anÁlisis de la tipificaciÓn de leucemias por citometrÍa de …
TRANSCRIPT
ANÁLISIS DE LA TIPIFICACIÓN DE LEUCEMIAS POR
CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD
JAVERIANA
OLGA MERCEDES PEÑA SERRATO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
BACTERIOLOGÍA
BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2000
ANÁLISIS DE LA TIPIFICACIÓN DE LEUCEMIAS POR
CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD
JAVERIANA
OLGA MERCEDES PEÑA SERRATO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el título de
BACTERIÓLOGA
DIRECTOR
JOHN MARIO GONZALEZ M.D. Ph.D.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
BACTERIOLOGÍA
BOGOTÁ, NOVIEMBRE DE 2000
2
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946: "La
Universidad no se hace responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado.
3
A Dios porque durante estos cinco años, al igual que durante toda mi vida, ha
estado a mi lado, levantandome en mis caidas y celebrando mis triunfos .
A mis padres al igual que a mis hermanos, especialmente a John Jairo, porque con su amor cariño y ayuda he logrado culminar esta etapa de mi vida, sin ustedes, sin su esfuerzo
sin sus deseos para que me superara, esto nunca habría sido posible.
A mis amigas del alma : Diana, Susana, y Constanza porque
estuvieron conmigo todo este tiempo compartiendo mis alegrias y tristezas, siempre estuvieron ahí
incondicionalmente, comprendiendome y brindandome su mano cuando más lo necesitaba.
A mis profesores, especialmente la Dra. Martha Mesa y el
Dr. Hugo Diez, porque me otorgaron los mejores conocimientos, y me enseñaron que para lograr lo que uno
desea hay que luchar bastante.
A todas estas personas, quiero decirle.... GRACIAS y aunque es una palabra tan corta, reune todos mis deseos de
comunicarles que para y por ustedes logré llegar a esta último escalón de mi carrera.
Siempre los llevare en mi mente y en mi corazón !
4
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Dr. Jhon Mario Gonzalez, Director de la unidad de
citometría de flujo, miembro del grupo de inmunobiología, y
profesor del departamento de microbiología de la Pontificia
Universidad Javeriana (PUJ), por haberme brindado esta
oprtunidad y haberme permitido demostrar mis capacidades como
estudiante al igual que como persona. Igualmente, agradezco a la
Dra Ana Maria Uribe, Dierctora del Departamento de Patología del
HUSI, Dra Jorleth Agudelo Forero y Dra Raquel Sandoval,
Bacteriologas del Centro Javeriano de Oncología, Dra Lucila
Zambrano, Directora de la Unidad de Citogenética del Instituto de
Genética Humana del PUJ, y a la Dra Luz Elena Parra, Directora
del Departamento de Estadística y Archivo del HUSI; a todas
ellas, por haberme colaborado en la recolección de la información
de la base de datos de este estudio y en su momento, por
haberme otorgado conocimientos propios de este trabajo.
5
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. Introducción 1
2. Marco Teórico 3
2.1. Hematopoyesis 3
2.1.1. Eritropoyesis 5
2.1.1.1. Ontogenia de Marcadores Celulares 7
2.1.2. Megacariopoyesis 7
2.1.2.1. Ontogenia de Marcadores Celulares 8
2.1.3. Granulopoyesis 8
2.1.4. Monopoyesis 8
2.1.4.1 Ontogenia de Marcadores Celulares 10
2.1.5 Linfopoyesis 11
2.1.5.1. Ontogenia de Marcadores Celulares 12
2.2. Leucemias 14
2.2.1. Leucemias Agudas 14
2.2.1.1. Etiología 15
2.2.1.2. Clasificación 15
2.2.1.3. Leucemia Linfoide Aguda (LLA) 16
2.2.1.3.1. Citoquímica 16
2.2.1.3.2. Características Clínicas 17
2.2.1.3.3. Alteraciones Cromosómicas 18
6
2.2.1.3.4. Inmunofenotipo 19
2.2.1.4. Leucemia Mieloide Aguda (LMA) 21
2.2.1.4.1. Citoquímica 21
2.2.1.4.2. Características Clínicas 25
2.2.1.4.3. Alteraciones Cromosómicas 25
2.2.1.4.4 Inmunofenotipo 26
2.2.2. Leucemias Crónicas 28
2.2.2.1 Leucemia Mieloide Crónica (LMC) 29
2.2.2.1.1 Características Clínicas 29
2.2.2.1.2. Alteraciones Cromosómicas 30
2.2.2.1.3. Clasificación 30
2.2.2.1.4. Inmunofenotipo 31
2.2.2.2. Leucemia Linfoide Crónica (LLC) 32
2.2.2.2.1. Características Clínicas 32
2.2.2.2.2. Alteraciones Cromosómicas 33
2.2.2.2.3. Inmunofenotipo 33
2.3. Citometría de Flujo 34
2.3.1. Fundamentos 34
2.3.2. Aplicaciones 36
3. Justificación 38
4. Objetivos 40
4.1. Objetivo General 41
4.2. Objetivos Específicos 41
5. Materiales y Métodos 41
7
5.1. Tipo de Estudio 41
5.2. Muestras 41
5.3. Equipos 41
5.4. Métodos 42
5.4.1. Protocolo de marcaje 42
5.4.2. Análisis de Archivos 46
5.5. Recolección de Información 49
5.5.1. Datos Diagnósticos 49
5.5.1.1. Diagnóstico Clínico 49
5.5.1.2. Mielograma 49
5.5.1.3. Diagnóstico Patológico 49
5.5.1.4. Cariotipo 49
5.5.2. Base de Datos 49
6. Resultados 51
7. Discusión 61
8. Conclusiones 64
9. Recomendaciones 65
10. Anexos 68
11. Bibliografía 75
8
INDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Características funcionales de las moléculas CD.
9
Tabla 2. Clasificación morfológica de las leucemias Linfoblástica
Aguda
17
Tabla 3. Alteraciones Cromosómicas en LLA
18
Tabla 4. Clasificación Morfológica FAB de Leucemia Mieloide
Aguda 23
Tabla 5. Alteraciones Cromosómicas
26
Tabla 6. Clasificación de la LMC
31
Tabla 7. Resumen de las características de los pacientes con
leucemia aguda
9
55
Tabla 8. Resumen de los hallazgos por citometría de flujo
en leucemias agudas
56
Tabla 9. Resumen de las características de los pacientes con
leucemia crónica
57
Tabla 10. Resumen de los hallazgos por citometría de flujo
en leucemias crónicas
58
Tabla 11. Resumen de las características de los pacientes con
Patología no leucémica
59
Tabla 12. Resumen de los hallazgos por citometría de flujo
en patologías no leucémicas
60
10
INDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Perfil de genes en hematopoyesis normal 6 Figura 2. Ontogenia de marcadores celulares en Granulopoyesis 10 Figura 3. Ontogenia de marcadores celulares en Monopoyesis 11 Figura 4. Ontogenia de marcadores celulares en Linfopoyesis de células T 12 Figura 5. Ontogenia de marcadores celulares en Linfopoyesis de células B 13 Figura 6. Fundamento de la detección de FSC y SSC 35 Figura 7. Gráfica de puntos de FSC / SSC 46 Figura 8. Gráficas de puntos de CD45 / SSC 47 Figura 9. Gráfica de puntos del control negativo 48 Figura 10. Gráfica de puntos de FL1 / FL2 48
11
ABREVIATURAS
AREBT: Anemia Refractaria con exceso de blastos en
transformación
CALLA: Antigeno de Leucemia Linfoide Aguda
CD: Clouster Designation
CIg: Inmunoglobulina de citoplasma
CRCP: Células de Repoblación a Corto Plazo
CRLP: Células de Repoblación a Largo Plazo
CSF-Meg: Factor Estimulador de colonias megacariociticas
F: Femenino
FB: Fase Blástica
FAB: Franceses Americanos y Britanicos
FCγγR: Receptor gamma para Fracción Cristalizable de las
inmunoglobnulinas
FITC: Tiocianato de Fluoresceina
FSC: Forward Scatter
HTLV-1: Virus de Leucemia T Humana
HUSI: Hospital Universitario San Ignacio
12
IgM cit: Inmunoglobulina M de citoplasma
IgM sup: Inmunoglobulina M de superficie
IgM Cneg: Inmunoglobulina M Control negativo
IgG: Inmunoglobulina G
IL-7R: Receptor de Interleucina 7
LLA: Leucemia Linfoide Aguda
LLA-B: Leucemia Linfioide Aguda de células B
LLA-T: Leucemia Linfoide Aguda de células T
LLC: Leucemia Linfioide Crónica
LM: Leucemia Mieloide
LMA: Leucemia Mieloide Aguda
LMC: Leucemia Mieloide Crónica
LMMC: Leucemia Mielomonocitica Crónica
LPS: Lipopolisacarido
M: Masculino
MO: Médula Ósea
MPO: Mieloperoxidasa
NO: No Observado
NR: No Realizado
13
NEG: Negativo
PAS: Acido Periodico de Shifft
PBS: Buffer Fosfato Salino
PE: Ficoeritrina
Phi: Cromosoma Filadelfia
POS: Positivo
PUJ: Pontificia Universidad Javeriana
R.L.: Reacción Leucemoide
RNAm: Acido Ribunocleico mensajero
S. M.D: Sindrome Mielodisplásico
SP: Sangre Periférica
14
RESUMEN
Las leucemias son neoplasias malignas que se caracterizan por la
proliferación o acumulación generalizada de células
hematopoyéticas, las cuales dependiendo de su agresividad y el
grado de diferenciación pueden dividirse en agudas y crónicas;
estas subclases a su vez pueden ser clasificadas como mieloides
o linfoides. Para el diagnóstico de esta patología se cuenta con
métodos morfológicos, citoquímicos, citogenéticos e
inmunológicos, siendo este último de gran importancia por el
hallazgo de marcadores específicos de linaje y curso de la
enfermedad.
El objetivo de este trabajo, fué analizar los casos de leucemias
provenientes del Hospital Universitario San Ignacio de Bogotá
(HUSI), a las cuales se les realizó inmunotipificación por
Citometría de flujo, con el fin de correlacionar estos datos con
otras ayudas diagnósticas y determinar la presencia de
maracadores atípicos. Para lograr este objetivo se recolectaron
15
los datos de los pacientes que acudieron a la Unidad de
Citometría de Flujo de la Pontificia Universidad Javeriana, en el
periodo comprendido entre Enero de 1999 y Septiembre de 2000.
Estos datos incluyen nombre completo, edad, tipo de muestra
(Sangre periférica o médula ósea), diagnóstico clínico y cuando
fué posible, cariotipo, mielograma, pruebas citoquímicas y
diagnóstico por patología del aspirado de médula ósea.
Se analizaron 47 muestras, de las cuales 25 (53%) pertenecían a
leucemias agudas. De estas, 18 (72%) eran de linaje linfoide
(LLA),en su mayoría provenientes de infantes con un promedio de
edad de 4 años (+/- 3,6), 7 de estas, expresaron marcadores de
linfocitos B, 3 de linfocitos T, 7 de ambos linajes y la restante fue
clasificada bajo criterio clínico como LLA. Adicionalmente, se
observó coexpresión de CD10/CD22 en y expresión aberrante de
CD13 y de CD33. Las leucemias de linaje mieloide (LMA), fueron
7 casos (28%), en su mayoría adultos con un promedio de edad
de 60 años (+/- 12,3); se presentó coexpresión de HLA-DR/CD13.
En la mayoría no se observaron anormalidades cromosómicas, a
16
excepción de la presencia de cromosoma Filadelfia en dos de
ellos.
