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LABORATORIO DE BIOQUlMICA DE LA ESCUELA DE MEDICINA DEL ESTUDIO GENERAL DE NAVARRA

Cromatografía. sobre papel de aminoácidos en

biológicos. Interferencia de proteinas, dectrolitos y ,

azucares

José M.ª Macarulla y Félix Alvarez de la Vega

RESUMEN

Se construye un mapa de la distribución de los aminoácidos en cromato­grafía sobre papel, utilizando como disolventes n-Butanol-Ac. Acético-Agua y Fenal 80°0 , con objeto de facilitar Ja rápida interpretación de los croma­togramas de estas sustancias en líquidos biológicos. Se estudia la interferen­cia teórica y práctica que originan las proteínas, electrólito3 y azúcares y se revisan los métodos recomendados para su eliminación. Finalmente se deta­llan los métodos seguidos en nuestro laboratorio y se discuten Jo; resultados obtenidos con cada uno de ellos. presenl'mdo algunos cromatogramas típicos de los líquidos investigados.

Bases teóricas del proceso.--Los tra­bajos de investigación en el campo de los aminoácidos, desde el fuerte impulso da­do por Emil Fischer habían sufrido un notable dec'.:limiento hasta que en 1944 aparece el primer estudio cualitativo de dichas sustancias en cromatografía sobre papel.

Consden, Gordon y Martín 2, al sustituir la complicada columna de gel de sílice por una simple hoja de papel de filtro, abrieron ho­rizontes más amplios para el conocimiento y determinación de aminoácidos en variados me­dios biológicos y en una amplia gama de con­diciones.

En efecto; estas sustancia;, como todo gru­po homólogo, tienen propiedades químicas y físicas análogas y resultaban difíciles de ais­lar por procedimientos químicos sencillos, ya que suelen presentarse en mezclas muy com­plejas y siempre varios componentes respon-

den de forma similar frente a un agente pre­cipitante , extractor, etc.

La cromatografía sobre papel se considera como una serie de procesos de distribución en­tre fases por Jo que. como en toda operación fraccionada, las pequeñas diferencias entre las propiedades de los componentes quedan nota­blemente multiplicadas. siendo posible su se­paración de la mezcla.

Los estudios teóricos. verificados fundame1h talmente por Martin y Gordon 14. 2, indican que el mecanismo de la cromatografía sobre papel es en esencia un caso particular de la cromatografía de partición entre dos fases lí­quidas. La fase estaciona ria suele ser a cuma y utiliza como soporte la celulosa de las fibras de papel de filtro. Sobre ella se desliza la fase orgánica móvil constituída por un disolvente parcial o totalmente miscible con el agua.

Aplicando al papel los cálculos teóricos de­ducidos para la cromatografía de partición sobre columna. y verificando las sustituciones necesarias se llega a la siguiente fórmula:

•)lit... .:::..vv

AL (X=---­

As Rf -1) (1)

donde rx es el coeficiente de reparto de cada sustancia entre el agua y el disolvente orgá-

Cs nico (rx = --), As es Ja sección de Ja zona

CL

acuosa, AL la sección de la zona orgánica y Rf el cociente entre el desplazamiento de Ja sustancia y el del frente del disolvente.

La zona acuosa se supone fija sobre el pa­pel debido a los eplaces' de puente de H entre las moléculas de celulosa y las de agua, re­tenidas por aquéllá,, al menos en su parte más próxima al papel. La zona orgánica se desliza por gravedad y capilaridad y como lleva una proporción notable de agua va fijando ésta en Ja parte del papel seco avanzando toda la capa. Los solutos a cromatografiar (aminoáci­dos, azúcares, etc.), son, por lo menos, solu­bles en agua y algo en la fase orgánica (fe­nol, butano!, propano!, colidina, etc., acuosos).

Si discutimos la fórmula (1), es fácil adver­tir que si rx crece - siendo rx tanto mayor cuanto crezca la razón de solubilidades a fa­vor del agua - el valor del Rf decrecerá y la substancia se desplazará poco sobre el papel. Inversamente si el soluto es muy soluble en la fase orgánica y poco en agua (a pequeño) el valor del Rf será muy alto.

La fórmula puede aplicarse a los dos casos extremos: !.º) la sustancia es insoluble en la fase orgánica y soluble en agua.

Cs 1 rx = -- = x y enton:es x ; luego

O Rf

Rf = O; la sustancia no se desplaza del ori­gen. 2. 0

) la sustancia es insoluble en agua y soluble en el disolvente orgánico.

o Cl = -- =O;

CL

l ----1=0;

Rf Rf =

La sustancia se desplaza hasta el frente. El cociente AL/As es difícil de medir expe­

rimentalmente, pero se puede deducir, supuesto constante, de Ja fórmula anterior conociendo el coeficiente de reparto de una sustancia y su Rf.

La concordancia de los coeficientes de re­parto calculados según la fórmula y Jos me­didos por England en 1935 es bastante buena­aunq ue el proceso real no parece ser tan fá­cil JO.

En las condiciones ideales cada sustancia se desplaza independientemente de las demás de modo que su Rf es constante y esto ocurre cuando las concentraciones de todas son pe­queñas y no reaccionan químicamente entre sí. De esta manera al cromatografiar mezclas

fl o!. !

de aminoácidos puros el valor del Rf de cual­quiera de ellos es influído muy poco por la presencia de los demás.

