CONTROL EN INMUNOLOGA-INMUNOFLUORESCENCIA

SISTEMA DE ANLISIS DE ANA-Ro POR INMUNOFLUORESCENCIA HEp-2000Se trata de una determinacin indirecta por inmunofluorescencia para la deteccin semicuantitativa de anticuerpos antinucleares (ANA) en suero humano. En este sistema de anlisis se emplean clulas HEp-2 transfectadas, lo que permite identificar los autoanticuerpos contra el antgeno SSA/Ro. Los autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden mostrar un patrn de tincin distintivo en las clulas transfectadas. Si se observa este patrn, el mismo se considera como prueba confirmadora de la presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro. La ausencia de este patrn distintivo no descarta la posible presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro. Este sistema de anlisis ha de emplearse como ayuda en la deteccin de anticuerpos asociados a las enfermedades reumticas sistmicas.EXPLICACIN DE LA PRUEBAAnticuerpo antinuclear (ANA) es un trmino general que se emplea para referirse a los autoanticuerpos dirigidos contra diversas protenas del ncleo celular. En los primeros estudios sobre estos autoanticuerpos, realizados con tcnicas de inmunofluoresencia, se observaron determinados detalles de unas pocas protenas del ncleo. A la vista de la elevada correlacin entre la presencia de ANA y el lupus eritematoso sistmico (LES), basta con que no estn presentes para descartar la enfermedad.Aunque los anticuerpos especficos del ADN siguen mostrando una elevada correlacin con l LES, tambin se han detectado algunas macromolculas nucleares y citoplsmicas asociadas a otras enfermedades del tejido conjuntivo. Parece que algunos de estos autoanticuerpos tienen un significado diagnstico y/o pronstico en la esclerosis sistmica progresiva, las enfermedades mixtas del tejido conjuntivo, el sndrome de Sjgren, la polimiositis y/o la artritis reumatoide . Debido a estas asociaciones a enfermedades, en la actualidad se considera que la deteccin de ANA constituye una herramienta general para la deteccin selectiva de las enfermedades del tejido conjuntivo.La sensibilidad de la prueba vara con el tipo de sustratos utilizado, el procedimiento de fijacin y los tipos de ANA presentes en los sueros. Por lo general, los sustratos de cultivos celulares muestran mayor sensibilidad que los cortes de tejido. La deteccin de autoanticuerpos contra el antgeno SSA/Ro es especialmente variable. Los tejidos de roedores no contienen niveles detectables del antgeno SSA/Ro, y la sensibilidad de deteccin de anticuerpos contra el SSA/Ro en sustratos de cultivos celulares vara, segn los informes, del 50 al 90%.El sistema de anlisis de ANA HEp-2000 de Immuno Concepts con clulas epitelioides humanas (HEp-2) mitticas representa un avanzado sistema de inmunofluorescencia para la deteccin de ANA. Se ha demostrado que las clulas HEp-2 con figuras mitticas son ms sensibles y proporcionan un modelo de reconocimiento ms preciso que el clsico sustrato de rin de ratn para detectar anticuerpos en la esclerosis sistmica progresiva (ESP). Las figuras mitticas mejoran el reconocimiento diferencial del modelo y ayudan a detectar antgenos nucleares no notificados anteriormente, que alcanzan concentraciones superiores en las clulas que se encuentran en mitosis. Las clulas HEp-2 de este sistema de anlisis han sido transfectadas con varias copias de la secuencia de ADN especfica que transporta la informacin del autoantgeno SSA/Ro. Aproximadamente el 10-20% de las clulas transfectadas expresan este antgeno en exceso, por lo que la deteccin de autoanticuerpos contra el SSA/Ro es ms homognea que en clulas HEp-2 no transfectadas. Los autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden mostrar un patrn de tincin distintivo en las clulas transfectadas. Si se observa este patrn, el mismo se considera como prueba confirmadora de la presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro. La ausencia de este patrn distintivo no descarta la posible presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro.PRINCIPIO DE LA PRUEBAEl sistema de anlisis de ANA por inmunofluorescencia de IC emplea la tcnica indirecta de anticuerpos fluorescentes descrita por primera vez por Weller y Coons. Las muestras de pacientes se incuban con un sustrato antignico que permite la unin especfica de los autoanticuerpos a los ncleos de las clulas. Si hay ANA, se forma un complejo antgeno-anticuerpo estable. Tras el lavado para retirar los anticuerpos unidos de forma inespecfica, se incuba el sustrato con anticuerpos antihumanos conjugados con fluorescena. Si los resultados son positivos, se forma un complejo estable con