Con respecto a las leucemias crónicas, se presentaron 13 casos (
28 %), de los cuales 11 (85%) fueron de linaje mieloide (LMC),
provenientes en su mayoría de pacientes adultos con un
promedio de 58 años de edad (+/- 6.4), en este grupo se
observó con coexpresión de HLA-DR/CD13. También se
encontró un caso que morfológica y clínicamente pertenecía a
LMC, pero fenotípicamente poseía marcadores de LLA, lo que
indica que en una crisis blástica puede ocurrir una conversión del
tipo de leucemia. Los 2 casos restantes (15%) fueron leucemias
linfoides crónicas (LLC), los cuales arrojaron un promedio de edad
de 44 años (+/- 17.3); en ellos se observó coexpresión de
CD20/CD5, característico de estos casos. En su mayoría los
pacientes con leucemias crónicas, exhibieron cromosoma
Filadelfia, común en este tipo de leucemia.
Las patologías no leucémicas, fueron en total 9 casos ( 19 %),
17
provenientes de pacientes con un promedio de edad de 66 años
(+/- 29.3), en estos, se observó en unos casos ausencia y en otros
presencia de marcadores típicos de linaje, sin embargo, no se
evidenciaron coexpresiones ni marcadores aberrantes, al igual
que anormalidades cromosómicas.
Estos datos permiten concluir que el análisis de la expresión
fenotípica de las leucemias es un método de gran importancia
como ayuda diagnóstica en estas patologías, máxime cuando la
expresión de ciertos marcadores, no detectables por otras
técnicas, permiten tomar conductas terapéuticas adecuadas.
1. INTRODUCCION
Las leucemias son enfermedades malignas, derivadas de la célula madre
hematopoyética, caracterizada por la proliferación o acumulación neoplásica
generalizada de células leucopoyéticas (Tood, 1993). Dependiendo de su
agresividad y del grado de diferenciación de las células, dichas neoplasias
pueden presentarse en dos formas : leucemia aguda y leucemia crónica. La
primera se distingue por el bloqueo en la diferenciación celular que se
18
traduce en una acumulación masiva de células inmaduras o blastos
(Murphy,1996). La segunda forma, es decir, la leucemia crónica, se
caracteriza por una proliferación no regulada y por tanto una importante
expansión de distintos tipos de células diferenciadas .
Existen diferentes métodos que colaboran al diagnóstico de esta patología,
sin embargo en ocasiones no es posible distinguir el tipo de leucemia
tomando como base única la morfología celular. Dentro de estos se
encuentran las pruebas citoquímicas, citogenéticas e inmunológicas. La
inmunotipificación de la células malignas, es el método inmunológico más
usado, el cual busca verificar la presencia de marcadores de superficie o
Cluster Designation “CD”, de forma efectiva y rápida. Además, el
advenimiento de la citometría de flujo, unido a una amplia gama de
anticuerpos monoclonales específicos para CD, hacen de esta técnica una
de las herramientas de mayor utilidad en el diagnóstico de las leucemias.
Desde 1999, se realiza la inmunotipificación de leucemias por citometría de
flujo en la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana. Sin
embargo, para lograr que este análisis inmunológico sea óptimo y preciso
como ayuda diagnóstica de estas neoplasias, se debe realizar una
evaluación e interpretación adecuada de cada caso, para llegar así a
correlacionar sus resultados con otros métodos diagnósticos usados. Por
tanto, el propósito de este trabajo es revisar y definir una forma sistemática
19
de análisis de los resultados obtenidos por citometría de flujo de los casos
reportados en el periodo comprendido entre Enero de 1999 y Septiembre de
2000.
20
2. MARCO TEORICO
2.1. HEMATOPOYESIS
Las células circulantes en el sistema vascular periférico desempeñan
papeles esenciales dentro del organismo, como son, la cesión de oxígeno a
los tejidos dado por los glóbulos rojos, la hemostasia realizada por las
plaquetas, y las defensas del huésped dada por los linfocitos, monocitos y
granulocitos. Normalmente, dichas células poseen una vida media, por lo
cual necesitan permanecer en un continuo recambio sanguíneo (Fauci,
1998). Este proceso conocido como hematopoyesis, se puede definir como
la serie de fenómenos consecutivos que se inician a nivel unicelular con la
autoduplicación seguidos de diferenciación y maduración culminando con la
producción de elementos formes sanguíneos funcionales (Ruiz Arguelles,
1998).
Dicho proceso esta basado en la presencia de ciertas células de médula
ósea conocidas como células madre hematopoyéticas (Hematopoietic Stem
Cell, HSC), de las que proceden todas las células sanguíneas (Fauci, 1998);
estas células se encuentran en un número muy reducido en la médula ósea,
cerca del 0.01%, y efectúan un ciclo muy lento, además, gracias a métodos
de depuración, ha quedado claro que existen dos tipos de estas células,
21
llamadas comúnmente, células de repoblación a largo plazo (CRLP) y células
de repoblación a corto plazo (CRCP), las cuales, como sus nombres lo
indican, difieren en su capacidad proliferativa y por ende en su poder
radioprotector (Fauci,1998).
La HSC en su momento, puede tomar dos caminos: uno es el de la
autoduplicación y el otro es el de la diferenciación, pero aún, los motivos por
los cuales dicha célula decide tomar uno u otro camino son desconocidos,
aunque al parecer pueden estar implicados tanto factores humorales como
ambientales. Si la célula madre, decide diferenciarse puede dar origen a
alguna de las células progenitoras comprometidas ya sea de linaje mieloide
o de linaje linfoide.
La célula progenitora mieloide, posee la capacidad de dar origen a colonias
megacario/eritrocíticas, granulo/monocíticas y mixtas o independientes de
cada una de las anteriores nombradas. Además se caracteriza por ser CD34
positivo y presentar baja expresión de FcγR, igualmente es propio de este
estadío de diferenciación la presencia activa de genes que codifican para
factores de transcripción, los cules son indispensables para el proceso, como
son GATA-1, GATA-2, NF-E2, SCL, c-mpl. Las células que hacen parte de
las colonias megacario/eritrocíticas, como su nombre lo indica, pueden dar
origen a plaquetas o a glóbulos rojos, estas células por su parte, se
22
caracterizan por la ausencia de CD34, presencia de CD41 y CD42a y
además por la baja expresión de FcγR. De igual forma las células
granulo/monocíticas pueden dar origen a granulocitos o monocitos y además
son positivas para CD34, CD33, CD15, CD13 y en algunos casos para HLA-
DR y CD14, unidas a una alta expresión de FcγR, ambos tipos de células
poseen un perfil de genes propios de estadío. Así mismo, la célula
progenitora linfoide, posee la capacidad de dar origen a colonias linfoides T,
B o NK, con la característica de expresar IL -7R, HLA-DR además de
contener la enzima desoxinucleotidil transferasa (TdT) y poseer un perfil de
genes propio para cada momento de diferenciación (Kondo, 1997).
(Figura 1).
Durante los procesos de diferenciación y maduración se da la presencia de
marcadores celulares, los cuales poseen funciones específicas como se
muestra en la Tabla 1. Dichos procesos se da para cada uno de los linajes de
forma individual y se desarrollan como se presenta a continuación.
2.1.1. ERITROPOYESIS: Esta básicamente controlada por la eritropoyetina
Los precursores eritroides de la médula ósea son llamados de manera
23
Figura 1. La gráfica muestra el perfil de expresión de genes desde la HSC hasta las células
maduras. CMP. Progenitores Mieloides Comunes; CLP. Progenitores Linfoides Comunes:
GMP. Progenitores Granulo/Monocíticos; MEP. Progenitores Megacario/Eritrocíticos
(Akashi,2000)
24
colectiva normoblastos o eritroblastos. Durante su maduración, la célula
disminuye en forma gradual de tamaño, se da la condensación y expulsión
final del núcleo, e incremento en la producción de hemoglobina. Dichas
etapas de se conocen morfológicamente como pronormoblasto, normoblasto
basofílico, normoblasto policromatofílico, normoblasto ortocromático,
reticulocito y eritrocito. (Mckenzie, 1991).
2.1.1.1. Ontogenia de Marcadores Celulares : Los proeritroblastos
tempranos expresan CD36 y posiblemente CD41A , mientras que los tardíos
expresan glicoforina A. CD34 solamente es expresado en el inicio de este
estadío , entre tanto el CD71 esta presente durante todas las fases de
desarrollo eritroblástico.
La hemoglobina es un marcador especifico de linaje eritroide pero esta no es
detectada antes del estadio de maduración del normoblasto policromático
(Behm, 1999).
2.1.2. MEGACARIOPOYESIS: El desarrollo de este proceso se presenta en
respuesta a un estímulo que puede ser la masa plaquetaria, la cual
dependiendo de su aumento o disminución se produce el aumento o
disminución inverso de factores reguladores como el factor estimulador de
25
colonias megacariocíticas (CSF-Meg), la trombopoyetina y la IL-3.
(Mckenzie,1991)
2.1.2.1. Ontogenia Marcadores Celulares: Durante su proceso de
maduración, los megacarioblastos en su fase temprana expresan CD41A y
CD61 seguidos por la expresión de CD42B, CD4 , CD33 , CD34 y CD117 ;
cuando estos blastos se transforman en megacariocitos maduros expresan
CD36, CD41,CD42,CD61 y factor VIII . (Behm,1999)
2.1.3. GRANULOPOYESIS: Los granulocitos ( neutrófilos, basófilos,
eosinófilos) proceden de progenitores mieloides comunes (CMP), estas
celulas poseen un proceso de maduración muy similar iniciando por
mieloblasto, y seguido por las etapas de promielocito, mielocito,
metamielocito, granulocito en banda, finalizando en una célula segmentada
funcional . Cada uno de los distintos granulocitos sigue esta etapas de
forma independiente y dirigida hacia su respectivo linaje . (Mckenzie ,1991)
2.1.4. MONOPOYESIS: Los monocitos se forman en la médula ósea a partir
de CMP, que en su momento deciden diferenciarse hacia este tipo de linaje;
cuando esto ocurre se forman los monoblastos seguidos de los promonocitos
y partir de este se forma el monocito maduro . (Mckenzie 1991)
26
TABLA 1 CARACTERISTICAS FUNCIONALES DE LAS MOLECULAS CD
Principal expresión Funciones conocidasCD celular o propuestas
CD1a*+ Timocitos, células dendriticas Presentación de antigenos no peptídicos a algunas células T (incluyendo las celulas de Langerhans)
CD1b Lo mismo que el CD1a La misma que Cd1aCD2 Células T, Células NK Molécula de adhesión (se une a LFA-3);activación de la molécula TCD3 Células T Se asocia al receptor del antigeno de la célula T ; transducción de
señales como resultado del reconocimiento del antígeno por células TCD4 Células T restringidas por el MHC de clase II Molécula de adhesión (se une a MHC de clase II);transducción de señalCD5 Células T; subpoblación de células B Ligando de CD72 ¿molécula de adhesión? CD7 Células madre hematopoyéticas ; subpoblación Transducción de señales
de células TCD10 Células B inmaduras y algunas maduras ; Metalopeptidasa de la superficie celular (CALLA)
progenitores linfoides , granulocitosCD11a++ Leucocitos Adhesión (se une a ICAM-1, -2)CD11b Granulocitos , monocitos , células NK Adhesión ; fagocitosis de particulas recubiertas por iC3b (opsonizadas)CD13 Monocitos , granulocitos Aminopeptidasa ; ¿papel en el estallido respiratorio?CD14 Monocitos Receptor de LPS ; ¿papel en el estallido respiratorio?CD15 Granulocitos La forma sialil es ligando de selectina CD16 Células NK, granulocitos , macrófagos Receptor de Fc delta de baja afinidad ; ADCC , activación de células NKCD19 La mayoria de las células B Papel en la activación de la célula B CD20 La mayoria o todas las células B ¿Papel en la activación o regulación de la célula B, canal iónico de calcio?CD21 Las células B maduras Papel en la activación de la célula B ; receptor de C3d,virus de Epstein-BarrCD22 Las células B Papel en la activación de la célula BCD24 Las células B , granulocitos ¿Papel en la coestimulación de las células T?CD25 Las células T y B activadas;macrófagos Complejos con el receptor IL-2R beta,deltac de alta afinidad ; crecimiento
activados de la célula TCD33 Monocitos, células progenitoras mieloides ?CD34 Precursores de células hematopoyéticas ; Ligando de la selectina-L
endotelio vascularCD36 Monocitos , plaquetas ¿Adhesión de plaquetas?CD38 Células plasmáticas, timocitos,células T activadas ?CD41 Plaquetas Agregación y activación plaquetaria; receptor del fibrinógeno y la
fibronectina ( se une a la secuencia R-G-D)CD42a Plaquetas , megacariocitos Adhesión plaquetaria , unión al factor de Von WillebrandCD42b Véase CD42a Véase CD42aCD45 Leucocitos Papel en la transducción de la señal (tirosina fosfatasa)CD56 Células NK Adhesión homotipica ; isoforma de la molécula de adhesión celular
neural (N-CAM)CD61 Plaquetas , megacariocitos, células endoteliales CD41
LeucocitosCDw65 Granulocitos ¿Papel en la activación del neutrófilo?CD79a Células B maduras Componente del receptor para el antígeno de la célula BCD79b Células B maduras Componente del receptor para el antígeno de la célula B
(Abbas, 1998)
27
2.1.4.1. Ontogenia de Marcadores Celulares de Linaje Mieloide y
Monocítico : Además de los marcadores presentados en las Figuras 2 y 3,
existen otras sustancias como la mieloperoxidasa (MPO) que es un
componente de gránulos azurófilos primarios y la lactoferrina que es una
enzima contenida en gránulos específicos secundarios, las cuales son
comúnmente usadas como marcadores de diferenciación mieloide, donde los
mieloblastos y promielocitos contienen MPO pero no lactoferrina, mientras
que los mielocitos, metamielocitos y neutrófilos poseen las dos. (Behm 1999)
Figura 2 La gráfica muestra la expresión de antigenos de diferenciación de linaje
grabulocitico. (Lee,1995)
2.1.5. LINFOPOYESIS: Se produce a partir de los progenitores linfoides
comunes (CLP) o llamadas comúnmente Células madres linfoides, los
cuales, pueden diferenciarse dentro de 1 o 2 progenitores intermedios:
MIELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO NEUTRÓFILO
CD13 CD33 CD34
HLADR
CD13 CD33
CD11b CD15 MPO
CD13 CD33
CD11B CD15 MPO CD16
CD13 CD11b CD15 MPO CD16
28
Figura 3 La gráfica muestra los antigenos de diferenciación en el linaje monocitico.
