera de un ser vivo, como

en el suelo, en material vegetal en descomposicin, herramientas,

cigarrillos, cabuya y estacas durante mucho tiempo. Por ello, debe

disponerse de las plantas virticas apropiadamente y desinfectar a los

operarios que trabajan en la plantacin. Los virus de transmisin

mecnica (Tobamovirus} son especficos de las solanceas (tomate,

chile, papa, tabaco, berenjena}.

Los sntomas causados por virus son de tipo sistmico.

Es decir se presentan en todos los brotes, en contraste con la mayora

de sntomas causados por otros fitopatgenos que suelen serlocalizados. El caro blanco causa sntomas muy parecidos a aquellos

causados por virus en chile y en otras solanceas, pero su dao raras

veces afecta todos los brotels. Adicionalmente, una vez controlado el

caro, el crecimiento de los brotes vuelve a ser normal, no as en la

virosis.

Los virus causan enfermedades que no pueden curarse y causan

prdida en rendimiento.A diferencia de la mayora de las enfermedades causadas por otros

fitopatgenos, toxicidad por qumicos, daos de caros, nematodos,

insectos y deficiencias nutricionales, las plantas infectadas por virus

tienen reducciones en rendimiento y sntomas que no pueden revertirse

(no pueden curarse). Al no tener alternativas curativas para el control

de virus, es necesario manejar los virus de manera preventiva. Las

reducciones en rendimiento pueden ser muy severas si la infeccin

ocurre a temprana edad de la planta (antes de fructificacin).

Los virus son especficos.

Suelen atacar plantas con caractersticas similares: hojas anchas

anuales o herbceas, hojas angostas o zacates, plantas perennes, pero

rara vez un virus es capaz de atacar ms de un grupo de plantas. Para

utilidad prctica, esto implica que los virus que atacan cultivos de

importancia econmica, como tomate, chile, meln, sanda, puedenocurrir 13n plantas solanceas o cucurbitceas, en otras herbceas


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nutrientes, acumulacin de desechos metablicos y otros factores

limitantes. Las bacterias se diferencian de los hongos por no ser

capaces de penetrar directamente tejidos de las plantas, sino que

necesitan de heridas provocadas por insectos, pjaros, nematodos y

por los Foto 53. Fisin binaria. Humanos durante prcticas

culturales como el trasplante, poda, etc. Las aberturas naturales de

las plantas tambin son puerta de entradas aprovechadas por las

bacterias.

Sobrevivencia de las bacterias

La mayora de las bacterias fitopatgenas se desarrollan dentro de

sus plantas hospederas, en la superficie de las plantas, en rastrojosde y en el suelo. En el suelo, las bacterias viven preferiblemente en

material vegetal y con menor frecuencia libre o saprofticamente. Las

bacterias pueden tambin sobrevivir dentro o sobre semillas o en

insectos encontrados en el suelo.

Sntomas mostrados por las plantas atacadas por bacterias.

Las bacterias fitopatgenas tienden a atacar follaje y frutos (por

ejemplo mancha y peca bacteriana en solanceas como chile) o a ser

problema en races (por ejemplo Ralstonia en tomate). A diferenciade los hongos, producen lesiones (manchas, pecas, podlredumbres

hmedas que despiden un mal olor, ch8incros, moteados, roas y

costras), pero nunca presentan micelios y son predominantes

nicamente bajo condiciones de alta humedad relativa o

encharcamiento del suelo. Adicionalmente, con condiciones

favorables (alta humedad relativa o encharcamiento), el avance de

las enfermedades causadas por bacterias puede ser sumamente

rpido debido a su extremadamente rpida multiplicacin

(minutos). Por esa misma razn, el uso de antibiticos para su

control debe tener una frecuencia de aplicacin ms corta (no mayor

a 4 das) que la normalmente acostumbrada para fungicidas o

insecticidas (alrededor de 7 das).