tres partes: el anticuerpo fluorescente unido al anticuerpo antinuclear humano, unido a su vez al antgeno nuclear. Este complejo se puede visualizar con la ayuda de un microscopio de fluorescencia. En las muestras positivas, los ncleos celulares mostrarn una fluorescencia de color verde manzana, con un patrn de tincin caracterstico de la particular distribucin del antgeno nuclear en las clulas. Si no hay ANA en las muestras, el ncleo no presentar un patrn de fluorescencia nuclear claramente discernible.COMPONENTES DEL SISTEMA Utilizacin: Todos los componentes se entregan listos para su empleo, sin necesidad de fragmentarlos ni prepararlos (excepto el tampn PBS, que debe ser disuelto en agua desionizada o destilada antes de utilizarlo). Conservacin: Todos los componentes se pueden conservar en refrigerador entre 2 y 10C. Una vez preparado, el tampn PBS debe conservarse en envases con tapn de rosca, y se conserva entre 2 y 25C. Estabilidad: Todos los componentes son estables al menos durante 12 meses a partir de la fecha de fabricacin. No utilice los componentes pasada la fecha de caducidad.REACTIVOS Portaobjetos de sustrato SLIDE: Portaobjetos con sustrato para ANA con clulas HEp-2000 (con figuras mitticas) cultivadas y estabilizadas directamente en los pocillos del anlisis. Son clulas HEp-2 transfectadas de manera estable con el autoantgeno SSA/Ro. El exclusivo diseo de los fosos del portaobjetos reduce al mnimo la contaminacin cruzada de los pocillos durante la prueba. La bolsa que contiene el portaobjetos se rellena con un gas inerte no txico que contribuye a la estabilidad de las clulas. Control positivo de SSA/Ro CONTROL +: N de catlogo 2035-Ro. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de control humano positivo con anticuerpo especfico contra los antgenos SSA/Ro. Este suero da una reaccin de tincin moteada fina, tpica del anti-SSA/Ro que se observa en el sustrato de clulas HEp-2000 de Immuno Concepts. La expresin se localiza predominantemente en el ncleo, con destacada tincin nucleolar. Tambin se puede observar una dbil tincin citoplsmica en las clulas que expresan el antgeno en exceso. La regin cromosmica de las clulas mitticas muestra una reaccin de tincin negativa. Control positivo homogneo CONTROL +: N de catlogo 2021. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de control humano positivo con anticuerpo especfico contra el ADN y/o los antgenos nucleares DNP. Este suero da una reaccin de tincin homognea con el sustrato de clulas HEp-2000 de Immuno Concepts. La regin cromosmica de las clulas mitticas muestra la misma reaccin de tincin homognea. Control positivo moteado CONTROL +: N de catlogo 2022. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de control humano positivo con anticuerpo especfico contra el Sm y/o los antgenos nucleares DNP. Este suero da una de las reacciones de tincin moteada ms habituales que se observan con el sustrato de clulas HEp- 2000 de Immuno Concepts. La regin cromosmica de las clulas mitticas muestra una reaccin de tincin negativa. Control positivo nucleolar CONTROL +: N de catlogo 2023. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de control humano positivo con anticuerpo especfico contra los antgenos del nuclolo. Este suero da una reaccin de tincin nucleolar con el sustrato de clulas HEp-2000 de Immuno Concepts. Control positivo del centromere CONTROL +: N de catlogo 2025. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de control humano positivo con anticuerpo especfico contra los centrmeros cromosmicos (cinetocentro). Este suero da una reaccin de tincin moteada discreta con el sustrato de clulas HEp-2000 de Immuno Concepts. La regin cromosmica de las clulas mitticas muestra la misma reaccin discreta de tincin moteada. Suero de control titulable TC: N de catlogo 2026. Vial listo para usar, que contiene 0,5 ml de suero de control humano positivo que ser tratado como si fuera una muestra de paciente sin diluir. Suero de control negative CONTROL| - : N de catlogo 2031. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de control humano negativo. Aunque el suero de control negativo puede dar cierta fluorescencia del citoplasma al teirse de forma ms brillante la regin no cromosmica de la clula mittica, no presenta un patrn de tincin nuclear discernible. Reactivo con anticuerpos fluorescents CONJ FITC: N de catlogo 2009-Ro (9,0 ml), 2075-Ro (23 ml). IgG de cabra antihumana (cadenas pesadas y ligeras) conjugada con fluorescena isotiocianato (FITC). El reactivo se presenta listo para usar en frascos con cuentagotas de precisin, con 9,0 ml por cada 10 portaobjetos, en kits de anlisiscompletos.

