componentes proteicos de alto valor añadido en la semilla del olivo: proyecto proteolimar de...

Componentes proteicos de

alto valor añadido en la semilla del olivo: proyecto PROTEOLIMAR de

alimentación de organismos marinos

Dr. Juan de Dios Alché Ramírez Departamento de Bioquímica,

Biología Celular y Molecular de Plantas.

Estación Experimental del Zaidín. CSIC

GRANADA

GRUPO PAIDI BIO-283

Estos científicos no

me estudian

lo suficiente Os voy a hacer

estornudar!!

Mis frutos son

“oro verde”

JUNTA DE ANDALUCÍA. PLAN ANDALUZ DE INVESTIGACIÓN (PAI) PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE EXCELENCIA. CONVOCATORIA 2010

LÍNEA ESPECÍFICA DEL OLIVAR Y EL ACEITE DE OLIVA Referencia AGR-6274

2011-2015

Ministerio de Economía y Competitividad y Agencia IDEA Proyecto INTERCONNECTA Referencia ITC-20131031

2013-2014

EL FRUTO DEL OLIVO COMO

DRUPA

Nevadillo de Alhama

Endocarpo

Epicarpo

Mesocarpo

Endocarpo

Semilla

Mesocarpo

EL FRUTO DEL OLIVO COMO

DRUPA

LA SEMILLA DEL OLIVO: Un material inexplorado e inexplotado: Endospermo + Embrión.

Endocarpos

Semillas

ENDOSPERM a ENDOSPERM b

EM

BR

YO

PROGRAMA ESTATAL DE INVESTIGACIÓN, DESARROLLO E INNOVACIÓN ORIENTADA A LOS RETOS DE LA SOCIEDAD.

Programa Retos-Colaboración 2015. Referencia RTC-2015-4181-2 2015-2017

http://www.grupoelayo.es

http://www.eez.csic.es

Acuicultura de Granada

Pulpa de aceituna

Hueso deaceituna

Aceitunas

Pulpa de aceituna

deshidratada

Semilla de olivo

Harinade semilla

de olivo

Aceitede semilla

de olivo

Harina deaceitunas

deshidratadas

Aceite deaceitunas

deshidratadas

Deshuesadora de aceituna desarrollada

por ELAYOTECNIA S.L.

Planta de secado, partido y clasificado de

hueso y semilla de ELAYOTECNIA S.L.

Proceso de secado y

molturación de la semilla

extraída del hueso de la

aceituna

1,3 y 4 son semillas o trozos de

semillas, y 2,5,6 y 7 son huesos.

Prensa

manual

hidráulica

en

discontinuo

.

Prensa manual

en continuo

Equipo de

extracción con

fluidos

supercríticos

Prensa semi-industrial de

rodillo para extraer el aceite

de la semilla de

ELAYOTECNIA S.L.

CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE LA ACEITUNA.

• Análisis histológico de mesocarpo + piel

CARACTERIZACIÓN DE VARIEDADES DE OLIVAR

AUTÓCTONO DE LA D.O.P. PONIENTE DE GRANADA

Análisis histológico de secciones completas de mesocarpo + piel con especial atención a la presencia y distribución de: - Número de capas celulares - Tamaño celular - Grosor de la cutícula (Cu) - Grosor de la epidermis (Ep) - Presencia de lípidos (L) - Presencia de esclereidas (Es) - Cloroplastos (P) y peroxisomas -Núcleos (N) e inclusiones intranucleares cristalinas (IN, flechas).

L

IN


• Análisis histológico de endospermo + testa



Análisis histológico de secciones completas de endospermo + testa con especial atención a la presencia y distribución de: - Número de capas celulares - Tamaño celular - Grosor de la cutícula interna (Cin) - Presencia de haces vasculares (HV) - Presencia de cuerpos lípidos (CL, flechas) - Presencia de cuerpos proteicos (CP, cabezas de flechas) - Cloroplastos (P) y peroxisomas


• Análisis histológico de embrión



Análisis histológico de secciones completas de embrión con especial atención a la presencia y distribución de: - Número de capas celulares - Tamaño celular - Grosor de las epidermis (Ep) - Presencia de haces vasculares (HV) - Presencia de cuerpos lípidos (CL, flechas) - Presencia de cuerpos proteicos (CP, cabezas de flechas)

variedad GORDAL DE ALHAMA

1-D PROTEIN PROFILE OF THE OLIVE SEED.

THE 11S SSPS IN THE OLIVE SEED

2-D PROTEIN PROFILE OF THE OLIVE SEED.


Figure 2. Proposed model showing the composition of the

subunits of the different 11S proteins found in olive

mature seeds.

Table 2. Storage proteins of olive

seeds identificated by MALDI-TOF.

Table 1. Molecular

masses estimated for

the selected spots of Fig 1A and 1B

ENDOSPERM

COTYLEDON

Estimated

molecular

mass kDa

basic

acidic Estimated

molecular

mass kDa

basic

acidic

ENDOSPERM

CELL LOCALIZATION OF 11S SSPs IN THE OLIVE SEED.