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Fitoplasmas

Las enfermedades causadas por fitoplasmas son relativamente

nuevas y poco conocidas. El caso ms conocido y econmicamente

importante de este tipo de enfermedad en Honduras ha sido el

amarillamiento letal del coco, que termin con la poblacin de

cocoteros de toda la zona de la costa Atlntica. Otros casos recientes

es el del madreado en todo el pas, el de maracuy en la zona

occidental del pas, y el de cundeamor y otros vegetales orientales

en el valle de Comayagua. Los fitoplasmas son bacterias modificadas

que carecen de pared celular y que estn generalmente presentes en

el floema. Los fitoplasmas son diseminados por insectos chupadores

de la familia Cicadelidae que actan como vectores. Su reproduccin

en medios artificiales no es posible, lo que ha hecho de su estudio

lento y difcil.

Los insectos vectores pueden adquirir el patgeno despus de

alimentarse en plantas infectadas por tiempo prolongado (das). Elvector no puede transmitir al fitoplasma inmediatamente despus


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de su contagio, sino que empieza a transmitirlo despus de un

perodo de incubacin que puede durar das. Se cree que los vectores

permanecen infectados de por vida y que la infeccin puede pasar

por medio de la madre a la siguiente generacin mediante la

infeccin de los huevos. La transmisin mecnica y por semilla

parece probable pero an no se ha probado de manera consistente

en todos los casos. Los fitoplasmas causan sntomas, en algunos

casos, parecidos a aquellos causados por virus (amarillamiento)

pero se distinguen de los virus por causar consistentemente

sobrebrotamiento y floracin anormal (flores deformes y de color

verde). Las plantas infectadas no presentan sntomas sistmicos,

sino localizados, es decir, slo en algunas ramas.

Nematodos fitopatgenos

Los nematodos son muy parecidos a los gusanos; sin embargo, su

tamao microscpico, sus hbitos alimenticios, su reproduccin y

modo de vida, los diferencia grandemente.

Caractersticas generales de los nematodos:

o Son organismos pluricelulares .

o

No presentan segmentacin, aunque algunas especies loaparenten.


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o No presentan sistema circulatorio ni respiratorio.

o Poseen sexo bien diferenciado, especialmente en hembras.

o Poseen estilete.

Sobrevivencia y reproduccin de los nematodos fitopatgenos:

Generalmente, las hembras adultas depositan al menos 500 huevos

unicelulares envueltos en una sustancia gelatinosa y las larvas que

nacen buscan alimento inmediatamente. Los nematodos se mueven

lentamente a travs de los espacios que se forman entre las

partculas del suelo, aprovechando la humedad del mismo para

desplazarse mediante movimientos ondulantes. Los nematodos se

mueven lentamente en el suelo, de unos pocos centmetros a un

metro por temporada. Sin embargo, pueden moverse a travs de

cualquier medio que mueva suelo, tales como maquinarias,

animales, herramientas agrcolas, adems del agua de riego, lluvia

y escorrentas. El exceso de humedad reduce el contenido de oxgeno

y los nematodos pueden morir por asfixia. La falta de humedad en

el suelo evita que los nematodos se desplacen para buscar alimento,

pudiendo stos morir de hambre. Esta es una de las principales

causas de reduccin de las poblaciones.


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5. VAS DE OBTENCIN DE MATERIAL DE PROPAGACIN LIBRE DE

PATGENOS

I.

MICROINJERTO DE APICES CAULINARES IN VITRO

II.

TERMOTERAPIA Y CULTIVO DE MERISTEMAS

III.

QUIMIOTERAPIA Y CULTIVO DE MERISTEMAS

6. ERRADICACION DE AGENTES CONTAMINANTES Y PATOGENOS EN LOS

CULTIVOS IN VITRO

I. ELIMINACIN DE LOS CONTAMINANTES DE LOS EXPLANTES

La mayora de los esfuerzos en este aspecto han estado concentrados en la

prevencin y tratamiento de los contaminantes que son introducidos con los

explantes tomados de las plantas in vivo. Los tres puntos fundamentales hacialos que debe estar dirigido el control y prevencin de los contaminantes son:

A.