(Lee,1995)
Células tempranas B o Células de triple linaje T/NK/células dendríticas
(Tucker, 2000). A nivel general, la linfopoyésis, puede dividirse en dos fases
diferentes : linfopoyésis independiente de antígeno, la cual tiene lugar en el
tejido linfoide primario, formando linfocitos T o B inmunocompetentes, y la
linfopoyésis dependiente de antígeno que ocurre en el tejido linfoide
secundario y empieza con el estimulo de los linfocitos T y B
inmunocompetentes, este tipo de linfopoyésis termina en la formación de
linfocitos T y B efectores que median la respuesta inmunitaria. La
identificación de estas etapas no es posible por medio de criterios
morfológicos, aunque si pueden indicar el grado de maduración y actividad
de estas células (Mckenzie,1995).
MONOBLASTO MONOCITO
CD13 CD33
CD11b CD34
HLADR CD4
CD13 CD33
CD11b CD14 CD4
29
2.1.5.1. Ontogenia de Marcadores Celulares :
• Estirpe T : Los linfocitos T son derivados de células pluripotentes de
médula ósea que expresan CD34, CD7, CD33 y posiblemente CD2. El
compromiso de estas HSC hacia linaje T tiene lugar en el timo bajo la
influencia de celulas estromales tímicas. Durante dicho proceso se
expresan distintos marcadores, como se muestra en la figura 4.
• Estirpe B : La diferenciación de la HSC a celulas B maduras se da a
través de 4 pasos que pueden identificarse por el patrón celular de
expresión de inmunoglobulinas y moléculas CD, como se muestran en la
figura 5.
Figura 4 La gráfica muestra la presencia de antígenos diferenciación en la estirpe de
linfocitos T . (Pui, 1993)
PROTIMOCITO TIMOCITO LINFOCITO T
TdT CD3c CD7 CD5
TdT CD3c CD7 CD5 CD1 CD2 CD4 CD8
CD2 CD3 CD5 CD7 CD4
Ó CD8
TCRαβ
30
Figura 5 La gráfica muestra las modificaciones antigénicas de la estrirpe de linfocitos B en
la maduración normal (Pui,1993)
PROGENITOR
DE CELULAS B C. PRE B
PRIMITIVAS CELULAS
PRE B CELULAS B
HLADR TdT
CD34
HLADR CD19 CD24 CD10 CD20 CD22c
HLADR CD19 CD24 CD10 CD22
cIg
HLADR CD19 CD24 CD22
sIg
31
2.2. LEUCEMIAS
Las Leucemias constituyen una proliferación o acumulación neoplásica
generalizada de celulas leucopoyéticas con invasión o sin ella de la sangre
periférica (Tood, 1993) . Craigie y Bennett en 1845 y Virchow en 1846
propusieron el nombre de sangre blanca o Leucemia, reconociéndola
además como entidad nosológica .
Por tradición y en aras de la simplicidad, la Leucemia se divide en Mieloide y
Linfoide, subclases que pueden ser agudas y crónicas. El fundamento de
esta distinción radica en dos conceptos : 1) Las dos estirpes provienen de
una célula madre medular común, divergen y luego maduran a lo largo de
vías paralelas separadas. 2) Los elementos principales que mantienen la
diferenciación parecen permanecer intactos aun en las células leucemicas.
(Lee , 1995).
2.2.1. LEUCEMIAS AGUDAS : Estas constituyen un grupo heterogéneo de
neoplasias que afectan a las células madres hematopoyéticas. Difieren entre
si con respecto al origen celular , presentación clínica , evolución y respuesta
al tratamiento. Dichas leucemias son el resultado de la proliferación
descontrolada de un clon maligno, el cual tiene ventajas de sobrevida con
respecto a las otras células normales y en consecuencia adquiere un
32
carácter dominante, conllevando al desarrollo de anemia, trombocitopenia y
granulocitopenia. (Kelley, 1990)
2.2.1.1. ETIOLOGIA : La etiología de la leucemia aguda es incierta , aunque
algunos factores son conocidos, tales como:
• Las radiaciones ionizantes
• Algunas drogas como el cloranfenicol y la fenilbutazona.
• Algunos antineoplásicos como los alquilantes.
• Virus como el HTLV-1.
Al parecer el nexo que une todos estos agentes inductores de leucemias
anteriormente mencionados y el desarrollo de esta patología, son los
oncogenes, los cuales participan en la regulación del crecimiento y
diferenciación en celulas normales. (Kelley ,1990)
2.2.1.2. CLASIFICACIÓN: Las leucemias agudas se clasifican de acuerdo
con el presunto origen celular. Un grupo internacional de investigadores
Franceses , Americanos y Británicos (FAB) desarrollaron en 1976 una
clasificación unificada para las leucemias agudas y síndromes
mielodisplásicos. Este sistema, se basa en la morfología de los blastos
medulares y periféricos en los frotis teñidos con colorantes de Romanovsky ,
suplementada si es necesario con métodos citoquímicos. En 1981 se
33
introdujeron modificaciones en la evaluación de los linfoblastos para
acrecentar la producibilidad y concordancia de la observaciones; en 1985 se
formularon criterios para el diagnóstico de la leucemia megacarioblástica
aguda. Dicha clasificación se adopto en todo el mundo para comparar los
resultados terapeuticos y aprovechar las divergencias biológicas entre los
subtipos (Tood, 1993).
2.2.1.3. LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA (LLA): Esta, puede
desarrollarse a partir de alguna celula linfoide bloqueada en un estadío
particular de desarrollo, incluyendo celulas de linaje potencial (Pui, 1998). De
acuerdo con el tamaño celular, configuración nuclear, cantidad y prominencia
de los nucleolos, cantidad relativa y aspecto del citoplasma se distinguen tres
subtipos de LLA, (Tabla 2). Uno de los problemas mas frecuentes en la
identificación de estos subtipos es la facilidad con que se confunden los
linfoblastos L2 con los mieloblastos M0 y M1. Para distingirlos se requieren
de técnicas citoquimicas y en ocasiones inmunologicas, otro incoveniente
existente es que alrededor del 10% de los pacientes con LLA exhibe blastos
heterogéneos, algunos L1 y otros L2
2.2.1.3.1. CITOQUIMICA: Los blastos son negativos para el negro Sudán B,
la peroxidasa y el naftol - ASD - cloroacetatosterasa. La reacción de
fosfatasa ácida es moderada a intensamente positiva en los blastos de un
20% de los casos de LLA. La mayoría de estos casos, son al parecer,
34
leucemias de celulas T. La tinción de PAS rara vez es positivo en algunos
linfoblastos (Tood, 1993).
TABLA 2 CLASIFICACION MORFOLOGICA (FAB) DE LA LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA
CARACTERISTICAS L1 L2 L3MORFOLOGICAS
Tamaño Celular Pequeño Grande GrandeCromatina Delicada o agrumada Delicada DelicadaNucleo Regular, puede ser Irregular , puede ser Regular ovalado a
hendidoo identado hendido o identado redondeadoNucleolos Irrelevantes o invisibles Unicos o mutiples , grande Unicos o mutiples , grande y
y prominentes prominentesCitoplasma Escaso Moderado ModeradoBasofilia Citplasmatica Leve Leve ProminenteVacuolas Variables Variables Prominente
(Tood, 1993)
2.2.1.3.2. CARACTERISTICAS CLÍNICAS : Los sujetos con este trastorno
suelen presentar sintomas de fatiga, fiebre y hemorragia. La linfadenopatía
generalizada, la esplenomegalia y la hepatomegalia son datos frecuentes.
Debida a la infiltración leucémica de otros tejidos pueden aparecer sintomas
como el dolor en las piernas, cefalea, nauseas, y vómitos (Tood, 1993).
35
2.2.1.3.3. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : La Tabla 3, enumera
varias de la anomalías cromosómicas recurrentes que se registran en la
LLA y los inmunofenotipos acompañantes. En general , las translocaciones
se asocian mas con los subtipos pre-B , B y T que con el pre-B primitivo.
Muchas de las fracturas cromosómicas responsables de estos
reordenamientos involucran a oncogenes y genes de las inmunoglobulinas o
los TCR .
TABLA 3 ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LLA
INMUNOFENOTIPO ALTERACION CROMOSOMICA GENES INVOLUCRADOS
LLA de estirpe B t(4;11) (q21:q23)
t(5;14) (q31;q32) IL3 , IgH
LLA de celulas pre-B t(1;19) (q23;p13) prl,E2A
LLA de celulas B t(8;14) (q24;q32) myc-c,IgH
t(2;8) (p11;q24) myc-c,Ig
t(8;22) (q24;q11) myc-c,Ig λ
LLA de celulas T t(11;14) (p13;q11) tcl-2,TCR αt(1;14) (p34;q11) TCR α
t(8;14) (q24;q11) myc-c, TCR α
t(10;14) (q24;q11) tcl-3, TCR αt(1;14) (p32;q11) TCR α
t(14;14) (q11;q32) TCR αt(7;9) (q35-36;q34) TCR β
t(7;14) (q35-36;q11) TCR βt(7;7) (p15;q11) TCR γ
t(7;14) (p15;q11) TCR γinv (14) (q11;q32) TCR α
inv (14) (q11;q32) tcl-1, TCR α
Variable t(9;22) (q34;q11) abl-c , bcr
IL3, Interleucina3 ; bcr,region de concentracion de fracturas ; If, interferon ; TCR , receptor de celulas T, IFN,
Interferon. (Lee,1995)
36
En la reorganizacion cromosómica los blastos revelan rasgos fenotipícos
linfoides y mieloides, no expresan inmunoglobulinas de superficie ni
citoplasmaticas, suelen ser CALLA negativo, y a menudo manifiestan
HLADR, en algunas ocasiones tiende a asociarse con leucocitosis llamativa y
esplenomegalia .