SD

S-P

AG

E

pH 3 pH 10

75

25

37

50

20

15

150

p1

p4

p3

p2

p5

1 2

3 4

5 6 7

8 9

10 11

Figure 3. Proposed model

showing the composition of the

subunits of the different 11S

proteins found in olive mature

seeds.

LARGE COMPLEXES

Native forms

Precursors forms

Mature forms

(-arm) p1 (-arm) p5 (-arm) p2 (-arm) p3 (-arm) p4 (-arm) p2 A) Light microscopy thin sections stained with methylene blue.

B) Fluorescence immunolocalization of 11S SSPs in protein

bodies using a polyclonal antibody.

C) Fluorescence localization of lipid bodies using Nile Red.

D) Ultrathin sections of olive endosperm. Transmission

Electron Microscopy. Bars=50 µm.

De novo construction and functional annotation of an olive seed transcriptome

11S SSPS IN THE OLIVE

SEED TRANSCRIPTOME

1) Semantic and name searches were carried out in the generated annotations using key words.

2) BLASTP searches of known, conserved sequences for 11S.

3) Annotations were manually screened for specific sequences selected from well-established bibliography resources.

SELECTION OF 11S TRANSCRIPTS


SEED TRANSCRIPTOME

ALIGNMENT OF AMINO ACID SEQUENCES

1. ALIGNMENTS by Clustal Omega software (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

2. ALIGNMENTS VISUALIZATION by Bioedit V7.0.5.3 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html).

3. Paired sequence (overlapping) reads were matched and joined to complete full-length sequences. Various mismatches in

the overlapping sequence reads were allow in order to obtain these full sequences.

4. Protein sequences derived from these final alignments were further analyzed for the PRESENCE OF PUTATIVE

FUNCTIONAL (BIOLOGICALLY MEANINGFUL) MOTIFS by the ScanProsite program

(http://www.expasy.org/tools/scanprosite), and to confirm the identity of the final (mature) sequences.

5. Protparam tool (http:// http://web.expasy.org/protparam/) was used to identify theoretical pI and molecular weight).


SEED TRANSCRIPTOME PHYLOGENETIC TREE

1. PHYLOGENETIC TREE was constructed with the aid of the software Seaview [Gou et al. Molecular biology and

evolution. 27, 221–4 (2010)] using the maximum likelihood (PhyML) method implemented with the LG model of the most

probable amino acid substitution calculated by the ProtTest 2.4 server [Abascal et al. Bioinformatics (Oxford, England).

21, 2104–5 (2005).]. The branch support was estimated by bootstrap resampling with 100 replications.

2. SELECTION OF SEQUENCES in the seed transcriptome based on the results of the phylogenetic tree. As the criteria for

selection, we designated their presence within the output results from the BLASTP (E-value=0.0 to e-14) alongside the

whole NCBI database, and their clustering with previously characterized 11S sequences in the phylogenetic analysis

Fig. 2. Phylogenetic analysis of olive 11S seed storage

protein sequences. Olive sequences obtained by NGS and

most relevant orthologous identified in the NCBI database were

used. Tree is divided in two big clusters, named Group 1 and

Group 2. Group 2 contains sequences less-related to olive from

a variety of plant species.


SEED TRANSCRIPTOME PHYLOGENETIC TREE

Sequences from group 1 included all retrieved olive sequences (dark grey box). Sequences from Lamiales/Solanales are

framed with doted and dashed lines. Asterisks (*) highlight the sequences from tobacco, sesame and common yellow

monkey flower used for the alignment in Fig 1. Arrows point out two sequences from group 1 and 2 corresponding to 11S

isoform 2 and 4 from the same species (sesame). Measurements of support for the nodes are represented as

percentages.


SEED TRANSCRIPTOME

STRUCTURE PREDICTION of BOTH α and β SUBUNITS

INTRA- AND INTER-MOLECULAR

DISULPHIDE BONDS

HEXAMER FORM

The sequences of two subunits taking part

of one of the five 11S globulin precursors

selected as indicated above (ID: 002407),

were subjected to 3D homology modeling

(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)

[38,39,40,41] by using 3ehk, 2e9q, 1od5,

3c3v, 3kgl and 2d5f protein templates

(alpha subunit) and 1fxz, 2e9q, 1od5, 3c3v,

3qac and 3kgl protein templates (beta

subunit) available in PDB

(http://www.pdb.org). Models were

visualized by PyMol software

(https://www.pymol.org/).

1. HOMOLOGY MODELING (http://swissmodel.expasy.org/workspace/) by using 3ehk, 2e9q, 1od5, 3c3v, 3kgl and 2d5f

protein templates (alpha subunit) and 1fxz, 2e9q, 1od5, 3c3v, 3qac and 3kgl protein templates (beta subunit) available in

PDB (http://www.pdb.org).

