aspectos ambientales del uso de glifosato (version para imprimir)

7/30/2019 Aspectos Ambientales Del Uso de Glifosato (Version Para Imprimir)

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Aspectos Ambientales del Uso de

Glifosato

Editoras:

Myriam CaminoTcnico del grupo

Manejo y Calidad de Suelos y Aguasrea de Investigaciones en Agronoma

INTA, EEA Balcarce

Virginia AparicioInvestigadora del grupo

Manejo y Calidad de Suelos y AguasCoordinadora de PE de INTA

INTA, EEA Balcarce


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Introduccin

Con satisfaccin desde el rea Estratgica GestinAmbiental de INTA damos la bienvenida a los especialistasconvocados al Taller Aspectos Ambientales del Uso de Glifosato.Este herbicida, de amplia y dominante utilizacin en la agricultura deArgentina, con varios millones de litros aplicados en asociacin condiversos cultivos, principalmente la soja, est en la mira de lasociedad por preocupaciones para la salud, tanto del ambiente como

humana.Sin dudas, es una actitud responsable de las institucionescontribuir con informacin cientfica y metodologas precisas paracomprender su destino en el ambiente. Estimar los riesgospotenciales de contaminacin en cuerpos de agua superficial,subterrnea y en el suelo es fundamental para establecerrecomendaciones de manejo de los agroqumicos utilizados en lossistemas productivos del pas. Estas estimaciones debern basarseen la informacin generada en las investigaciones del pas as comolas generadas a nivel internacional.

En general, los principios activos tienen dos componentesen su toxicidad, una es la inherente a la molcula y otra a la posibleexposicin de los organismos vivos. Siempre hay riesgo, an en losproductos menos txicos, y en la mayora de los casos, losproblemas de toxicidad en el ambiente se magnifican si el uso de lasustancia no se hace en forma adecuada o siguiendo lasindicaciones de los marbetes.

En el caso especfico del glifosato, quizs uno de losproblemas asociados es la simplificacin del paisaje que tiene lugarcomo resultado de la desaparicin de las coberturas vegetalescircundantes a los campos de cultivos, y que afectan el hbitat parala diversidad de especies y los procesos ecolgicos que estasdesempean en el ecosistema. Por esta razn, no solo debemosconsiderar los aspectos toxicolgicos asociados a los agroqumicos,sino todos los efectos secundarios que pueden resultar de susaplicaciones, sobre todo, si estas ocurren a grandes escalasespaciales y con repeticin en el tiempo.


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Sin dudas, este taller interinstitucional e interdisciplinario,arrojar luz sobre los aspectos metodolgicos para la deteccin deresiduos de glifosato en muestras ambientales y contribuir a reunirlos resultados relevantes generados en Argentina. Por otra parte, elaporte de especialistas internacionales brindar nuevas capacidadesy relaciones para ahondar en la generacin de conocimientoscientficos. Sin embargo, estimulamos a los especialistas a pensaren forma integral, y aportar las mejores recomendaciones desde locientfico para minimizar los impactos ambientales y maximizar losbeneficios en el uso de esta tecnologa.

Mara Elena ZaccagniniCoordinadora Nacional INTA

rea Estratgica Gestin Ambiental

El proceso de intensificacin productiva de las ltimasdcadas, que acompa a los cambios de contexto socio-econmicode nuestro pas, produjo un incremento notable de la produccin degranos. Su continuidad puede conducir a alteraciones ambientalesde magnitud global, no slo sobre la calidad de vida de la poblacinrural y consumidores en general, sino tambin sobre lasoportunidades de exportacin de productos diferenciados y sobre la

propia capacidad productiva de los sistemas agropecuarios, amediano y largo plazo.

Dicho proceso conlleva la incorporacin creciente deproductos fitosanitarios, siendo los herbicidas los que ocupan laparte mayoritaria del volumen comercializado. Ellos reemplazaron eluso de energa mecnica por la qumica para el control de malezas yacompaaron la introduccin de soja transgnica cultivada bajosiembra directa, cuya adopcin masiva transform al glifosato en elherbicida ms utilizado, y fuente de controversias actuales sobre su

potencial carcinognico.Nuestra institucin, tempranamente, y en concordancia conlos grandes cambios enunciados, incluy el estudio de la variableambiental en el proceso de intensificacin productiva. Es as quealgunos grupos de trabajo, particularmente los vinculados conproyectos de contaminacin de suelos y aguas por agroqumicos,decidieron asociarse intra e inter institucionalmente para ocuparsede dicha problemtica. Desde la coordinacin del Proyecto Propio


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de la Red del rea Estratgica de Gestin Ambiental (Desarrollo deconocimiento y tecnologas para mitigar la contaminacin de suelo yagua bajo produccin agropecuaria) consideramos prioritariodesignar a la Unidad Integrada FCA-INTA Balcarce encargada decoordinar los temas vinculados con los herbicidas y para ello,resultaba imprescindible que este nodo se dotase del instrumentalms avanzado y que incorporara personal especializado para poderasistir a todos aquellos nodos que integran la red de medicionesactuales. Varios aos despus de esos primeros logros, con gransatisfaccin, asistimos a la realizacin de este Taller sobre AspectosAmbientales del Uso de Glifosato, el cual, nos permitir ir ms lejosen la comprensin de sus vas de degradacin ambientales y en lasgestiones necesarias para disminuir su impacto. Por otro lado,

sentar las bases para actualizar la informacin a nivel nacional yhar posible la integracin y articulacin necesarias para llevaradelante los futuros trabajos de investigacin.

Adrin AndriuloCoordinador interino PPR Contaminacin

INTA, EEA Pergamino


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ndice

Anlisis de Residuos de Plaguicidas Polares, con 9

especial enfasis en el Herbicida Glifosato: ProblemticaAnaltica.Flix Hernndez

Comportamiento del Glifosato en la interfase agua: 17slido. Una aproximacin al estudio en suelos.Maria dos Santos Afonso.

Competencia Glifosato Fosfato por la Superficie 25de Minerales. Estudio por ATR FTIR.Carolina Waiman, Carina Luengo y Graciela Zanini

Anlisis de Residuos de Glifosato en Muestras 31Ambientales y Alimentos. Maitre, Mara Ins., Eduardo. Lorenzatti;Argelia. Lenardon; Susana. Enrique.

Anlisis de Glifosato y AMPA en Balcarce: 35Cromatografa Liquida y Espectrometra de masas.Manuel J. Zelaya, Jos L. Costa, Francisco Bedmar,

,Virginia Aparicio,

Valeria Gianelli, Elena Okada, Mara Eugenia Kloosterman

Ana Mara Gmez Ortiz

Toxicidad de Glifosato en Peces Autctonos: Estudios de 57Laboratorio y Campo. Pedro Carriquiriborde

La soja y sus agroqumicos: evaluando impactos en anfibios. 69Julie C. Brodeur

Efecto del Herbicida Glifosato sobre el Estado Oxidativo en 77Hgado de Ratas Preadas y sus Fetos. Beuret Cecilia.,.Daurich Jorgelina, Zirulnik Fanny, Gimnez Sofa.

The Danish Pesticide Leaching Assessment Programme 79a post registration monitoring programme. Preben Olsen,Jeanne Kjr and Walther Brsch, Ruth Grant

Impacto de plaguicidas en ambientes acuticos pampeanos: 85Integracin de estudios qumico ecotoxicolgicos enexperimentos de campo y laboratorio, con especial nfasisal caso del glifosato. Alicia E. Ronco


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Transporte de glifosato en el perfil un suelo del sudeste 95Bonaerense . Jos Luis Costa, Virginia Aparicio, Manuel Zelaya,Valeria Gianelli y Francisco Bedmar

Prdidas de Glifosato por Drenaje y Escurrimiento y 103Riesgo de Contaminacin de Aguas. Carolina. Sasal,Adrian. Andriulo, Marcelo. Wilson, Silvina Portela


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Anlisis de Residuos de Plaguicidas Polares,con especial enfasis en el Herbicida

Glifosato: Problemtica Analtica.

Flix HernndezInstituto Universitario de Plaguicidas y Aguas

Laboratorio de Anlisis de Residuos de PlaguicidasUniversidad Jaume I, Castelln, Espaa

La determinacin de residuos de plaguicidas se ha llevadotradicionalmente a cabo mediante tcnicas cromatogrficas, tantoGC como LC, usando diferentes tipos de detectores. El

acoplamiento GC-MS ha sido, sin duda, la tcnica de referenciadurante muchos aos en este campo. Sin embargo, la retiradapaulatina de la mayora de plaguicidas tradicionales (ej.- OCs ymuchos OPs) por motivos de toxicidad y persistencia en el medioambiente, ha provocado la introduccin de nuevas materias activas,de menor toxicidad y ms fcilmente degradables. La mayora deestos nuevos pesticidas son ms polares, incluso de tipo inico, y sudeterminacin mediante GC-MS resulta problemtica. Este hecho,

junto con los grandes avances producidos en el acoplamiento LC-

MS en los ltimos aos, ha provocado que la tcnica LC-MS seacada vez ms utilizada, de modo que en la actualidad se haconvertido en imprescindible en los laboratorios especializados enanlisis de residuos de plaguicidas (ARP).

