cromatografía 7° congreso internacional de quÍmicos farmacobiÓlogos y xxii jornadas cientÍficas
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Cromatografía
7° CONGRESO INTERNACIONAL DE QUÍMICOS FARMACOBIÓLOGOS Y
XXII JORNADAS CIENTÍFICAS
Definición
• Técnica analítica de separación de componentes químicos de una mezcla a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados por una fase móvil a través de una fase fija o estacionaria.
Clasificación
• Columna– FE, contenida en
tubo estrecho
– FM, se fuerza el paso de la fase móvil a través de la fase estacionaria
• Plana– FE, contenida sobre
una superficie plana o en los poros de una papel
– FM, se desplaza por capilaridad o por efecto de la gravedad
Cromatografía en columna
• Se lleva a cabo en tubos de diámetro variado (1cm – 30cm), aunque se puede hacer columnas mucho más amplias o bien reducirlas hasta mm
• La columna es empaquetada con un sólido finamente dividido y éste debe ser inerte al tubo y a la muestra (no siempre)
• Se llevan a cabo equilibrios entre la cantidad de soluto contenido en FM y en FE.
FM-S FE-S
• La capacidad de cada soluto de permanecer en la FM es la que determina el orden de elución de los analitos.
Tipos de cromatografÍa en
columna• Se tienen varios tipos de cromatografía en
columna, los más representativos son:
– Partición– Afinidad– Intercambio iónico– Filtración en gel
CROMATOGRAMA
Where:tR = retention timetM = void timeWb = baseline width of the peak in time unitsWh = half-height width of the peak in time units
Wh
Wb
Inject
Tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm
Volumen de retención ajustado = V’r = Vr - Vm
Cromatograma
SEÑAL
ANALÍTICA
tM =tiempo muerto
tR = tiempo de retención
Tiempo
Volumen
La separación depende de dos factores
Peak width & peak positiondetermine separation of peaks
VELOCIDAD DE ELUCIÓN
FACTOR DE RETENCIÓN
k’ = (tR –tM)/tM
o k’ = (VR –
VM)/VM
Factores de separación
POR DEFINICIÓN
k’ Está directamente ligado a la interacción entre un soluto con la fase eStacionaria
k’ =
moles Astationary phase
moles Amobile phase
Si k‘ es <1.0, la separación es mala
Si k‘ es >30.0, la separación es lenta
When 2<k‘<10 la separación es buena
Wh
EFICIENCIA
ESTA RELACIONADA EXPERIMENTALMENTE AL ANCHO DE PICO- Picos delgados son mejores
TEORICAMENTE ESTA RELACIONADA AL PROCESO CINÉTICO DE TRANSPORTE DE LOS SOLUTOS EN LA COLUMNA
Wb = 4s
Wh = 2.354s
Dependent on the amount of time that a solute spends in the column (k’ or tR)
NOS SIRVE PARA ESTIMAR LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA O SEPARACIÓN
N = (tR/s)2
O TOMANDO EN CUENTA QUE LOS PICOS SON GAUSSIANOS
N = 16 (tR/Wb)2
N = 5.54 (tR/Wh)2
• Entre más grande sea, se considerá que la columna es capaz de separar un par de compuestos cercanos
• Mejores separaciones en pequeñas diferencias de retención
• N es dependiente del largo de la columna
PLATOS TEÓRICOS
Compara la eficiencia de separación entre columnas de diferentes longitudes
H = L/N
where: L = Longitud de la columna N = Número de platos teóricos
H can be also used to relate various chromatographic parameters (e.g., flow rate, particle size, etc.) to the kinetic processes that give rise to peak broadening:
Why Do Bands Spread?a. Eddy diffusionb. Mobile phase mass transferc. Stagnant mobile phase mass transferd. Stationary phase mass transfere. Longitudinal diffusion
Altura equivalente de plato teóricoAEPT=H
a.) Eddy diffusion – a process that leads to peak (band) broadening due to the presence of multiple flow paths through a packed column.