2.2.1.3.4. INMUNOFENOTIPO
• LLA pre-B temprana : las celulas leucemicas de LLA pre-B temprana
expresan CD19 , HLADR de superficie , CD22 y CD79 A de citoplasma,
aunque en gran parte muchas de ellas presentan baja expresión de CD22
de superficie y alta expresión de CD10, TdT y CD34. El marcador CD20
normalmente aparece con la producción de cadenas pesadas µ sobre
una menor proporción de blastos en algunos casos. CD45 generalmente
no es detectado o posee muy baja expresión .
• LLA pre-B : las celulas de este subtipo generalmente expresa CD19 ,
CD22 , CD79 y HLADR . Los linfoblastos de LLA pre-B exhiben
inmunoglobulina de citoplasma ( cIg ) µ pero no de superficie, así como
tampoco son detectadas las proteínas κ y λ . Casi en la totalidad de los
casos de este subtipo de LLA se expresan CD10 y TdT , pero solamente
37
las dos terceras partes de los mismos expresan CD34. Ademas no
expresan CD20 o su expresión es muy baja.
• LLA pre-B tardía : los blastos que expresan cadenas pesadas de cIg µ
y sIg (superficie) µ, sin expresar cadenas livianas κ o λ han sido
descritos como LLA pre-B transicional o tardía. La sIg µ en estos casos se
encuentra unida a CD79A y CD79B. Asi mismo, dichos blastos expresan
CD10 , usualmente TdT y algunas veces CD34.
• LLA-B : los blastos que expresan sIg µ vs cadenas livianas κ o λ son
clasificadas como LLA-B. Existen dos tipos de blastos con estas
características, los cuales son fenotipica y genotipicamente distintos. Un
grupo es caracterizado por ser blastos FAB L3 los cuales, expresan CD19,
CD22 y frecuentemente CD10, pero no presentan CD34 ni TdT. En
contraste, el otro grupo se caracteriza por ser blastos FAB L3 pero con
una fuerte expresión de CD20 y usualmente CD23. Además , existe un
subtipo infrecuente de LLA-B caracterizada por la presencia de blastos
con morfología L1 o L2 los cuales expresan TdT y CD34 y una baja
expresión de CD20, ademas la intensidad de sIg µ es muy baja
comparada con la LLA-B L3 .
38
• LLA-T : los blastos en LLA-T poseen CD7 de superficie y CD3 de
citoplasmática (cCD3), ademas expresan CD2, CD5 y TdT ; también
expresa CD45 pero usualmente con mayor intensidad que la LLA pre-B y
pre-B temprana. Generalmente del 40 al 45% de los casos de LLA-T son
CD10 positivos y/o CD21. Las celulas T-NK están asociadas con CD56 y
son detectadas en muy pocos casos. La identificación de subpoblaciones
inmunofenotipicos de LLA-T esta dividida entres estadíos : temprana
(CD7+, cCD3+, sCD3-, CD4- y CD8-) , común (cCD3+, sCD3- o CD3 bajo,
CD4+,CD8+ y CD1+) y tardía (CD3+,CD1-,y CD4+ o CD8+).
2.2.1.4. LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (LMA) : La clasificación FAB
ampliada define 8 variantes de LMA, como se describen en la Tabla 4. Esta
patología esta caracterizada por un incremento en el número de células
mieloides en la médula ósea y una detención en su maduración,
frecuentemente resultando en insuficiencia hematopoyetica
(Lowenberg,1999)
2.2.1.4.1. CITOQUÍMICA : La mieloperoxidasa es intensa en la serie
granulocítica y débil en la monocítica. También puede ser positiva en los
mieloblastos indiferenciados que carecen de gránulos azurófilos (LMA-M1),
los linfocitos y precursores eritroides son peroxidasa negativos.
39
T A B L A 4 C L A S I F I C A C I Ó N M O R F O L Ó G I C A ( F A B ) D E L E U C E M I A M I E L O I D E A G U D A
C a r a c t e r i s i t i c a s C i t o q u i m i c a sC u e r p o s M i e l o p e r o x i d a s a C loroace ta to
S u b t i p o C a r a c t e r i s t i c a s M o r f o l o g i c a s d e A u e r o S u d á n b l a c k B e s t e r a s aM O Leucem ia m ie l ob lás t i ca M ie l ob l as tos s i n g ránu los N e g N e g N e g
s i n m a d u r a c i ó nM 1 Leucem ia m ie l ob lás t i ca M i e l o b l a s t o s c o n g r á n u l o s e s c a s o s P o s / N e g * P o s P o s / N e g
c o n m a d u r a c i ó n m í n i m a o a u s e n t e s M 2 Leucem ia m ie l ob lás t i ca M ie lob las tos con g ránu los , p rom ie loc i t os , P o s P o s P o s / N e g
c o n m a d u r a c i ó n a lgunos m ie loc i t osM 3 Leucem ia p rom ie l oc í t i ca P r o m i e l o c i t o s c o n g r á n u l o s p r o m i n e n t e s D o b l e P o s P o s P o sM 4 L e u c e m i a m i e l o m o n o c í t i c a M i e l o b l a s t o s y p r o m i e l o b l a s t o s > 2 0 % ; P o s / N e g P o s P o s
p r o m o n o c i t o s y m o n o b l a s t o s > 2 0 %M 5 a L e u c e m i a m o n o b l á s t i c a M o n o b l a s t o s g r a n d e s c o n c r o m a t i n a N e g N e g N e g
s in d i f e renc iac i ón y c i t o p l a s m a a b u n d a n t eM 5 b L e u c e m i a m o n o b l á s t i c a Monob las tos , p romonoc i t os , monoc i t os ; N e g N e g N e g
con d i f e renc iac ión monoc i tos i s pe r i f é r i ca M 6 Er i t ro leucemia P recu rso res e r i t r o i des mega lob lás t i cos P o s P o s N e g
( > 5 0 % ) ; m i e l o b l a s t o s ( > 3 0 % ) M 7 L e u c e m i a m e g a c a r i o b l á s t i c a Megaca r i ob las tos , mor fo log ia ¨ l i n fo ide ¨ N e g N e g P o s / N e g
(L1 ,L2 ,M1) , b ro tes c i t op lasmá t i cos
Pos, En general presente; DoblePos, abundante; Neg, en general ausente; Pos/Neg, puede o no estar presente (Lee,1995)
41
El Sudan black B, tiñe diversos lípidos y componentes celulares y el patrón
es similar al de la peroxidasa aunque la técnica podría ser positiva en
algunos mieloblastos sin gránulos azurófilos y peroxidasa negativos, pero los
linfocitos y los normoblastos son negativos, y los cuerpos de Auer son
sudanófilos. El Acido Periodico de Shiff (PAS) reacciona sobre todo con el
glucógeno celular, en linfoblastos de la LLA se registra incorporación de este,
pero en los mieloblastos de LMA puede ser positivos o negativos. Las
estearasas, como AS-D cloroacetato es positivo especialmente en la LMA-
M3 (promielocitos) (Lee, 1995)
2.2.1.4.2. CARACTERISTICAS CLÍNICAS : el inicio se asemeja al de una
infección aguda o incluso a un proceso séptico. Otros cambios incluyen
signos de insuficiencia granulocítica, con ulceraciones en mucosas y fiebre ;
el aumento de ganglios linfáticos, del bazo y del hígado es poco pronunciado,
puede presentarse una notable postración y malestar general y en los casos
no tratados son rápidamente progresivos (Tood, 1993).
2.2.1.4.3. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : La Tabla 5, ilustra las
aberraciones cromosómicas mas frecuentes en la LMA. Con pocas
excepciones no existen diferencias entre los defectos estructurales y subtipos
FAB. A diferencia de lo que ocurre en la LLA , las alteraciones clonales de
LMA podrían afectar a los progenitores eritroides y megacariociticos ademas
del linaje mieloide.
42
TABLA 5 ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LMA
MORFOLOGIA ALTERACION CROMOSOMICA GENES INVOLUCRADOS
LMA - M2 t(8;21) (q22:q22) ETO-AML 1
LMA - M3 y M3v t(15;17) (q22;q12) PML - RAR αLMA - M3 t(11;17) (q23;q21) PLZF-RAR αLMA - M4Eo inb / del 16 (q22) CBFβ-MIH 11
LMA - M4 y M5 con eritrofagocitosis t(8;16) (p11;p13)
LMA - M2 baso del (12p)
LMA - M2 baso , M1 , M4 t(6;9) (p23;q34) DEK-CAN
LMA - M7 t(1;22) (p12-13;q13)
LMA - M2 , M4 , M5 Monosomia 7
LMA - M1 , M2 Monosomia 5 , del (5q)
Variable Trisomia 8
(Stasi,1995) ; (Lee, 1993)
2.2.1.4.4. INMUNOFENOTIPO : En la leucemia mieloblástica aguda con
poca diferenciación (M1), comúnmente se da la expresión de CD13, CD33,
CD34, CD65, CD117, y HLA-DR, pero en diferentes combinaciones. La
expresión de CD4, CD11b, CD15 y CD66 son menos frecuentes, esta
heterogeneidad, al parecer es debido a los diferentes tipos de LMA-M1
morfológicamente similares.
En la LMA- M2, los blastos comúnmente expresan CD34, CD65 y HLA-DR,
aunque la expresión de CD13 y CD33 es característicamente muy baja o
algunas veces no es detectada.
43
En la leucemia promielocitica o M3, se da una variante microgranular
conocida como M3v que es morfologicamente semejante a la LMA-M3, estas
expresan CD9, CD13, CD33 y CD65, y usualmente no expresan CD34 y
HLA-DR. La expresión de CD11b y CD15 es variable. Se ha observado que
cerca de la mitad de los casos se da la expresión de CD2 asociado a celulas
T, aunque es más frecuente en el subtipo M3v.
En la leucemia mielomonocitica aguda o M4, se da la presencia de
componentes neoplásicos mieloides y monocíticos , asumiendo que
provienen de un precursor común, por ello, es normal encontrar la expresión
de CD4, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD33, CD34, CD45, CD65 y HLA-DR.
Dentro de este subtipo, también aparece una variante no muy común
conocida como LMA-M4Eo, la cual esta asociada con el incremento de
eosinófilos en médula ósea, o la ausencia de eosinofilia en sangre periférica,
sin embargo lo único encontrado en esta variante es la expresión
característica de CD2 asociado a celulas T.
En la leucemia monocítica aguda o M5, donde se presenta una gran cantidad
de monoblastos, promonocitos y monocitos ; generalmente se da la
expresión de HLA-DR, CD14, CD11b, CD33, CD65, CD15, CD36, en algunos
casos se exhibe la expresión de CD117, y solo en casos raros se presenta
CD34, y baja expresión de CD41 y CD61.
44
En la leucemia eritroblastica aguda o M6, los eritroblastos comunmente
presentan la expresión de CD36 , CD71 y glicoforina A y la hemoglobina es
detectada en formas eritroides más maduras, en algunas ocasiones se puede
dar la presencia de CD41A, CD42B y CD61, los cuales son antígenos
megacariociticos sugiriendo que estas células provienen de un progenitor
común de eritropoyesis y mecariopoyesis.
En la leucemia megacarioblástica aguda, se da la expresión de CD41A y
CD61 y algunas veces CD42B , en raras ocasiones se da la presencia de
CD4 , CD33 , CD13 , CD34, CD36 , CD45 , CD7 y HLADR. (Behm, 1999)
2.2.2. LEUCEMIAS CRONICAS : A diferencia de las leucemias agudas, los
clones de celulas malignas de la leucemia crónica retienen una cierta
capacidad normal de diferenciación y función, por lo menos en una fase
inicial. A medida que el clon maligno se expande, la capacidad de
funcionamiento normal desaparece en forma progresiva y disminuye
gradualmente la cantidad de células sanguíneas circulantes (Kelley. 1990).