A diferencia de GC-MS en donde el analizador de quadrupolopermite obtener buenos resultados analticos, en LC-MS esteanalizador resulta menos adecuado por el elevado ruido de fondo y,especialmente, por la suave ionizacin producida en las interfasesAPI, lo que conduce auna pobre fragmentacin y espectros MS con

pocos iones (generalmente [M+H]+

). Hoy en da, el analizador msatractivo en ARP es el de triple cuadrupolo (QqQ), que permitetrabajar en modo tndem MS, con excelente sensibilidad yselectividad gracias a la adquisicin de transiciones especficas(modo de trabajo SRM), que difcilmente son compartidas por otroscomponentes de la matriz. LC-MS/MS QqQ es una tcnica muypoderosa, con un excelente potencial para el anlisis rpido,sensible y fiable de la gran mayora de plaguicidas y sus


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metabolitos, con la excepcin de los compuestos ms apolares y/ovoltiles, como piretroides y algunos OPs (1,2,3). Con el uso de, almenos, dos transiciones especficas (se debe evitar, en lo posible, laseleccin de transiciones genricas, como prdidas de H2O, CO2,NH3, HCl), se consigue una alta selectividad y especificidad, ademsde una disminucin notable del ruido de fondo, lo que redunda enmuy bajos lmites de deteccin. Por otro lado, con dos transiciones yla evaluacin de la relacin de intensidades (Q/q ratio), se minimizanlos riesgos de reportar falsos positivos o falsos negativos en lasmuestras analizadas (4).

En este trabajo, se presentan las principales aplicaciones de LC-MS/MS QqQ en ARP, prestando especial atencin a plaguicidasparticularmente problemticos desde el punto de vista analtico,

como fosetil, etefon, melamina (metabolito de la ciromazina),abamectina y azadiractina, o glifosato. La exposicin se centra en laproblemtica analtica del glifosato, especialmente en muestras deaguas y suelos.

El glifosato [N-(phosphonomethyl)glycine] (GLY) es un herbicidano selectivo, de post-emergencia, de amplio espectro, ampliamenteutilizado para el control de las malas hierbas. Introducido porMonsanto en la dcada de los 70 como principio activo delformulado Round Up, es posiblemente el herbicida ms utilizado

en la actualidad en todo el planeta. Diversos estudios handemostrado que una vez aplicado el GLY, ste es fuertementeadsorbido por los componentes del suelo, tales como arcillas, xidosde hierro y cidos hmicos. Adems, sufre una importantedegradacin, principalmente de tipo biolgico, siendo su metabolitomayoritario el cido aminometilfosfnico (AMPA). De acuerdo conestos datos, no sera previsible su presencia en altasconcentraciones en las aguas subterrneas y/o superficiales. Sinembargo, diversos autores han reportado niveles de GLY y AMPA

del orden de ppb en aguas, especialmente en las superficiales.Nuestro propio grupo de investigacin ha realizado controles

peridicos de GLY y AMPA en aguas, habiendo detectadohabitualmente ambos compuestos. As, en un estudio realizadosobre 50 muestras de aguas subterrneas y superficiales de laComunidad Valenciana (Espaa), en entornos con fuerte actividadagrcola, se detect GLY en el 25% de las muestras analizadas, enconcentraciones que variaron entre 0.06 y 0.48 g L-1, mientras que


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el AMPA se detect en el 40% de las muestras, con niveles entre0.05 y 0.18 g L-1. La frecuente deteccin de AMPA, tanto en aguascomo en suelos, es indicativa de la degradacin del GLY en elmedio ambiente.

Las caractersticas fsico-qumicas del GLY son muy diferentes alas de la mayora de herbicidas, debido a su carcter anfotrico yelevada polaridad. Sus propiedades anfotricas se deben a lapresencia de grupos cidos y bsicos en su molcula. Con cuatropK caractersticos (pK1=0.8, pK2=2.2, pK3=5.5, pK4=10.1) (5) seencuentra normalmente en forma inica (generalmente con carganeta negativa en casi toda la escala de pH, aunque puede presentarcarga positiva a pH


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uracilos, sobre los que existe mucha ms informacin al respecto, esmotivo de preocupacin sobre todo en pases del mbitolatinoamericano, en los que existen amplsimas reas dedicadas alcultivo de variedades transgnicas de soja o maz, resistentes alglifosato. El uso de este herbicida en estas circunstancias es muyelevado, pero a pesar de ello, existen pocos programas eficaces decontrol en las aguas y suelos.

La mayora de los mtodos analticos reportados soncomplicados, con una preparacin de la muestra larga y compleja.LC-MS/MS es una tcnica muy poderosa y se muestra como la msatractiva actualmente para el anlisis de residuos de estecompuesto. A pesar de sus excelentes caractersticas analticas, losmtodos basados en LC-MS/MS requieren normalmente una etapa

de derivatizacin previa, con el fin de mejorar la separacincromatogrfica y facilitar la retencin de GLY y AMPA en el procesode pre-concentracin (ejemplo, SPE en anlisis de aguas). Se hanpropuesto varios reactivos para su derivatizacin, pero sin duda losms usados son OPA y FMOC. En los ltimos aos, nuestro grupode investigacin ha desarrollado varias metodologas, todas ellasbasadas en la derivatizacin previa con FMOC. En los mtodosinicialmente propuestos se utiliz acoplamiento LC-LC (columnswitching) con deteccin por fluorescencia, para el anlisis de estos

compuestos en aguas (6,7), suelos (8) y productos vegetales (9). Latcnica LC-LC-FD proporcion excelentes resultados y supuso unnotable avance en el anlisis de residuos de glifosato, llegando aalcanzar los bajos LODs requeridos en este tipo de anlisis.

Con la irrupcin de LC-MS/MS, la metodologa desarrollada enla dcada de los 80 y 90 se pudo renovar y actualizar, de modo queesta tcnica ha sido la base de nuevos mtodos, con excelentesensibilidad y selectividad, que se han aplicado con xito a aguas ysuelos (10,11). Estos mtodos permiten la determinacin de GLY y

AMPA en aguas, previa derivatizacin con FMOC en medio borato,usando una pre-concentracin en lnea (SPE-LC-MS/MS). Medianteesta aproximacin analtica es posible determinar de modo fiableniveles de GLY y AMPA del orden de unos pocos ng L-1, usandomenos de 5mL de muestra. Para la determinacin en suelos, no fuenecesaria la pre-concentracin en lnea, sino ms bien al contrario,la dilucin de los extractos alcalinos antes de la derivatizacin. Otrosautores han usado una metodologa similar para determinacin de


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GLY y AMPA en lodos de depuradora, pero realizando laderivatizacin sobre soporte slido con resina intercambiadoraaninica fuerte (12).

A pesar de los buenos resultados obtenidos en los suelos yaguas analizados en Espaa, hemos encontrado dificultadesaadidas en suelos con elevada carga orgnica, caractersticos dealgunas reas de cultivo de pases latinoamericanos. La mayorcomplejidad de estos suelos obliga a realizar un estudio analticomuy detallado, con el fin de encontrar una solucin satisfactoria paraeste tipo de muestras. Adems de evaluar la eficiencia de la etapade extraccin (generalmente se lleva a cabo en medio alcalino,tpicamente con KOH), parece necesario aplicar una etapa depurificacin en suelos de matriz compleja para reducir el fuerte

efecto matriz observado y facilitar la cuantificacin a bajos niveles.El uso de columnas cromatogrficas especiales, diseadas para laseparacin de compuestos inicos, es otra de las alternativas que seest actualmente investigando pues esto permitira determinar GLYsin necesidad de llevar a cabo una etapa de derivatizacin.

Bibliografa

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Re-evaluation of glyphosate determination in water by liquidchromatography coupled to electrospray tandem massspectrometry, J Chromatogr A, 1134, 51-55 (2006)

(12)A Ghanem, P. Bados, L. Kerhoas, J. Dubroca, J. Einhorn,Glyphosate and AMPA analysis in Sewage Sludge by LC-


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MS/MS after FMOC derivatization on strong anion-exchangeresin as solid support, Anal Chem, 79, 3794-3801(2007)


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Comportamiento del Glifosato en la interfaseagua: slido. Una aproximacin al estudio en

suelos.Maria dos Santos Afonso

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires

Los fosfonatos son sustancias que poseen una gran afinidadpara la formacin, en solucin acuosa, de complejos con los metalesde transicin (Barja et al., 2001, and references cited therein) pero

tambin tienen una gran afinidad por la superficie de los oxidos dehierro y aluminio (Nowack and Stone, 1999; Sheals et al., 2001;Barja and dos Santos Afonso, 2005). Estas propiedades juegan unrol muy importante a la hora de evaluar el comportamiento y eltransporte de estos compuestos en el medio ambiente.

Los fosfonatos son utilizados mundialmente en muchsimasaplicaciones, que van desde el tratamiento de aguas hasta losplaguicidas. En este sentido el componente activo del herbicida msutilizado a nivel mundial, herbicida no selectivo, de amplio espectro yde aplicacin en postemegencia, comnmente conocido comoglifosato, es la N-fosfonometilglicina (PMG) (Barja et al., 2001).