ELEMENTOS NO REACTIVOS Polvo tampn PBS PWDR PBS: N de catlogo 1011. Polvo salino tamponado con fosfato (0,01 M, pH 7,4 0,2). Cada bolsa contiene polvo tampn suficiente para formar 1 litro. (Los kits de anlisis completos llevan una bolsa de polvo tampn por cada cinco portaobjetos). Preparacin: Disuelva una bolsa de polvo tampn en 1 litro de agua desionizada o destilada, tpelo el recipiente y almacenar entre 2 y 25C durante 4 semanas como mximo, o hasta que aparezcan signos de contaminacin u otros cambios visibles. Medio para preparaciones microscpicas semipermanentes SOLN MM: N de catlogo 1111. Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 5,0 ml de medio para preparaciones microscpicas a base de glicerol. Cubreobjetos CVSLP: N de catlogo 1042. Cada envase contiene diez cubreobjetos de vidrio n 1 de 24 x 64 mm.OTROS MATERIALES Pipetas volumtricas para dispensar volmenes de 20-25 l Jarras Coplin o platillos de tincin Frasco para exprimir o pipetas de Pasteur Pipetas serolgicas Envases de un litro (para el tampn PBS) Agua desionizada o destilada Probetas para preparar las diluciones de suero Placa de Petri u otra cmara de incubacin Papel secante o toallas de papel Guantes desechables Cronmetro Microscopio de fluorescencia equipado con un filtro excitador de 495 nm y un filtro de barrera de 515 nmPRECAUCIONES1. Todos los materiales de procedencia humana utilizados en este producto han sido analizados en busca de anticuerpos con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), el virus de la hepatitis C (VHC) y el antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAG) con mtodos homologados por la FDA, obteniendo resultados negativos (no reactivos en varias ocasiones) en todos los casos. Pero no existe ningn mtodo de anlisis que pueda garantizar por completo la ausencia de VIH-1, VIH-2, hepatitis C, hepatitis B u otros agentes infecciosos. Por eso, todos los materiales del kit deben ser manipulados como si fueran infecciosos.2. Todas las muestras de paciente deben ser manipuladas segn el nivel 2 de bioseguridad, segn se recomienda en el manual de los Centers for Disease Control/National Institutes of Health para toda muestra de suero o sangre humana potencialmente infecciosa: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 1999 Edition.3. La disolucin de los componentes o su sustitucin por otros distintos de los suministrados con el sistema puede arrojar resultados incoherentes.4. Se emplea azida sdica (0,09%) como conservante. La azida sdica puede reaccionar con el plomo o con las conducciones de cobre y formar sales de azidas metlicas explosivas. Al eliminar los reactivos, lavar con grandes volmenes de agua del grifo para evitar que queden residuos en las tuberas. La azida sdica es venenosa y puede ser txica en caso de ingestin.5. Este kit es para uso diagnstico in vitro.6. Si fuera necesario utilizar sueros hemolizados o lipmicos, calintelos para inactivarlos a 56C durante 30 minutos para obtener resultados ptimos. No utilice sueros con contaminacin microbiana.7. El suero de control titulable debe utilizarse para controlar la reproductibilidad entre lotes y entre ciclos. No est concebido para medir la sensibilidad o la especificidad generales del ensayo.8. Est prohibido fumar, comer o beber en las zonas de manipulacin de las muestras o los reactivos del kit.9. Evite salpicaduras y la generacin de aerosoles en todo momento.10. Si los tiempos de incubacin y las temperaturas no son los especificados, los resultados pueden ser errneos.11. La contaminacin cruzada de los reactivos o de las muestras puede dar resultados falsos.12. Los elementos de vidrio reutilizables deben ser lavados y enjuagados a fondo para eliminar los detergentes antes de su uso. Todos los elementos de vidrio deben estar limpios y secos antes de su uso.13. Todos los reactivos, portaobjetos y muestras deben estar a temperatura ambiente (18-25C) antes de su uso.14. Para manipular las muestras y los reactivos debe utilizar guantes desechables, y cuando acabe deber lavarse bien las manos.15. La contaminacin microbiana de los reactivos o de las muestras puede dar resultados falsos.16. No pipetee nunca con la boca y evite el contacto de los reactivos y las muestras con la piel y las mucosas. En caso de contacto, lvese con un jabn germicida y agua abundante.OBTENCIN DE MUESTRAS Obtencin: La muestra ideal es suero. Se obtendrn aproximadamente 5 ml de sangre por venipuncin asptica, con un tubo de vaco estril u otro sistema de obtencin adecuado. Deje que la sangre coagule a temperatura ambiente (18-25C). Se separar el suero del cogulo por centrifugado cuanto antes, para que la hemlisis sea mnima. Sustancias que interfieren: No se utilizarn sueros que muestren grados elevados de hemlisis, ictericia, lipemia o crecimiento microbiano, pues en todas esas circunstancias se pueden producir resultados aberrantes. Si la muestra presenta partculas visibles, stas deben ser eliminadas por centrifugado antes de la prueba. Conservacin: Los sueros se pueden conservar entre 2 y 10C durante una semana como mximo. Si el anlisis se posterga, los sueros deben conservarse congelados a una temperatura de 20C o menos. No se utilizarn refrigeradores ni congeladores con sistema auto-frost (eliminacin automtica de la escarcha).PRECAUCIN: Si las muestras son sucesivamente congeladas y descongeladas, se pueden obtener resultados falsos positivos o negativos.INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOSCONTROL DE CALIDADPara el control de calidad se dispondrn los controles positivo, negativo y de PBS en los pocillos al efecto que se encuentran en todos los portaobjetos. El control positivo debe dar una fluorescencia de color verde manzana en los ncleos de las clulas, con un patrn claramente discernible caracterstico del suero de control utilizado. El control negativo debe dar una fluorescencia inespecfica de color verde mate en el citoplasma y en el ncleo, pero sin un patrn discernible de tincin nuclear. El control PBS se emplea para observar la tincin inespecfica del reactivo de anticuerpos, y no debe dar fluorescencia verde. Si los controles no se ven como se ha descrito, la prueba no es vlida y debe repetirse. Si se emplea el anlisis de ANA-Ro HEp-2000 para confirmar la presencia de anticuerpos anti-SSA/Ro, el control positivo de SSA/Ro, nmero de catlogo 2035-Ro, debe realizarse en al menos un portaobjetos de los utilizados ese da.