2. VISUALIZATION OF MODELS was made by PyMol software (https://www.pymol.org/).

http://swissmodel.expasy.org/workspace/









SEED TRANSCRIPTOME

STRUCTURE PREDICTION VERSUS ELECTROSTATIC POTENTIAL

1. Poisson–Boltzmann ELECTROSTATIC POTENTIALS were obtained using APBS (DeLano Scientific LLC) molecular

modeling software implemented in PyMol 0.99 (www.pymol.org ) with AMBER99 to assign the charges and radii to all of

the atoms (including hydrogens), which were added and optimized with the Python software package PDB2PQR. Fine

grid spaces of 0.35 A ° were used to solve the linearized PB equation in sequential focusing multigrid calculations in a

mesh of 130 points per dimension at 310.00 K. The dielectric constants were 2.0 for the protein and 80.00 for water. The

output mesh was processed in the scalar OpenDX format to render isocontours and maps onto the surfaces with PyMOL

0.99. Potential values are given in units of kT per unit charge (k Boltzmann’s constant; T temperature).

Three-dimensional structure of

olive 11S protein

corresponding to the α (A) and

ß (B) subunits. Structures

were depicted as a cartoon

diagram. α-helices, β-sheets

and coils are depicted in red,

yellow and green,

respectively. Two views

rotated 180 degrees round the

x-axis are provided for both

subunits of surface (green and

blue) and electrostatic

potential representation. The

electrostatic potential surface

colors are clamped at red (-

10) or blue (+10).


SEED TRANSCRIPTOME α/β –INTERACTING COMPLEXES

Representation of

the 11S α/β –

interacting

complexes. Three

views rotated 30

and 45 degrees

around the x-axis

are provided (α in

purple and ß as a

cartoon diagram).

1. For DOCKING ANALYSIS of 11S protein, we considered backbone flexibility by using rigid-body ensemble docking with

multiple structures derived from NMR. The Fast Fourier Transform (FFT) correlation approach to protein–protein docking

evaluated the energies of billions of docked conformations on a grid. To obtain decoys by rigid-body docking, we used the

option ZDOCK for sampling at 6-degree rotational steps in CLUSpro server. Using Fast Fourier Transform, ZDOCK

searches for all possible binding orientations of a ligand along the surface of a receptor protein, optimizing desolvation,

shape complementarily and electrostatics. The top 2,000 structures, along with their ZDOCK scores, were used as

candidates of near-native structures. The docking score was calculated by considering several interaction properties, e.g.,

shape complementarity, desolvation, and electrostatics potential. For each docked conformation, we computed the

residues of the ligand within 10 A ° of its receptor. This RMSD computing analysis was done for all the 2,000 ligands in

this study. After clustering, the ranked complexes are subjected to a straightforward (300 steps and fixed backbone) van

der Waals minimization using CHARMM to remove potential side chain clashes. Best scoring was chosen as higher

possible model for proteins interaction.


SEED TRANSCRIPTOME IDENTIFICATION OF T-cell EPITOPES

1. Stabilization matrix alignment methods allowing direct prediction of PEPTIDE MHC BINDING SEQUENCES AND

AFFINITIES were used for both alpha and beta peptides: TEPITOPE (www.bioinformation.net/ted), Propred

(www.imtech.res.in/raghava/propred) (using quantitative matrices), NetMHCII (www.cbs.dtu.dk), Multipred (antigen.i2r.a-

star.edu.sg/multipred), CTLpred (www.imtech.res.in/raghava/ctlpred) (artificial neural network approach), and RANKPEP

(Position-specific scoring matrix, bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) which employ binding status scoring qualitative

prediction methods and were used for predicting T-cell epitopes. HLA class II binding peptides of Ole e 12 were also

predicted by inhibitory concentration (IC50) value based in quantitative prediction methods MHCpred (www.ddg-

pharmfac.net/mhcpred/MHCPred), SVRMHC (SVRMHC.umn.edu/SVRMHCdb), ARB matrix methods

(www.epitope.liai.org:8080/matrix), SMM-Align in MetaMHC (www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/MetaMHCII/server.html).

Promiscuous peptides binding to multiple HLA class II molecules were selected.

Position of the epitope in each subunit is numbered at the

beginning and end of the sequence.


SEED TRANSCRIPTOME

FUTURE STRAGIES AND BIOTECHNOLOGICAL APPROACHES

based on structural analyses

- Codon optimisation and in vitro expression to generate material (recombinant allergens) for diagnosis and

therapy (desensitization).

- Generation of specific antibodies.

- Development of quantification methods for standardisation of vaccines

- Design of hypoallergens and new variants

- Design of chimera allergens

- Design of multi-allergens

- Analysis of digestibility

- Internalisation experiments

SDS-PAGE Coomassie ANTI-CONGLUTINAS

CONCLUSIONS

A B

D E

C

F

G H

A

B

C

D

E

F

G

H

Catalasa

Glutatión reductasa

Cu,Zn superóxido dismutasa

Gamma glutamil-cisteín-sintetasa

Glutatión sintetasa

NADPH oxidasa

Glutatión peroxidasa

Glutatión S-transferasa

Recogida de erizos de mar en la franja

infralitoral. Posteriormente se tomarán

muestras biológicas y biometría de los

animales recogidos.

Medición de los erizos

Proceso de extracción de

gónadas. La coloración de la

gónada se mide por comparación

con la escala comercial Pantone

y, rápidamente las muestras son

congeladas y guardadas para su

posterior análisis.