Una vez que es aplicado, el PMG puede alcanzar el suelo y sertransportado a otras reas o ser inmovilizado en el suelo.

La tendencia del PMG a la formacin de compuestos decoordinacin es conocida. PMG forma complejos estables con loscationes en solucin acuosa (Barja and dos Santos Afonso, 1998;Barja et al., 2001; Sheals et al., 2001, Gimsing and dos SantosAfonso, 2005) y sus constantes de estabilidad han sido publicadaspreviamente (Madsen et al., 1978; Appleton et al., 1986; Smith andRaymond, 1988; Dhansay and Linder, 1993, Popov et al., 2001).

La inmovilizacin en suelos ocurre por adsorcin (Piccolo et al.,1994; Gerritse et al., 1996; Morillo et al., 2002; Gimsing et al., 2004),a travs de la coordinacin del PMG a los metales que constituyenlos minerales que lo componen (xidos y arcillas) llevando a laformacin de complejos superficiales. As, el tiempo de residenciade este compuesto en el suelo es una funcin de su retencin en elmismo y est afectada por la composicin mineralgica del suelo.


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El contenido de arcillas en suelos, el tipo de arcilla y sucapacidad de intercambio cationico, son parmetros importantes a lahora de evaluar la adsorcin (Glass, 1987; Dion et al., 2001; deSantana et al., 2006). Usualmente, las isotermas de adsorcin sonajustadas mediante los modelos de Freundlich (Glass, 1987;McConnell and Hossner, 1989; Dion et al., 2001), Freundlichextendido (de Jonge et al., 2001) o Langmuir (Piccolo et al., 1994;Dion et al., 2001; Pessagno et al., 2005).

Los coeficientes de adsorcin en suelos y minerales obtenidos apartir de los experimentos en batch pueden ser utilizados parapredecir la movilidad y el destino de los contaminantes en losambientes naturales.

Resultados y discusin

Se obtuvieron las isotermas de adsorcin de PMG sobrefracciones de suelos de las provincias de Santa Cruz, Misiones yCorrientes.

Los principales componentes de los suelos de Misiones yCorrientes son cuarzo, caolinita y xidos de hierro mientras que parael suelo de Santa Cruz son cuarzo, feldespatos y montmorillonita.Entre todos estos minerales el cuarzo es el que tiene menor rea

superficial y menor afinidad por el PMG.Los resultados experimentales se ajustaron utilizando los

modelos mencionados previamente. Se calcularon losrecubrimientos mximos, normalizados con respecto a la superficieespecifica y las constantes de afinidad del ligando por la superficie yse compararon los resultados con los obtenidos para los mineralespuros.

Los minerals arcillosos muestran que el proceso de adsorcinocurre en pasos sucesivos (Damonte et al., 2007) que corresponden

a adsorcin en sitios superficiales estructuralmente diferentes. Abajas concentraciones de PMG la adsorcin solo ocurre en un tipode sitio y a medida que la concentracin de PMG aumenta los otrossitios contribuyen a la adsorcin.

Se encontr la secuencia goetita > caolinita > illita >montmorillonita para la adsorcin. Tambin se encontr que lamateria orgnica (OM) contribuye a la adsorcin es decir que el


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recubrimiento superficial, , aumenta con el aumento en elcontenido de OM y de hierro.

La adsorcin disminuye con el incremento en el pH lo que estindicando que el proceso es anionico, similares resultados fueronencontrados por algunos autores (McConnell and Hossner, 1985;Nicholls and Evans, 1991; Morillo et al., 1997; de Jonge and deJonge, 1999; de Jonge et al., 2001; Gimsing et al., 2004). Sinembargo otros autores indican que la adsorcin de PMG en suelosno depende del pH (Sprankle et al., 1975a,b; Glass, 1987; Cheah etal., 1997). El efecto del pH puede atribuirse a las variaciones decarga sobre la molcula de PMG debido a los procesos dedisociacin acido-base y a la carga superficial de los adsorbentes(Pessagno et al., 2005; Gimsing et al., 2007), lo que lo correlaciona

con la composicin mineralgica del suelo.Por otra parte las medidas de potencial zeta realizadas en

funcin del pH utilizando slidos con y sin PMG adsorbido muestranque el punto de carga cero se corre a valores de pH ms cidosdebido al incremento de la carga sobre la superficie. El incrementode la carga se vuelve ms negativa y aumenta con la concentracinde PMG indicando que los complejos superficiales contienen unamayor densidad de carga que los formados por la interaccin de lasuperficie con el agua.

La extensin de la coordinacin superficial y su dependenciacon el pH puede ser explicada considerando la afinidad de los sitiossuperficiales por los ligandos y la dependencia de ellos con el pH.Dado que la adsorcin de aniones esta acoplada a la liberacin deiones OH-, la adsorcin se encuentra favorecida a pH bajos.

Las diferencias en los valores de las constantes de afinidad dePMG por la superficie de los slidos, KL, son atribuidas,principalmente, a las diferencias en el contenido de xidos de hierro.

Para ajustar las curvas de adsorcin se utiliza el modelo de

Langmuir, suponiendo que no hay interaccin entre loscomponentes de los slidos y que la fase mineral est compuesta dedos adsorbentes o dos clases diferentes de sitios superficiales.Considerando estas aproximaciones los valores calculados y losexperimentales tienen una buena aproximacin. Sin embargo losrecubrimientos mximos son sobreestimados para el suelo deMisiones y subestimado para el suelo de Corrientes. Estasdiferencias se pueden asignar a la cantidad de hierro incorporado en


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la estructura de la caolinita (28 y 40% respectivamente). Este hierroestructural presente en algunos minerales de las arcillas puedeafectar el grado de adsorcin y degradacin de los plaguicidas (Xuet al., 2001). La sustitucin de Al(III) por Fe(III) tiene un mayor efectosobre la reactividad de la caolinita (1:1) que en las smectitas (2:1 ).

Para el suelo de Santa Cruz las isotermas de adsorcin semodelaron utilizando la isoterma de Langmuir de dos trminos,encontrndose un buen ajuste. En este caso el grado de adsorcindebe atribuirse mayoritariamente al contenido en montmorillonita.

Conclusiones

PMG forma complejos superficiales con goetita, caolinita, illita,

montmorillonita y suelos con recubrimientos superficiales mximossimilares siendo el grado de complejacin dependiente de laconcentracin del ligando y del pH de la suspensin. La extensinde la adsorcin sobre goetita es mayor que en suelos y en losminerales arcillosos. Los resultados encontrados sugieren que elgrupo fosfonato del PMG se coordina a los sitios superficialesexternos de los slidos con formacin de complejos de esferainterna. La complejacin con los iones metlicos y la adsorcinsobre superficies minerales puede afectar la persistencia, la

distribucin y la biodisponibilidad del PMG en suelos y aguasnaturales.

Bibliografa

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Competencia Glifosato Fosfato por laSuperficie de Minerales. Estudio por ATR

FTIR.Carolina Waiman, Carina Luengo y Graciela Zanini

INQUISUR (UNS-CONICET)- Departamento de QumicaUniversidad Nacional del Sur

Los beneficios que los plaguicidas han brindado a laproduccin de los cultivos son incuestionables, pero es importante

resaltar que solamente una parte de lo que se aplica ejerce sufuncin, el resto es distribuido en el ambiente. La presencia de estasespecies en aguas subterrneas y cuerpos de agua natural es untema que nos preocupa desde varios puntos de vista: desde lasalud, desde lo ecolgico, desde lo ambiental, desde lo productivo,etc.

En nuestro pas, el control de malezas es casi exclusivamentequmico y uno de los pesticidas ms utilizados es el glifosato. Luegode su aplicacin, el destino del glifosato en el ambiente va adepender de su capacidad de interactuar con el medio natural. Elsuelo es uno de los principales responsables de la movilidad de estetipo de sustancias ya que la mayora de los procesos qumicos ybiolgicos que determinan la retencin y el transporte de losplaguicidas ocurren en la superficie del suelo. Estos procesosincluyen fenmenos de adsorcin, degradacin qumica,degradacin biolgica, etc. (Cheng, 1990)

El estudio de la interaccin del glifosato con los componentesorgnicos e inorgnicos del suelo puede brindar informacinimportante para predecir y comprender su comportamiento en elambiente. Los constituyentes de la fase slida del suelo tales comolas arcillas y los xidos de aluminio, hierro y manganeso, juegan unrol extremadamente importante. Aunque no se encuentren engrandes cantidades, tienen efectos significativos en los procesos deadsorcin-desorcin debido a su gran superficie especfica y a sureactividad (Spark, 2003).

Los procesos de adsorcin estn ntimamente relacionadoscon los sitios que la superficie del mineral posee. De esta manera,


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hay una alta probabilidad de que en un medio natural existanmuchas sustancias compitiendo con glifosato por los mismos sitiosde adsorcin y as puedan modificar su movilidad en el ambiente.Por lo tanto, un punto muy importante a considerar en el estudio delas interacciones con los componentes del suelo es la influencia delas especies que co-habitan con glifosato en el ambiente y quepueden competir con l por los sitios de adsorcin. Dentro de esasespecies se encuentran los iones del tipo fosfato, naturalmenteexistentes en los suelos y en muchos casos en aumento por laaplicacin excesiva de fertilizantes (Gimnsing, 2004; Bogaard,2008).