CONTROL TITULABLE OPCIONALPara interpretar los ttulos, muchos laboratorio empiezan por el pocillo que contiene la muestra ms diluida, y van retrocediendo hasta la dilucin 1:40. El primer pocillo en el que se aprecie un patrn discernible de tincin nuclear corresponde al ttulo que se considera como criterio de valoracin. Recomendamos utilizar esta tcnica para determinar los criterios de valoracin de los ttulos.El ttulo medio y el rango de ttulos ( una dilucin a cada lado de la media) determinados para este nmero de lote han sido establecidos en nuestro laboratorio, y se consideran la norma. Este control se facilita para que cada laboratorio pueda evaluar la reproductibilidad (precisin) de sus anlisis de ANA. Como quiera que este control no ha sido diseado como indicador de la exactitud de la titulacin, cada laboratorio deber establecer su propio criterio de valoracin del ttulo medio para cada muestra, utilizando esta informacin para evaluar la reproductibilidad (precisin) de unos ciclos a otros.Mediante la reiterada evaluacin de este control titulable utilizando el sistema de anlisis de ANA por inmunofluorescencia de Immuno Concepts, se ha establecido un ttulo medio para cada nmero de lote. El nmero de lote, el ttulo medio y el rango de ttulos ( una dilucin doble a cada lado de la media) figuran en la etiqueta del vial y deben servir como gua para el funcionamiento del sistema de anlisis.Es importante no confundir la intensidad de la fluorescencia con la presencia o ausencia de anticuerpos antinucleares. La clave para determinar si una dilucin de suero es positiva radica en la aparicin de un patrn claramente discernible, sea cual sea la intensidad de la tincin fluorescente.Este control titulable mostrar el tpico patrn moteado que se asocia al anticuerpo RNP. Tambin puede aparecer un segundo patrn de NSp I (varias manchas aisladas en el ncleo de las clulas que se encuentran en la interfase); pero el patrn que se emplear como criterio de valoracin ser el tpico moteado correspondiente a RNP.Puede que los valores obtenidos en nuestro laboratorio difieran de los suyos. He aqu algunos de los muchos factores que pueden afectar a sus resultados:1. El tipo de luz utilizada. Las fuentes de luz de mercurio producen una energa de excitacin a 495 nm mayor que las de cuarzo/halgenas. Las fuentes de luz de mercurio de 50, 100 y 200 vatios difieren poco en la energa de excitacin a 495 nm. Las fuentes de luz de cuarzo/halgenas de 100 vatios producen una energa de excitacin a 495 nm superior a la proporcionada por las de cuarzo/halgenas de 50 vatios.2. El estado de la fuente de luz y su edad. Esto es especialmente cierto para las fuentes de luz de mercurio, que suelen experimentar una reduccin gradual de la energa de excitacin a 495 nm antes de agotarse. Esta gradual reduccin de la energa de excitacin puede producir una prdida significativa de la sensibilidad en un plazo de semanas. El problema se puede evitar con un registro cronolgico. Para que los resultados sean ptimos, cambie las bombillas de mercurio de 500 vatios cada 100 horas, y las de 100 200 vatios cada 200 horas. Por lo general, las fuentes de luz de cuarzo/halgenas no experimentan una reduccin gradual de la energa de excitacin antes de agotarse.3. El tipo de filtro excitador utilizado. Los filtros excitadores por interferencia proporcionan mayor sensibilidad en una longitud de onda mucho menor que los filtros excitadores por absorcin. Si desea ms informacin, consulte el manual de su microscopio de fluorescencia, o con su delegado de ventas.4. Correcta alineacin del haz de luz del microscopio. Consulte las instrucciones del manual del microscopio de fluorescencia.5. La apertura numrica del objetivo. Si se emplea fluorescencia por luz incidente (Epi), la fluorescencia aumenta exponencialmente con la apertura numrica (NA) del objetivo. As, puede que un objetivo de 40X con una NA de 0,65 interprete una o ms diluciones como inferiores a las determinadas con un objetivo de 40X con una NA de 0,85. La apertura numrica va impresa a un lado del objetivo. La NA no afecta a la sensibilidad del microcosopio de luz fluorescente transmitida.6. Filtros de supresin. Los filtros de supresin reducen longitudes de onda de excitacin concretas, y se pueden utilizar para reducir la sensibilidad. Si desea ms informacin, consulte el manual de su microscopio de fluorescencia, o con su delegado de ventas.7. Precisin y exactitud de la tcnica de dilucin, del equipo y de la realizacin de los procedimientos de anlisis.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DEL PACIENTESe recomienda un aumento total de 200X para la deteccin selectiva de positivos y negativos, y de 400X para el reconocimiento de patrones y la visualizacin de clulas mitticas. Negativos: Se considera que un suero es negativo para la presencia de anticuerpos antinucleares si la tincin es igual o inferior a la del pocillo de control negativo, sin patrn claramente discernible. Puede que el citoplasma muestre una tincin dbil, ms brillante en la regin no cromosmica de las clulas mitticas, pero sin patrn nuclear claramente discernible. Positivos: Se considera que un suero es positivo si el ncleo muestra un patrn de tincin claramente discernible en una mayora de las clulas que se encuentran en la interfase. SSA/Ro: Se considera que un suero es positivo para los anticuerpos SSA/Ro si el 10-20% de los ncleos en interfase muestra el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro, que aparece como un patrn moteado brillante distintivo con una llamativa tincin de los nuclolos. Son clulas transfectadas que expresan el antgeno en exceso. El restante 80-90% de los ncleos en interfase puede presentar una fina tincin moteada del ncleo, con o sin tincin fluorescente de los nuclolos. Ttulos: Para interpretar los ttulos, muchos laboratorio empiezan por el pocillo que contiene la muestra ms diluida, y van retrocediendo hasta la dilucin 1:40. El primer pocillo en el que se aprecia un patrn discernible corresponde al ttulo que se considera como criterio de valoracin. Recomendamos utilizar esta tcnica para determinar los criterios de valoracin de los ttulos. Es importante no confundir la intensidad de la tincin con la presencia o ausencia de anticuerpos antinucleares. La clave para determinar si una determinada dilucin de suero es positiva radica en la aparicin de un patrn claramente discernible, sea cual sea la intensidad de la tincin. Debido al aumento de la concentracin del antgeno SSA/Ro en las clulas que lo expresan en exceso, no es raro ver que estas clulas se tien con ttulos muy elevados. Se desconoce la importancia clnica de estos ttulos elevados.PRECAUCIN: Algunos sueros pueden presentar tincin en ncleos y citoplasmas sin patrn nuclear evidente. Este fenmeno suele deberse a los anticuerpos heterfilos, y se considerar resultado negativo.INTENSIDAD DE LA FLUORESCENCIAEs posible semicuantificar la intensidad de la fluorescencia con arreglo a las directrices sobre reactivos con anticuerpos fluorescentes establecidas por los Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia (CDC). 4+ Verde manzana brillante (fluorescencia mxima): perfil celular claramente definido; centro celular claramente definido. 3+ Fluorescencia de color verde manzana menos brillante: perfil celular claramente definido; centro celular claramente definido. 2+ Patrn celular definido, pero fluorescencia tenue: perfil celular menos definido. 1+ Fluorescencia muy leve: perfil celular prcticamente indistinguible del centro celular en la mayor parte de los casos.Immuno Concepts, N.A. Ltd. facilita un portaobjetos estndar para la determinacin de la intensidad de la fluorescencia, FITC QC Slide, nmero de catlogo 1900.

