CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS, MÉTODO DE BIURET.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas

constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los

procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de

moléculas (Berg et al, 2008).

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica

de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína

concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación

enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros

propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos

de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para

absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la

capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes (Segal, 2005).

La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de

un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de un

enlace peptidico, como las proteinas (Cambell et al, 2006):

Figura 1: Reacción de Biuret.

La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la

concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de

elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en

principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los

enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración).

Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se

produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática

que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema

y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene

la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede

cuantificarse y, empleando la curva patrón, se puede interpolar el dato de la

muestra problema hasta encontrar la concentración (Harris, 2003)

OBJETIVO GENERAL

Aplicar un método colorimétrico para determinar la concentración de proteína en

una muestra problema.

OBJETIVOS PARTICULARES

- Aprender el manejo del espectrofotómetro y su aplicación en los métodos

colorimétricos.

- Aprender el empleo de una curva patrón para la determinación de la

cantidad de moléculas presentes en una muestra, en este caso de

proteínas.

- Determinar la concentración de proteínas en una muestra de leche,

utilizando el método de Biuret.

HIPÓTESIS

Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada con el reactivo de

Biuret ésta será proporcional a la concentración de proteína de dicha muestra.

MATERIAL Y MÉTODO

Primero, se dispuso a tomar la caseína y macerar con ayuda de un mortero con

pistilo, después se peso para ocupar 0.1g para una solución de 1:10, al no

disolverse bien se le agregaron gotas de hidróxido de sodio hasta llegar a la

homogenación deseada, también se realizo la solución de leche 0.05ml para una

solución 1:20 y se disolvieron en agua; Al mismo tiempo se calentaba agua hasta

llegar a una temperatura de 500C a 550C.

A continuación, se separaron 24 tubos de ensaye en dos grupos de 12 “A y B” los

seis primeros se utilizaron para obtener la curva patrón y los otros seis para

obtener la curva problema esto en los dos grupos, el tubo 1 se ocupó como

blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al 5 0.8ml, al 6 1.0ml de albumina

sérica bovina (BSA) con concentración de 10 mg/ml, respectivamente.

En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de caseína, el 9 con 0.25ml y el

10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con 0.25 ml y el 12 con 0.5ml de leche

diluida, (todo esto obtenido en la práctica anterior); a todos los tubos se les agrego

Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente cantidad de 2.9ml al 2, 2.8ml al 3, 2.6ml al

4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6. Para tener una solución de 3ml y reactivo de Biuret con la

misma cantidad de 3 ml, así logramos una solución de 6ml, se homogenizo la

solución por medio de un agitado tipo vortex. (Solamente al tubo 1 se le agregaron

3 ml de reactivo de biuret y 3 ml de NaCl)

Después de tener todos los tubos con la solución se colocaron en un vaso de

precipitados de 1000 ml con agua caliente y se dejaron durante 10 minutos

aproximadamente (hasta lograr tonalidades de azul cielo a violeta), al termino del

tiempo se colocaron en agua a temperatura ambiente, hasta lograr que se enfriara

la solución.

Posteriormente se realizo la cuantificación de la solución por medio de un

espectrofotómetro a 540 nm de los tubos A y B, entre cada medición se lavaban

las celdas; al tener todas las mediciones se dispuso a realizar la curva obtenida.

RESULTADOS

Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotómetro a 540 nm para

cada una de las 12 soluciones se muestran a continuación (solamente se

muestran los tubos A y no los duplicados):

Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.

Tubo No. Solución * Proteína (mg)Absorbancia

a 540 nm1 3 ml NaCl, 0 Blanco2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 0.0343 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 0.0714 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 0.1425 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 0.2776 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 0.3457 0.25 ml caseína y 2.75 ml NaCl ¿? 0.0798 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl ¿? 0.1989 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl ¿? 0.22110 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl ¿? 0.24011 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl ¿? 0.04412 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl ¿? 0.068

*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.

Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se realizó la gráfica 1, de la

curva patrón de proteína, obtenida por el método de regresión lineal de mínimos

cuadrados; donde las abscisas (x) representan la concentración en mg de

proteína, y las ordenadas (y) los valores de la absorbancia de cada concentración.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-5.55111512312578E-17

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35f(x) = 0.0344166666666667 x + 0.00171666666666664R² = 0.999825790017651

Proteina (mg)

Ab

so

rba

nc

ia a

54

0 n

m

Figura 2: Curva patrón de proteína.

La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema, tubos siete

a doce, se obtuvo con el valor de la absorbancia obtenida por el espectrofotómetro

para cada muestra (tabla 1), mediante la interpolación de estos valores en la curva

patrón (figura 3) y despejado los valores respectivos de x de la ecuación de la

recta (y= mx + b) tal como se muestra a continuación (tabla 2):

Figura 3: interpolación de los valores de absorbancia de las muestras problemas en la curva patrón.

De acuerdo a la figura anterior, la cantidad aproximada de proteína en las

muestras problema, de la siete a la doce, seria: 2.35, 5.7, 6.2, 6.9, 1.05 y 1.9 mg,

respectivamente.

La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema despejando

los valores de “x” de la ecuación de la recta (y = 0.0344X +0.0017) quedaría:

x= y−0.00170.0344

Tabla 2: determinación de la cantidad de proteína utilizandola ecuación de recta.