As solute molecules travel through the column, some arrive at the end sooner then others simply due to the different path traveled around the support particles in the column that result in different travel distances.
Longer path arrives at end of column after (1).
A solute in the center of the channel moves more quickly than solute at the edges, it will tend to reach the end of the channel first leading to band-broadening
The degree of band-broadening due to eddy diffusion and mobile phase mass transfer depends mainly on:
1) the size of the packing material2) the diffusion rate of the solute
b.) Mobile phase mass transfer – a process of peak broadening caused by the presence of different flow profile within channels or between particles of the support in the column.
c.) Stagnant mobile phase mass transfer – band-broadening due to differences in the rate of diffusion of the solute molecules between the
mobile phase outside the pores of the support (flowing mobile phase) to the mobile phase within the pores of the support (stagnant mobile phase).
Since a solute does not travel down the column when it is in the stagnant mobile phase, it spends a longer time in the column than solute that remains in the flowing mobile phase.
The degree of band-broadening due to stagnant mobile phase mass transfer depends on:
1) the size, shape and pore structure of the packing material2) the diffusion and retention of the solute3) the flow-rate of the solute through the column
d.) Stationary phase mass transfer – band-broadening due to the movement of solute between the stagnant phase and the stationary phase.
Since different solute molecules spend different lengths of time in the stationary phase, they also spend different amounts of time on the column, giving rise to band-broadening.
The degree of band-broadening due to stationary phase mass transfer depends on:
1) the retention and diffusion of the solute2) the flow-rate of the solute through the column3) the kinetics of interaction between the solute and the stationary phase
e.) Longitudinal diffusion – band-broadening due to the diffusion of the solute along the length of the column in the flowing mobile phase.
The degree of band-broadening due to longitudinal diffusion depends on:
1) the diffusion of the solute2) the flow-rate of the solute through the column
Van Deemter equation: relates flow-rate or linear velocity to H: H = A + B/m + Cm
where:
m = linear velocity (flow-rate x Vm/L)H = total plate height of the columnA = constant representing eddy diffusion & mobile phase mass transferB = constant representing longitudinal
diffusionC = constant representing stagnant mobile
phase & stationary phase mass transfer
One use of plate height (H) is to relate these kinetic process to band broadening to a parameter of the chromatographic system (e.g., flow-rate).
This relationship is used to predict what the resulting effect would be of varying this parameter on the overall efficiency of the chromatographic system.
Number of theoretical plates(N) (N) = 5.54 (tR/Wh)2peak width (Wh)
H = L/N
m optimum
Plot of van Deemter equation shows how H changes with the linear velocity (flow-rate) of the mobile phase
Optimum linear velocity (mopt) - where H has a minimum value and the point of maximum column efficiency:
mopt = rB/C
mopt is easy to achieve for gas chromatography, but is usually too small for liquid chromatography requiring flow-rates higher than optimal to separate compounds
Factor de Separación o Selectividad Parámetro usado para describir si dos compuestos se separan bien en un sistema cromatográfico.
a = k’2/k’1 k’ = (tR –tM)/tM
donde:k’1 = the capacity factor of the first
solutek’2 = the capacity factor of the second
solute, with k’2 >k’1
Un valor de k´1.1 indica que hay una buena separaciónDoes not consider the effect of column efficiency or peak widths, only retention.
MEDICIÓN DE LA SEPARACIÓN DE SOLUTOS
La retención relativa indica si los picos están separadospero no si están resueltos.
t't'
relativaRetención r1
r2
tm
MEDICIÓN DE LA SEPARACIÓN DE SOLUTOS
Resolución Es el párametro más comun usado para definir si dos compuestos se separan bien en un sistema cromatográfico.