NOTIFICACIN DE LOS RESULTADOS Seleccin: Los resultados deben ser notificados como muy positivos o positivos en la dilucin 1:40; y hay que informar del patrn de tincin del ncleo. Titulacin: El resultado que se notifica es el de la ltima dilucin en la que se observa una tincin claramente discernible. Si el resultado se observa con la dilucin 1:2560, se notificar como superior a 1:2560. Los ttulos de 1:40 a 1:80 se consideran bajos; de 1:160 a 1:320, medios; y de 1:640 en adelante, elevados.

DETECCIN DEL PATRN Homogneo: Tincin slida del ncleo, con o sin enmascaramiento evidente de los nuclolos. La regin cromosmica de las clulas mitticas en metafase es claramente positiva, con una intensidad de la tincin suave o perifrica superior o igual a la de los ncleos en interfase. Sinnimos: Difuso; slido. Antgenos nucleares: ADNbc; ADNn; DNP; histona. Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados sugieren LES. Los ttulos bajos sugieren LES u otras enfermedades del tejido conjuntivo. Perifrico: Tincin slida, sobre todo alrededor de la regin externa del ncleo, con tincin ms dbil del centro de ste. La regin cromosmica de las clulas mitticas en metafase es claramente positiva, con una intensidad de la tincin suave o perifrica superior o igual a la de los ncleos en interfase. Sinnimos: Borde, spero, membranoso. Antgenos nucleares: ADNbc, ADNmc, ADNn, DNP, histona. Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados sugieren LES; los ttulos bajos sugieren LES u otras enfermedades del tejido conjuntivo. Moteado: Tincin granular spera o fina del ncleo, generalmente sin tincin fluorescente de los nuclolos. La regin no cromosmica de las clulas mitticas en metafase se tie, mientras que la regin cromosmica no lo hace. Antgenos nucleares: Sm; RNP; Scl-70; SSA/Ro; SSB/La; y otros sistemas de antgenos/anticuerpos an no caracterizados. Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados sugieren LES (antgeno Sm), enfermedades mixtas del tejido conjuntivo (antgeno RNP), esclerodermia (antgeno Scl-70) o sndrome de Sjgren-complejo seco (antgeno SSA/Ro o SSB/La). Los ttulos bajos sugieren otras enfermedades del tejido conjuntivo. Nucleolar: Tincin moteada grosera de grandes dimensiones, generalmente menos de 6 manchas por clula, con o sin manchas finas ocasionales, entre 5 y 10. La regin no cromosmica de las clulas mitticas en metafase se tie mucho, mientras que la regin cromosmica lo hace dbilmente. Las clulas en anafase y en telofase pueden teirse de forma similar a como lo hacen los ncleos en interfase. Antgenos nucleares: Se suelen denominar ARN 4-6s, y otros antgenos nucleares como fibrilarina, polimerasa I de ARN, NOR 90 y PM/Scl. Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados prevalecen en la esclerodermia y el sndrome de Sjgren. Centrmero: Un patrn de tincin discretamente moteado es muy sugerente de la variante de la esclerosis sistmica progresiva que se conoce como sndrome CREST. Las manchas nucleares son muy discretas y su nmero suele ser mltiplo de 46 (habitualmente 23-46 manchas por ncleo). Dado que los centrmeros son constricciones en las que la fibras fusiformes se unen a los cromosomas, las clulas mitticas mostrarn la misma reaccin de moteado en la regin cromosmica. Sinnimos: ACA; moteado discreto. Antgenos nucleares: Centrmero cromosmico (cinetocoro). Asociacin a enfermedades: Muy sugerentes de la variante de la esclerosis sistmica progresiva que se conoce como sndrome CREST. CREST es una forma de ESP con calcinosis importante, fenmeno de Raynaud, disfuncin esofgica, esclerodactilia y telangiectasias. SSA/Ro: Patrn moteado brillante evidente con tincin destacada de los nuclolos en el 10-20% de los ncleos en interfase. Son clulas transfectadas que expresan el antgeno en exceso. El restante 80-90% de los ncleos en interfase puede presentar una fina tincin moteada del ncleo, con o sin tincin fluorescente de los nuclolos. La regin no cromosmica de las clulas mitticas en metafase se tie, mientras que la regin cromosmica no lo hace.Antgenos nucleares: SSA/Ro (60kD).Asociacin a enfermedades: Se observa en el 60-70% de los pacientes con sndrome de Sjgren primario, en el 30-40% de los pacientes con LES y en ms del 95% con lupus cutneo subagudo.