Gónadas de erizos

Nursery de Acuicultura de Granada

ANÁLISIS DE DIGESTIBILIDAD DE EXTRACTOS DE SEMILLA

FRACCIONAMIENTO DE COMPONENTES DE LA

ACEITUNA Y AISLAMIENTO DE COMPONENTES BIOACTIVOS

ANÁLISIS DE ESTABILIDAD TÉRMICA DE EXTRACTOS DE SEMILLA

FRACCIONAMIENTO DE COMPONENTES DE LA


ESTUDIO DE CONTENIDO EN GLUTEN. FRACCIONAMIENTO DE COMPONENTES DE LA


ANTIINFLAMATORY effects of flours purified from olive seeds in diabetic patients.

2015

Elena Lima1, Victor Alché2, Adoración Zafra1, José Miguel Benavente3, Sandra Carmona4, Yaiza Palma5, Mengyao Pan6, Cristina Pedrosa4, Juan Pedro Sánchez-Rivas7, Jose Carlos Jimenez-Lopez1, Francisco Manuel Marco8, Juan de Dios Alché1* 1Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology of Plants, Estación Experimental del Zaidín (CSIC), Profesor Albareda 1, 18008 Granada, Spain 2Andalusian Health Service. Granada, Spain. 3IES Juan XXIII, Camino Santa Juliana s/n, 18007 Granada, Spain. 4IES Zaidín-Vergeles, Primavera 24, 26, 18080 Granada, Spain. 5IES Aricel, Aricel s/n, 18220 Albolote, Granada, Spain. 6IES Generalife, Huerta del Rasillo s/n, 18004 Granada, Spain. 7ELAYOTECNIA S.L. Almendro, 31, Polígono Industrial El Cerezo, 23670 Castillo de Locubín. Jaén, Spain. 8Department of Biotechnology, University of Alicante, Alicante, Spain *autor para correspondencia: [email protected]

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

INTRODUCTION

Olive oil plays a well-established, beneficial role in promoting good health. Oil retains the compounds that the fruit develops in response to environmental stress, especially phenolic compounds. Moreover, virgin olive oil is an integral ingredient of a Mediterranean diet. Its nutritional and medical benefits are widely known and approved. Indeed, virgin olive oil has been used as a folk remedy for combating diseases due to its hypotensive, cardioprotective, antimicrobial, anti-hyperglycemic, anticancer, and anti-inflammatory pharmacological properties.

A subclinical inflammatory reaction has been shown to precede the onset of type 2 (non-insulin-dependent) diabetes. An olive-oil-rich diet is not only a good alternative in the treatment of diabetes. It may also help to prevent or delay the inflammatory reaction of the disease.

1) To investigate the anti-inflammatory effects of optimized olive seed flour in whole blood cultures from healthy and diabetic patients.

OBJECTIVE

MATERIALS AND METHODS

• Specialised flours were obtained from olive seeds isolated from olive fruits by the company Elayo

(Castillo de Locubín, Jaén). The flours were de-fatted by supercritical fluid technology (SCF) by the

company Fluysur (Castillo de Locubín, Jaén)

MATERIALS AND METHODS

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A: 1μg/ml Phorbol 12 myristate 13 acetate +

ionomicine (PMA+IO)

B: 1μg/mL phytohaemagglutinin (PHA)

C: 1μg/mL Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS).

• The study comprised two healthy subjects and two diabetic patients. The subjects were unrelated,

recruited and diagnosed at the coverage area of basic area “Pedro Martínez” (A.G.S. NorthEast

Granada, Spain). Venous blood was collected from the cubital vein in 4-ml lithium-heparin tubes.

• 1ml samples of whole blood were incubated in 24-well plates at 37°C with and without flour extract

(25 μg/mL), and 1μg/ml Phorbol 12 myristate 13 acetate + ionomicine (PMA+IO), 1μg/mL

phytohaemaglutinin (PHA) and 1μg/mL Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) as positive controls.

• The production of interleukin 1(beta) (IL-1β) and inducible nitric oxide (iNOS) was measured by

Western blotting and further quantification

IL-1β 17 kDa

iNOS 130 kDa A

B

RESULTS I

INDUCED

INDUCED

0

50

100

150

200

250

0

50

100

150

200

250

300

350

iNO

S %

IL

-1β

%

iNOS 130kD

IL-1β 17kD

* #

* #

* # * #

* #

* #

* # * #

* #

* # * # * #

* # * # * #

* # * #

Statistically significant comparisons (p<0,05) between the control and the induced samples with and without flours *

# Statistically significant comparisons (p<0,05) between induced samples with and without flours

PRODUCTION OF iNOS AND IL-1β IN HEALTHY PATIENTS

RESULTS II

Figure 2

A

B

iNO

S %

0

50

100

150

200

250

* # * # * #

* #

&

* #

&

* #

&

* #

&

* #

&

Statistically significant comparisons (p<0,05) between the control and the induced samples with and without flours

* # Statistically significant comparisons (p<0,05) between induced samples with and without flours

$ Statistically significant comparisons (p<0,05) between the control and non-induced samples with flours