Este trabajo presenta un estudio de cmo el fsforo, como ionfosfato (PO4

3-), afecta la adsorcin de glifosato sobre la superficie

de goethita (-FeOOH) sinttica, usada como modelo del mineralgoethita presente en suelos. Esto se determin por medio deespectroscopia ATR-FTIR.

La espectroscopa ATR-FTIR permite registrar in situ cmovara la cantidad de glifosato adsorbido a medida que transcurre eltiempo y adems tiene la ventaja de permitir identificar a lasespecies adsorbidas sobre la superficie del slido. De esta manera,tambin hace posible registrar cuando el glifosato es desorbido porla presencia de iones fosfato.

Se realizaron estos estudios a pH = 4,5; 6 y 8. En la figura 1se muestra la informacin que brindan los espectros de ATR-FTIRcuando se adiciona una solucin de fosfato al glifosato adsorbidosobre goethita a pH: 4,5.

En esta figura puede verse como una vez agregada lasolucin de fosfato, la bandas que corresponden al adsorbido vandisminuyendo a medida que transcurre el tiempo (flechas haciaabajo en la figura 1) y comienza a observarse el aumento de lasbandas correspondientes al fosfato adsorbido (flechas hacia arriba

en la figura 1), indicando que una especie va desplazando a la otrade sus sitios de adsorcin.


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95010501150125013501450

Longitud de onda (cm-1

)

A

bsorbancia

glifosato

fosfato

Figura 1: Espectros ATR-FTIR de glifosato y fosfato adsorbidos sobre

goethita.

La figura 2 muestra la variacin de la cantidad adsorbida deglifosato y fosfato a medida que transcurre el tiempo de reaccin,datos que pueden obtenerse del anlisis de los espectros de lafigura 1.


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Tiempo (min)

Con

centracin

(

m

ol/m

2)

Gilfosato

Fosfato

Figura 2: Desorcin de glifosato en goethita debido a la adsorcin defosfato a medida que transcurre el tiempo. pH=4,5

Como puede observarse el fosfato desplaza al glifosatoadsorbido durante las 2 horas del ensayo. Esta competencia esseguramente debida a la similitud en las estructuras qumicas deambas especies, que hace que compitan por los mismos sitios deadsorcin. El desplazamiento ocurre a los tres pH estudiados.

Estos minerales de hierro son muy reactivos, y aunque se

encuentren en poca proporcin en el suelo pueden ser responsablesde este tipo del comportamiento del glifosato en el ambiente. As,los resultados sugieren que en sistemas naturales una vez que elglifosato ha sido inmovilizado por adsorcin en lo componentesinorgnicos del suelo, la fertilizacin con especies fosforadas del tipoPO4

3- podra ser responsable de que el herbicida retorne a lasolucin del suelo pudiendo facilitar su transporte en el ambiente.


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Agradecimientos: Este trabajo es financiado por SECyT, UNS,

INTA y CONICET.


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Anlisis de Residuos de Glifosato enMuestras Ambientales y Alimentos

Mara I. Maitre, Eduardo A. Lorenzatti, Mara A.Lenardon, Susana N. Enrique .

Instituto de Desarrollo Tecnolgico para la Industria Qumica(INTEC) UNL-CONICET

En este trabajo se hace referencia a estudios realizados por elGrupo de Medioambiente del INTEC (UNL-CONICET) sobreresiduos de glifosato durante el perodo 1997-2008

La deteccin y cuantificacin de residuos se realiz en todoslos casos por HPLC con derivatizacin pos-columna., utilizando uncromatgrafo Waters TM 600 con detector de fluorescencia (470: Ex 339 nm; Em. 445 nm), columna de Exclusin Inica IC-Pak(Water) a 55C de temperatura y cido fosfrico al 0,5% como fasemvil. Como solucin oxidante se utiliz una mezcla de fosfatomonobsico de Potasio, Cloruro de Sodio, Hidrxido de Sodio eHipoclorito de calcio, siendo el complejo oftaldehido-2-mercaptoetanol el reactivo de derivatizacin. La temperatura de

reaccin fue 38C. (EPA 1990, Fabre M. Bordey T ,1992). Tngaseen cuenta que el glifosato es un analito muy difcil de analizar, yaque es inactivo en deteccin U.V (excepto en muy altasconcentraciones), siendo necesaria la derivatizacin de la molculapara deteccin por HPLC.

En el perodo 1997-1999 se monitorearon tres campos de laprovincia de Santa Fe con dos y tres aplicaciones de glifosatoisopropialamina en distintas concentraciones obtenindose residuosentre 0,3 - 4 mg kg-1 para glifosato y 0,2-0,9 mg kg-1 de AMPA (AcidoAminometilfosfnico) en plantas y granos de soja (Arregui y col2003). Estos resultados indican una deteccin de residuos deglifosato en todo el ciclo de cultivo, a niveles relacionados al tiempode aplicacin. Las concentraciones fueron mayores cuando sepulveriz el herbicida cerca de la cosecha y no se encontraronrelaciones con respecto a las dosis de aplicacin.

Estudios similares se realizaron durante los aos 2000-2001en la Provincia de Entre Ros; en este caso sobre granos de soja


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verde (utilizada para consumo humano en los pases asiticos comoalimento de alto contenido nutricional) en los que se encontraronpequeas concentraciones de ambos plaguicidas. Algunosalimentos procesados a partir de los granos de soja presentarontambin residuos de glifosato.(Lorenzatti y col 2004).

Asimismo Lorenzatti (2006) propuso una tcnica paraextraccin simultnea de residuos de endosulfan, sulfato deendosulfan, glifosato y AMPA , en granos de soja, consiguiendo laextraccin de metabolitos hidro y liposolubles a travs de un mismoprocedimiento.

El glifosato es considerado como de rpida degradacin ensuelos y aguas por los microorganismos y con alta capacidad paraadsorberse a las partculas de suelo. Sin embargo hemos detectado

una cierta capacidad de desorcin en suelos de nuestra zona, lo quepermitira (dadas condiciones de precipitaciones abundantes) lixiviara travs del suelo con la consiguiente contaminacin de los mismos.

Se trabaj con dos Argiudoles pertenecientes a las Provinciasde Santa Fe y Entre Ros, en los que se efectuaron ensayos deadsorcin y desorcin del glifosato puro y el producto Tcnico. Seestudiaron asimismo las diferencias de adsorcin a diferentes pH.

En la tabla 1 se observan los resultados obtenidos a partir delos ensayos realizados en laboratorio con el empleo de glifosato

puro y con glifosato comercial.

Tabla I: Cuadro Comparativo de la adsorcin del glifosato (cido) y unproducto comercial (sal de isopropilamonio )

Suelos Kd Kf

Argiudol Tpico99% 6,87 24,63

Argiudol TpicoProd.Com. 57,00 23,00Argiudol Acuico 99% 9,66 13,83

Argiudol Acuico Prod.Com.

41,74 17,55


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En lo referente a estudios de desorcin y movilidad deglifosato en suelo la informacin es menor y con mayorescontroversias que en el caso de adsorcin. Los resultados obtenidosa partir de las experiencias realizadas en el INTEC indicarondesorciones promedios entre el 51 y el 69% utilizando el productopuro y el comercial.

Nuestros resultados indican porcentajes relevantes deglifosato desorbido. Esta informacin es importante ya que, si elglifosato se desorbe y es lixiviado a horizontes inferiores, existramenos posibilidad de que sea degradado en condicionesanaerbicas y aumentara el peligro de contaminacin.

En nuestra regin hemos efectuado asimismo estudios detoxicidad comparada del glifosato commercial en anuros

(Lajmanovich y col 2003). Se investig el efecto del herbicida antesmencionado sobre renacuajos (Scinax nasicus (ANURA: HYLIDAE)y la influencia de la degradacin del glifosato en agua en test derenovacin y de no renovacin.

Respecto al perodo 2008-2009, en el ltimo ao se hananalizado en nuestro laboratorio 20 muestras de agua subterrneasy en slo una se encontraron vestigios de glifosato.

Para conocer la persistencia del glifosato comercial en elmedio de dilucin (medio Daphnia), paralelamente a los ensayos

crnicos con cladceros, se prepararon 8 muestras colocando eltxico en el medio de dilucin dentro de vasos de precipitado sin lapresencia de neonatos ni el agregado de alimento. stas semantuvieron en las mismas condiciones que las de los tratamientos,extrayndose una muestra cada da en que se efectu la renovacinde los recipientes de experimentacin (3 veces por semana). Encada muestra se midi la concentracin del glifosato para evaluar sudegradacin durante el tiempo y la posible aparicin del principalmetabolito (AMPA). A las concentraciones utilizadas al final del

tiempo establecido se observ una degradacin del glifosato entre34,8% y 74,53%, sin deteccin del metabolito AMPASe han efectuado asimismo experiencias de absorcin del

glifosato en las macrfitas acuticas (Pistia stratiotes L y Salviniaherzogii De La Sota), autctonas de Amrica Tropical y Subtropicalobservndose bajos niveles de captacin (3,37%, para P.Stratiotesy 1,16%. en S.Herzogii). Esto posiblemente se deba al bajo factor de


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bioconcentracin del glifosato y a la posibilidad que haya sidoadsorbido por los sedimentos.