Cuando están presentes otras sustancias, en la mezcla que vamos a aplicar sobre el pa­pel, pueden producirse interferencias si afec­tan de alguna manera a Ja validez de Ja fór-

AL mula rx = -­

As

1 ( -- - l ) o a la constan­

Rf

cía de algún término de ella.

1.---Alteración de rx . Puede modificarse Ja solubilidad del aminoácido en agua y en el medio orgánico cambiando notablemente su Rf (las sales tienen este efecto entre otros más importantes: Aumentan Ja solubilidad de los aminoácidos en agua 17). (La temperatura in­fluye también so brc el valor de rx).

2.-Alteración en el volumen y proporción entre las fases (AL/ As). Los so lutos hidrófilos pueden provocar Ja condensación de agua en una zona húmeda próxima al origen que por su gran volumen puede llegar a disolver la to­talidad de los aminoácidos de Rf bajo (glico­cola) o deformar notablemente la mancha y el Rf de otros más altos (valina).

3.-Alteración de la mecánica del proceso y por tanto de la aplicabilidad de la fórmula. Los coloides hidrófilos pueden deslizarse sobre el papel rodeados de una película acuosa alte­rando las propiedades del agua que los imbide y la difusión del disolvente sobre ella de mo­do que los aminoácidos dan manchas despla­zadas y difusas.

4.---C:omplejarniento del aminoácido. Las sa­les de Cu++, Co++, etc., dan manchas alar­gadas y pardas con los aminoácidos debido a formar complejos tipo quelato modificando to­talmente la estructura y propiedades de la mo­lécula original sencilla.

En el cuarto caso, o sea cuando la mezcla tenga sales de metales pesados, deberá proce­derse siempre a su eliminación (precipitándo­los con SH0 o añadiendo 9-hidroxiquinoleina al disolvente cuando se corre el cromatograma. En los otros casos, cantidades pequeñas de sales, azúcares (solutos hidrófilos) o proteínas (coloides hidrófilos) no alteran tan considera­blemente el cromatograma que impidan su in­terpretación. Por lo tanto se puede prescindir de ellos y permitirles acompañar la disolución de aminoácidos. No obstante si las cantidades son notables la interferencia puede ser seria y debe procederse a su eliminación. Para ello los caminos son muy variados y después de una revisión sucinta de los más frecuentes pasaré a anotar los seguidos en nuestro laboratorio hasta el momento.

Las propiedades que debe reunir toda eli-

.Se111/Jre .. 19S1 UW.\LITUGR.\FÍA SOBRE l'Af'EL DE A \Il'\O\Cl!lOS 207

minación son las siguientes: 1. 0 Grado alcan­zado. No es preciso que sea completa. Basta que se suprima la interferencia que la moti­vó. 2. 0 Alteración de la muestra. Los amino­cícidos no deben ser alterados, las pérdidas han de ser mínimas y se ha de evitar las hidrolisis ch: otros péptidos o proteínas si no entraban en el estudio. 3. 0 El método debe ser, en tan­to se pueda, breve, fácil y reproducible.

Métodos de eliminación de y péptidos de peso molecular elevado.­y a hemos citado brevemente las interfe­rencias que provocan los coloides hidró­filos en los cromatogramas de aminoáci­dos. Las proteínas encajan plenamente en este grupo. Se ha visto que el fenol arrastra las proteínas en los cromatogra­mas unidimensionales depositándolas a lo largo de todo el camino dando con la ninhidrina una mancha difusa violácea que enmascara casi todos los aminoácidos. Estos quedan identificados solamente por intensificaciones locales de la coloración.

Si se actúa con butanol-acético-agua las manchas de las proteínas plasmáticas, por ejemplo, son más concretas y múlti­ples. Se pueden llegar a confundir con aminoácidos aunque viajan más lenta­mente y su coloración es más intensa.

Por lo tanto en la cromatografía bidi­mensional las manchas de proteínas se­rán alargadas en el sentido del fenol y separadas en el del butanol.

Así en los cromatogramas de sangre y orina no tratados según el método habi­tual aparece una serie de manchas alar­gadas que se distinguen de las de amino­ácidos por su mayor longitud en la direc­ción del fenol.

Vista la interferencia de las proteínas en la cromatografía debido a su tamaño coloidal y sus propiedades hidrófilas, vea­mos los métodos más comunes de elimi­nación. En resumen, se trata de separar coloides y cristaloides lo cual se conse­guirá: a) precipitando aquéllos en la mezcla; b) extrayendo a éstos del pro­ducto previamente desecado, o c) sim­plemente dializando. Son numerosos los

estudios realizados sobre aminoácidos li­bres en plasma, orina, músculo, células animales, vegetales, zumos de frutas, etc., y entonces interesa evitar cuidadosamen­te cualquier hidrolisis de péptidos duran­te el trabajo para no obtener resultados por exceso. al dar como libres, aminoáci­dos que estaban combinados.