Tubo No. Absorbancia (y) a 540 nm Proteína (mg)7 0.079 2.2188 0.198 5.7069 0.221 6.375

10 0.240 6.92711 0.044 1.22912 0.068 1.927

Tomando en cuenta los factores de disolución, por cada mililitro de muestra se

obtiene la siguiente tabla:

Tabla 3: Concentración de proteína en las muestras problema.

Tubo No. Proteína (mg) Factor de disolución Proteína (mg/ml)7 2.218 4x100 887.28 5.706 2x100 1141.29 6.375 4x10 225

10 6.927 2x10 138.5411 1.229 4x20 98.3212 1.927 2x20 77.08

A continuación se resumen los resultados finales en la siguiente tabla:

Tabla 4: resultados finales de la concentración de proteína

Tubo No.

Solución *Proteína

(mg)Proteína (mg/ml)

Absorbanciaa 540 nm

1 3 ml NaCl, 0 0 Blanco2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 10 0.0343 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 10 0.0714 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 10 0.1425 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 10 0.2776 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 10 0.3457 0.25 ml caseína y 2.75 ml NaCl 2.218 887.2 0.0798 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl 5.706 1141.2 0.1989 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl 6.375 225 0.22110 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl 6.927 138.54 0.24011 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl 1.229 98.32 0.04412 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl 1.927 77.08 0.068

*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.

DISCUSIÓN

De acuerdo a los resultados finales (tabla 4) obtenidos en la determinación de la

concentración de proteína en las muestras de caseína, sobrenadante y leche

diluida, que aunque no son los esperados, pues, la concentración de proteínas

tendría que ser mayor en la leche diluida que en el sobrenadante y los valores de

la concentración de cada muestra problema iguales entre sí, no se descarta este

método de cuantificación de proteínas, pero es recomendable utilizar los

materiales de laboratorio correctos para hacer las diluciones y ser precisos, mas

aun exactos, en la medición de volúmenes.

El sobrenadante consiste en una suspensión a la cual se le ha eliminado la mayor

cantidad de proteínas contenidas en la leche, por lo que su concentración de

proteína tendría que ser mejor que el de la leche pura.

CONCLUSIÓN

Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración

de proteína en una o varias muestras problema, que resultan al interpolar los

valores de absorbancia en una curva patrón originada a partir de concentración de

proteína conocida.

BIBLIOGRAFÍA

Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.

Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial publidisia. Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006) Bioquímica ilustrada: bioquímica y biología molecular en la era posgenómica. Masson, España.

Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman.

ANEXO (CUESTIONARIO)1.- describa que es el espectrofotómetro y para que sirve.

Sirve para calcular las concentraciones de las distintas sustancias en función de la

absorción del color. Técnicas de bioquímica y biología moleculas.freifelder

David. Editorial reverte.2003

2.- mencione que es un espectro de absorción y las diferentes longitudes de onda

del espectro.

La espectroscopia de absorción es la medida de la cantidad de luz absorbida por

un compuesto en función de la longitud de onda de la luz. En general, se irradia

una muestra con una fuente de luz y se mide la cantidad de luz transmitida a

varias longitudes de onda, utilizando un detector y registrando el fenómeno en una

grafica. Técnicas de bioquímica y biología moleculas.freifelder David.

Editorial reverte.2003

3.- defina con sus propias palabras que es una curva patrón.

Son las medidas conocidas en orden ascendente que sirven de guía para ajustar

una solución problema.

4.- cuales son las ventajas y las desventajas, de emplear los reactivos de biuret

para cuantificar proteínas explique.

Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es que es bastante específico para

proteínas, muestra pocas interferencias y es barato. Y la desventaja es que es

poco sensible.

5.- mencione cual es la razón de que en el método de biuret la absorbancia de una

proteína se lea a una longitud de 540 nm.

El color violeta característico se presenta a esa longitud la cual se da por

la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno.

El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para

formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace

coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos

de oxigeno y de nitrógeno del péptido. Técnicas de bioquímica y biología

moleculas.freifelder David. Editorial reverte.2003

6.- explique si una curva patrón puede ser empleada para cuantificar

sustancias diferentes a las proteínas y cual seria la diferencia con estas.

7.- ¿Cuál es la finalidad de utilizar un tubo como blanco? Mencione si

siempre se utiliza agua como blanco.

Tomar la medida de la cual parte la curva patrón, no siempre se utiliza

agua como blanco, si no una mezcla concentrada de la sustancia con la

cual se esta trabajando. Técnicas de bioquímica y biología

moleculas.freifelder David. Editorial reverte.2003

8.-realice una curva patrón con los datos de absorbancia y proteína

obtenidos en una determinación hipotética:

Se realizo una solución estándar de albúmina (10mg/ml).

Los valores de absorbancia referidos se determinaron por duplicado.

9.-con los datos obtenidos en el ejemplo anterior, determina la ecuación

de la recta que representa la curva patrón.

10.- basándose en la curva patrón y la ecuación de la línea recta,

determine la cantidad de proteína en MG/ml de las siguientes muestras,

cuyos valores de absorbancia se indican

11.- elabore una lista de 5 compuestos que se podrían cuantificar

empleando una curva patrón, y menciona que importancia tiene

determinar la cantidad de dichos compuestos.

a) inmunoglobulinas. Mal funcionamiento inmunológico

b) hemoglobina. Una concentración baja produce anemia.

c) insulina. Una concentración baja produce diabetes.

d) fibrilinas. La falta de esta produce deformación en los huesos.

e) seroalbumina. Su falta produce deformaciones.

Bioquimica.berg Jeremy.editorial reverte.2008