Por ltimo se han determinando los efectos subletales en lalombriz Eisenia fetida expuesta al glifosato, a concentraciones de 0,7, 11, 18, 30 y 50 mg kg-1.No se observaron efectos sobre lasobrevivencia ni la biomasa, pero s la movilidad y la reproduccin .

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Anlisis de Glifosato y AMPA en Balcarce:Cromatografa Liquida y Espectrometra de

masas.

Manuel J. Zelaya1, Jos L. Costa

1, Francisco Bedmar

2, Virginia

Aparicio1, Valeria Gianelli

1, Elena Okada

3, Mara Eugenia

Kloosterman4,

Ana Mara Gmez Ortiz4

1 Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria INTA. Balcarce. 2 Facultad deCiencias Agrarias. Universidad Nacional de Mar del Plata. 3 Consejo Nacional de

Investigaciones Cientficas y Tcnicas4 PICT 2007 -00448- FONCYT AgenciaNacional de Promocin Cientfica y Tecnolgica.

a.- Cromatografa Liquida y Espectrometra de masas

Introduccin

La deteccin y cuantificacin de residuos de plaguicidas ensuelo y agua requiere el empleo de mtodos validados que

involucren tcnicas de pretratamiento de las muestras y el desarrolloy/o adaptacin de mtodos cromatogrficos segn las necesidadesde anlisis del laboratorio.

Por las caractersticas qumicas de las molculas de glifosato(GLY) y su principal metabolito el acido aminometilfosfonico(AMPA), se necesitan modificaciones previas de la estructuramolecular mediante reacciones qumicas que reciben el nombre dederivatizacin. Una de las ms empleadas es la que utiliza comoreactivo el 9-fluorenilmetil cloroformato (Fmoc-Cl), con la cual

mediante una sustitucin nucleoflica a nivel del grupo aminosecundario, en un medio con buffer borato a pH 9 y a temperaturaambiente, se obtienen a partir del GLY y el AMPA unos productosfluorescentes, menos polares y estables, los cuales pueden serdetectados y cuantificados por mtodos cromatogrficos condiferentes tipos de detectores: ultravioleta, conductividad,fluorescencia y espectrmetros de masas (3).


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Dado que en las etapas de derivatizacin, separacin ydeteccin, las condiciones citadas en la bibliografa difierenampliamente (3, 4, 5, 6, 7, 8), se realizaron ensayos con el objetivode adaptar dicha tcnica en funcin de la conveniencia dellaboratorio.

Materiales y mtodos

El equipamiento utilizado fue un cromatgrafo lquido de ultra-performance (UPLC Waters ) acoplado a un espectrmetro demasas triple cuadrupolo (Quattro Premier XE) (UPLC-MSMS), elcual permite la cuantificacin y confirmacin de los analitos que seestn investigando (1,2). El software operativo utilizado fue el

Masslynx 4.1 y su paquete Targelynx.Derivatizacin

Las condiciones de derivatizacin estuvieron basadas en losmtodos descriptos en la literatura (4, 5, 6, 7, 8). Las cantidades delos diferentes compuestos fueron optimizadas, as como el tiempode reaccin, empleando muestras de aguas fortificadasartificialmente con GLY y AMPA (17).

Los parmetros evaluados fueron: concentracin de FMOC_CL,

porcentaje de acetonitrilo en el producto final, tiempo de reaccin,extraccin liquido-liquido para la eliminacin de interferentesorgnicos y modificaciones de la muestra antes de la inyeccin.

Cromatografa y espectrometra

Los parmetros evaluados fueron:a. Condiciones instrumentales del espectrmetro de masas:

.Intensidades de los iones producidos en ambos modos deionizacin por Electroespray (ESI) positivo y negativo, voltajesde cono y capilar, flujo de los gases de desolvatacin y de cono,Temperaturas de la fuente y de desolvatacin y Dwell time.

b. Condiciones del UPLC: Se estudiaron el efecto de losmodificadores orgnicos (metanol y acetonitrilo) y buffer (acetatoy formiato de amonio), volumen de inyeccin, gradiente de


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separacin, temperatura de columna, linealidad, lmite decuantificacin y deteccin, efecto matriz y repetibilidad.

Resultados y discusinDerivatizacin

1. Concentracin de FMOC_CL

En la literatura en general se citan valores que van desde 0,1 gL-1(9) hasta 12 g L-1(6). En nuestro ensayo se obtuvo comoconcentracin ms adecuada 6 g L-1, (Figura 1), evidencindoseadems un efecto importante cuando la solucin de FMOC se

prepar en forma reciente respecto de una almacenada a 24 hs a5C.

Figura1. Efecto de la concentracin del FMOC-CL.

2. Porcentaje de acetonitrilo en el producto final

Debido a que el FMOC-CL es casi insoluble en agua, y el GLYes insoluble en solventes tales como acetonitrilo o acetona, sedebera encontrar la relacin Acetonitrilo/agua ms adecuada (12).En la literatura se mencionan niveles de acetonitrilo que oscilan


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entre 12 % y 50 % (9, 10, 11). En nuestra experiencia no se observun cambio en la respuesta de la derivatizacin al variar el % deacetonitrilo, partiendo desde un 10 % hasta un 65%, por lo que sedecidi trabajar con un 12 % de acetonitrilo(Figura 2).

Figura 2.Efecto del % de acetonitrilo en la derivatizacin del Glifosato conFMOC_CL.

3. Tiempo de reaccin

Los datos de literatura con respecto al tiempo de reaccindifieren ampliamente, variando desde 30 segundos (13), 0.5-1 hora(4) e incluso hasta varias horas (11). En la Figura 3, se puedeobservar que en las condiciones de nuestro ensayo, la reaccin secompletara despus de las 10 horas.


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Figura 3.Efecto del tiempo en la derivatizacin del Glifosato con FMOC-CL.

4. Extraccin liquido-liquido para la eliminacin de interferentesorgnicos

Se estudiaron 3 de los extractantes reportados en la literatura:

etilacetato, hexano y diclorometano (4,14). Los mejores resultadosse obtuvieron cuando se emple diclorometano, con una mejoraconsiderable de la forma, intensidad y relacin seal/ruido de lospicos, adems de facilitar la decantacin (Figura 4).


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Manuel J. Zelaya

Time2.00 4.00

%

2

18072008-GLIFO-1,0UG-ML-hexano09,26 F1TIC

7.71e3Area

Area%100.00

Area1917.33

Height7112

Time2.53

A- HEXANO

Manuel J. Zelaya

Time2.00 4.00

%

0

18072008-GLIFO-1,0UG-ML-1ml etil-09,26 F1TIC

1.91e4Area

Area%100.00

Area1286.83

Height5969

Time2.54

2.54392

1287

B-ETILACETATO

Manuel J. Zelaya

2.00

%

0

19072008-GLIFO-1-UG-ML- 2 M

Ti2

Figura 4.Efecto del extractante orgnico en la respuesta obtenida del sistema


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5. Modificaciones de la muestra antes de inyectarLas mismas fueron realizadas en varios trabajos, por ejemplo

Ibez et al. (5) utilizaron HCL mientras que otros autores (4,11)utilizaron buffer fosfato para acidificar. En nuestro ensayo se empleacido clorhdrico y acido frmico, sin obtener mejoras significativas enla respuesta del sistema UPLC-MSMS.

Cromatografa y espectrometra de masas

a. Condiciones instrumentales del espectrmetro de masasAl igual que en la derivatizacin, las condiciones instrumentales

varan ampliamente en la literatura cientfica (3, 5, 7, 11, 22). GLY-FMOC y AMPA-FMOC fueron analizados mediante una infusindirecta en el espectrmetro de masas, de una solucin acuosa conuna concentracin de 10 mg L-1. La intensidad de los iones fuesiempre mayor en ESI +, utilizando metanol como fase orgnica y 5mM de acetato de amonio como fase acuosa. El voltaje de cono fueoptimizado y se ajustaron los valores de Dwell time de manera deobtener como mnimo 15 puntos por pico. Para la optimizacinMS/MS se estudi la fragmentacin del [M + H]+ y, en funcin de la

energa de colisin, se seleccionaron 2 fragmentos hijas de los cualesel ms intenso se utiliz para la cuantificacin (M/Z: 88) mientras queel de menor intensidad para la confirmacin (M/Z: 213.9) (Figuras 5 y6, y Tabla 1).

Figura 5. Hijas de la molcula GLY-FMOC + H (392) a un voltaje de cono ycapilar de 20.