Algo semejante nos ocurrió en unos estudios sobre líquido céfalorraquídeo. Se daba en la literatura una cantidad nota­ble de ácido glutámico libre (superior en ccncentración a cualquier otro amino­ácido). En nuestro laboratorio hicimos la extracción de los aminoácidos con ace­tona clorhídrica (como detallaremos) evi­tando todo calentamiento, y observamos que en la zona correspondiente al glutá­mico sólo había trazas de este aminoáci­do mientras que aparecía una mancha enormemente grande en la zona de la glutamina. Verificada la hidrolisis (hir­viendo la muestra original con ClH 4N) y cromatografiando de nuevo desapare­cía por completo la glutamina y apare­cía una gran mancha en la zona del glu­támico. Esto comprobó las suposiciones de que el trabajo poco cuidadoso era la causa de recoger como glutámico libre lo que en el organismc era glutamina.

l. Precipitación de las proteínas con disolventes orgánicos.

a) Con etanol-cloroformo. - La adi­ción de alcohol a la disolución acuosa de coloides tiene un efecto floculante por deshidratación de las partículas del soluto hidrófilo. Normalmente a este efecto se une la deshidratación producida por el calor de modo que se consigue una pre­cipitación irreversible.

Partridge 1' consigue por este procedi­miento precipitar la mayor parte de las proteínas de la sangre fetal de cordero. Los aminoácidos y azúcares que puedan interesar para el análisis como están en concentraciones pequeñas seguirán disuel­tos en el volumen final.

b) Con etanol numero-

208

sas referencias en la literatura del tra -tamiento de muestras (plasma, orina, zu­mos de frutas, etc.), con la cantidad de alcohol absoluto o de 96%, necesaria pa­ra que la disolución final quede del 75-90%. Las proteínas precipit:in entonces, o al evaporar para reducir el volumen. La separación suele hacerse centrifueando el precipitado o extrayendo los aminoácidos del residuo sólido ccn agm destilada.

Entre otros trabajos es muy represen­tativo el de Walker, Telles y Pastore en líquido ceralorraquídeo 19

. Análogamente Hassall verifica unas extracciones de se­millas vegetales 12 a fin de localizar unos componentes tóxicos en ellas, que se iden­tifican con los polipéptidos: Hipoglicina A y B.

2. Precipitación con ácidos orgánicos. Suelen emplearse como agentes precipi­tantes el ác;do tricloroacético y d sulfo­salicílico.

a) Con tricloroacético.-Henriques y colaboradores 1

' ( 1955) emplean disolu-ciones de ácido tricloroacético al 10% ,para separar aminoácidos, glutatión y péptidos de las proteínas que son preci­pita bles.

b) Son sulfosalicílico. - Bh1ttacha­rya 1 (1955) hace una separación similar de proteínas y aminoácidos de la sangre precipitando las primerns con disolucio­nes de ácido sulfosalicílico al 3 % (peso/ vol.).

Entre los trabajos que siguen este ca­mino de extracción de aminoácidos citaré el de Gordon y Nardi 8 por haber servi­do de base a uno de los métodos segui­dos en nuestro laboratorio.

3. Separación de las proteínas por ultrafiltración. - Ya que las proteínas en concentración apreciable dificultan el desarrollo normal del cromatograma, Dent pensó en separarlas de los elec­trolitos y aminoácidos introduciendo las modificaciones mínimas o sea no aña­diendo reactivos precipitantes o extrac­tivos que pudieran alterar las concen-

Vol!

traciones y estructurns de algunos ami­noácidos. Para ello hace una separación de coloides y crist2Io:des sin precipitar aquéllos' por simple diálisis a presión r,_

Eliminación de efoctrofüo!!. - Al cro­matografiar con fenol y colidina-lutidi­na no es imprescindible la eliminación de electrolitos. En presencia de éstos só­lo aparecen seriamente ddormadas las manchas de los aminoácidos aspártico y glutámico, aunque en general cantida­des notables de estas substancias suelen interferir por crearse zonas húmedas so­bre el papel con el consiguiente despla­zamiento y deformación de algunos ami­noác~dos.

1. Precipitación con reactivo adecua­do.-Si les iones presentes son de un solo tipo fácilmente precipitable se tra­tarán con la disolución del ion que for­me una sal de un producto de solubili­dad mínimo. Así, por ejemplo, de un hidrolizado de proteínas o polisacáridos con SO,H,, puede separarse el ion SO,= del ácido neutralizando con Ba(OH), hasta viraje del rojo de metilo. La di­solución está suficientemente libre de iones para cromatografiar azúcares\ pe­ro las trazas de so,= pueden perturbar algo si se trata de aminoácidos.

2. Separación por electrodiálisis. -La disolución conteniendo aminoácidos y electrolitos salinos puede someterse a una diálisis selectiva aprovechando la carga positiva o negativa de los iones salinos y la carga resultante nula de los aminoácidos por su carácter de iones hí­bridos.

Puesta la disolución en un campo eléc­trico fuerte ( 100-200 voltios) entre elec­trodos situados a 2-3 cm., se consigue separar en un tiempo corto los iones sa­linos que emigran a sus polos qued1ndo las otras sustancias en disolución. El aparato de desalado («de-salting appara­tus>i) fue descrito primeramente por Gor­don 9 y posteriormente modificado por Den t.

195/ CHOll ·ITOCH -IFÍ 1 SOBRE PHEL DE ·\ llL\().\UJJOo 209

3. Extracción de los aminoácidos con acetona clorhídrica. - Si se escoge la acetona con un mínimo de agua, 1,6 ce. de ClH 6N por 100 ce. de disolución, tiene 1a acidez suficiente (prácticamente O, 1 N) para formar hidrocloruros con los aminoácidos, permitiendo su disolución en ella, y es suficientemente orgánica pa­ra dejar insolubles los demás electroli­tos.