PATRONES BSICOS DE TINCIN

CLULAS MITTICASDETECCINLas clulas mitticas deben ser visibles en todos los campos con una ampliacin de 200X o inferior. Para comprobar si una clula se encuentra en mitosis debe utilizarse la ampliacin de 400X. Las clulas mitticas muestran una forma redondeada caracterstica, sin membrana nuclear detectable. Por lo general, la regin cromosmica de las clulas mitticas muestra una forma irregular en el seno de la clula debido a la ausencia de membrana nuclear, y una extrema constriccin de los cromosomas.Los sueros positivos para ADN y/o DNP y/o histona (como el control positivo homogneo de Immuno Concepts) presentarn una tincin brillante de la regin cromosmica de estas clulas. En las muestras negativas para ADN y/o DNP y/o histona (como el control positivo homogneo de Immuno Concepts), los cromosomas de las clulas mitticas no se teirn y ser difcil verlos.

USO DE CLULAS MITTICAS Distincin entre anticuerpos moteados y homogneos: En ocasiones es difcil distinguir un patrn de tincin moteado fino de otro homogneo. Si el patrn es homogneo, habr una tincin slida de los cromosomas de las clulas mitticas. Si el patrn es estrictamente moteado, la regin situada fuera de los cromosomas presentar una reaccin de moteado fino.NOTA: Si se presenta un moteado fino de toda la clula mittica junto con la tincin slida de la regin cromosmica, es muy probable que haya dos o ms anticuerpos. Designe la dilucin de seleccin como moteada/homognea, y titule cada anticuerpo hasta el criterio de valoracin. Anticuerpo perifrico frente a anticuerpo contra la membrana nuclear: En general, los anticuerpos que muestran un patrn perifrico se asocian a antgenos nucleares de ADN/DNP. Los ttulos elevados de estos anticuerpos sugieren LES. En sustratos que no incluyen clulas mitticas puede ser difcil distinguir el patrn perifrico del de los anticuerpos contra la membrana nuclear. Con las clulas mitticas de Immuno Concepts es posible distinguir estos patrones, pues la regin cromosmica de las clulas mitticas se teir intensamente con un patrn perifrico, pero no ser teida por el anticuerpo contra la membrana nuclear. Esta distincin es importante desde el punto de vista clnico, pues los anticuerpos contra la membrana nuclear carecen de especificidad ADN/DNP y no se asocian al LES. Anticuerpo anticentrmero (ACA) frente a centrmero atpico con aspecto de anticuerpo moteado: Para verificar la presencia de ACA, la regin cromosmica de las clulas mitticas debe teirse brillantemente con manchas discretas. Si la regin cromosmica no se tie, el anticuerpo no es ACA y debe designarse como moteado atpico. SSA/Ro frente a patrones que se pueden parecer a la tincin por SSA/Ro: La tincin distintiva de SSA/Ro adopta un patrn moteado brillante y delimitado con tincin destacada de los nuclolos en el 10-20% de los ncleos en interfase. El restante 80-90% de los ncleos en interfase puede presentar una fina tincin moteada del ncleo, con o sin tincin fluorescente de los nuclolos. La regin cromosmica de las clulas mitticas en metafase no se tie. El patrn nucleolar se distingue por la tincin moteada grosera y grande de todos los ncleos, por lo general menos de 6 por clula. El patrn de Scl-70 corresponde a una tincin moteada fina y una tincin nucleolar de todos los ncleos en interfase, y la tincin de la regin cromosmica de las clulas mitticas en metafase. Los anticuerpos contra el antgeno nuclear de clulas en proliferacin (PCNA) muestra un moteado variable grosero y fino en el 30-50% de los ncleos en interfase.