Tratamiento a las plantas madres

Las plantas madres deben mantenerse libres de enfermedades por

estrictos mtodos de control biolgico y qumico. El nmero de bacterias y

hongos en el tejido areo de las plantas usadas como explantes debe ser

reducido mediante el mantenimiento de stas lo ms secas posibles en

casa de cristal. El tomar explantes de rganos subterrneos de la planta,

de muy cerca del suelo o de plantas con riego excesivo, reduce la eficiencia

de los subsecuentes procesos de desinfeccin.

Los explantes que usualmente son tomados de tejidos areos jvenes de

las plantas (meristemos, ndulos, botones florales, discos de hojas,

anteras, polen, etc.) estn por lo general libres de poblaciones internas

detectables de viroides, virus, micoplasmas, bacterias y hongos.

B.

Desinfeccin de los explantesLos contaminantes microbianos en la superficie de los explantes son

generalmente eliminados por la inmersin de estos en un amplio espectro

de biocidas tales como: hipoclorito, alcoholes, cloruro de mercurio u otros

productos qumicos con actividad ms selectiva como son los fungicidas,

insecticidas y antibiticos.

La mayora de los biocidas de amplio espectro son no sistmicos, pero los

explantes mueren si se les permite que penetren en sus tejidos internos.

El xito de la desinfeccin utilizando estos compuestos est en que el tejidointerno de la planta est libre de microorganismos contaminantes, sin


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embargo, si este est infestado por hongos, bacterias, micoplasmas, virus

o viroides, estos son inevitablemente transferidos al cultivo de tejidos.

En estudio realizado se ensay un mtodo fsico de separacin de

microorganismos de las clulas y protoplastos mediante un gradiente de

centrifugacin de la sucrosa. Posteriormente se plante que este mtodo

puede ser combinado con diluciones de hipoclorito y/o tratamientos

antibiticos de las clulas antes y despus de la centrifugacin con muy

buenos resultados.

C. Deteccin de contaminantes latentes

Los explantes tomados de las plantas madres deben ser testados para la

presencia de contaminantes latentes en todos los subcultivos al menos seismeses despus de la desinfeccin, y testados para las bacterias

vitropatgenas a intervalos regulares de dos a tres meses. Nuevas

contaminaciones bacterianas son permanentemente introducidas en el

laboratorio.

En la mayora de los laboratorios el test de rutina para bacterias latentes

se lleva a cabo mediante transferencias del material de la planta y/o el uso

de medios de cultivo de tejidos con test de esterilidad bacteriolgica o

medios index. El uso de medios bacteriolgicos tiene la ventaja de que

estos permiten el crecimiento y deteccin de un amplio rango de especies

bacterianas que causan severos daos en el cultivo de tejidos de plantas.

Sin embargo, tienen algunas limitaciones como que las bacterias con

requerimientos nutricionales especiales no crecen en los medios de rutina,

en las etapas 1 y 2 de los index los residuos de desinfectantes pueden

inhibir el crecimiento del material vegetal y con ello prevenir el crecimiento

y deteccin de bacterias, adems, algunas bacterias necesitan estar en un

elevado nmero para que se expresen en el index, los materiales de

algunas plantas pueden excretar sustancias antimicrobianas y la mayora

de los micoplasmas, spiroplasmas y rickettsias no crecen en medios

comunes.

Los micoplasmas, virus y viroides pueden ser detectados solamente

mediante inoculacin de plantas indicadoras y/o con el uso de mtodos

serolgicos, microscpio electrnico o hibridizacin de cidos nucleicos.


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II.

USO DE ANTIBITICOS

En cultivo de tejidos vegetales, los antibiticos solo son empleados cuando los

microorganismos no pueden ser eliminados par otros mtodos. Estos

compuestos son caros y no existe ninguno que ser efectivo para controlar

todos los organismos contaminantes. Antes de decidir utilizar antibiticos se

recomienda eliminar todas las posibles fuentes de contaminacin (Reed and

Tanprasert, 1995).