Así obtenemos los aminoácidos acom­pañados de un solo electrolito fuerte: el ácido clorhídrico. Este se elimina al eva­porar la muestra a sequecl3.d con co­rriente de aire caliente gracias a su vo­latilidad. De todas formas, antes de cro­matcgrafiar los am¡noácidos convendrá neutralizar la muestra con vapores de

4. Fijación de los aminoácidos sobre resinas con elución posterior. La sepa­ración completa de sa.les y azúcares se consigue perfectamente gracias a las re­sinas de interc1mbio iónico n

Las propiedades de los aminoácidos concuerdan con las de los azúcares en la insolub;lidad en éter, tetracloruro de carbono, etc .. en su solubilida.d en agua y su ligera solubilidad en piridina por lo que no había métodos sencillos de aislamiento de los aminoácidos en pre­sencia de est'.ls sustancias hasta que se aplicaron las resinas cambiadoras de io­nes. E~tas poseen la capacidad de fija­ción sdectiva del aminoácido precisa­mente pcr su carácter anfótero. propie­dad que no tienen las sales fuertes ni los azúcares.

Por este método se consiguen recoger todos los aminoácidos salvo los de ca­rácter básico (arginina. ornítina. lisina, histid;na ... ). que s~ separan junto con los cationes K ... ). Con las resinas riueden emplearse disoluciones hidroal­cohólicas si les aminoácidos venían di­sueltos en este medio.

Eliminación de azúcares. - En gene­ral, no se aplican métodos especiales pa-

ra su eliminación ya que ésta suele ha­cerse junto con los electrolitos. Caso de no atenderse a los electrolitos, la elimi­nación de interferencias debidas a los azúcares se haría por los siguientes mé­todos.

l. Extracción de los aminoácidos con acetona clorhídrica. Esta disuelve muy pequeña cantidad de azúcares de tal for­ma que si se repite la extracción la can­tidad arrastrada es inocua para el cro­matograma. Léi magnitud de la disolu­c~ón crece si no se llega a evaporar a sequedad. fenómeno que ocurre al ope­rar con concentraciones grandes de azú­car. Se llega a un jarabe del que hay que extraer con acetona los aminoácidos ocluí dos.

2. Oxidación de los azúcares. Cuan­do la cantidad de éstos es grande pueden eliminarse por oxidación tratándolos du­rante varias horas con Cu(OH)2 en me­dio alcalino (preparado de S01Cu y

18 ). Este método es más engorro­so y menos práctico que otros posterio­res.

3. Fijación de los aminoácidos en re­sinas. El método de fijación de los ami­noácidos en resinas de intercambio ió­nico es el mejor para separar azúcares, ya que se verifica simultáneamente la se­paración de las sales inorgánicas. Sola­mente la glucosamina es retenida en for­ma catiónica con los aminoácidos.

4) Selección de determinados disol­ventes que eviten su interferencia en el cromatograma. Cuando la concentración de azúcares no es muy elevada se pue­de hacer cromatogramas sin eliminarlos, con pequefias distorsiones de los amino­ácidos siempre que se escoja la pareja de disolvente adecuada. El Propano! 80 por 100 es muy útil porque la glucosa co­rre en él más que los propios aminoáci­dos.

MkroDO Y HESULTADOS

Comtmcción del mapa de aminoáci-

dos. -- En un solo cromatograma bidi­mensional ascendente hemos separar 16-20 aminoácidos. dando man­chas bastante definidas. empleando can­tidades del orden 4-20. l 0-8 moles de ca­da uno.

En nuestro laboratorio se han realiza­do gran número de cromatogramas de este tipo empleando corno primer disol­vente la mezcla butanol-acético-agua ( 4: l: 1 en volumen) y como segundo fe­nol-agua ( 4: l peso/volumen con 4 gotas de NH1 en el ambiente).

Los resultados son concordantes. y standarizando las condiciones de traba­jo hemos construído el siguiente mapa de aminoácidos (fig. l) para la posterior identificación de estas sustancias en plas­ma. orina, líquido céfalorraquídeo, etc.

La disposición de los aminoácidos concuerda en líneas generales con la que se publica en la literatura con disolven­tes similares (butanol-fórmico-agua) panol-agua) (butanol secundario-acético­agua), etc., frente a fenol saturado, fe­nol 80% o fenol-amoníaco 3 .~. El croma­tograma está trazado a escala, siendo las dimensiones reales adoptadas para las hojas las siguientes: 34 cm. para la l.ª (butanol-acético-agua) y 28,5 para la 2.ª (fenol 80%). El desarrollo cromatográfi­co se da por terminado cuando el disol­vente llega a 1-2 cm. del borde.

Los procesos de partición tienen lugar en escala microanalítica, ya que las can­tidades de cada aminoácido puestas en la mancha de origen eran de 3 a 15 mi­crolitros de disolución 0,01 M o sea del orden de 1 o-~ Moles. En la cromatografía descendente las cantidades son ligera­mente mayores y el poder separador de la operación también lo es, ya que crece el camino recorrido por el disolvente.

a la variedad de líquidos estudiados son distintas las sustancias de máxima inter­ferencia. Así en el plasma son las pro­teínas, en el líquido cefalorraquídeo las

V o/. 1

sales y en los vinos y zumos los azú­cares,

1. Cromatogramas de aminoácidos li­bres en sanguíneo. - La inves­tigación de aminoácidos libres en la san­gre tiene interés para el estudio de los procesos digestivos y la relación entre la presencia y cantidad de estos aminoáci­dos y determinadas enfermedades.