,,,,,

10-Mar-2009

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

10032010-GLIFO-10,97 mg-l DCM-7-MRM-+ACI FORMICO-5 625 (2.201) 1: Daughters of 392ES+2.20e588.0

77.1

179.1

124.1

101.3170.1

149.6130.0 229.2205.6193.3 369.7249.3 271 .8 283 .7 295 .8 320 .4 340 .0 358.4 381.4 395.4


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42

Figura 6. Hijas de la molcula GLY-FMOC +H (392) a un voltaje de cono ycapilar de 10.

b. Condiciones Instrumentales del UPLC:

Se seleccion como fase orgnica el metanol y como faseacuosa una solucin de 5 mM de acetato de amonio, debido a que

fueron las que generaban mayor intensidad en la respuesta delespectrmetro de masas. Como consecuencia de la mayor viscosidaddel metanolrespecto al acetonitrilo, se trabaj auna temperatura decolumna de 50 C. El gradiente de corrida comenz con un bajo %de solvente orgnico, de manera que los analitos se concentren en lacabeza de columna, con el objeto de disminuir el efecto deensanchamiento de banda extracolumnar y mejorar a su vez lasformas de los picos en los cromatogramas. A las concentracionesestudiadas y al volumen de inyeccin empleado (20 ul) no se

observaron deformaciones (tailing) en los picos que sugieransobrecarga de la columna (15, 19, 20, 21).

En la Tabla 1 se presentan las condiciones instrumentalesoptimizadas tanto del espectrmetro de masas como del sistemaUPLC, mientras que en la Figura 7, se presentan uno del loscromatogramas obtenidos, donde se puede observar los picosresueltos de GLY y AMPA.

,,,,,

10-Mar-2009

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

10032010-GLIFO-10,97 mg-l DCM-7-MRM-+ACI FORMICO-C APILAR10 624 (2.199) 1: Daughters of 392ES+

1.39e5213.9169.987.9

82.771.2123.4

97.1 141.7 157.0

178.9

195.7

184.9 204.7

392.0

310.7268.4256.3237.5219.1 293.8279.5 353.5340.4326.9 371.5


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43

2. Linealidad, lmite de deteccin y de cuantificacin

Lalinealidadse estudi en el rango de 0,10 a 30,0 ug L

-1

para elanlisis de muestras ambientales y de 1,0 a 100,0 ug L-1 para elestudio de isotermas en sus respectivas matrices. Los valoresobtenidos de los coeficientes de determinacin (r2) fueron mayores a0,99, con desvo de los residuales menores al 20 %, aplicando unaponderacin de 1/X (Figuras 8 y 9) (3, 4, 5, 15). Los limites dedeteccin obtenidos para GLY y AMPA fueron de 0.5 y 0,1 ug L-1

respectivamente, con una relacin seal/ruido mayor a 4 (peak topeak). A su vez los limites de cuantificacin fueron de 1,0 ug L -1 para

ambos compuestos, con una relacin seal/ruido mayor a 9 (peak topeak) (23). Estos valores varan segn la matriz utilizada.


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Tabla 1-Condiciones Instrumentales

Sistema UPLC

-Gradiente con fase mvil A: 5 mM de Acetato de amo-Flujo de 0.500 ml min

-1.

-Volumen de inyeccin 20 ul.

-Columna ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 um 2.1 x 5-Temperatura de columna (C) 50.-Tiempo de corrida 5min.-Tiempo de retencin de glifosato 1.40 minutos y AMP

Gradiente

Flujo ml % A

inicial 500 90

0,5 500 90

1,5 500 5

1,6 500 0

2,6 500 0

2,7 500 90

Modo: MRM ESI +Glifosato: 392 > 87.9

Volt Cono (v): 20E.de collision: 20 v

Dwell time (seg): 0.01

Modo: MRM ESI +AMPA: 334 > 155.8 (cuantificador)

Volt Cono (v): 20E.de colisin (v): 10

Dwell time (seg): 0.02

Espectrmetro de masas(Quattro Premier XE)

Voltaje del capilar (Kv) Temperatura de la fuente (C)

Temperatura de desolvatacin

Flujo del gas de cono (L/Hr) Flujo del gas de desolvatacin (

Condiciones

instrumentales

Software Masslynx 4.1 y Targelynx 4.1


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Manuel J. Zelaya

Time1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90

%

0

1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90

%

0

2010-05-02-EK-CCA 3 2: MRM of 2 Channels ES+

TIC

2.15e5

Area

1.60

334

4281

2010-05-02-EK-CCA 3 1: MRM of 2 Channels ES+

TIC

1.91e7

Area

GLIFOSATO

AMPA

Figura 7. Cromatograma de GLY y AMPA.

Figura 8.Curva de calibracin obtenida para glifosato.

Compound name: AMPA

Correlation coefficient: r = 0.999016, r^2 = 0.998033

Calibration curve: 690.887 * x + -12.8841

Response type: External Std, Area

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

Conc-0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5

Response

-0

10000

20000

Conc

Residual

-10.0

0.0

10.0


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46

Figura 9. Curva de calibracin obtenida para AMPA.

3. Efecto matriz

En todas las matrices analizadas, se investig la presencia oausencia de efecto matriz, por medio de la tcnica del agregado de

una cantidad conocida del analito y su posterior comparacin con lasreas obtenidas en una muestra de agua nanopure fortificadaartificialmente. En la Tabla 2 se muestran las ecuaciones deregresin lineal obtenidas a partir de las curvas de calibracin,realizadas con diferentes matrices (CaCL2, suelos de Anguil,Balcarce y Cerro Azul). Se realiz un anlisis de varianza de lasmismas, y se obtuvo que existieron diferencias significativas entrelas rectas, por lo que la respuesta y la concentracin varan segn lamatriz (=0,05).

Compound name: AMPA

Correlation coefficient: r = 0.999016, r^2 = 0.998033

Calibration curve: 690.887 * x + -12.8841

Response type: External Std, Area

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

Conc-0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5

Response

-0

10000

20000

Conc

Residual

-10.0

0.0

10.0


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Tabla 2. Regresin lineal de curvas de glifosato realizadas para 4 matricesdiferentes

Matriz Ecuacin r2

Suelo de Anguil Y= 146.41X 47.06 0.99

Suelo de Balcarce Y= 123.93X 43.06 0.99

Suelo de Cerro Azul Y= 4.81X +12.09 0.77

Cloruro de calcio Y= 185.02X 164.92

0.99

4. Repetibilidad

Antes de comenzar una secuencia, como control delfuncionamiento del equipo, se estudia la repetibilidad de las areasobtenidas a partir de inyecciones repetitivas de un mismo vial.En la Tabla 3 se presentan los resultados de uno de los controlesdiarios mencionados. Mientras que en la Tabla 4 se encuentran los

resultados de la repetibilidad intermedia, calculada a partir de 9inyecciones de un mismo vial en un lapso de 10 horas. En todos loscasos se obtuvieron coeficientes de variacin (CV) menores al 17 %,mostrando la buena performance del sistema UPLC MSMS siempreque las condiciones ambientales estn controladas (temperatura decuarto).


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Tabla 3. Repetibilidad de GLY y AMPA

Tabla 4. Repetibilidad intermedia de GLY y AMPA.

*9 inyecciones con una diferencia de 1 hora entre las mismas en un lapso total de 10horas

Analito ug L-1

CV% n

AMPA 0,201 16 6

AMPA 1,272 7 6

AMPA 10,301 2 6

GLY 0,194 17 6

GLY 1,108 3 6

GLY 10,234 1 6

Analito ug L-1

CV% n

AMPA 1.123 4 9*

AMPA 5,189 8 9

AMPA 7,593 3 9

AMPA 10,122 6 9

GLY 1,023 13 9

GLY 5,120 9 9

GLY 7,587 8 9

GLY 10,002 7 9


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Conclusiones:

Se optimizaron las condiciones tanto de derivatizacin como las

instrumentales, los lmites de cuantificacin obtenidos sonadecuados para los trabajos planificados en el laboratorio. Elproceso es chequeado mediante el empleo de controles de calidadinternos en la secuencia e inyecciones intercaladas de muestras yestndares. Valores menores del lmite de cuantificacin (< 0,1 ugL-1) se pueden llegar previo a un proceso de concentracin de lamuestras antes o despus de la derivatizacin. Y el empleo de unestndar interno mejora la precisin.

b.- Puesta a punto de la tcnica de extraccin de glifosato yAMPA en muestras de suelo

Se utiliz la tcnica propuesta por Ibez et al. (6), adems seevaluaron diversas adaptaciones para comparar el porcentaje derecuperacin de cada una, debido a que est comprobado que elmismo vara de acuerdo al tipo de suelo y metodologa empleada.

Si bien est prevista la puesta a punto de la tcnica con distintossuelos, hasta el momento, se utiliz suelo superficial (0-15 cm)proveniente de un campo experimental de Tandil, provincia deBuenos Aires (3734S; 5904O) descripto en la Tabla 5. Setomaron 5 g de suelo y se les agreg1 ml de 250, 1000 o 2500 gL-1 de glifosato 24 h previas a la extraccin. En el caso del sueloblanco solo se agreg 1 ml de agua destilada. Las muestras serealizaron por triplicado.

La extraccin se realiz agregando 10 ml de KOH 0.6 M, se

agit por 30 minutos y luego se centrifug. Se muestra un esquemade los procedimientos utilizados en la Figura 10.