2.2.2.1. LEUCEMIA MIELOCITICA CRONICA (LMC) : La LMC , se
caracteriza por una elevación considerable del recuento leucocitario y
acumulación de granulocitos maduros e inmaduros. Puede aparecer en
cualquier momento de la vida pero su frecuencia aumenta con la edad.
45
2.2.2.1.1. CARACTERISTICAS CLINICAS : Los pacientes con LMC pueden
presentarse con un grado mínimo de perdida de peso , anorexia o letargia ,
pero en la mayoría se muestra sorprendentemente asintomatico en el
momento del diagnóstico . El curso natural de la LMC puede ser dividido en
tres fases : una fase crónica de varios años de duración , una fase acelerada
cuya duración usualmente es medida en meses , y una fase terminal aguda o
blástica que persiste de varias semanas a meses. La mayoría de los casos
son diagnosticados en la fase crónica en donde el examen físico revela por lo
general una esplenomegalia de leve a moderada y el recuento leucocítico
total suele estar elevado en un rango de 30.000 a 50.000 celulas / ul ,
aunque puede superar en algunos casos las 100.000 celulas /ul. Recuento
diferencial revela porcentaje disminuido de linfocitos y un incremento
pronunciado de los granulocitos como una gama de madurez que varia entre
granulocitos polimorfonucleares y mielocitos. Los granulocitos muy
inmaduros , tales como los promielocitos o los mieloblastos , representan el 1
a 2% de todos los glóbulos blancos en el extendido de sangre periférica. La
médula ósea de la fase crónica de la LMC es sumamente hipercelular a
causa del numero elevado de precursores mieloides en todos los estadios de
desarrollo. Los recuentos leucocitarios diferenciales en sangre periférica y en
medula ósea son casi idénticos. La crisis blástica es la principal causa de
muerte y en pocas palabras es la conversión de la LMC en LMA (Kelley,
1990)
46
2.2.2.1.2. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : La LMC se caracteriza por
la presencia de cromosomas Filadelfia (Phi), el cual es el resultado de una
translocación que afecta a los cromosomas 9 y 22 y origina la translocación
y la activación de un protooncogen. En esta aberración el gen c-abl es
translocado desde el cromosoma 9 al cromosoma 22 y el c-sis , desde el
cromosoma 22 al 9. Debido a esta translocación al cromosoma 22 , el gen c-
abl se yuxtapone con una secuencia especifica de DNA denominada la
región de agregación y ruptura (dcr). En las células de pacientes con LMC se
ha identificado RNAm quimérico c-abl / bcr de 8.2 kilobase que determina
una proteína de fusión quimérica con un PM de 210 kDa , que no es hallada
en las celulas normales. Dicha proteína (P210) ejerce una actividad
tirosinocinasa significativamente mayor que la proteína codificada por el c-
abl. La cantidad de producción de dicha proteína varia enormemente entre
los distintos pacientes y no siempre se correlaciona de manera directa con el
curso de la enfermedad. (Kelley,199)
2.2.2.1.3. CLASIFICACION : De acuerdo con la presencia o ausencia de
cromosoma philadelphia (Ph1) se distinguen dos subtipos principales de
LMC. Esta categorización es útil porque estos dos subgrupos exhiben
diferencias en las manifestaciones clínicas, evolución y sobrevida, (Tabla 6).
47
T A B L A 6 C L A S I F I C A C I O N D E L A L M C
Var iantes Cl in icas
LMC T ip i ca ( c romosoma Ph1 p resen te )
LMC A t ip i ca ( c romosoma Ph1 ausen te )
LMC t ipo juven i l
Var ian tes Mor fo lóg icas
Leucemia Eos inof í l i ca c rón ica
Leucemia Basof í l i ca c rón ica
Leucemia Monoc í t i ca c rón ica
Leucemia Neut ro f í l i ca c rón ica
(Lee, 1993)
2.2.2.1.4 INMUNOFENOTIPO : El linaje de procesos blásticos usualmente no
puede ser determinado por estudios morfológicos y citoquímicos pero sí son
de gran ayuda los estudios inmunofenotipicos. La crisis blástica del 40 al
50% de los casos infantiles es caracterizado por blastos de inmunofenotipo
mieloide (CD13+,CD15+,CD33+, ó CD65+ vs CD59A-, CD3-,CD41-). Sin
embargo , del 30 al 40% de los pacientes desarrollan crisis blástica de
celulas pre-B temprana (TdT+,CD19+,CD79A+,sIg- y cIg-) o en menos
cantidad con celulas pre-B (cIg µ +) (Lee,1995)
48
2.2.2.2. LEUCEMIA LINFOIDE CRONICA (LLC): La LLC es una neoplasia
hematológica que se caracteriza por la proliferación y acumulación de
linfocitos bastante maduros en sangre periférica, médula ósea, ganglios
linfáticos, bazo, hígado y otros órganos. En la mayoría de los casos , un solo
clon de linfocitos B sufre transformación maligna , pero algunas instancias
involucran linfocitos T monoclonales.
2.2.2.2.1. CARACTERISTICAS CLINICAS : Alrededor del 25% de los
pacientes con esta patología no refieren sintomas atribuibles. Se encuentra
linfocitosis , adenopatias o esplenomegalia en un examen de rutina o durante
la evaluación de enfermedades no relacionadas. El recuento leucocitario total
periférico se encuentra elevado en casi todos los pacientes y por lo general
supera las 20.000 celulas /ul y en el recuento diferencial se revela un
predominio de leucocitos morfológicamente maduros. En una fase temprana ,
la anemia y la trombocitopenia son infrecuentes , pero , a menudo se
presentan con la evolución de la enfermedad. La medula ósea suele ser
hipercelular con un número creciente de linfocitos morfológicamente
maduros. Las infecciones recurrentes causadas por la granulocitopenia y la
disminución de la inmunidad humoral son comunes durante el curso de la
LLC y en general se torna un problema dominante y continuo con la
evolución de la enfermedad, hasta llegar al punto en algunos casos de
causar la muerte. La transformación blástica aguda de la LLC es sumamente
rara. (Fauci,1998)
49
2.2.2.2.2. ALTERACIONES CROMOSOMICAS : En alrededor del 50% de
los pacientes se detectan anomalías cromosómicas en donde predomina la
trisomía 12 sola o combinada con otros defectos citogenéticos. También se
advierte la presencia de 14q+ , 13q+ y 11q+. La mayoría de estos fenómenos
implican translocaciones de cromosomas dadores desconocidos. Las
correspondientes al cromosoma 14 exhiben puntos de fractura en la banda
q32. También se documentan de lesiones del cromosoma 11 con puntos de
fractura en 11q21 , 11q22 y 11q14. Ademas los defectos estructurales del
cromosoma 13 y las lesiones del 6 son comunes (Lee,1995).
2.2.2.2.3. INMUNOFENOTIPO : En el 95% de los casos la LLC deriva de la
transformación maligna de un solo linfocito B y su expansión clonal ; y en
ocasiones muy aisladas involucra a los linfocitos T. La presencia de CD5 es
una propiedad única de las celulas B de la LLC y su expresión es tan
característica que muchos autores consideran que su ausencia descarta el
diagnóstico de esta enfermedad. No obstante la variante prolinfocítica carece
de CD5. Algunos marcadores de superficie usuales en los linfocitos B
normales como el CD22 y los receptores de transferrina son infrecuentes en
esta patología . Generalmente, el fenotipo compuesto genralmente por CD5,
CD20 y CD23, es propio de celulas B de LLC, (Digiuseppe, 1998;
Matutes,1994).
50
2.3. CITOMETRIA DE FLUJO
Como su nombre lo indica, la citometría de flujo es una técnica utilizada para
el análisis de células, por medio de una medición simultánea de múltiples
características, célula a célula, en tiempos muy cortos.
2.3.1. FUNDAMENTOS : La citometría de flujo, esta basada en la medición
de múltiples parámetros celulares, como son :
• Tamaño relativo (Forward Scatter ó dispersión frontal), la cual esta
relacionada con el área de la superficie celular, y que es detectada a lo
largo del eje de luz incidente en dirección frontal.
• Granularidad relativa (Side Scatter ó dispersión lateral), la cual esta
relacionada con la granularidad o complejidad celular y que es detectada
por la luz reflejada y refractada a 90º del rayo láser (Figura 4).
• Intensidad de fluorescencia relativa, la cual es directamente proporcional
a la cantidad de sitios de ligazón, dicha fluorescencia es emitida por
fluorocromos los cuales, son sustancias químicas que tienen la propiedad
de absorber fotones de alta energía procedentes de radiación ultravioleta
o del espectro visible (espectro de absorción), lo que produce una
51
redistribución de sus electrones corticales de tal forma que algunos de
ellos pasan a ocupar una órbita más alejada del núcleo (excitación), dicha
situación es inestable por lo que el electrón tiende a volver a su estado
fundamental o primitivo, emitiendo la energía absorbida en una longitud de
onda distinta (espectro de emisión (Paul,1989) .
Figura 6 La gráfica muestra la detección de Forward Scatter y Side Scatter.
Para el correcto desempeño de un citómetro de flujo, este necesita de un
sistema combinado de :
∗ Componentes fluídicos : los cuales sirven para introducir y focalizar las
células a evaluar. Esta, es un sistema de circulación con un solución
tampón que permite el paso de las células.
∗ Componentes ópticos : Gracias a estos se da la excitación y colección
óptica, la cual depende de un láser que posee generalmente una longitud
Detector de luz frontal α área de superficie celular
Fuente de luz incidente
Detector de luz lateral α complejidad celular
52
de onda de 488 nm. Igualmente, cuenta con un conjunto de lentes , los
cuales son utilizados para regular y focalizar el rayo láser. También
consta de un sistema de espejos ópticos y filtros, para dirigir las longitudes
de onda especificadas por la luz colectada hacia detectores ópticos
designados.
• Componentes electrónicos : Los cuales convierten las señales ópticas a
señales electrónicas proporcionales y establece interfaces con el
computador para transferir los datos (Becton Dickinson, 1999).
2.3.2. APLICACIONES DE CITOMETRIA DE FLUJO : La citometría de flujo,
es una herramienta de gran utilidad en citología , inmunología, hematología
y anatomía patológica. A continuación se mencionan las aplicaciones mas
frecuentes, así como las susceptibles de ser utilizadas en estudios de
citología :
• Análisis fenotipicos de células sanguíneas (Darnell, 1997)
• Cuantificación de ADN y ciclo celular
• Determinación de la viabilidad celular
• Evaluación de la activación celular
• Análisis de reticulocitos
• Detección de anticuerpos en suero
53
• Cuantificación de potencial de membrana celular
• Determinación de pH Intracelular
• Medida del calcio intracelular
• Aplicaciones en citopatologia : dentro de estas tenemos el lavado
bronquioalveolar , en donde su estudio es de gran importancia para el
diagnostico de diversas enfermedades pulmonares, otro de gran
importancia, es para el estudio del liquido cefaloraquideo. (Viguer, 1995).
54
3. JUSTIFICACION
En la segunda mitad del siglo XX se han realizado avances importantes en el
tratamiento de las leucemias que cambiaron de modo notable el concepto
que prevalecía de que la palabra leucemia era sinónimo de muerte a muy
corto plazo. Estos avances han permitido que en la actualidad se curen gran
parte de las personas que la padecen, especialmente en el caso de las
leucemias agudas (Ruiz Arguelles, 1998). Sin embargo, a pesar de los
avances en tratamiento, según el Instituto Nacional de Cancerología de
Bogotá, en 1999 las neoplasias del sistema hematopoyético y
reticuloendotelial, dentro de las cuales se encuentran las leucemias,
ocuparon el tercer lugar de más alta incidencia. En la ciudad de Santa fe de
Bogotá se presentaron el 82% del total de los casos reportados (Ministerio de
Salud/1997), y la tasa de mortalidad de leucemias es de 1 a 2 casos por
100000 habitantes (Registro Poblacional, Cali,1991-1996).