Para la investigación de aminoácidos se han de eliminar algunos elementos que interferir en el cromatogra­ma. Entre las diversas técnicas existentes hemos escogido y adaptado a nuestro trabajo dos fundamentales:

a) Cromatograma directo de plasma dializado,

Seguimos aproximadamente el método de Dent 6 con algunas variaciones en la diálisis y en los disolventes del croma­tograma, La marcha elegida es la si-

l-Se toman 5 ce. de sangre en con heparina para evitar su Se transfiere a un tubo de

centrífuga de 10 ce., centrifugando lue-go a pequeña velocidad (600 revolucio­nes/minuto). Con ello se consigue en diez minutos una buena sedimentación de los glóbulos. Si la velocidad es muy elevada la centrifugación dura menos, pero se rompen los glóbulos difundiendo la hemoglobina al plasma (hemolisis). 2-Se toman con una pipeta 2 ce. de plasma sobrenadante, transparente y amarillento cuidando no tomar glóbulos y se pasan al saco de colodión prepara­do. La preparación del saco de colodión

hacerse unos días o unas horas antes de su empleo. La técnica utilizada es muy sencilla. Se toma un tubo de unos 1 O ce. limpio y seco y se le vierte unos 5 ce. de disolución de colodión al 8% en alcohol-éter (1:1). Se procura, ha­ciendo rodar el tubo, que moje unifor­memente las paredes y se va vertiendo al frasco el líquido excedente poniendo el tubo horizontal y sin dejar de rodar­lo. Se agrega otra vez 3 ce. aproximada­mente y se va rodando con una inclina-

CRO\L\TOGl\AFL\ :iOIJRE PHEL m: \ \!J:\O \Cll>OS

l- A.e. cisteico 2- Ac. raspártico 3- Cisteina 4- Ac. glutámico 5- Serina. IS- Glicocola 7- As parragina ll- TreonJ.na

itg~~"" 11- Al1mina U- Htdroxiprolin.a 13= ~irosina

14- Jl -Alru>i:OO 15- Lisi= 16- TriptÓf~.l1o 17- Citru.lillr>. 18- Ac. T -:uúoobutfrico 19- Ac. "' -em:!nol>ut:írieo :?O- Jhstidim 21- V alinr:l 22- Arginil'llll 23- llorvalina 24- !.oU<:inas 2$- !detionina 26- ll!etionina sulf6xido

:Manchas complementa­rias para. interpretar otros cromatogramas

AlljÚC:eres Peptido Colorantes Sal.e e

:rn

r

Fig. 1.- Mapa de aminoácidos en cromatografía bidimensional ascendente. ---Se utiliza como primer disolvente la mezcla butanol-acético-agua (4: l 1) y como segundo fenol 80 °,1 con unas pocas gotas de amoníaco. Casi todos los aminoácidos quedan por debajo de Ja diago­nal que va de la mancha de origen al extremo opuesto de papel. Sólo los ácidos aspártico

y glutámico tienen un Rf mayor en la mezcla ácida de butano] que en fcnol.

:212 Jos1:: \l. \J \C-IIWU.-1 y F1::1X\ \J.\"\HE/. llE J..\ n:r:1 Vol. J

ción de 30 grados. El excedente se va vertiendo al frasco prccurando que se forme un refuerzo de colodión en la bo­ca del tubo. Se ha de evitar cuidadosa­mente la formación de burbujas de aire en el cclodión ya que pondrían en pe­ligro la efectividad de la pared del saco. Cuando está vacío se coloca vertical in­vertido y se deja secar al aire. Al cabo de una hora se lava con agua varias ve­ces y, estando lleno de ella, se empieza a despegar de la boca del tubo; con el chorro de un frasco lavador se echa agua entre el tubo y el saco que empieza a despegarse, consiguiéndose con suma facilidad la separación completa. 3-El saco se ata a un tubo de vidrio gracias a un engrosamiento producido en éste y se intrcduce en un tubo de ensayo gran­de acortado, perfectamente limpio, al que se puede hacer succión. 4-Una vez puestos los 2 ce. de plasma en el saco de colodión, se conect'i el tubo que lo contie­ne a una pequeña succión continu1, con la trompa durante ocho horas o más (toda la noche). 5-Pasa por ultrafiltración aproximadamente 1 ce. de pbsma conte­niendo aminoácidos, péptidos, azúcares, sales ... pero libre de proteínas y péptidos elevados. Se toma la cantidad que se quiera cromatografiar (200 1d.) y se eva­pcra en vidrio de reloj con corriente de aire seco a 30-40º C. El resto de diali­zado se queda en nevera. 6-Se añade agua al residuo seco, se agita y pasa al papel de cromatografía Whatman n.º 1 en varias porciones. Se lava el vidrio de reloj con nueva agua y se agrega al cro­matograma secando continuamente la mancha de origen con aire caliente. 7-Se desarrolla el cromatograma con fenol 80% como primer disolvente y butanol­acético-agua como segundo, o viceversa.

El cromatograma tiene la disposición siguiente después de revelado con diso­lución de ninhidrina en butanol-acético 2N (19:1) (fig. 2).

En este método se eliminan los gló­bulos y las proteínas, pero permanecen

Fig. 2.- Cromatograma de plasma dializado.· -Aparecen los aminoácidos frecuentes, algunos en concentración muy grande, además de una cierta cantidad de sales. azúcares y péptidos.