FLUORESCENCIA CITOPLSMICAAunque los anticuerpos contra antgenos citoplsmicos no suelen asociarse a enfermedades del tejido conjuntivo, se pueden detectar con sustratos de cultivos de clulas epiteliales (40). Los anticuerpos que se detectan con ms frecuencia son los dirigidos contra las mitocondrias y el msculo liso; suelen asociarse a la mononucleosis, la hepatitis activa crnica y las hepatopatas. Con el sustrato de clulas HEp-2 tambin se han demostrado anticuerpos contra el msculo liso en pacientes con verrugas. Anticuerpos anti-mitocondriales (AMA): Manchas discretas, concentradas en la regin perinuclear de la clula y que se extienden, con menor intensidad, a las regiones exteriores del citoplasma. Hay que distinguirlo de los anticuerpos anti-Golgi, que suelen teir slo un lado de la regin perinuclear, y de los anticuerpos anti-ribosomas, que muestran manchas ms finas con aspecto filamentoso compatible con la localizacin del retculo endoplsmico en el interior de la clula.NOTA: La forma ms fcil de distinguir las manchas perinucleares de la tincin perifrica del ncleo consiste en observar que las manchas mitocondriales forman una tincin moteada discontinua en torno al exterior de la membrana nuclear, mientras que en los sueros perifricos se forma una tincin lisa slida en el interior de dicha membrana.DESIGNE LOS SUEROS COMO NEGATIVOS PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES, Y VERIFIQUE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTIMITOCONDRIALES EN EL SUSTRATO ESPECFICO CORRESPONDIENTE. Anticuerpos anti-msculo liso (ASMA): Tincin fibrosa muy fina en todo el citoplasma, con aspecto de tela de araa. Al contrario que los anticuerpos antimitocondriales, la tincin de los anticuerpos anti-msculo liso es uniforme en todo el citoplasma, y puede llegar al ncleo. Por lo general, las clulas mitticas muestran grandes manchas discretas en el exterior de la regin cromosmica. Se ha demostrado que los anticuerpos anti-msculo liso son muy especficos de la actina.DESIGNE LOS SUEROS COMO NEGATIVOS PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES, Y VERIFIQUE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-MSCULO LISO EN EL SUSTRATO ESPECFICO CORRESPONDIENTE.LIMITACIONES DEL ANLISIS1. No es posible hacer un diagnstico basndose slo en la deteccin de anticuerpos antinucleares. El mdico debe interpretar estos resultados en el contexto de la historia y los sntomas del paciente, los hallazgos fsicos y otros procedimientos diagnsticos.2. No se debe iniciar un tratamiento basndose exclusivamente en un resultado positivo del anlisis de anticuerpos antinucleares. Antes de iniciar un tratamiento hay que tener en cuenta las indicaciones clnicas, otros hallazgos de laboratorio y la impresin clnica del mdico.3. Determinados frmacos, como procainamida e hidralazina, pueden inducir un trastorno similar al lupus eritematoso. Los pacientes con LE inducido por frmacos pueden dar positivo para los ANA homogneos u homogneos/perifricos que suelen ir dirigidos contra las histonas nucleares.4. Un pequeo porcentaje de pacientes con LES puede no presentar ANA en el anlisis por inmunofluorescencia indirecta, pero s empleando otras tcnicas.5. Aunque una titulacin elevada de ANA puede ser muy sugerente de enfermedad del tejido conjuntivo, no debe considerarse diagnstica, sino parte de la historia clnica general de un paciente.6. A menudo, los patrones de tincin cambian con la progresiva titulacin de los sueros. Este fenmeno suele deberse a la presencia de ms de un anticuerpo antinuclear.7. Como quiera que existen muchas opciones en los microscopios de fluorescencia, se recomienda estandarizar las fuentes de luz, los filtros y los medios pticos para comparar los ttulos de los pacientes obtenidos en diferentes laboratorios.8. Tambin se observan ANA en un pequeo porcentaje de pacientes con enfermedades infecciosas y/o neoplsicas.9. Los autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden mostrar un patrn de tincin distintivo en las clulas transfectadas. Si se observa este patrn, el mismo se considera como prueba confirmadora de la presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro. La ausencia de este patrn distintivo no descarta la posible presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro.10. Debido al exceso de expresin del autoantgeno SSA/Ro en las clulas HEp-2000, las muestras que contienen anticuerpos anti-SSA/Ro muestran ttulos superiores en estas clulas que los que se obtienen en las clulas HEp-2 no transfectadas. Como quiera que ninguno de los dems autoantgenos de las clulas HEp-2000 se ve afectado por el proceso de transfeccin, los sueros con otras especificidades de autoanticuerpos no muestran diferencias significativas en los ttulos entre la lnea de clulas HEp-2000 y las clulas HEp-2 no transfectadas. VALORES ESPERADOSEn un gran centro mdico universitario se obtuvieron los siguientes datos en un perodo de 2 aos, utilizando el sustrato de clulas HEp-2 para ANA.