Señ
al2
tiempo
Resolución = 0.5
Señ
al3
tiempo
Resolución = 0.75
Señ
al
4
6
Señ
al
tiempo
tiempo
Resolución = 1.0
Resolución = 1.5
Ejemplos de Fase Reversa
Selección de columnas cromatográficas y sus
aplicaciones.
Dr. Victor Hugo Abrego Reyes
Cromatografía
Definición
• Técnica analítica de separación de componentes químicos de una mezcla a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados por una fase móvil a través de una fase fija o estacionaria.
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La capacidad de cada soluto de permanecer en la FM es la que determina el orden de elución de los analitos
Cromatografía en columna
• Se lleva a cabo en tubos de diámetro variado (1cm – 30cm), aunque se puede hacer columnas mucho más amplias.
• La columna es empaquetada con un sólido finamente dividido y éste debe ser inerte al tubo y a la muestra (no siempre)
Cromatografía de Líquidos de Alto desempeño HPLC
• Tipos
– Cromatografía de reparto
• Normal o Reversa
– Adsorción
– Exclusión (GPC, GFC)
– Interacción hidrofóbica
– Interacción Hidrofílica
– Iónica
– Quiral
Algunos tipos de analitos
Fases
COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS
Tipos de columnas
• Fase Normal• Fase Reversa (C18, C8, Fenilo)
COLUMNAS BASE SÍLICE•Fases antes mencionadas•Largos variables
–1.0 – 30 cm o más
•Presiones máximas 5000-6000psi
•D partícula 3, 5 y 10um
• pH de trabajo 3-10
• T limite a pH bajo 60°C
• T límite a pH alto 40°C
• D poro 135 A
• Volumen de inyección 5 -10 uL
Columnas Poliméricas
Mayor resistencia a la presiónAltas temperaturasMejores platos teoricosAumento en resolución Menor gasto de disolventeMayor rapidezMenos costo
(1) Polystylene (Styrene divinylbenzene copolymer)(2) Polymethacrylate(3) Polyhydroxymethacrylate(4) Polyvinyl alcohol
Polímero v/s Gel de Sílice
GRUPOS DE MUESTRASToma de decisiones
Grupos de Muestras
Grupo A
Grupo C
Grupo B
Grupo D
Baja Polaridad Alta
Baj
o
P
.M.
A
lto
Exclusión por tamaño
(Solvente Orgánico)
Exclusión por tamaño
(Acuoso)
Grupos de Muestras
Grupo A
Grupo C
Grupo B
Grupo D
Baja Polaridad Alta
Baj
o
P
.M.
A
lto
Fase Normal
Intercambio iónico
Exclusión de ión
Fase Normal
Grupos de Muestras
Grupo A
Grupo C
Grupo B
Grupo D
Baja Polaridad Alta
Baj
o
P
.M.
A
lto
Intercambio iónico
Grupos de Muestras
Grupo A
Grupo C
Grupo B
Grupo D
Baja Polaridad Alta
Baj
o
P
.M.
A
lto
Fase reversa
ELECCIÓN DE COLUMNAS. Ejemplos
Grupos de Muestras• PM > 2000 Baja Polaridad
– Resinas epoxicas, Policarbonatos.
• SEPARACIÓN EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS – GPC: Columnas SHODEX series K, KD, KF, SB, HFIP, GF-HQ,
Exclusión por tamaño
(Solvente Orgánico)
Exclusión por Tamaños
Fase Móvil: THF, DMF, Cloroformo, Tolueno, etc.
Se necesitaa al menos 0% de diferencia en el PM.
Alto PM/Baja polaridad
Alto PM/Baja polaridad
Grupos de Muestras• PM > 2000 Ata Polaridad
– Polisacaridos, proteínas, polímeros en agua.
• SEPARACIÓN EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS – GFC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak– IEC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak
Exclusión
por tamaño
Intercambio iónico
Alto PM/Alta polaridad
Alto PM/Alta polaridad
Intercambio iónico (Aniones)
Alto PM/Alta polaridad (carga -)
Alto PM/Alta polaridad (carga +)
Alto PM/Alta polaridad (carga +)
Grupos de Muestras• PM < 2000 Baja o media Polaridad
– Ácidos Grasos, vitaminas liposolubles.