La numeración de las manchas, en todos los cromatogramas que publicamos, concuerda con la tabla del Mapa general (Fig. 1) complemen­tadas en la misma pan sales, azúcares. pépti­dos, etc. La intensidad relativa de coloración la hemos traducido convencionalmente bordean­do la mancha con los siguientes tipos de tra-

zos distintos.

····· ·····.Solo visible por transparencia .. - · · - •• Justamente visible por reflexiór. '••1!1111!11ee111111,Perfectrunente visible ~~~-De color rojo relativamente intenso

color rojo intenso --~-lle inte~idad especialmente fuerte - - - -De otros. colores y aspectos (sales l

azúcares. colorantes, yrolina, etc

los azúcares (glucosa) y sales (Cl Na) que producen deformaciones en las man­chas de aminoácidos y los péptidos que dan color a J'i ninhidrina en posiciones distintas a las de las habituales a los aminoácidos.

b) Crom':ltograma de aminoácidos extrnídos con acetona clorhídrica. - En líneas generales seguimos el método de Gordon y Nardi 8 cuando interesa elimi­nar la mayor parte de proteínas. sales y azúcares.

Se¡J!bre .• liJ.57 CI\0\1 H'OGH u·¡\ SOBl\E l' \PEL IJE ·\ \l!NO \CllJO~

El tratamiento de la sangre adoptado en el laboratorio es el siguiente: l --Se toman 5 ce. en un tubo de centrífuga de l O ce. Se centrifug2 como se ha des­crito anteriormente. 2-Se toma l mi. de plasma sobrenadante y se pasa a un tubo de centrífuga pequeño. 3-Se le añaden 4 ce. de acetona clorhídrica (98,4 acetona 1,64 CI H 6N) y se agita consi­guiendo coagular las proteínas v perma­neciendo los aminoácidos en disolución. 4-Se centrifuga y decanta la disolución de aminoácidos a otro tubo de centrí­fuga, se agrega al precipitado 1,5 ce. de acetona clorhídrica, se 2gita para repe­tir la extracción, se centrifuga y decan­ta de nuevo. Se repite la operación con 1 ce. de acetona clorhídrica y se reúnen los líquidos recogidos. 5-Se evapora a sequedad la mezcla obtenida para inso­lubilizar las sales y azúcares que habrán permanecido en disolución gracias al agua del plasma. Esta evaporación con­viene hacerla sin elevar mucho la tem­peratura, para evitar la hidrolisis de pép­tidos con el CIH del disolvente. Para ello se somete el tubo a una corriente de aire seco previamente calentado. 6-El residuo seco se extrae con acetona clorhídrica corno anteriormente, con la diferencia que ahora quedan las sales y azúcares prácticamente sin disolver. Fi­nalmente esta disolución de aminoácidos se evapora para eliminar el C l H y se diluye con un volumen de agua igual al primitivo (1 ml.). 7-Se lava con éter (5 ce.) y decanta después de agitar para extraer las grasas. Se añ2de nuevo éter y ya puede pipetearse la muestra para la cromatografía. 8--Se tornan 100-150 p. l. de líquido acuoso guardado ba­jo éter y se va colocando en la mancha de origen del cromatograma sobre el papel de filtro. Se desarrolla igual que el anterior.

En los cromatcgramas más modernos se invierte el orden de Jos líquidos de desarrollo porque las impurezas del fe­nol eran arrastradas con dificultad al

secar el cromatograma y el butano! co­rría mal. Cuando éste se corre primero no hace falta secar tanto tiempo entre los des jes2rrolbs debido a mayor vola­tilid2d del butano!.

Las m2nch'tS son más déb;Ies como corresponde a un2 cantidad menor de muestra tomada (fíg. 3).

.. ~' '28 1 1 , ... @ .. ,

f'B ' · ............

Sangre

Fig. 3.--Cromatograma de plasma extraído con acetona clorhídrica. ·--Aparecen los mismos aminoácidos· pero sin sustancias interferentes. Las manchas son más definidas y no tan in­tensas por haberse tomado una muestra

menor.

Están situadas en los puntos más acor­des con el mapa de distribución de ami­noácidos puros. ya que no hay sales que desvíen las posiciones. Finalmente no hay huellas de azúcares ni CINa.

2. Cromatografía de aminoácidos li­bres en líquido céfalorraquídeo. - El líquido céfalorraquídeo es esencialmen­te agua que lleva en disolución sales mi­nerales y glucosa. Las proteínas y los aminoácidos libres en él son tan esca­ms. que ha de tomarse una muestra muy

21'!

t

2 oc. Fenol 30,lb

Fig. 4.-Cromatograma del líquido cefalorra­quídeo desproteinizado.-Eliminadas las pro­teínas con alcohol, quedan cantidades grandes de sales y azúcares que deforman el croma­tograma. La glutamina es constante y abun-

dante.

grande para que aparezcan éstos en can­tidad apreciable. Por lo tanto, carece de dificultades la eliminación de proteínas mientras que debe procederse con es­mero a la eliminación de sales. Los pro­cedimientos seguidos tienen el proceso inicial común. l -Se recoge una mues­tra de 4 ce. de líquido céfalorraquídeo en un tubo de centrífuga grande debien­do aparecer limpio y transparente como agua destilada. 2-Se le agregan 6 vo­lúmenes (24 ce.) de alcohol absoluto, se mezcla bien y se deja en frío durante 24 horas. 3-Al día siguiente aparece un pequeño precipitado blanco debido a las proteínas que coagularon. Entonces se separa una fracción del líquido (8-14 ce.) y se pueden seguir uno de los cami­nos siguientes.