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Tabla 5.Profundidad, distribucin del tamao de partculas, contenido demateria orgnica y carbono orgnico y pH del horizonte superficial del suelode Tandil.

Textura Profundidad Arcilla Limo Arena MateriaorgnicaCarbonoorgnico pH

Cm % % %

Franco 0-10 36,27 40,43 23,31 6,10 3,55 5.2

5 gr suelo

10 ml KOH 0.6 M

Agitar 30 min.Centrifugar 30 min.

EXTRACTO

pH 2

Centrifugar

Sobrenadante

pH 7

Dilucion20veces

Sin diluir

pH 9

Sin diluir Dilucin 20veces

Extraccin I Extraccin II

Ext raccin III Ext raccin IV

Figura 10. Esquema de la metodologa utilizada.


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Figura 11.Muestras de extraccin de glifosato en suelo de Tandil previo ala inyeccin en HPLC MS MS. El blanco de H2O indica una muestra de aguadestilada derivatizada. Ext. IV: el sobrenadante de la extraccin se llev apH 9 y luego se diluy 20 veces. Ext. II: se llev el sobrenadante de laextraccin a pH 1 y luego se diluy.

Se observ que luego de la extraccin con KOH 0.6 M seobtena una muestra coloreada con alto contenido de materiaorgnica (Figura 11). Para separar las sustancias hmicas de lasolucin se llev a pH 1 con HCl (0.6 M y 6 M). Luego se centrifugy se recuper el sobrenadante obtenindose una solucin lmpida ytransparente. Previo al paso de derivatizacin se neutraliz a pH 7 yse diluy 20 veces, como indica la tcnica original (Extraccin I). Serealiz el mismo procedimiento omitiendo el paso de la dilucin

(Extraccin II). La extraccin tambin se analiz dejando elsobrenadante a pH 9 sin diluir (Extraccin III) y diluyendo 20 veces(Extraccin IV). Luego de la extraccin, las muestras fueronderivatizadas y analizadas por UPLC-MSMS.

Los resultados de recuperacin mediante la tcnica deextraccin IV (83% en promedio), indican que la extraccin deglifosato utilizando KOH 0,6 M, llevando el sobrenadante a pH 9 ydiluyendo previo al paso de derivatizacin, es efectiva para el tipo de

Blanco H2O Ext . IV Ext . II


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suelo estudiado (Tabla 6). En lo referente a AMPA, una extraccinrealizada mediante la misma tcnica, alcanz la mayor recuperacindel ensayo (94.8%). Si bien los resultados obtenidos hasta elmomento resultan auspiciosos, deben ser confirmados con otrossuelos.

Tabla 6.Recuperacin de distintas concentraciones en el suelo deglifosato.

Mtodo Compuesto Concentracin(g kg-1 suelo)

Recuperacin(%)

CV (%)

ExtraccinI

GLY 50500

55,83,7

95,521,3

ExtraccinII

GLY 50500

36,048,0

111,470,9

ExtraccinIII

GLY 50500

-12,7 155,8

GLY 50200500

80,691,377,8

12,79,50,9

ExtraccinIV

AMPA 0,178 94,8 4,6

c.- Isotermas de Adsorcin en Suelo

Uno de los objetivos de nuestro grupo de trabajo es la obtencinde los parmetros de adsorcin de glifosato para diferentes tipos desuelos agrcolas de Argentina. Tal informacin permitir establecer,

conjuntamente con la determinacin de la vida media y el transporteen columnas de suelo sin disturbar, el riesgo de contaminacin desuelos y aguas subterrneas debida a la aplicacin de glifosato.Para ello se comenz a estudiar un suelo de Tandil cuyasprincipales caractersticas se presentan en la Tabla 5.

Se sigui la metodologa establecida por OECD (1995) (18) parala determinacin de los parmetros de ensayo y la realizacin de laisoterma de adsorcin mediante el mtodo de equilibrio por tanda


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(Batch Equilibrium Method). Todos los ensayos se determinaron enmuestras por triplicado. Las concentraciones utilizadas fueron: 0,0.5, 2, 5.0, 10.0, 15.0 y 20.0 mg L-1. Se tomaron 2 g de suelo loscuales se agitaron con 40 ml de solucin de CaCl2 0.01 M durante24 h a 20C, agregndose posteriormente las diferen tesconcentraciones de glifosato. Luego de agitar otras 24 hs, lasmuestras obtenidas fueron centrifugadas y filtradas con filtro jeringade nyln de 0.2 um de tamao de poro y luego 3 ml de lassoluciones obtenidas fueron sometidas al proceso de derivatizacinya descripto anteriormente.

A partir de los ensayos en tandas se determin el coeficiente departicin Kd (relacin entre la concentracin de glifosato en la faseacuosa y la adsorbida por el suelo).

Para el adecuado procesamiento de los datos y realizacin dela isoterma de adsorcin se utiliz el modelo de Freundlich, definidocomo: Cs =Kf * Ce ncuya expresin lineal es: ln Cs = ln Kf + n ln Ce,donde Cs (mg/kg) es la cantidad de herbicida adsorbido en el sueloen la concentracin de equilibrio, Ce (mg/l) es la concentracin deherbicida en la solucin, Kf y n son coeficientes empricos queindican el grado de adsorcin y la curvatura de la regresin.

La retencin de glifosato en el suelo fue del 98 %, observndose

que en el intervalo de concentraciones evaluadas (0,1 a 20 mg L-1)no se alcanz la capacidad de saturacin del suelo. Dadas estascaractersticas y el Kf obtenido (709 l kg-1), la adsorcin del glifosatopara un suelo Argiudol tpico como el estudiado, permite establecerque el grado de retencin resultante es muy elevado (Figuras 12 y13).


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Figura 12. Curva de equilibrio Figura 13.Isoterma de ads


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Agradecimientos:

Estos estudios se realizaron gracias a INTA a travs del proyecto deinvestigacin AEGA 221641, a la AGENCIA-SECYT a travs del PICT2007-00448 y a CONICET por el otorgamiento de una beca doctoral.

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Guide. 71500122009. Revision A.


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Toxicidad de Glifosato en Peces Autctonos:Estudios de Laboratorio y Campo

Pedro CarriquiribordeCentro de Investigaciones del Medio Ambiente

Facultad de Ciencias Exactas Universidad Nacional de la Plata.

Introduccin:

El glifosato (CAS No. 1071836) es un herbicida postemergente, sistmico y de amplio espectro utilizado en agricultura,horticultura, silvicultura e incluso uso domestico en jardinera.

Qumicamente, el glifosato (N-(fosfonometil) glicina) es unanlogo aminofosfonado del aminocido natural, glicina, y su nombreproviene de la contraccin gly(cina)-fos(fono)-ato. El glifosato essoluble en agua (11,6 g L-1, 25C) y una baja presin de vapor (7,5 x10-8 mmHg). Por tanto posee un valor de constante de Henry bajo(1,44x10-12 atm m3 mol-1), indicando que se distribuirpreferentemente en el compartimiento acutico. Sus valores de Koc(21699 mm g-1) y Kd (61 g m3-1) elevados permiten estimar que estecompuesto se halle mayormente adsorbido al sedimento y posea bajamovilidad. La presencia de 4 grupos ionizables, le da carcteranftero y hace que la molcula se encuentre cargada negativamentea pH neutros (pKa: 2; 2,6; 5,6; 10,6). Esto sumado a su bajo valor deKow (3,3x10-4) indican que su biodisponibilidad en ambientesacuticos y capacidad de acumulacin se ver limitada, explicandolos bajos factores de bioconcentracin (BFC = 0.04) publicados. Enagua, la persistencia del glifosato es baja con una vida media (DT50)

de 2,5 d. (UN-ILO-WHO, 1994; Schuette, 1998; Giesy et al., 2000)El modo de accin del glifosato como herbicida es a travs de la

inhibicin de la enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfato sintetasa(EPSPS), que se encuentra implicada en la sntesis de losaminocidos aromticos: tirosina, triptfano y fenilalanina(Schnbrunn et al., 2001). La va del shiquimato no est presenteenlos animales, que en su lugar obtienen aminocidos aromticos de sudieta.


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El glifosato es un herbicida especialmente diseado para elcontrol de malezas en cultivos genticamente modificados queposeen una versin de la 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato sintetasa(EPSPS) resistente a la inhibicin por glifosato. En Argentina, elempleo de soja transgnica resistente a este herbicida ha crecidosistemticamente desde la dcada del 70 superando las 16 millonesde hectreas en la campaa 2007/2008 (James, 2007). Ello hamotivado una preocupacin general en la opinin pblica y lasautoridades respecto a los posibles efectos adversos del glifosatopara el medioambiente y la salud humana.