RESULTS III PRODUCTION OF iNOS AND IL-1β IN

DIABETIC PATIENTS

0

50

100

150

200

250

300

350

* #

&

* #

&

* #

&

* #

&

* #

&

* # * # * #

IL-1

β %

Figure 3

A

B

iNOS 130kD

IL-1β 17kD

RESULTS IV

NO + O2

.- ONOO

- 3-Nitrotyrosine

Healthy Patient Diabetic Patient

A B

CONCLUSIONS

- Plasma samples from diabetic patients in whole blood cultures are hyper-responsive to inflammation induction by PHA, LPS and PMA+IO, as demonstrated by the increased levels of IL-1β and iNOS markers in plasma, and 3-nitrotyrosine production. - The addition of extracts from olive seed flour produced unequivocal signs of reduced inflammatory response, mainly in diabetic patients. This is likely mediated through modifications of the complex subclinical inflammatory reaction, and is witnessed here as reduced levels and/or biological activity of IL-1β, iNOS and presence of 3-nitrotyrosine. - The specific components of the olive seed flour ultimately responsible for this antiinflammatory effects are yet to be characterised. Such characterization will help to design new therapeutical approaches for these patients.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was funded through the “Excelencia projects” P2010-AGR6274 y P2011-CVI7487 (CEICE, Junta de Andalucía), BFU2011-22779 (MINECO) and a INTERCONNECTA ITC-20131031 project (CDTI, Fondo Tecnológico, MINECO and Agencia IDEA), all of them participated by ERDF funding, and PIOF-GA-2011-301550 (EC). AZ thanks the “Campus de Excelencia Agroalimentario ceiA3” for Ph. D. funding.

INVESTIGADORES EN PLANTILLA

- JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ - ANTONIO JESÚS CASTRO LÓPEZ

ESTUDIANTES DE DOCTORADO - ADORACIÓN ZAFRA ÁLVAREZ - MARIA JOSÉ JIMÉNEZ QUESADA - ESTEFANÍA GARCÍA QUIRÓS - VICTOR ALCHÉ RAMÍREZ

POSTDOCTORALES - JOSÉ CARLOS JIMÉNEZ LÓPEZ - ELENA LIMA CABELLO - ADORACIÓN ZAFRA ÁLVAREZ - JOSÉ ANGEL TRAVERSO GUTIERREZ

PERSONAL TÉCNICO

- DIANA FUENSANTA NICOLÁS LLORACH - ELISABET BUJALANCE ESPEJO - JOSE Mª BERRAL HENS

ESTUDIANTES DE MÁSTER - ISABEL MARTINEZ BEAS - IRENE GALLEGO MARTÍNEZ - Mª MAR PATÓN ÁLVAREZ - PAULA MARTÍNEZ MAZÓN

MUCHAS GRACIAS !!!!!!

Colaboraciones Proyectos/acciones concertadas

Colaboraciones regulares

Sociedades/Redes

Financiación (Proyectos Activos)

Campus de Excelencia Internacional en Agroalimentación ceiA3. Programa de Doctores en Empresas 2013. Programa de Tesis en co-tutela Internacional 2013.

El Personal

La investigación (parcialmente FEDER) Proyectos del Ministerio de Ciencia e Innovación

BFU2011-22779

Proyectos de Excelencia de la Junta de Andalucía P2010-AGR-6274, P2010-CVI5767 y P2011-CVI-7487.

Acción Marie Curie programa PEOPLE. CE. PIOF-GA-2011-301550.

Programa JAE-CSIC

Programa FPI

Convenios empresas

Inmunal

Allergenome (spin-off) Grupo Elayo

El olivo como modelo reproductivo de

plantas.

http://images.google.es/imgres?imgurl=http://weblogs.madrimasd.org/images/weblogs_madrimasd_org/universo/159/r_EEZ.jpg&imgrefurl=http://weblogs.madrimasd.org/universo/gallery/image/6166.aspx&usg=__9ScHXUjRpwGv-HQtUwSfkxoKsC4=&h=280&w=330&sz=7&hl=es&start=3&um=1&tbnid=EJ2d9qhnJR4BEM:&tbnh=101&tbnw=119&prev=/images?q=estacion+experimental+del+zaidin&hl=es&rlz=1T4SNYK_esES309ES309&sa=N&um=1

Línea 1) Identificación, caracterización y análisis de la función de productos

génicos implicados en el desarrollo del polen y pistilo y en la germinación y

crecimiento del tubo polínico. Estudio de las bases celulares y moleculares

de la (auto)polinización y la polinización cruzada. Mecanismos de

señalización implicados en la orientación y direccionabilidad del crecimiento

del tubo polínico.

Caracterización de

caleosinas y cuerpos

lipídicos.