Cromatograma directo (sin proteínas). 4a-Se acaba de evaporar a sequedad y se diluye a 0,5 ce. de agua, se agregan

Vol. I

1 O ce .de éter y se toma directamente la mitad del agua para cromatografiar. En el cromatograma aparecen claramente las manchas de azúcares. sales y los ami­noácidos distorsionados (fig. 4).

Crcm<itograma de aminoácidos extraí­dos con acetona clorhídrica. 4b-Se eva­pora a sequedad y se extraen los amino­ácidos ccn acetona clorhídrica, como se ha descrito antes. 5b-Se vuelve a eva­porar eliminando el CI H y se diluye en la cantidad medida de agua (0.5 ce.) se agrega 1 O ce. de éter para extraer lípi­dos y se hace un cromatograma con la mitad de la muestra (0,25 ce.). Se obser­va, comparando con el anterior, que las manchas de aminoácidos son más regu­lares y están mejor distribuídas. La can­tidad de azúcar es muchísimo menor. pero la glutamina sigue algo deformada por residuos escasos de sal (fig . .5).

Cromatograma de líquido electrodia­lizado. 4c-Se toman los 8 ce. de disolu-

,~ ........ • 24 ·, ...........

C.S.F. 2 oo. Fenol 80~

(.i"l .. 4. ..

+ Fig. 5.--Cromatograma de líquido cefalorra­quídeo extraído con acetona clorhídrica.-Apa­recen sólo las manchas de aminoácidos y tra­.rns de azúcar. Las manchas están mejor defi-

nidas y se identifican bien.

Scpt.bre., 1957 Ll\(nJ\TOGH·IFil somu: l'APEL DE \\flNO~CIDOS 21.)

cien hidroalcohólica de líquido céfalo­rraquídeo desproteinizado, se le agrega 4 ce. de agua y se somete a desalado electrolítico en ((de-Salting apparatus". 5c-El aparato construído y montado en nuestro laboratorio concuerda en líneas generales con el de Gordon 9 , con la modificación de renovarse el líquido aniónico previamente enfriado para evi­tar sobrecalentamientos al paso de la corriente. Un papel celofán envuelve el ánodo que está bañado en una corriente de S01H, enfriado. El cátodo es el fondo de mercurio circulante por impul­so de una corriente de agua del grifo. El mecanismo del proceso es el siguiente. Se conectan los electrodos a los bornes ( y de un generador de corriente continua de 100 a 200 voltios. se traba­ja primeramente a potencial hasta que no se presentan sales en concentra­ción apreciable, quedando en cambio los azúcares, y se va subiendo a medida que decrece la intensidad de la corriente. Sí había Cl Na en la disolución hidroal­cohólica (o acuosa) el ion CI- pasa el celofán camino del ánodo. pero no a descargarse pues arrastrado por la co­rriente de SO,H, dando ClH. El ion que se descarga es el OH- que da agua y O, atacando al electrodo, si es de grafito. El ion sodio se descarga sobre el cátodo dando amalgama de sodio, que tratada por el agua del grifo se descompone en NaOH + En el propio cátodo se desprende desde el principio por des-carga de los iones H+. El desprendi­miento crece a medida que se el ion Na+. La operación de desalado se da por terminada cuando de salir sosa (control con fenolftaleína) y decrece la intensidad de corriente a 2 rniliampe­rios. 6c-El líquido céfalorraquídeo de­salado se coloca en tubo de y se evapora a sequedad con corriente de aire caliente. Se diluye con 05 ce. de agua, se agrega éter (5 y se to­ma la mitad de la solución acuosa para desarrollar el cromatograma. Las man-

chas de aminoácidos salen limpias aun­que aparecen también las de azúcares (fig. 6).

3. CronBtograrna de aminoácidos li­bres en vinos, mostos y zumos de fru­<tas.---Los aminoácidos suelen estar en pequefias cantidades en estos líquidos de origen vegetal, por otra parte muy ricos

t

+, Fig. 6.-Cromatograma de líquido cefalorra­quídeo desalado electrolíticamente. - Aparece como el extraído con acetona, con más azúcar y una intensidad ligeramente superior en algu-

nas manchas.

en azúcares (glucosa y fructosa). Para su análisis se deberá tomar muestras con­siderablemente grandes y por lo tanto la interferencia de Jos azúcares es en gene­ral seria.

Como ejemplo de marcha pondremos el camino seguido en una serie de cro­matogramas de aminoácidos en vinos pendiente de próxima publicación 15 . 1-Se parte de 20 ce. de vino. Se evapora

vacío en una cápsula de Petri, en de­secador conectado a la trompa con li­gero calentamiento con infrarrojos. En

dos horas se consigue llegar a la consis­tencia de jalea y calentando dos horas más queda prácticamente sólido sin lle­gar a eiiminar tcdo el agua. 2--Se ex­traen los aminoácidos con acetona clor­hídrica removiendo el precipitado para que la extracción sea completa. Los ami­noácidos se separan de las sales y prác­ticamente de los azúcares que quedan inwlubles. Los colorantes del vino se d;suelven en parte, pero no interfieren en la cromatografía. 3~Se evapora a se­quedad y s~ diluyen con 5 ce. de agua. Se trata con éter como en los otros ca­rns. y se guarda la muestra para todos los análisis que se desee hacer. Aparece: mucho ácido ·¡ -amino butírico. una can­tidad muy grande de prolim. algo de citrulina y un péptido constank (man­cha 31) (fig. 7).