Las siguientes combinaciones de antibiticos se han aplicado con xito en

cultivo de tejidos de plantas:

Cefotaxima

Gentamicina

Rifampicina Nistaina + Carbenecilina

Gentamicina + Amfotericina B

Vancomicina HCl + Micostatina

Estreptomicina + Carbenecilina

En algunos cultivos se ha encontrado fitotoxicidad causada por:

Penicilina

Estreptomicina Bactericina

Esparsomicina

III.

PREVENCION Y TRATAMIENTO DE LA CONTAMINACION EN EL

LABORATORIO.

En el cultivo de tejidos de plantas comercial, la prevencin y tratamiento de

la contaminacin ha conducido a la implementacin de sistemas detallados

de control de la produccin microbiolgica en un intento de prevenir la

contaminacin mediante el monitoreo y control de todas las posibles fuentes

de contaminantes.

Los parmetros probados y los mtodos microbiolgicos utilizados son

similares a los empleados en otras industrias que elaboran productos

aspticos o libres de contaminacin, esto incluye:

El monitoreo de diferentes fuentes de contaminacin mediante el

testaje regular del aire del laboratorio, la esterilidad del medio

preparado y el funcionamiento de autoclaves, flujos laminares e


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instrumentales, adems, la determinacin de tasas de contaminacin

por lnea vegetal individual y operadores y por ltimo, la identificacin

de organismos indicadores.

El medio de cultivo puede contaminarse a causa de una insuficiente

esterilizacin y/o durante la manipulacin despus del autoclaveo.

Esto puede evitarse garantizando que cada ciclo de autoclaveo se lleve

a cabo con la temperatura adecuada.

Las levadurasy los hongos introducidos durante las manipulaciones

del medio de cultivo generalmente crecen en forma de colonias visibles

despus de una o dos semanas de incubacin a temperatura ambiente,

y el medio puede haber sido descartado antes de introducir las plantas

si se observaron aparentes colonias, sin embargo, los medios songeneralmente utilizados antes de que este crecimiento se haga visible

y/o son ubicados en locales fros donde las tasas de crecimiento

fungoso son limitadas.

La deteccin de las bacterias introducidas durante la preparacin del

medio es ms difcil de acuerdo a lo que se ha explicado en epgrafes

anteriores, aunque, el medio puede ser testado por adicin de

nutrientes extras en forma de caldo nutriente o caldo triptona-soya

despus de ser vertido. Esto permite el crecimiento bacterial y ladeteccin visible de colonias de microorganismos en el medio.

La adicin de reguladores del crecimiento sensitivos al calor mediante

la esterilizacin del filtro despus del autoclaveo, permiten que el medio

sea autoclaveado por ms tiempo. El xito de la esterilizacin de los

ciclos individuales de autoclaves puede ser monitoreado por la cinta

para autoclave u otros indicadores fsicos de temperatura o mediante

mtodos biolgicos ms precisos que son basados en la sobrevivencia

de esporas de Bacillus.

Como se describi anteriormente para el subcultivo del material vegetal, la

contaminacin durante el servido manual del medio puede ser evitada

mediante el entrenamiento de los operadores en tcnicas aspticas,

conjuntamente con la evaluacin de los medios servidos en busca de la

presencia de contaminantes.

Los sistemas de dosificacin de medios mecanizados y semimecanizadosusualmente resultan en ninguna contaminacin o en menor tasa de


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contaminantes que cuando esta operacin se hace manualmente, pero

costosos y necesitan mantenimiento peridico.

Existe poca informacin sobre el nmero y tipos de organismos que son

introducidos durante el subcultivo del material de las cabinas de flujo

laminar, pero las tasas en que los mismos aparecen estn en dependencia de

las tcnicas de asepsia y del equipamiento usado, adems, en esto influye

tambin el operador y si las plantas fueron subcultivadas hacia el frente del

flujo laminar.

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cultivo in vitro en la erradicacion de patogenos

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