• SEPARACIÓN Fase Normal / Fase Reversa – NPC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak– RPC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak
Exclusión por tamaño
Fase Normal Fase Reversa
Fase reversa
Separación Fase Normal (NPC)
PM bajo/ baja o media polaridad
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Fase Reversa (RPC)
SOLVOPHOBIC THEORY
PM bajo/ baja o media polaridad
Analgésicos Locales
PM bajo/ baja o media polaridad
Antibióticos
PM bajo/ baja o media polaridad
Anticonvulsivos
PM bajo/ baja o media polaridad
Análisis de aminas sin el uso de pares iónicos.Columna Polimérica
Grupos de Muestras• PM < 2000 Alta o media Polaridad
– Ácidos orgánicos, iones inorgánicos, sacaridos,
• SEPARACIÓN Fase Normal / Fase Reversa – NPC: Columnas SHODEX series, KW, SB, GS, KS. OH-pak– RPC: Columnas SHODEX series IEC, PIKESS, Asahipak, CXPak– Exclusión iónica series SH, KC
•Exclusión por tamaño.
•HILIC•Intercambio
iónico•Fase Normal •Fase Reversa
Interacción hidrofílica (HILIC)
• Grupos Aminos• Ciano
Separación mediante HILIC
Carácter hidrofóbic
o
Exclusión iónica: Alta o media Polaridad
• Es contraria a la cromatografía de intercambio iónico.
• Repulsión por cargas.
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Análisis de ácidos orgánicos por exclusión iónica
Intercambio de Ligando: Alta o media Polaridad
• Azúcares y compuestos ricos en electrones – “complejación”
con metales unidos a la fase estacionaria.
• Pb y Zn forman complejos muy estables.
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J. Braz. Chem. Soc. vol.13 no.5 São Paulo Sept.Oct. 2002
Mecanismo de selección del ligando
Alta o media Polaridad: Azúcares
Alta o media Polaridad: Azúcares
Serie SUGAR… doble mecanismo de separación
Quiral…
Cromatografía de inmunoafinidad
Inmunoafinidad Aplicaciones
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TroubleshootingSistema y Método
Troubleshooting
• Localizar el problema en “orden” de probabilidades.• Revisar la causa más problale.• Corregir• Saltal a la siguiente probabilidad.
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No hay procedimientos estándar para resolver problemas en HPLC.
Patrón General:
De qué se trata?
MétodoSistema
Troubleshooting
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Método• Velocidad de flujo• Tipo de eluyente• Composición del
eluyente• pH• Volumen de inyección• Temperatura• Perfil del gradiente
Sistema• Estabilidad de flujo• Backpressure• Taponeamiento• Detector• Inyección• Temperatura
Parámetros del sistema
• Verificación preeliminar
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Solvente Degas bomba automuestrador
Columna Detector
Reservorio
lleno
Backpressure Estabilidad de Flujo
Revisar las válvulas
Viales llenos
Revisar conecciones
Conexiones de la columna
LO
Secuencia de Detectores
Volúmenes de inyección
Conexiones críticas
System Suitability
Consejos iniciales.• Celda de detección de 20 ml incompatible con columnas con <3
mm D.I• Loop de muestra de 10 ml incompatible con columnas <1 mm D.I.• micro-inyectores 0.2 ml son inútiles con columnas convencionales
Regla Básica Volumen de inyección < Volumen de ceda
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HPLC System set up
• Minimize the volume and connections between autosampler, column, and detector.
• No guard, no prefilter
90
Tubing & connections
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• Importante recordar que la viscosidad aumenta a su vez la P final aplicada.