EARLY

MICROSPORE

MATURE

POLLEN

VACUOLATED

MICROSPORE

BICELLULAR

POLLEN

TETRADMEIOCYTES

GERMINATEDPOLLEN

EMBRYO-LIKE

STRUCTURE

(DI)HAPLOID

PLANT

MULTINUCLEATEMULTINUCLEATE

STRESS TREATMENT

GAMETOPHYTIC PATHWAYGAMETOPHYTIC PATHWAY

SPOROPHYTIC PATHWAYSPOROPHYTIC PATHWAY

PMC

UPREGULATION OF THE

UBIQUITIN-MEDIATED

DEGRADATIVE SYSTEM

UPREGULATION OF THE

UBIQUITIN-MEDIATED

DEGRADATIVE SYSTEM

IRREVERSIBLE DEGRA-

DATION OF PROTEINS

CONTROLLING CELL CYCLE

IRREVERSIBLE DEGRA-

DATION OF PROTEINS

CONTROLLING CELL CYCLE

Implicación de la degradación

proteica mediada por ubiquitina

en la inducción de

androgénesis.

Perfiles proteicos del exudado

estigmático en varias especies. Clasificación funcional de proteínas

del secretoma del estigma del olivo.

Pectinas y arabino-

galactano-proteinas.

Actividad R+D+i

IX Foro INIA DE COLABORACIÓN PÚBLICO-PRIVADA “Olivar y aceite de oliva”. CÓRDOBA 20 Junio 2013

NOTICIAS: ¡¡¡ transcriptoma reproductivo del olivo (POLEN Y ESTIGMA) ensamblado y anotado !!!!

Línea 2) Alergia al polen del olivo y seguridad alimentaria en relación

al contenido y composición alergénica de panalergenos (profilinas,

proteínas de transferencia de lípidos, glucanasas, proteínas de

almacenamiento de semillas…). Caracterización de su variabilidad

genética y funcional y de sus implicaciones fisiológicas y clínicas.

Desarrollo de técnicas moleculares avanzadas de diagnosis y terapia.

Digestibilidad de proteínas 11S y su implicación en

alergenicidad potencial.

Presencia masiva de

profilinas en el grano

de polen durante la

germinación in vitro

Clasificación filogenética

de las secuencias del alérgeno

Ole e 1 en distintas variedades de

olivo.

Modelos 3-D de distintas isoformas

de profilinas presentes en el olivo.


Actividad R+D+i

http://www.biomedcentral.com/1471-2229/8/10/figure/F1

Línea 3) Caracterización de proteínas de almacenamiento en la

semilla del olivo, en subproductos de la extracción del aceite y

en co-productos novedosos resultantes del procesado

diferencial de la aceituna. Posible uso alimentario de proteínas

de almacenamiento de olivo. Caracterización de proteínas en

aceites. Identificación y caracterización de otros componentes

proteicos de interés industrial, alimentario o farmacéutico.

RADICLE

Localización de proteínas 11S en secciones

semifinas de endospermo de olivo y

tratamiento con tripsina.


Actividad R+D+i

Línea 4) Discriminación varietal del polen y muestras líquidas

(extractos clínicos y aceites de oliva) mediante características

morfológicas/moleculares (SSRs). Utilización en gestión de

germoplasma, Aerobiología, predicción de cosechas y detección de

fraudes potenciales en aceite de oliva.

Parámetros de la exina analizados

mediante MEB y valores obtenidos en 14

variedades


Detección de fraudes potenciales

en aceites de oliva

Actividad R+D+i

Geles 2-D de endospermo y cotiledón de semilla de olivo (215DAA: “days after anthesis”) de la variedad Picual y detalle de péptidos mayoritarios.

Figura 2. Descripción de las distintas

fracciones histológicas de la aceituna (% en

peso seco)

Máquina de extracción con fluidos supercríticos (equipo subcontratado a

Fluysur por BRP-EEZ-CSIC)

Transcriptome-based identification of a seed

olive legumin (11S globulin).

Characterization of subunits, 3D modelling

and molecular assessment of allergenicity.

Adoración Zafra1, José Carlos Jimenez-Lopez1, Rosario Carmona1,

Gonzalo Claros2, Juan de Dios Alché1

1Plant Reproductive Biology Laboratory. Department of Biochemistry, Cell and

Molecular Biology of Plants Estación Experimental del Zaidín. CSIC. Granada. Spain

2Department of Molecular Biology and Biochemistry. University of Málaga. Spain

[email protected]

HISTOLOGICAL CHARACTERIZATION OF THE OLIVE FRUIT. THE OLIVE FRUIT

AS A DRUPE

Nevadillo de Alhama

Mesocarp

Endocarp

Epicarp

Mesocarp

Endocarp

Seed

THE OLIVE FRUIT AS A DRUPE

THE OLIVE SEED: An unexplored and unexploited material: Endosperm + Embryo

Endocarps

Seeds

ENDOSPERM a ENDOSPERM b

EM

BR

YO

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was supported by the following European Regional Development Fund co-financed grants:

RTC-2015-4181-2 (MINECO), 201540E065 (CSIC) and P2010-AGR-6274 and P2011-CVI-7487 (Junta de

Andalucía). A. Zafra thanks the Agrifood Campus of International Excellence ceiA3/Elayotecnia S.L. for grant

funding. This research was also partially supported by the European Research Program MARIE CURIE (FP7-

PEOPLE-2011-IOF), under the grant reference number PIOF-GA-2011-301550 to JCJ-L and JDA. JCJ-L thanks

the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness for the grant ref. number RYC-2014-16536 (Ramón y

Cajal Research Program)

The authors also gratefully acknowledge Rocío Bautista

(PAB) for helpful discussions and bioinformatic

counselling, and Josefa Gómez Maldonado for highly

valuable pyrosequencing at the sequencing facilities of

the University of Málaga.