El pronóstico y la respuesta al tratamiento en leucemia se basa
principalmente en la realización de un diagnóstico oportuno, el cual depende
55
obviamente, tanto del cuadro clínico del paciente así como de las pruebas
que se realicen, especialmente las de tipo morfológico, inmunológico y
genético.
De esta forma, al ser la inmunoitipificación por citometría de flujo una técnica
de gran utilidad en el diagnóstico de dicha patología, es necesario que esta
sea correcta, óptima y precisa ; por esta razón, se decidió verificar y definir
una forma sistemática de análisis de los resultados obtenidos de las
muestras de leucemias procesadas por dicha técnica en la Pontificia
Universidad Javeriana durante Enero de 1999 y Septiembre de 2000 y
correlacionar dichos resultados con las demás ayudas diagnósticas para así
lograr una adecuada interpretación de los mismos y posteriormente la
aplicación de un tratamiento adecuado y oportuno.
56
4. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
Realizar un análisis completo de la inmunofenotipificación de las muestras de
leucemias efectuada por citometría de flujo, en el periodo comprendido entre
Enero de 1999 y Septiembre de 2000.
4.2. ESPECIFICOS
Reunir todos la información de cada uno de los casos de leucemias que
incluya tanto los datos personales como las demás ayudas diagnósticas
realizadas en los mismos.
Confirmar los criterios del análisis de citometría de flujo realizado en todos
los casos de leucemias que ingresaron.
Comparar los resultados obtenidos por citometría de flujo con los demás
métodos útiles para el diagnóstico de las leucemias en cada uno de los
casos.
57
5. MATERIALES Y METODOS
5.1. TIPO DE ESTUDIO
Este trabajo es un estudio de tipo observacional descriptivo o de casos en
serie.
5.2. MUESTRAS
Las muestras, provenían de pacientes que fueron remitidos
Hemato/Oncología del Hospital Universitario San Ignacio (HUSI), los cuales,
por criterio médico y para corroborar su diagnóstico era necesario realizarles
inmunotipificación por citometría de flujo. Dichas muestras, procedían de
medula ósea o en algunos casos, debido a los antecedentes clínicos, de
sangre periférica.
5.3. EQUIPOS
Citómetro de flujo: Facs Calibur (Becton Dickinson), U.S.A.
Cámara de flujo Laminar: Jouan ( Hotte LC2.12), Francia.
58
Centrfuga: Jouan (MR 22), Francia.
Nevera: Supernordico (4ºC)
Vortex: Thermolyne (Maxi Mix II)
5.4. METODOS
5.4.1. PROTOCOLO DE MARCAJE
• Se procede con la realización de un primer marcaje de la muestra, el cual
posee anticuerpos marcados con fluorocromos anti CD, tanto de linaje
mieloide como linfoide entre los que se encuentran CD3, CD5, CD7,
CD10, CD13, CD20, CD22, CD33; algunos anticuerpos utilizados
reconocen moléculas compartidas para los dos linajes, como son : CD45 y
HLA DR. En la prueba, además se utilizan controles de isotipo
(IgG1a/IgG2), los cuales se utilizan como control negativo. De cada uno de
los anticuerpos mencionados anteriormente se agregan 10 ul, en el
siguiente orden :
• Tubo 1 : CD45.PerCP/CD3. FITC
• Tubo 2 : IgG1a.FITC/IgG2.PE
• Tubo 3 : CD10.FITC/CD22.PE
• Tubo 4 : CD20.FITC/CD5.PE
59
• Tubo 5 : CD7.FITC/CD33.PE
• Tubo 6 : HLA-DR.FITC/CD13.PE
• Posteriormente, se adiciona la muestra, la cual, dependiendo del recuento
de leucocitos totales presentes en la misma, se lleva a una concentración
final de 10,000células/ul, para luego agregar un volumen de 50ul.
• Se mezcla en vortex, a cada uno de los tubos y se llevan a incubación por
30 minutos a 4ºC y en oscuridad.
• Posterior al tiempo de incubación, se realizan dos lavados con PBS-azida
de sodio 0.1%, de 5 minutos y a 2,000 rpm cada uno.
• Se lisan los eritrocitos, realizando una dilución 1/10 del solución de lisis
con un volumen final de 1,000ul, para cada tubo.
• Se mezcla en vortex a todos los tubos, y se lleva a incubación por 10
minutos exactos, en oscuridad y a 4ºC.
• Se realizan dos lavados con PBS-azida de sodio 0,1% por 5 minutos a
2,000 rpm cada uno, y luego se resuspende la muestra en PBS-
Paraformaldehido 0,5%, 500ul, el cual permite la fijación y preservación de
60
las células al momento de su adquisición.
• Luego de procesar y adquirir las muestras en el citómetro de flujo, es
posible observar si esta es de línea mieloide (CD13, CD33) o linfoide, de
tipo T (CD3, CD7, CD5) o de tipo B (CD20, CD22) dependiendo ello, del
tipo de marcadores positivos encontrados, así, para confirmar esto se
realizar un segundo marcaje:
• Leucemias mieloides : este segundo marcaje se realiza con anticuerpos
anti CD14 y anti CD16, los cuales aclararán si la leucemia mieloide es de
tipo granulocítica (CD16) o monocítica (CD14).
• Leucemias linfoides : este segundo marcaje solo es necesario cuando
luego del análisis se observe que la leucemia es linfoide y que además los
marcadores positivos para linfocitos son de línea B. De esta forma se
evidenciará que tan madura o inmadura se encuentra la leucemia linfoide
B, dependiendo ello de la presencia o ausencia de IgM citoplasmática y de
superficie. Para este marcaje es necesario seguir los siguientes pasos :
◊ Se marcan 3 tubos , cada uno con el nombre, la fecha, y el anticuerpo que
se adiciona a cada uno, en el siguiente orden:
61
∗ Ig M citoplasmática control negativo (IgM Cneg)
∗ IgM citoplasmática (IgM cit)
∗ IgM de Superficie (IgM sup)
◊ Se realiza el proceso de permeablización, el cual es necesario, solo en el
tubo control y en el IgM cit, por ser marcajes intracelulares, adcionando
50ul de la muestra y una dilución 1/10 del buffer de permeabilización con
un volumen final de 1.000ul a cada tubo, mientras que al tubo de IgM sup,
solo se adiciona muestra.
◊ Se mezcla en vortex y se lleva a incubación por 15 minutos a 4ºC.
◊ Se lava 2 veces con PBS por 5 minutos a 2.000 rpm, solo a los tubos a los
que se le realizo el proceso de permeabilización.
◊ Se adicionan 4ul de anticuerpo anti IgM a todos los tubos, menos al de
IgM Cneg, pues este es el control de la prueba.
◊ Se mezcla en vortex y se lleva a incubación por 30 minutos a 4ºC y luego
se lava dos veces con PBS-azida de sodio 0.1%, pero solo los tubos a los
que se les agrego anticuerpo.
◊ Se agrega a todos los 3 tubos, 10 ul del anticuerpo secundario, que en
62
este caso sería el Goat anti mouse IgG total marcada con FITC, se realiza
vortex y se lleva a incubación por 30 minutos a 4ºC en oscuridad.
◊ Se lava 2 veces todos los tubos con PBS por 5 minutos a 2000RPM, y
luego se resuspende el pelled con PBS-paraformaldehido 0,5%, 500ul.
5.4.2. ANALISIS DE LOS ARCHIVOS: Toda la adquisición de las muestras,
como su respectivo análisis se realizaron bajo el programa Cell Quest
(Becton Dickinson). Inicialmente se realiza una gráfica de puntos de Forward
scatter (FSC) y Side Scatter (SSC), en la cual se podía visualizar la
morfología celular con respecto al tamaño y la granularidad (Figura 7).
FIGURA 7 La gráfica muestra la distribución de las células con respecto a su tamaño y
granularidad (FSC/SSC)
R1
63
Seguidamente, se realiza una gráfica de puntos con CD45 vs SSC, ello con
el fin de dividir la población total con respecto a su expresión de CD45 y su
complejidad celular. (Figura 8).
FIGURA 8. Gráfico de puntos donde se muestra la expresión de CD45 (FL3) y la
complejidad de una muestra de médula ósea.
A partir de estas dos gráficas se selecciona la población a estudiar, esto se
logra delimitando la población de interés sobre la primera gráfica FSC vs
SSC, para luego observar su distribución en la segunda gráfica CD45 vs
SSC. Posteriormente se realiza una gráfica para observar el control de
isotipo (Figura 9), el cual debe dar negativo, de esta forma, se puede crear
un cuadrante que logrará definir las poblaciones positivas y negativas para
todos los marcadores utilizados. Por último, se habren gráficas de puntos
para cada uno de dichos marcadores, en las cuales se coloca en el eje de las
X a FL1 (FITC), y en el eje de las Y al FL2 (PE). (Figura 10).
64
FIGURA 9. Gráfico de puntos mostrando la delimitación del cuadrante basado en el control
de isotipo.
FIGURA 10. Gráfico de puntos en donde se muestra la distribución celular con respecto al
marcaje en FL1 (FITC) y en FL2 (PE).
65
5.5. RECOLECCION DE INFORMACION
5.5.1. DATOS DIAGNOSTICOS:
5.5.1.1. Diagnóstico Clínico: Gracias a la colaboración de la Unidad de
Estadística del HUSI, se revisaron cada una de las historias clínicas de los
pacientes, de las cuales se reconfirmó, el nombre completo, la edad y el
diagnóstico clínico.
5.5.1.2. Mielograma: Los datos sobre el mielograma fueron obtenidos de la
Unidad de Hemato/oncología del HUSI.
5.5.1.3. Diagnóstico Patológico: Las biopsias de médula ósea, fueron
confirmadas por parte de la Unidad de Patología del HUSI.
5.5.1.4. Cariotipo: Gracias a la ayuda prestada por el Instituto de Genética
Humana de la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ), fue posible la
recolección de datos del cariotipo de cada uno de los pacientes a los que se
les realizó dicho examen.
5.5.2. BASES DE DATOS: Con el propósito de organizar toda la
información existente en la UCF y además, cumplir con uno de los objetivos
de este trabajo, se creó una base de datos, a la cual, se le anexo ademas
66
los diagnósticos patológicos, y exámenes extras como mielograma y
cariotipo. Vale la pena aclarar, que no todos los pacientes, poseían esta
información extra, ello debido a su estado clínico, el cual en algunas
ocasiones no ameritaba el desarrollo de dichos exámenes. Toda esta
información recolectada se procesó en Excel 7.0 (Microsoft)
67
6. RESULTADOS
Los resultados de este trabajo son mostrados en forma de tablas dentro de
las cuales se recolectó toda la información de cada uno de los pacientes,
dividiéndolas en tres grupos : leucemias agudas, leucemias crónicas y
condiciones no leucemicas ; el criterio para esta selección estuvo basado en
la aproximación diagnóstica dada por el médico tratante. Igualmente, las
muestras fueron ordenadas de acuerdo a la fecha de arribo a la unidad de
citometría de flujo, dándosele un código numérico iniciado en 1.