92
Back Pressure
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From Pump To Column
SamplingNeedle Metering
Syringe
Automuestreador – Conexiones Columna Bomba
Conexión correctaConexiones equivocadas
From Pump To Column
SamplingNeedle Metering
Syringe
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Sample Diluent Effect
12345
Sample diluent:1- 50/50 MeOH/Water2 - 80/20 MeOH/Water3 - 90/10 MeOH/Water4 - 95/5 MeOH/Water5 - 100 MeOH
La imcompatibilidad de disolventes puede causar precipitación de la muestra y taponamiento
Diferentes valores de pH pueden causar picos defectuosos
Sobrecargado de Columna
95
1 ml
5 ml
96
Chromatographic Conditions Eluent: 90% Aqueous:10% MeCNAqueous: 15 mM K2HPO4•7H2O adj. to
pH 1 - 9 with H3PO4
Flow rate: 1 ml/minTemp: 25oC
Efecto del pH UV-Vis
sspH 5.2-9.2
sspH 3.2
sspH 1.2-2.2
sspH 4.2
Ab
s.
Wavelength (nm)
97
Effect of pH on Aniline Retention and UV response (220 nm)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Det
ecto
r R
esp
onse
(m
V)
wwpH 2
wwpH 4
wwpH 5
wwpH 6
wwpH 9
Time (min.)Chromatographic Conditions Column: 15 cm x 0.46 cm C18 Eluent: 90% Aqueous: 10% MeCN
Aqueous: 15 mM K2HPO4•7H2O adj. to wwpH 1.5 - 9 with H3PO4
Flow rate: 1 ml/min Temp: 25oC
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Equlibrio de la columna
• 30 minutos de eluyente
• Checar la estabilidad de la retención con “estándares probados” inyectando de 3 a 4 veces.
• Proporciones orgánicas y o acuosas muy elevadas en fase móvil requieren estabilizaciones de columna a 1 ml/min.
• Mentira que usar solo agua acaba con las columnas...
99
Gradiente
• Alta presión vs. baja presión de mezclado mixing
J.Dolan, LC-GC V.16 #1, 16
“Method troubleshooting”
• Problemas relacionados a:
100
1. Sistema
2. Columna
3. Muestra
4. Fase móvil
Sistema
• System-to-system compatibility
–Configuraciones diferentes–Volúmenes de permanencia diferentes (conexiones)–Sensibilidades de Detectores (marcas)–Selección exacta de la longitud de onda–Ancho de banda–Factores ambientales
101
Muestra
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Filtrar y sonicar las muestras Causa tipicamente taponamiento
Filter
Centrifuge
Algunas veces puede cambiar composición de las muestras
Viales Portamuestra
Tipos de septas y tapas.
Volúmenes de llenado
Secuencia lógica
• Bomba– Algun patrón reciproco en el cromatograma– Fluctuaciones en la presión– Cambios en la linea base impurezas o contaminación
• Automuestreador– Injection marks (baseline disturbance)– Contaminación cruzada
• Detector– Respuesta (linea base ruidosa, sucia, etc.)– Wavelength (bandwidth, accuracy, etc.)
103
• Cheque siempre la “plomeria” (Bajo flujo, presión, conexiones)
• Evaluación del cromatograma.
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 1 2 3 4 5 6
0.49
0.5
0.51
0.52
0.53
0.54
0.55
0.56
0.57
0.58
0.59
0.6
0 1 2 3 4 5 6
104
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6
1 2 31- flow or detection problem 2 – possible injection problem3 – correct chromatogram
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6
1
Secuencia lógica
Troubleshooting sequence
• Analysis of chromatogram– Compare con
cromatogramas previos– Revise la forma del
cromatograma– Cambios en tiempos de
retención– Elución reversa?
-1
4
9
14
19
24
0 1 2 3 4 5 6
-1
4
9
14
19
24
0 1 2 3 4 5 6
105
-1
4
9
14
19
24
0 1 2 3 4 5 6
-1
4
9
14
19
24
0 1 2 3 4 5 6