Abreviaturas: S=Moteado, H=Homogneo, P=Perifrico, N=Nucleolar, ACA=anti-CentrmeroCARACTERSTICAS DEL RENDIMIENTOMUESTRAS NORMALESSe evaluaron sueros de 500 donantes de sangre sanos, 242 mujeres y 258 varones, ninguno de los cuales presentaba antecedentes de enfermedades reumticas, en paralelo con clulas HEp-2 no transfectadas comercializadas y el sistema de anlisis de ANA-Ro HEp-2000 Colorzyme. En esta poblacin, 36 muestras (7,2 %) dieron positivo en el anlisis de anticuerpos antinucleares con una dilucin srica de 1:40. Los patrones de tincin fueron idnticos con los dos sustratos en 34 de las 36 muestras que dieron positivo. Las dos muestras que ofrecieron diferencias correspondieron a mujeres, y en ambas se confirm que contenan anticuerpos anti-SSA/Ro. Una de estas muestras mostr una dbil reaccin moteada fina en las clulas HEp-2 no transfectadas y la tpica tincin SSA/Ro en el sistema de anlisis de ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000 Colorzyme. La otra muestra dio negativo en las clulas HEp-2 no transfectadas, pero mostr la tpica tincin SSA/Ro en el sistema de anlisis de ANA-Ro por inmunoflurescencia HEp-2000. La especificidad de estas dos muestras por el SSA/Ro fue confirmada por ELISA e inmunotransferencia de Western. Las muestras que dieron negativo en las pruebas de ANA tambin lo dieron en las de ELISA.

SUEROS DE PACIENTES CON ANTICUERPOS SSA/Ro EXCLUSIVAMENTESe evaluaron sueros de 46 pacientes con LES o sndrome de Sjgren con clulas HEp-2 no transfectadas comercializadas y el sistema de anlisis de ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000. Mediante ELISA e inmunotransferencia de Western se confirm que todos los sueros contenan anticuerpos contra el autoantgeno SSA/Ro. No se detectaron otros autoanticuerpos en ninguna de estas muestras. Treinta y seis de estas muestras (78%) fueron positivas (patrn moteado) con las clulas HEp-2 no transfectadas, y las 46 (100%) fueron positivas (patrn de tincin distintivo de SSA/Ro) con el sistema de anlisis de ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000.

SUEROS DE PACIENTES CON AUTOANTICUERPOS DISTINTOS DE SSA/RoSe evaluaron sueros de 230 pacientes con diversas enfermedades (reumticas y no reumticas) en paralelo con clulas HEp-2 no transfectadas comercializadas y el sistema de anlisis de ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000. Se observ un patrn de tincin aislado en 120 muestras, y patrones mixtos en 110 muestras. En la poblacin total de 230 muestras, 333 patrones de tincin fueron idnticos en los dos sustratos. Veintinueve muestras presentaron el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro en el sistema de anlisis de ANA-Ro HEp-2000. Veintitrs de estas muestras mostraron patrones moteados en las clulas HEp-2 no transfectadas. Las seis muestras discrepantes (positivas en HEp-2000, pero negativas en clulas HEp-2 no transfectadas) tenan anticuerpos contra SSA/Ro, como se demostr mediante el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro, pruebas ELISA y confirmacin por inmunotransferencia de Western.

COMPARACIONES DE LOS TTULOSDebido al exceso de expresin del autoantgeno SSA/Ro en las clulas HEp-2000, las muestras que contienen anticuerpos anti-SSA/Ro muestran ttulos superiores en estas clulas que los que se obtienen en las clulas HEp-2 no transfectadas. Como quiera que ninguno de los dems autoantgenos de las clulas HEp-2000 se ve afectado por el proceso de transfeccin, los sueros con otras especificidades de autoanticuerpos no muestran diferencias significativas en los ttulos entre la lnea de clulas HEp-2000 y las clulas HEp-2 no transfectadas.REPRODUCTIBILIDAD DE LOS TTULOSDiez muestras elegidas entre los controles de los CDC y otros sueros locales bien caracterizados, fueron sometidas a tres nmeros de lote diferentes de portaobjetos HEp-2000, en tres ocasiones diferentes. No se dio ningn caso de que una muestra negativa diera resultados positivos. Todos los ttulos fueron inferiores al doble de dilucin del ttulo medio establecido para todas las muestras evaluadas.

CONFIRMACIN DE ANTICUERPOS SSA/RoEn un gran laboratorio de reumatologa de referencia, se analizaron con el sistema de anlisis de ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000 muestras de suero de 349 pacientes que haban dado positivo en la deteccin de ANA. En esta poblacin seleccionada, 239 muestras presentaron el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro. Se obtuvieron resultados ELISA positivos para anticuerpos SSA/Ro en 238 (99,6%) de estas muestras. Otras 79 muestras presentaron intensos patrones moteados y/o homogneos, y dieron positivo en las pruebas ELISA para anticuerpos SSA/Ro. Por consiguiente, si se observa el patrn distintivo de SSA/Ro, el mismo confirma la presencia de anticuerpos SSA/Ro, pero la ausencia de dicho patrn no descarta la presencia de esos anticuerpos. En los estudios que hemos descrito, hemos examinado un total de 429 sueros que contenan anticuerpos SSA/Ro confirmado por ELISA y/o inmunotransferencia de Western, y que presentaron el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro en la lnea de clulas HEp-2000 transfectadas. Tambin hemos visto muestras que contienen anticuerpos SSA/Ro pero no que muestren el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro, porque los elevados niveles de otros autoanticuerpos (habitualmente anticuerpos anti-ADN o anti-Sm/RNP) enmascaran el patrn SSA/Ro. Por consiguiente, si se observa el patrn distintivo de SSA/Ro, el mismo confirma la presencia de anticuerpos SSA/Ro, pero la ausencia de dicho patrn no descarta la presencia de esos anticuerpos.

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