Ultimamente estos métodos van sien­do unificados con la utilización casi ex-

Vino JOO l"e Fenol 80',.h

1 o " ·.-<

Fig. 7. -Cromatograma de vino extraído c;on acetona c]orhídrica.-----Aparecen los ammoac1-dos corrientes con una riqueza especial en pro­lina, alanina v ácido ¡-aminobutírico y están presentes Ja citrulina. un péptido constante Y

algunos colorantes.

Vol. I

elusiva del desalado electrolítico o de resinas.

RESUiVIEN Y CONCLUSIONES

Se ha puesto en marcha un método eficaz y sencillo de análisis de aminoáci­dos en líquidos biológicos por cromato­grafía scbre papel. ~ Primeramente se ha construído un ma­pa de aminoácidos puros con su dispo­sición sobre la lámina de papel cuida­dosamente determinada. Se han escogido dos sistemas disolventes accesibles, fá­cilmente purificables y no alterables por los cambios de temperatura ambientales. Son el butanol-ácido acético-agua ( 4: l: l en volumen), corno primer disolvente. perfectamente eliminable por ventilación a 30º C.. y fenol-agua (4: l peso/volu­men) como segundo, también elirninable con más tiempo de ventilación.

Siempre se ha seguido la técnica de revelado normal con disolución de nin­hidrina descrita por Crarner 1 y calefac­ción en estufa a 90º C. durante seis mi­nutos. El fijado con nitrato de cobre no resultó tan . perfecto corno el que utiliza nitrato de cobalto en disolución hidro­alcohólica ligeramente ácida.

El método~ óptimo de trabajo para ais­lar v analizar aminoácidos. consta de la elin{inación de proteínas con disolución alcohólica o acetóníca y la disolución posterior en agua para separar electroli­tos por de-Salting.

El método de separación de amino­ácidos en plasma por simple diálisis ( cro­rnatograma de la fig. 2), ofrece las ven­tajas de simplificar la manipulación de la. muestra y alternr al mínimo el estado físico-Lrnímico de sus componentes. Pero tiene les inconvenientes de no ofrecer les aminoácidos en concentración cuan­titativamente determinable y dejar en el cromato~rama numerosas sustancias in­terferent~s (sales, azúcares. oligopépti­dos ... ) que despbzan la posición de las manchas y deforman o difuminan sus

Septbre., 1957 Cl\O.\IATOGRAFÍA SOBRE PAPEL m: AMINOÁCIDOS 217

contornos. El tratamiento completo con acetona clorhídrica, tanto en plasma, co­mo en líquido céfalorraquídeo o vinos, presenta la ventaja, dentro de la mayor laboriosidad de operaciones y lavados sucesivos, de dar prácticamente los ami­noácidos puros sobre la hoja, con can­tidades pequeñísimas de azúcares, si és­tos abundaban en la muestra primitiva; come la extracción es prácticamente to­tal, los aminoácidos son perfectamente determinables ( cromatograma de la fi­gura 3). El método que utiliza el desala­do por electrodiálisis ( de-Salting), una vez elimin'.tdas las proteínas, es simple, cómodo y no altera en general los ami­noácidos -exceptuando algunos de na­turaleza básica- aunque los azúcares quedan intactos en la mezcla y daría por tanto malos resultados en vinos y zumos de frutas.

El número de aminoácidos que apa­recen en cualquier líquido biológico, cre­ce lógicamente con el volumen de la muestra tomada, pues al ser éste mayor, las concentraciones de afaunos de ellos van alcanzando el umbral mínimo de­tectable. En el plasma dializado (250 :d.) suelen aparecer todos los aminoáci-

dos clásicamente conocidos en la sangre, junto con algunos péptidos en concen­tración no muy elevada y abundantes sales y azúcares. Del plasma extraído con lcetona clorhídrica (125 p.l.), sacamos 12-14 aminoácidos con manchas mucho mejor definidas. De 2 ce. de líquido cé­falorraquídeo, simplemente desproteini­zado se sacan 8-10 aminoácidos corrien­tes -con especial abundancia de gluta­mina-, pero el cromatograma sale dis­torúonado por la gran abundancia de sales y azúcares (crom. de la fig. 4). El mismo volumen de muestra tratado por de-Salting o extraído con acetona da los mismos aminoácidos, pero solamente con b mancha de azúcar, reducida al míni­mo en el método de la acetona clorhí­dr~ca (figs. 5 y 6).

Finalmente los vinos (fíg. 7) tienen, en 300 ¡J.l. de muestra, una gran riqueza de aminoácidos, especialmente alanina y dos aminoácidos curiosos: la prolina-en cantidad muy superior a cualquier otro y producida, según hemos comprobado, en la fermentación del mosto-y el áci­do 1-aminobutírico, que da una mancha intensa a la izquerda de la alanina.

SmvrlVIARY

Paper chromatography of amino tluids. lnterference by proteins, electrolytes and sugars.

A map has been constructed of the distribu­tion of amino acids in paper chromatography when using n-butanol-acetic acíd-water and 80'}ü phenol, in arder to facilitate rapid inter­pretation of chromatognms of these substan­ces in biologícal fluids. Protein, e!ectrolyte and sugar interference. in theory and practice. is

studie::I and the methods recommended for its elimination are revised. Finally the methods followed in our laboratory are detailed and the results obtained with each one discussed. Sorne typical chromatograms of the fluids in­vestig<1ted are presented.

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