De 47 casos que llegaron a la unidad de citometría de flujo, 25 (53%)
pertenecían a leucemias agudas. En la Tabla 7, se resumen los datos de
individuos con leucemia aguda y las ayudas diagnósticas que se les
practicaron; a partir de esta, se determinó que el recuento de leucocitos
promedio fue de 46.7x10e9/L (+/- 57.3), el porcentaje promedio de blastos
fue de 53% (+/- 33.8), en sangre periférica y en médula ósea del 81%
(+/- 29.6). Adicionalmente, dentro de los pocos casos de LLA a los que se les
realizó pruebas citoquímicas, se encontró positividad para el PAS, y
negatividad para el SUDAN; así mismo, morfológicamente, se encontraron
68
dos casos de L1, dos de L2 y dos de L3 y cariotípicamente no se presentaron
anomalías cromosómicas a excepción de dos casos con cromosomas
Filadelfia, dos con deleciones y uno con trisomía. Con respecto a las LMA
morfológicamente se encontró un caso de M2, uno de M3, uno de M4 y dos
de M4 o M5. Dentro de estos, algunos fueron negativos para PAS y positivos
para SUDAN y ninguno presentó anomalías cromosómicas.
Del total de leucemias agudas, 18 (72%) eran de linaje linfoide (LLA)
(Ver Anexo A)provenientes en su mayoría de infantes con un promedio de
edad de 4 años (+/- 3.6); siete de estas, expresaron marcadores de linfocitos
B, tres de linfocitos T, siete de ambos linajes y la restante fue clasificada bajo
criterio clínico como LLA simplemente. Adicionalmente se observó
coexpresión de CD10/CD22 en 7 de los casos, además se encontró un caso
de expresión aberrante de CD13 y otro de CD33. Por otra parte, de las
Leucemias mieloides agudas (LMA) (Ver Anexo B) fueron en su mayoría de
pacientes adultos con un promedio de edad de 60 años (+/- 12.3), se
encontró un total de 7 casos (28%), presentándose en cuatro de ellos la
coexpresión de HLA-DR/CD13, y la expresión aberrante de CD7 en uno de
estos. Vale la pena resaltar, que en la mayoría de estos casos con curso
clínico agudo, se presentaron altos porcentajes de HLA-DR con un
promedio de expresión del 52% (+/- 29,5), junto a una expresión media de
CD45. (Tabla 8)
69
Se encontraron un total de 13 (28%) casos de leucemias crónicas, en estos
se presentó un alto recuento de leucocitos totales, con un promedio de
74,3X10e9/L (+/- 55.9), junto con un promedio bajo del porcentaje de blastos
en sangre periférica y médula ósea, siendo estos de 24%(+/- 29.9) y 25%
(+/- 32.6), respectivamente. En la mayoría de los casos se exhibió la
presencia de cromosoma Filadelfia y en algunos de ellos, el diagnóstico por
patología fue compatible tanto para LMC (4 casos) como para LLC (1caso),
(Tabla 9 )
De estos casos con curso crónico, 11 (85%) fueron de linaje mieloide (LMC)
en su mayoría adultos con un promedio de edad de 58 años (+/- 6.4)
(Ver Anexo C) observándose en dos de estos casos una coexpresión de
HLA-DR/CD13 y de CD14/CD16 en uno de ellos. También se encontró un
caso que morfológica y clínicamente pertenecía a LMC, pero
fenotípicamente poseía marcadores de LLA (Ver Anexo D). Los 2 casos
restantes, fueron Leucemias linfoides crónicas (LLC), las cuales arrojaron un
pomedio de edad de 44 años (+/- 17.3) (Ver Anexo E), en donde se observó
coexpresión de CD20/CD5. (Tabla 10)
Por último, se encontraron 9 (19%) casos pertenecientes a patologías no
leucémicas, los cuales provenían en su mayoría de pacientes adultos con un
promedio de edad de 66 años (+/- 29.3), los cuales presentaron un recuento
de leucocitos promedio de 42.7x10e9/L (+/- 71.2) con un porcentaje
70
promedio de leucocitos totales en sangre periférica del 10.2% (+/- 11.3), al
igual que en médula ósea con un promedio del 4.5% (+/- 5.4). Con respecto
al diagnóstico patológico y citoquímico en su mayoría no fueron realizados,
así mismo, las alteraciones cromosómicas estuvieron ausentes o
no se realizaron, a excepción de un caso que presentó deleción
en el cromosoma número 7, (Tabla 11).
Adicionalmente en estas patologías no leucémicas se observó en algunos
casos la presencia y en otros la ausencia de marcadores específicos de
linaje, además no se presentaron coexpresiones ni expresiones aberrantes,
además la expresión de CD45 y HLA-DR era relativamente normal con
respecto al tipo región analizada. (Tabla 12)
Vale la pena aclarar, que en todos los grupos de clasificación, existieron
casos a los que no se les realizaron alguna (s) prueba diagnóstica, estos no
fueron tomados en cuenta dentro de lo relatado anteriormente, pero se
designaron con la abreviatura NR, en los cuadros que se presentan a
continuación.
71
Tabla 7. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES CON LEUCEMIA AGUDA
(Ver carpeta “ACCESORIOS”)
72
Tabla 8. RESUMEN DE LOS HALLAZGOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN LEUCEMIAS AGUDAS
(Ver carpeta “ACCESORIOS”)
73
Tabla 9. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES CON LEUCEMIA CRÓNICA
(Ver carpeta “ACCESORIOS”)
74
Tabla 10. RESUMEN DE LOS HALLAZGOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN LEUCEMIAS CRÓNICAS
(Ver carpeta “ACCESORIOS”)
75
Tabla 11. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES CON PATOLOGÍA
NOLEUCÉMICA
(Ver carpeta “ACCESORIOS”)
76
Tabla 12. RESUMEN DE LOS HALLAZGOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN PATOLOGÍAS NO
LEUCÉMICAS
(Ver carpeta “ACCESORIOS”)
77
78
7. DISCUSION
El análisis de la inmunotipificación de leucemias por citometría de flujo
realizado en este trabajo fue llevado a cabo, mediante la recolección de
datos de cada uno de los casos y una evaluación detallada de cada uno de
los resultados encontrados, ello para lograr una adecuada interpretación y
correlación de los mismos, lo anterior permitió definir los siguiente :
Los casos de leucemias agudas, al encontrarsen dentro de la población
infantil especialmente en la LLA, fue concordante con lo que se halla en la
literatura internacional (Sandler, 1997). Además, mostraron un recuento
leucocitario promedio alto y un porcentaje promedio de blastos alto en
médula ósea y sangre periférica, típico de estas patologías (Lee, 1995). La
negatividad del Sudan Black en la LLA y la positividad en la LMA, es de
esperarse, pues este, tiende a teñir los gránulos de los precursores
mieloides, mientras que el PAS por su parte pude ser positivo en ambas
patologías al ser un colorante que reacciona principalmente con el glucógeno
celular, pero con la diferencia de mostrar un aspecto distinto en cada una,
por esto no es de asombro, encontrar positividad en LLA y negatividad en
LMA (Tood, 1993). Con respecto a los hallazgos morfológicos de la LLA y la
79
LMA son tota lmente concordantes con los resultados de citometría, pero sin
tener en cuenta la clasificación FAB, a excepción de un caso de LMA-M4, en
el que se encuentra la presencia de CD14, que es frecuentemente positivo
en este subtipo de LMA; aunque si se observan los casos de LLA, partiendo
de los diferentes subtipos de esta, se puede decir que lo observado
fenotípicamentera en su mayoría LLA pre B, ello por la presencia de
marcadores propios de dicho subtipo (HLADR, CD20, CD10, IgMcit)
(Darnell, 1997). Igualmente, vale la pena resaltar la relación entre la regiones
analizadas y sus respectivas expresiones de CD45 y HLA-DR, la cual, al ser
en la mayoría de los casos población blástica, tienden a poseer un alto
porcentaje de HLA-DR, por ser este una molécula característica de
inmadurez celular en estos casos, y la expresión de CD45 media, que es
típica de esta población; sin embargo la relación entre HLADR y la población
blástica de los casos no fue estadísticamente significativa (r:0.36). También,
es importante resaltar los casos de LLA que mostraron expresión de
marcadores de ambos linajes, los cuales podrían ser argumentados por el
hecho de que el inicio de la leucemia se dio a partir de una célula progenitora
más temprana que la que se da en los casos en donde la expresión es
restricta de un linaje específico ya sea B ó T, ello, observándose desde el
punto de vista de la diferenciación normal de estas células (Kondo, 1997).
Así mismo, la presencia de marcadores aberrantes, se atribuye en la
presencia de progenitores inmaduros, como por ejemplo CD7 en un caso de
LMA, el cual, según algunos trabajos ha sido encontrado sobre células de
80
normales CD34+ que exhiben potencial mieloide (Stasi,1995), con respecto a
las expresiones de CD13 y CD33 en casos de LLA, coincide con el hecho de
que este tipo de expresiones es muy común en adultos (Hon Pui, 1991). Por
otra parte, la presencia de cromosoma Filadelfia en dos de los casos de LLA,
refieren algo de asombro, pues aunque no es anormal encontrarlos, si son
escasos en este tipo de patología ; pero al parecer, la proteína que codifica
este cromosoma generalmente es distinto a la que se halla en el cromosoma
de la LMC (Kelley,1990).
En las leucemias crónicas, se presentó una población adulta en su mayoría,
coincidiendo esto con lo encontrado en literatura, en donde la alta incidencia
de LMC y LLC se presenta en esta población (Byrd,1998; Epsatein,1999);
adicionalmente también se encontró un recuento leucocitario alto, típico de
las leucemias en general y un porcentaje promedio de blastos bajo tanto en
sangre periférica como en médula ósea, lo que es normal en las leucemias
de curso crónico. Igualmente la presencia de cromosoma Filadelfia fue alta
en esta población, que es típico de esta patología (Epstein,1999). Con
respecto al inmunofenotipo, los dos casos de LLC, que coexpresaron de
CD20/CD5 es lo más encontrado fenotípicamente en estas leucemias
(DiGiuseppe, 1998). Con respecto al caso que morfológica y clínicamente era
LMC pero presentaba marcadores de LLA, al parecer puede indicar que el
paciente se encontraba en un estado de crisis blástica en el que se estaba
dando una conversión tanto de linaje como de curso de la enfermedad
81
(Lee, 1995).
En las patologías no leucémicas, aunque se encuentra un recuento de
leucocitos tanto alto como bajo, el porcentaje de blastos en sangre periférica
y médula ósea es relativamente bajo, coincidiendo esto con los diagnósticos
clínicos que son generalmente síndromes mielodisplásicos (Lee,1995). Así
mismo, la no presencia de marcadores atípicos, ni de aberraciones ni
coexpresiones indican la normalidad aparente de las células, confirmándose
ello por su expresión de CD45 vs SSC; en estos casos, los estudios por
citometría de flujo no fueron relevantes como ayuda diagnóstica, solo
descartaron cuadros leucémicos.
82
8. CONCLUSIONES
♦ La realización de una base de datos, al igual que la confirmación de los
criterios de análisis por citometría de flujo, es de gran utilidad para la
correlación y la realización de un buen análisis de los casos.
♦ La edad, el recuento leucocitario y los porcentajes de blastos.
Generalmente tienden a coincidir con el tipo de leucemia presente.
♦ La información de cada tipo de diagnóstico no es de gran valor cuando
se analiza de forma individual, a diferencia de cuando se relaciona con los
demás métodos.
♦ Existió una buena concordancia entre las diferentes ayudas diagnósticas
usadas.
♦ El análisis de citometría de flujo es de gran utilidad, especialmente en
casos de conversión blástica, en donde por morfología en algunas
ocasiones no es posible determinar.
83
9. RECOMENDACIONES
♦ Siempre que una muestra de leucemia llegue a la Unidad de Citometría
de flujo de la Pontificia Universidad Javeriana, debe traer consigo la
información básica del paciente como nombre completo, edad, sexo,
mielograma, datos de sangre periférica y diagnóstico clínico presuntivo :
ello con el fin de tener antecedentes claves, que pueden ser de utilidad
para la realización de un buen análisis.
♦ El reporte de citometría de flujo no solo debería llevar los porcentajes de
los marcadores utilizados, sino que también se le debería anexar las
gráficas de puntos de FSC/SSC y CD45/SSC, y además la de los
marcadores más relevantes para cada caso ; esto con el propósito de
permitirle al médico la observación y correlación de los marcadores con
respecto a la región analizada.