Con motivo de dicha intensificacin agrcola, desde el ao 2001en el Centro de Investigaciones del Medio Ambiente de la Facultad deCiencias Exactas de la UNLP, se ha venido trabajando en el estudio

de los posibles efectos adversos sobre los ecosistemas acuticosasociados al uso de plaguicidas en las prcticas agrcolas de nuestropas (Carriquiriborde et al., 2003; Marino and Ronco, 2005; Martin andRonco, 2006; Carriquiriborde et al., 2007; Sobrero et al., 2007;Peruzzo et al., 2008; Rimoldi et al., 2008; Ronco et al., 2008;Carriquiriborde et al., 2009; Mugni et al., 2010). El objeto del presentetrabajo es resumir algunos de los estudios dirigidos a evaluar elimpacto del glifosato, y de los insecticidas que suelen utilizarse juntoa l para el control de plagas en el cultivo de soja transgnica por la

modalidad de siembra directa, sobre poblaciones experimentales depeces autctonas expuestas en condiciones de laboratorio y campo.

Metodologa

Bioensayos de Toxicidad Aguda

Los bioensayos de toxicidad aguda se realizaron de acuerdo alos mtodos normalizados por la Agencia de Proteccin Ambiental d

los Estados Unidos (USEPA, 2002).Las especies ensayadas fueron el pejerrey (Odontesthesbonariensis) y la madrecita (Cnesterodon decemmaculatus).

Los alevines de pejerrey se obtuvieron de la EstacinHidrobiolgica de Chascoms. Las madrecitas de a partir dereproductores criados en el laboratorio. Los ensayos se realizaron conalevinos de 15 das de vida. Los bioensayos fueron estticos conrenovacin del 100% del medio de ensayo cada 24h. Se ensayaron


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en cada caso 5 concentraciones del txico y un grupo control portriplicado. En los casos que se utiliz una sustancia vehiculizante, seemple la misma contraccin de esta en todos los tratamientos,incluidos los controles. Se utilizaron recipientes de vidrio de 250 mlconteniendo 200 ml de medio de ensayo. Como medio de dilucin, seemple agua de red declorinada y filtrada por carbn activado. A lospejerreyes se los alimento con 2 ml de concentrado de nauplii deArtemiasp. de 24h de vida cada 48h.

Las cras de madrecita no se alimentaron durante el ensayo. Enningn caso se suministr aireacin. La temperatura se mantuvo a 22 1 C y el fotoperodo a 16h luz: 8h oscuridad. Se registr el nmerode organismos vivos y muertos cada 24h, retirando estos ltimos delrecipiente de ensayo. Las LC50 se estimaron mediante el mtodo

Probit utilizando el programa informtico desarrollado por la USEPA(1995).

Los datos de toxicidad aguda (LC50 96h) para la construccin dela curva de distribucin de sensibilidad de las especies de peces seobtuvieron de la base de datos ECOTOX de la USEPA.

Ensayos de Campo

Los ensayos de campo se realizaron entre los aos 2002 y 2005

en 2 explotaciones agropecuarias privadas situadas en la Provinciade Buenos Aires, una localizada en el Partido de Arrecifes y la en elPartido de La Plata. En ambas explotaciones los lotes en los cualesse llevaron a cabo los estudios tuvieron una extensin deaproximadamente 100 ha y eran atravesados por un arroyo de primerorden. En ambos casos se cultiv soja de acuerdo a las prcticasconvencionales para este cultivo en la modalidad de siembra directa.El manejo de agroqumicos durante el perodo estudiado consisti entres aplicaciones de plaguicidas en cada ciclo de cultivo. Una

aplicacin preemergente de glifosato (Roundup), luego unaaplicacin de una mezcla de glifosato (Roundup) y cipermetrina(Sherpa) en la etapa que la plntula adquira sus primerashojas (V2)y finalmente una aplicacin de una mezcla de glifosato (Roundup),cipermetrina (Sherpa) y clorpirifos (Lorsban Shooter ) endosulfn (Thionex), dependiendo el caso, cuando la plantadesarrolla la vaina y los granos (R5-R6) y el nmero de chinches porplanta lo indicaba necesario.


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60

Las dosis de aplicacin utilizadas por hectrea fueron 1000-2000g de glifosato, 100-150 ml del formulado Sherpa (25 mg decipermetrina p.a./ml), 800-1000 ml del formulado de clorpirifos (48 mgde clorpirifos p.a./ml), 700 ml de Thionex (35 mg de endosulfnp.a./ml). Las aplicaciones se realizaron con medios terrestres aexcepcin de la aplicacin de la mezcla de formulados de glifosato,cipermetrina y endosulfan que fue realizada por avin.

En cada arroyo se seleccionaron 2 o 3 sitios en los cuales seubicaron de 3 a 8 limnocorrales construidos con tubos de PBC de 100cm de longitud y 20 cm de dimetro, perforados en su mayor partepor 4 ventanas rectangulares, forrados con una malla de nylon de 0,1cm de abertura de trama y 2 tapas en los extremos con malla deacero de 0,1 cm de trama. Los limnocorrales se sostuvieron

verticalmente con una estaca de hierro manteniendo un extremoapoyado en el sedimento y el otro 20 a 30 cm sobre la superficie delagua. En cada limnocorral se colocaron de 30 a 50 cras deCnesterodon decemmaculatus de 15 das de vida llevadas desde ellaboratorio una semana previa a la aplicacin de plaguicidas.

Diariamente desde 48 o 96 h previo a la aplicacin y hasta 96 hluego de la aplicacin o de la primera lluvia, se control el nmero depeces sobrevivientes en cada limnocorral.

Resultados y Discusin

En la Tabla 1. se muestran las LC50 96h obtenidas para las dosespecies autctonas expuestas a los principios activos del glifosato ylos dems insecticidas utilizados junto a este herbicida en el cultivo desoja.

Tabla 1 . Toxicidad Aguda Pesticidas Soja

Pesticida

LC50 24h

(g L-1

)

LC50 96h

(g L-1

)

LC50 24h

(g L-1

)

LC50 96h

(g L-1

)

Glifos ato > 225.000,00 > 225.000,00 > 150.000,00 163.000,00

Clorpirifos 300,00 75,00 SD SD

Endosulfan 1,70 0,65 1,50 0,30

Cipermetrina 2,50 0,40 1,20 0,24

SD: s in datos

C. decemmaculatusO. bonariensis


61/114

61

Los datos muestran que la toxicidad letal aguda del glifosato espor lo menos entre mil a un milln de veces menor que la de losinsecticidas. De acuerdo a la curva de distribucin de sensibilidad deespecies (Figura 1), las dos especies ensayadas se encuentrandentro del grupo de especies poco sensibles al glifosato. Esto esparticularmente llamativo para el pejerrey que es una especiesensible a los contaminantes. Para otros compuestos ha mostradovalores de sensibilidad comparable al de los salmnidos,particularmente las truchas (Oncorhynchus mykiss). Los niveles detoxicidad reducidos observados para el glifosato son consistentes conlas caractersticas fisicoqumicas y biolgicas del glifosato queestiman una baja biodisponibilidad y bioacumulacin. Adems,concuerda con el modo de accin toxica que posee que es especfico

para el metabolismo de los vegetales.

Figura 1. Curva dedistribucin de valoresde toxicidad aguda paraespecies de pecesmostrando la posicinrelativa para las especiesautctonas estudiadas yla del salmnido massensible. Om: O. mykiss,Ob: O. bonariensis, Cd:C. decemmaculatus.

La Figura 2 muestra la supervivencia a lo largo del tiempo enlos ensayos de campo realizados bajo prcticas convencionales decultivo de siembra directa. Los datos muestran que durante lostratamientos del cultivo con el formulado de glifosato (Roundup) nose observ una reduccin significativa de la supervivencia a lo largodel ensayo ni tampoco un incremento de la mortalidad instantnealuego de la aplicacin (Figura 2 A). En el caso de las aplicaciones conla mezcla de los formulados de glifosato (Roundup) y cipermetrina(Sherpa), si bien se observ un descenso de la supervivencia con el

Om

Ob

Cd

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

1.000 10.000 100.000 1.000.000

Porcenta

jedeespecies

Concentracion de glifosato (g L-1)


62/114

62

tiempo, sta fue similar tanto en el sitio dentro del cultivo (S1) comofuera del cultivo (S2). La mortalidad instantnea tampoco mostr unaclara correspondencia con el evento de aplicacin (Figura 2 B). Enambos casos slo se observ un incremento de la mortalidadinstantnea luego de las lluvias, independientemente si esta ocurrieraprevia o posteriormente a una aplicacin. Cuando se aplic la mezclade los formulados de glifosato (Roundup), cipermetrina (Sherpa) yclorpirifos (Lorsban), se observ un claro descenso de lasupervivencia y un marcado aumento de la mortalidad instantnea enrelacin a la aplicacin (Figura 2 C). Ello fue consistente con laobservacin de peces con nado errtico asociada a un evento demortandad en el arroyo.

Finalmente, durante la aplicacin area de la mezcla de losformulados de glifosato (Roundup), cipermetrina (Sherpa) yendosulfn (Thionex) se observ un efecto adverso severo sobre lasupervivencia y la mortalidad instantnea que pudo ser claramenterelacionado con el evento de fumigacin (Figura 2 D).

Desde el punto de vista metodolgico, los resultados muestranque si bien todas las estrategias de seguimiento de la supervivenciaen los limnocorrales permitieron discr

aspectos ambientales del uso de glifosato (version para imprimir)

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