OBJETIVO 1:

DESARROLLO DE NUEVAS

TECNOLOGÍAS PARA AVANZAR EN LA

"DECONSTRUCCIÓN DE LA ACEITUNA"

HACIA LA EXTRACCIÓN OPTIMIZADA DE

PROTEÍNAS.

OBJETIVO 2:

CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE LA ACEITUNA

Y DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS

OBJETIVO 3:

DETERMINACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COMPONENTES

PROTEICOS NO ENZIMÁTICOS DE LA SEMILLA DEL

OLIVO

OBJETIVO 4:

DETERMINACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COMPONENTES ENZIMÁTICOS DE LA SEMILLA DEL

OLIVO.

OBJETIVO 5:

APLICACIONES DE LAS PROTEÍNAS DE

SEMILLA DE OLIVO EN LA ELABORACIÓN DE

PIENSOS PARA LA ALIMENTACIÓN DE

ERIZO DE MAR PRODUCIDO EN PISCIFACTORÍAS

Tarea 1.A.: Estudio de un nuevo proceso en planta piloto de deconstrucción de la aceituna

Tarea 1.B.: Desarrollo de un proceso para la obtención de harina desengrasada de semilla de hueso de aceituna

Proteínas y Enzimas de harinas

optimizadas de semilla de OLIvo para uso en alimentación

de organismos MARinos

(PROTEOLIMAR)

Tarea 2.A: Análisis histológico de secciones de frutos de variedades relevantes.

Tarea 2.B.: Análisis histológico de secciones de las fracciones obtenidas.

Tarea 3.B.: Aproximaciones proteómicas a la caracterización de los componentes proteicos no enzimáticos

Tarea 4.A.: Análisis de perfiles proteicos native-PAGE y actividades in-gel de las fracciones y harinas obtenidas

Tarea 3.A.: Análisis de perfiles proteicos SDS-PAGE de las fracciones y harinas obtenidas

Tarea 5.A. Diseño experimental: formulación de los piensos y ajuste de la dieta

Tarea 4.B.: Aproximaciones proteómicas a la caracterización de los componentes proteicos enzimáticos

Tarea 1.C.: Desarrollo de un proceso de fraccionamiento de la harina de semilla de olivo en: proteína del resto de componentes

Tarea 5.B. Puesta a punto de la estabulación experimental y la selección de erizos de mar.

Tarea 5.C. Seguimiento de parámetros biométricos en los erizos de mar.

Tarea 5.D. Análisis, interpretación de resultados y elaboración del informe final

OBJETIVO 6: INCORPORACIÓN DEL PRODUCTO ELABORADO A LA RED COMERCIAL

Tarea 6.A.: Adaptación de las formulaciones desarrolladas en Planta Piloto a Línea de producción

OBJETIVO 1:

DESARROLLO DE NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA AVANZAR EN LA "DECONSTRUCCIÓN DE LA ACEITUNA" HACIA

LA EXTRACCIÓN OPTIMIZADA DE

PROTEÍNAS.

OBJETIVO 2:



OBJETIVO 3:


PROTEICOS NO ENZIMÁTICOS DE LA SEMILLA DEL OLIVO

OBJETIVO 4:


ENZIMÁTICOS DE LA SEMILLA DEL OLIVO.

OBJETIVO 5:





Tarea 1.A.: Estudio de un nuevo proceso en planta piloto de deconstrucción de la aceituna

Tarea 1.B.: Desarrollo de un proceso para la obtención de harina desengrasada de semilla de hueso de aceituna




(PROTEOLIMAR)

Tarea 1.C.: Desarrollo de un proceso de fraccionamiento de la harina de semilla de olivo en: proteína del resto de componentes

OBJETIVO 1:

DESARROLLO DE NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA AVANZAR EN LA "DECONSTRUCCIÓN DE

LA ACEITUNA" HACIA LA EXTRACCIÓN

OPTIMIZADA DE PROTEÍNAS.

OBJETIVO 2:

CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE

LA ACEITUNA Y DE LAS FRACCIONES

OBTENIDAS

OBJETIVO 3:



OBJETIVO 4:



OBJETIVO 5:

APLICACIONES DE LAS PROTEÍNAS DE SEMILLA

DE OLIVO EN LA ELABORACIÓN DE PIENSOS PARA LA

ALIMENTACIÓN DE ERIZO DE MAR PRODUCIDO EN PISCIFACTORÍAS




(PROTEOLIMAR)

Tarea 2.A: Análisis histológico de secciones de frutos de variedades relevantes.

Tarea 2.B.: Análisis histológico de secciones de las fracciones obtenidas.

OBJETIVO 1:

DESARROLLO DE NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA AVANZAR EN LA "DECONSTRUCCIÓN DE LA ACEITUNA" HACIA

LA EXTRACCIÓN OPTIMIZADA DE

PROTEÍNAS.