♦ A la entrega del reporte de citometría de flujo, se debería realizar la
discusión del caso con los responsables de las demás ayudas
84
diagnósticas, ello con el objetivo de correlacionar todos los resultados
obtenidos y poder aportar opiniones que sean de utilidad para el
diagnóstico definitivo del caso y por ende un oportuno y óptimo
tratamiento.
♦ Para la continuidad de este trabajo, podría sugerir estudiar la relevancia
de las expresiones aberrantes en la clínica y curso de la enfermedad.
85
10. ANEXOS
86
Anexo A. CASO DE LLA
Sample ID: 240699Acquisition Date: 24-Jun-99Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 25 0.30 0.25UR 549 6.62 5.49LL 4209 50.72 42.09LR 3516 42.37 35.16
Sample ID: 240699Acquisition Date: 24-Jun-99Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 47 0.52 0.47UR 12 0.13 0.12LL 8992 99.17 89.92LR 16 0.18 0.16
Region Events % Gated % TotalR1 8859 88.59 88.59
R1
Sample ID: 240699Acquisition Date: 24-Jun-99Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 1121 12.65 11.21UR 4737 53.47 47.37LL 2994 33.80 29.94LR 7 0.08 0.07
Sample ID: 240699Acquisition Date: 24-Jun-99Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 2537 28.31 25.37UR 386 4.31 3.86LL 1620 18.07 16.20LR 4420 49.31 44.20
Sample ID: 240699Acquisition Date: 24-Jun-99Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 1 0.01 0.01UR 3 0.03 0.03LL 6573 74.46 65.73LR 2250 25.49 22.50
Sample ID: 240699Acquisition Date: 24-Jun-99Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 263 2.99 2.63UR 26 0.30 0.26LL 5463 62.15 54.63LR 3038 34.56 30.38
87
Anexo B. CASO DE LMA
Sample ID: Acquisition Date: 29-Aug-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 1016 12.66 10.16UR 2193 27.32 21.93LL 888 11.06 8.88LR 3931 48.97 39.31
Sample ID: Acquisition Date: 29-Aug-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 14 0.17 0.14UR 6 0.07 0.06LL 8076 99.52 80.76LR 19 0.23 0.19
R1
Region Events % Gated % TotalR1 8113 81.13 81.13
Sample ID: Acquisition Date: 29-Aug-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 104 1.28 1.04UR 19 0.23 0.19LL 7950 97.74 79.50LR 61 0.75 0.61
Sample ID: Acquisition Date: 29-Aug-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 55 0.67 0.55UR 0 0.00 0.00LL 8076 99.03 80.76LR 24 0.29 0.24
Sample ID: Acquisition Date: 29-Aug-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 2583 32.04 25.83UR 35 0.43 0.35LL 5293 65.65 52.93LR 151 1.87 1.51
Sample ID: Acquisition Date: 29-Aug-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 0 0.00 0.00UR 2 0.02 0.02LL 7966 98.19 79.66LR 145 1.79 1.45
88
Anexo C. CASO DE LMC
Sample ID: CONSUELO ACOSTAAcquisition Date: 24-Mar-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 17 0.36 0.17UR 6 0.13 0.06LL 4735 99.52 47.35LR 0 0.00 0.00
Sample ID: CONSUELO ACOSTAAcquisition Date: 24-Mar-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 434 8.23 4.34UR 22 0.42 0.22LL 4811 91.19 48.11LR 9 0.17 0.09
Sample ID: CONSUELO ACOSTAAcquisition Date: 24-Mar-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 4682 94.13 46.82UR 61 1.23 0.61LL 194 3.90 1.94LR 37 0.74 0.37
Sample ID: CONSUELO ACOSTAAcquisition Date: 24-Mar-0Gate: G1Total Events: 20000
Quad Events % Gated % TotalUL 32 0.30 0.16UR 16 0.15 0.08LL 10610 99.34 53.05LR 23 0.22 0.11
Sample ID: CONSUELO ACOSTAAcquisition Date: 24-Mar-0Gate: G1Total Events: 10800
Quad Events % Gated % TotalUL 3 0.06 0.03UR 8 0.15 0.07LL 5328 99.72 49.33LR 4 0.07 0.04
R1
Region Events % Gated % TotalR1 10681 53.41 53.41
Sample ID: CONSUELO ACOSTAAcquisition Date: 24-Mar-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 11 0.21 0.11UR 9 0.17 0.09LL 5277 99.51 52.77LR 6 0.11 0.06
89
Anexo D. CASO DE LMC EN T RANSFORMACION BLASTICA
Sample ID: Johnatan CalderonAcquisition Date: 28-Jun-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 96 1.29 0.96UR 6276 84.53 62.76LL 1035 13.94 10.35LR 18 0.24 0.18
Sample ID: Johnatan CalderonAcquisition Date: 28-Jun-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 576 8.01 5.76UR 212 2.95 2.12LL 506 7.04 5.06LR 5896 82.00 58.96
Sample ID: Johnatan CalderonAcquisition Date: 28-Jun-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 3712 46.11 37.12UR 95 1.18 0.95LL 3521 43.73 35.21LR 723 8.98 7.23
Sample ID: Johnatan CalderonAcquisition Date: 28-Jun-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 1 0.01 0.01UR 190 2.61 1.90LL 603 8.27 6.03LR 6495 89.11 64.95
Sample ID: Johnatan CalderonAcquisition Date: 28-Jun-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 31 0.38 0.31UR 34 0.42 0.34LL 8098 98.99 80.98LR 18 0.22 0.18
R1Region Events % Gated % Total
R1 7651 76.51 76.51
Sample ID: Johnatan CalderonAcquisition Date: 28-Jun-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 1 0.01 0.01UR 1 0.01 0.01LL 6862 89.69 68.62LR 787 10.29 7.87
90
Anexo E. CASO DE LLC
Sample ID: Mari E MatizAcquisition Date: 29-May-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 131 1.57 1.31UR 12 0.14 0.12LL 7610 91.18 76.10LR 593 7.11 5.93
Sample ID: Mari E MatizAcquisition Date: 29-May-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 18 0.23 0.18UR 169 2.21 1.69LL 804 10.49 8.04LR 6671 87.07 66.71
Sample ID: Mari E MatizAcquisition Date: 29-May-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 2 0.03 0.02UR 6 0.08 0.06LL 7246 91.64 72.46LR 653 8.26 6.53
Region Events % Gated % TotalR1 7907 79.07 79.07
R1
Sample ID: Mari E MatizAcquisition Date: 29-May-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 694 8.69 6.94UR 6804 85.18 68.04LL 373 4.67 3.73LR 117 1.46 1.17
Sample ID: Mari E MatizAcquisition Date: 29-May-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 4718 72.21 47.18UR 5 0.08 0.05LL 1810 27.70 18.10LR 1 0.02 0.01
Sample ID: Mari E MatizAcquisition Date: 29-May-0Gate: G1Total Events: 10000
Quad Events % Gated % TotalUL 16 0.20 0.16UR 12 0.15 0.12LL 7882 99.29 78.82LR 28 0.35 0.28
91
Anexo F. PREPARACION DE REACTIVOS
Stock PBS 25X
188gr de K2HPO4
33gr de NaH2PO4.H2O
188gr de NaCl
Para prepararar 1L, disolver totalmente en 900ml de agua destilada.
Estabilizar pH en 7.4, Completar volumen a 1000ml con agua destilada.
Concentración utilizada de trabajo: 1x
Stock PBS - Azida de Sodio 1%
1gr de Azida de Sodio
Disolver en 100ml de PBS 1x
Concentración utilizada para trabajo: 0.1%
Stock PBS - Paraformaldehido 5%
5gr de Paraformaldehido
Disolver en 100 ml de PBS 1x
Concentración utilizada para trabajo: 0.5%
92
11. BIBLIOGRAFIA
1. Abbas, A; Lictman, A; Pober, J. Inmunología Celular y Molecular. 3ª ed.
España : Interamericana. 1999. p. 519
2. Akashi, K; Traver, D; Miyamoto, T. A clonogenic common myeloid
progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000, 404 :193-
197.
3. Beckton Dickinson. Citometría de flujo, análisis celular Multiparametrico
Inmunolab. Laboratorios C.A. Colombia. 1999.
4. Behm, F ; Campana, D. Immunophenotyping Studies of Childhood
Hematologic. Memphis. 1999.
5. Byrd, J; Army, W. Introduction:Chronic lymphocytic leukemia. Seminars in
Oncology,1998. 25:4-5
6. Darnell, C; Foon, J. Recent advances in flow cytometry: aplication to the
diagnosis of hematologic malignancy. Blood, 1997. 90:2863-2879
7. DiGiuseppe, J ; Borowitz, M. Clinical Utility of Flow Citometry in the
Chronic Lymphoid Leukemia. Seminars in Oncology, Febrero1998, 25 : 6-
10.
93
8. Epstein,F. The Biology of chronic myeloid leukemia. The New England
Journal of Medicine. 1999, 341:164-171
9. Fauci, A . Harrison Principios de Medicina Interna. 14a. De. España :
McGraw Hill-Interamericana. 1998. p. 278-780
10. Hon Pui, C; Raimondi, C; Head, D; Schell, M; Rivera, D; Mirro,J; et al.
Characterization of childhood acute Leukemia with multiple myeloid and
lymphoid at diagnoses and relapse. Blood, 1991. 78:1327-1337
11. Hon Pui, C ; Behm, F . Clinical and Biologic Relevance of Immunologic
marker studies in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia. Blood,1993,
82 :343-362.
12. Instituto Nacional de Cancerología. Distribución de Casos Nuevos de
Cancer por Grupos de Edad y sexo según Localización Topográfica.
Bogotá. ESE. 1999.
13. Kelley, J. Principios de Medicina Interna . 9ª ed. España: Medica
Panamericana. 1990
14. Kondo, M; Weissman, I; Akashi, K. Identification of clonogenic common
lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 1997, 91 : 661-672.
15. Lowenberg, B ; Downing, J ; Burnett, A. Acute Myeloid Leukemia. New
England Journal Medicine, Septiembre 1999 ; 341 :14
16. Mckenzie, S. Hematología Clínica, 1991. 1ra ed. México : El Manual
Moderno S.A. 1991.
17. Ministerio de Salud. Morbilidad por Consulta Externa. Bogotá. Archivo
maestro SIS 103.1997.
94
18. Murphy, GP ; Lawrence, W ; Lenhard, RE. Oncología Clínica. 2da ed.
Washington D.C. : OPS. 1996.
19. Paul, W. Fundamental Immunology. 2ª ed. New York: Kaves press. 1989.
p. 781-815
20. Ruiz Arguelles, G. Fundamentos de Hematología. 2da ed. Mexico :
Medica Panamericana.1998.
21. Registro Poblacional de Cancer. Mortalidad de Leucemias en Colombia
para Ambos Sexos - Tasa por 100000 Habitantes, 1991-1996. Cali. 1996.
22. Sandler, D; Rots, Julie. Epidemiology of leukemia in children and Adults.
Seminars in Oncology, 1997, 24: 3-11
23. Stasi, R; Taylor, D; Venditti, A; Del Poeta, C; Aronica; D; Bastianelli, et al.
Contribution of Immunophenotyping and Gentyping Analyses to the
Diagnosis of Acute Leukemia. Ann Hematology. 1995, 75 :13-27
24. Tood, J. Diagnóstico y Tratamiento Clínico por el Laboratorio. 9ª ed.
Barcelona : Masson. 1993. p. 713-735.
25. Tucker, L, Misson JR. Fates of Human B-cell Precursors. Blood. 2000,
96, 1 : 19-23
26. Viguer, J ; Garcia, R. Laboratorio y Atlas de Citología. España :
McGrawHill-Interamericana.1995.
95