OBJETIVO 2:



OBJETIVO 3:



OBJETIVO 4:



OBJETIVO 5:








(PROTEOLIMAR)

Tarea 3.B.: Aproximaciones proteómicas a la caracterización de los componentes proteicos no enzimáticos

Tarea 3.A.: Análisis de perfiles proteicos SDS-PAGE de las fracciones y harinas obtenidas

Tarea 4.A.: Análisis de perfiles proteicos native-PAGE y actividades in-gel de las fracciones y harinas obtenidas

Tarea 4.B.: Aproximaciones proteómicas a la caracterización de los componentes proteicos enzimáticos

OBJETIVO 1:





PROTEÍNAS.

OBJETIVO 2:



OBJETIVO 3:



OLIVO

OBJETIVO 4:


OLIVO.

OBJETIVO 5:








(PROTEOLIMAR)

Tarea 5.A. Diseño experimental: formulación de los piensos y ajuste de la dieta

Tarea 5.B. Puesta a punto de la estabulación experimental y la selección de erizos de mar.

Tarea 5.C. Seguimiento de parámetros biométricos en los erizos de mar.

Tarea 5.D. Análisis, interpretación de resultados y elaboración del informe final

OBJETIVO 1:





PROTEÍNAS.

OBJETIVO 2:



OBJETIVO 3:



OLIVO

OBJETIVO 4:


OLIVO.

OBJETIVO 5:








(PROTEOLIMAR)

OBJETIVO 6: INCORPORACIÓN DEL PRODUCTO ELABORADO A LA RED COMERCIAL

Tarea 6.A.: Adaptación de las formulaciones desarrolladas en Planta Piloto a Línea de producción

Semillas de algunas variedades de aceituna


En el caso de secciones de mesocarpo, se intentó realizar secciones de fragmentos completos comprendidos

entre el endocarpo y el epicarpo, conteniendo éste último. Como carácterísticas esenciales se observó la

presencia de una epidermis de grosor variable, una serie de capas subepidérmicas y un amplio panel de

células parenquimáticas conteniendo un número variable de inclusiones lipídicas, provenientes de la

cohalescencia de cuerpos lipídicos. No se observaron cuerpos lipídicos individualizados en el estadio

analizado. Se observó frecuentemente la presencia de inclusiones intranucleares, ya descritas por el grupo

de investigación en distintos tejidos del olivo con diversa incidencia en las distintas variedades analizadas.

También se observó en muchos casos la notable presencia de estructuras, recientemente caracterizadas

como peroxisomas. En este caso se observó un gradiente descendente en la presencia de dichas

estructuras entre las zonas del mesocarpo más cercanas al epicarpo y las más cercanas a endocarpo.

También se observó un gradiente en el sentido opuesto, relativo a la presencia de traqueidas y otras

estructuras como tejido conductores, ampliamente lignificadas en la cercanía del endocarpo. Se

observaron claras diferencias en la frecuencia de estos componentes entre las distintas variedades

analizadas, así como en parámetros como el número de capas subepidérmicas, el grosor de la cutícula, y

aparentemente en el número y tamaño de las inclusiones lipídicas presentes en las células del mesocarpo.

En cuanto a los tejidos de la semilla, fueron analizados independientemente fragmentos de endospermo + testa,

y de embriones de cada una de las variedades.

En ambos casos es notoria la presencia de células parenquimáticas con amplio contenido en cuerpos proteicos

y cuerpos lipídicos individualizados, en diversos estratos o capas de células. Es notoria la diferencia entre

la fina epidermis presente en los embriones, y las gruesas capas epidérmicas presentes en el endospermo,

en muchos casos con engrosamientos multicapa causantes de la amplia y diferencial ornamentación de la

testa en las distintas variedades analizadas.



- Seed storage proteins (SSPs) are fundamental molecules for seed germination as an important source of carbon and nitrogen. Among the main four protein families that integrate SSPs, legumins (11S globulins) are widely distributed in dicots, and represent the major contribution to the pool of seed proteins in olive. - In the present study, we have used an olive seed transcriptome generated de novo by 454/Roche Titanium+ sequencing to identify a broad panel of 11S protein sequences. Among these identified legumin sequences, five were selected using their presence within the output results from the BLASTP alongside the whole NCBI database, and their clustering with previously-characterized 11S sequences in the phylogenetic analysis as the criteria. The selected sequences were identified as corresponding to the isoform 2 of the 11S protein precursor. - One of the sequences was used for further analysis. Individual acidic and basic subunits within this sequence were recognised, 3D-modeled and assessed as regard to their potential molecular interaction by docking methods. Furthermore, T-cell epitopes were forecast by using predictive software in order to evaluate the putative implications of the olive 11S proteins in food allergy.

CONCLUSIONS

EFECTOS INMUNOLÓGICOS SOBRE PACIENTES SANOS DEL CONSUMO DE TRES ACEITES DE OLIVA VIRGEN CON CONTENIDO DIFERENCIAL EN COMPUESTOS BIOACTIVOS

ESTUDIO DE LOS BENEFICIOS DEL CONSUMO DE LOS

ACEITES OBTENIDOS PARA LA SALUD HUMANA

componentes proteicos de alto valor añadido en la semilla del olivo: proyecto proteolimar de...

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